CELULAS MADRE HEMATOPOYETICAS Y EL ENVEJECIMIENTO DEL SISTEMA HEMATOPOYETICO.

El envejecimiento es una de las fatalidades de la vida al que nadie es inmune. Todos los aspectos de nuestra fisiología y nuestro fenotipo están sometidos a lentos pero contantes cambios a medida que envejecemos. En contrasta con el envejecimiento de otros órganos como la piel y el cabello, que fácilmente observamos su deterioro fisiológico, el envejecimiento del tejido hematopoyético es sutil y casi siempre se asocia con un estado patológico especifico. Sin embargo, estudios detallados claramente documentan cambios en la función de varias líneas hematopoyéticas a medida que nos envejecemos. Quizás el mejor ejemplo sea la disminución de la competencia del sistema inmune observado en la vejez. Las células madre hematopoyéticas (CMH) funcionando durante toda la vida para generar todas las células efectoras del sistema hematopoyético, están imbuidas de un potencial de desarrollo, que incluso en teoría una sola célula madre hematopoyética puede reconstituir el sistema hematopoyético entero. El extraordinario potencial de desarrollo de las CMH es posible a su capacidad única de renovarse a sí mismo lo que garantiza reservas de células madre en el tiempo así como para diferenciarse en células efectoras. Por ello las CMH se han convertido en el sistema modelo para estudiar los efectos del envejecimiento, porque entre otras cosas se pueden purificar hasta cerca de la homogeneidad lo que permite que sean analizadas cuantitativa y cualitativamente. Claro que lo que conocemos sobre las CMH y el envejecimiento se basan en estudios en ratones.

Ontogenia de las Células Madre Hematopoyéticas.

Aunque la mayoría de los estudios sobre el envejecimiento se centra en los cambios fisiopatológicos que se presentan a lo largo de la vida, una consideración de la ontogenia es importante si pensamos en el envejecimiento a partir de la diferenciación de células madre adultas en diversos comportamientos, ya que la diferenciación es el inicio del envejecimiento y en el caso de las células madre hematopoyéticas comienza cuando su reserva se mantiene solamente por auto-renovación. En ratones, la hematopoyesis se inicia en el 7 día embrionario con la aparición de células progenitoras primitivas en el saco vitelino que son capaces de generar eritrocitos que son esenciales para la oxigenación del embrión en rápido crecimiento.

Tras el saco vitelino, la hematopoyesis tiene lugar en el mesonefrón aórtico que se ha sugerido sea el sitio donde se forman las definitivas CMH. Las CMH luego se forman en el hígado del feto, el timo, el bazo y en última instancia en la médula ósea. Si bien estos sitios antiguos son colonizados por la migración de CMH, la relación de desarrollo entre los sitios primarios de hematopoyesis y la aparición de CMH definitivas sigue siendo controversial. Aunque progenitores del saco vitelino se creían contribuyentes a la hematopoyesis definitiva, varias líneas de evidencia a partir de experimentos en pollos de codorniz sugieren que esto podría no ser el caso. Sin embargo, recientes experimentos en vivo sobre linaje utilizando ratones heterocigotos para el gen Runx1 demostró que la hematopoyesis del saco vitelino puede contribuir al pool definitivo de CMH adultas1 aunque el alcance de esta contribución está por determinarse.

Las CMH que surgen en el feto en desarrollo difieren del adulto no sólo en su ubicación, sino en varias propiedades, como el fenotipo de la superficie celular.2, 3 De otro lado, las

CMH del adulto residen primariamente en estado de reposo (G0) en el ciclo celular.4, 5

Mientras las CMH fetales están en rápida proliferación2 en las primeras tres semanas después del nacimiento, en concordancia con su papel en el establecimiento del compartimiento hematopoyético.

Las CMH fetales funcionalmente producen subtipos de células de la sangre que luego no serán producidas por las CMH del adulto como las células T V-3 y células B y B1.6, 7 lo que sugiere que la transición embrionaria a neonatal incluye limitaciones en la potencia de diferenciación. La habilidad de la CMH humana de generar progenitores primitivos in vitro se reportó alto en el hígado fetal en comparación con la sangre de cordón umbilical y se reduce aún más en las CMH aisladas de la médula ósea del adulto.8 parece probable que muchos de los cambios funcionales que acompañan la transición de feto a CMH después del parto surgen como consecuencia de cambios en la demanda de desarrollo de la hematopoyesis del feto frente a la del adulto. La transición de la hematopoyesis embrionaria a las del adulto se acompaña de profundas diferencias en el control. Por ejemplo, la transcripción del factor Sox17 es requerido para el mantenimiento y funcionamiento de las CMH fetal, pero no para las CMH del adulto, mientras que Gfi-1 y ETV6 parecen ser exclusivas para el mantenimiento de las CMH del adulto.9, 10 Esta dicotomía de la dependencia en la regulación de la transcripción revela una alteración fundamental en los mecanismos moleculares que regulan la identidad de la célula madre durante la ontogenia, que permite la transición desde el establecimiento inicial del sistema hematopoyético a su papel en la homeostasis del adulto y el mantenimiento a largo plazo. Sean o no sean estos los reguladores moleculares representan blanco potenciales para el re-establecimiento potencial embrionario en la adultez de manera parecida a la re-programación de células somáticas en las células madre pluripotenciales inducidas aún no ha sido probado.11 Sin embargo, el hecho de que divergentes reguladores moleculares puede funcionar en las células madre para afectar el destino de las primeras etapas de la ontogenia al mismo tiempo sugiere que al menos algunos de los cambios funcionales que acompaña la transición a la vejez de manera similar puede ser regulada y no simplemente por azar.

Reservas de Células Madre Hematopoyéticas durante el Envejecimiento.

Una creencia común acerca de cómo se produce el envejecimiento de las células madre en los diversos tejidos es que las reservas de células madre disminuye progresivamente con la edad y finalmente no puede satisfacer las demandas para la renovación celular. De hecho, este mecanismo parece contribuir a uno de los fenotipos más evidentes del envejecimiento, como el cabello blanco por la pérdida gradual de células madre de melanocitos en el folículo del bulbo del pelo. 12 Por otra parte, las células madre de la epidermis que residen en la cercanía de las células madre de melanocitos, presentan disminuida actividad dependiendo de la edad, pero parece que mantiene su número.13 El efecto del envejecimiento en el comportamiento hematopoyético parece ser más complejo y depende de variables como el tipo de ensayo utilizado para evaluar el número de células madre y de la genética de la cepa de ratón que se analiza. Los primeros experimentos demuestran que la medula ósea del ratón viejo C57BL6 era superior a la médula ósea de jóvenes en los referentes a la capacidad de reconstituir el comportamiento eritroide por irradiación o receptores W/Wv incondicionados.14 Esta observación fue confirmada por la cuantificación

de linaje adicionales en experimentos que demuestran una potencia dos a tres veces superior a las células de la médula ósea de toda edad de ratones.4, 15

Esto es contrario a la intuición que el potencial de la célula madre en el ratón disminuye y por el contrario aumenta con la edad. Independiente de la capacidad del tejido hematopoyético. El mantenimiento del potencial de las CMH en la edad avanzada está en consonancia con los experimentos de transplante que demuestra que las CMH posee la capacidad funcional de por lo menos 15 a 50 de la vida normal. 16 Una limitación a todos estos experimentos de transplante de médula ósea es que no es capaz de distinguir entre el potencial de las células alrededor de las CMH o un incremento dependiendo de la edad en la médula ósea. La medición de las CMH, por estimaciones estadísticas, 17 los experimentos de dilución,4, 18 y cultivo en vitro19 sugiere un aumento de aproximadamente el doble del numero de CMH en la médula ósea de los ratones C57BL6 viejos versus los jóvenes, aunque las diferencias entre las bases genéticas son observadas.14, 19 Esto ha sido demostrado por experimentos con agregación de dos cepas (DBA2 y C57BL6) que inicialmente revela equivalente producción de células de la sangre del quimerismo con la edad20, lo que señala que la existencia de diferencias de recursos genéticos es capaz de sostener la actividad de las CMH.

Las CMH pueden ser aisladas por el fenotipo de la superficie celular y validada funcionalmente. Criterios divergentes han surgido con los años para definir rigurosamente la identidad fenotípica de las CMH y una crítica de los diversos estudios divergentes sobre el fenotipo de la superficie celular se ha dado. Por ejemplo, la estrategia más utilizada de establecer la actividad de las CMH por el fenotipo de su superficie (c-kit Linaje Sca-1-[KLS]) no lo distingue de numerosos progenitores multipotenciales que constituyen la mayoría de la fracción KLS. El uso de criterios de selección adicionales, como CD34, flk2 y CD48-CD150 ha permitido la resolución mucho mayor entre las células madre y progenitores en recientes años.21-24 Varios estudios, utilizando métodos comparables, pero no uniformes, sugiere que las CMH aumentan en frecuencia con la edad entre a 6 a 17 veces.4, 25-28 Es interesante que la cuantificación por Inmunofenotipo en ratones viejos C57BL6 es sistemáticamente mucho más que las estimaciones antes mencionadas funcionalmente. De hecho, los estudios de la competencia mediante el transplante de células madre usando células madre purificadas han demostrado que la actividad de las CMH de ratones viejos se reduce sustancialmente en comparación de los jóvenes.4, 26, 29

Curiosamente, las CMH de ratones de mayor edad se muestra funcionalmente capaz de establecer células diferenciadas en receptores de transplante primario,26, 27 lo que sugiere que las CMH mantiene la capacidad estable de expansión de reserva de células en los ratones viejos por una autónoma capacidad de auto renovación. En conjunto, estos estudios se sugiere que mientras que la actividad de las CMH disminuye con la edad, su producción funcional total dentro de la médula ósea es sostenida por un aumento en su número.

Cambios funcionales en las Células Madre Hematopoyéticas con el envejecimiento.

Los estudios han demostrado que la composición de las células sanguíneas cambia con la edad. Más notable, mientras que la linfopoyesis es robusta en la juventud, disminuye con la edad en el ratón4, 10 y en seres humanos. 1 Mientras se produce la involución del timo y un exceso de células linfoides en competencia para limitar las citoquinas que declina la linfopoyesis, lo que está demostrado por estudios que demuestran disminución de la

linfopoyesis (sobre todo de células B) lo que es una propiedad intrínseca del envejecimiento de las CMH.4, 26 Este potencial disminuido linfoide es diferente en el potencial mieloide (particularmente en la granulopoyesis) que es mantenido o incluso se incrementa con la edad. Esta diferencia de los potenciales del linaje linfoide y mieloide fue evidente en pequeñas cantidades de células madre fueron trasplantadas. 4, 26 Este potencial de linaje alterado fue evidente en los progenitores linfoide y mieloide, sugiere que las diferencias dependientes de la edad en el sistema hematopoyético primitivo son dependientes de factores extrínsecos que surgen en el microambiente de edad. De hecho, diversas estratégicas de transplante han demostrado claramente que la diferencia de potencial de linaje mieloide y linfoide se mantiene en las células madre, incluso en receptores jóvenes de transplante.4, 26, 29 Consistente con la observación, el perfil de expresión de CMH de animales jóvenes y viejos revela que el número de genes de especificación linfoide son más regulados en CMH más jóvenes, mientras que los genes de especificación mieloide preferentemente están regulados por CMH más viejas.26

Los cambios en las características del potencial linaje de las CMH envejecidas pueden reflejar de manera más amplia las demandas en diferentes etapas del desarrollo. Por ejemplo, mientras las CMH tienen un sesgo linfoide temprano en el desarrollo facilita el establecimiento del sistema inmune adaptativo, mientras el sesgo mieloide que sobreviene con la edad avanzada puede ser necesaria para reforzar la inmunidad innata para hacer frente a la infección en el anciano. Una característica global de la generación y función de todos los tipos de células inmunes, tanto innato como adaptativo durante el envejecimiento puede sugerir que los cambios en el equilibrio linfoide y mieloide son derivados de la inmunidad innata-adaptativa, levantando una perspectiva diferente sobre este fenómeno. Es también significativo que las neoplasias hematopoyéticas que predominan en la tercera edad tienden a ser de origen mieloide, mientras que las neoplasias pediátricas manifiestan predominio de compartimiento linfoide. Esto sugiere que las diferencias en la prevalencia de neoplasias hematológicas dependientes de la edad pueden producirse por cambios en las tendencias de desarrollo de las CMH durante el envejecimiento. En apoyo de esto, un estudio reciente demostró que la expresión ectópica del oncogen BCR-ABL en ratones jóvenes condujo al desarrollo tanto de leucemia de células B y una enfermedad mieloproliferativa, mientras que la expresión de la misma construcción en ratones de mayor edad dio lugar a una enfermedad mieloproliferativa pero no linfoma.30

Mecanismos subyacentes del Envejecimiento de las Células Madre Hematopoyéticas.

Los mecanismos moleculares del envejecimiento de las CMH son pocos conocidos. Como ya he señalado, la expresión génica global de perfiles de CMH aisladas de ratones jóvenes y viejos revela una regulación coordinada de grupos de genes específicos de linaje es consistente con cambios observados en las CMH con el envejecimiento. 26 Por otro lado, la regulación de genes dependiente de la edad involucra la remodelación de la cromatina 26, 28,

310 y la regulación coordinada a lo largo de la estructura de orden superior del cromosoma28

lo que sugiere que el aumento de la dinámica de la cromatina puede estar implicado en el envejecimiento de las CMH. Metilación del ADN y la acetilación de las histonas son las modificaciones epigenéticas importantes a largo plazo que regulan la diferenciación celular.

Estudios ex vivo de células humanas sugiere que la deacetilación de las histonas (HDAC) podría retrasar la perdida de potencial de las células madre in vitro y mejorar la capacidad de injerto.32, 33 En los ratones, la manipulación de los genes del policomb influye sobre el destino de las células madre. La expresión forzada de EZH2 funcionalmente amplia el potencial de las CMH a través de series de transplantes.34 Deficiencia de Bmi1 demostró su papel esencial en el mantenimiento a largo plazo del comportamiento de las células madres in vivo,35, 36 y expresión forzada de Bmi1 dramáticamente promueve tanto in vitro como in vivo la auto-renovación como la re-población de CMH.36 Bmi1 también está implicado en el mantenimiento de células madre neuronales37 y la función de células madre leucémicas.38

Un posible mecanismo común de estas vías es la inhibición de p16Ink4ap19Arf (genes supresores de crecimiento) por Bmi1 junto con Ezh2.39 Recientemente, la metilación del ADN de novo fue evaluada en CMH condicionada por depleción de Dnmt3a y Dnmt3b.40

Interesantemente, estos experimentos revelo un papel esencial para la metilación del ADN de novo en el mantenimiento de las células madre pero no en la potencial diferenciación. Esto fue particularmente interesante, ya que los estudios demostraron que la metilación del genoma se incrementa a medida que la progresa la diferenciación hematopoyética, mientras que la metilación global fue inferior en las mismas CMH, poniendo de manifiesto una paradoja de la dependencia de la metilación del ADN de novo en la diferenciación hematopoyética versus la auto-renovación de las CMH.40 Estos resultados sugieren que tal vez sólo unos pocos genes clave requieren de metilación de ADN de novo por Dnmt3a y Dmnt3b en CMH para mantener la capacidad de auto-renovación, mientras que la diferenciación hematopoyética es independiente de Dnmt3a y Dnmt3b a pesar del incremento normal de la metilación global de ADN.40

La longitud de telomero es quizás el más conocido reloj molecular de la división celular con un papel bien documentado en el mantenimiento de la función de la célula madre. En humanos, la mutación en la telomerasa ARN50, 51 es componente catalizador43 o en proteínas asociadas44 que lleva a la pancitopenia y falla de la médula ósea en pacientes con anemia aplásica y/o disqueratosis congénita a través de defectos de células madre y progenitoras. En ratones, la ablación genética de la actividad de la telomerasa y de los telomeros disminuye la repoblación potencial de CMH45 y de manera dependiente de la edad,31 y en última instancia limita la capacidad de replicación de las CMH en ensayos de series trasplantadas.46 Esto sugiere que la sobre expresión ectópica de un componente catalítico de la telomerasa en las CMH era insuficiente para ampliar su capacidad de transplante en series, sugiriendo que la longitud de los telomeros es un mecanismo independiente que en última instancia limita la capacidad de replicación de las CMH.47

Especies reactivas de oxigeno (ROS) y daño oxidativo se cree que son los factores que contribuyen al envejecimiento de muchos tipos de células. Pero las CMH pueden estar algo protegidas contra este tipo de daño debido a su posición en el nicho de la médula ósea, y se cree que es la hipoxia, 48, 49 aunque hay que señalar que la localización precisa y la composición celular del nicho de la célula madre aún no está determinada de manera convincente. Debido a que el ciclo celular de las CMH es infrecuente y con la concomitante baja actividad metabólica estos limitan exposición a stress oxidativo. Otro mecanismo de protección activa en las CMH es por su alta expresión de transportadores de cassette de unión al ATP (ABC) que transporta componentes peligrosos para la célula.50 Por otro lado, las CMH exhiben una potencial bloqueado en ausencia de factores de transcripción ATM60

y FoxO,51, 52 que parecen estar mediados por stress oxidativo. Los altos niveles de ROS en los ratones deficientes en ATM60 da lugar a la activación de la proteína quinasa activadora del mitógeno p38 (MAPK) e induce la proliferación, lo que es prevenido por tratamiento anti-oxidante o inhibidores específicos de p38.53 Similarmente, el déficit de células madre en ratones con deficiencia de triple de FoxO 1, 3 y 4 fueron menos revertidos por el tratamiento anti-oxidativo.52 En una noticia relacionada, los ratones deficientes en FoxO3a mostraron u desarrollo hematopoyético normal pero exhiben CMH con deficiencias múltiples cuando tienen edad avanzada.51 Deficiencia de FoxO3 mostró afectar más a las CMH a través de ATM en parte e involucra a las vías p53/p21.54 En conjunto, estos estudios identifican el manejo intracelular de los niveles de ROS como un mecanismo importante que contribuyen a la protección de las reservas de CMH y su función durante el envejecimiento.

Acumulación de ADN dañado se piensa que es el mecanismo central que contribuye a la declinación celular. De hecho, la importancia del mantenimiento genómico para preservar la función de la célula madre está demostrada en varios estudios que evalúan la función de las CMH en ratones deficientes en vías divergentes de reparación del ADN, incluyendo FancD1/Brca2,55 Msh2,56 Lig4,57 Rad50,58 mTR, XPD y Ku80.31 Estos estudios sugieren que si bien la hematopoyesis puede a menudo mantenerse en ausencia de de las principales proteínas de reparación del ADN, la capacidad de las CMH para responder al estrés agudo se ve afectado en ausencia de estos factores. Interesantemente, exámenes inmunohistoquímicos de CMH altamente purificadas de ratones jóvenes y viejos para evaluar los daños del ADN con la edad, revela que las células madre de ratones viejos hay mucho más daño de ADN que en ratones jóvenes, como la acumulación dependiente de la edad de H2AX.31 Es importante destacar que el examen de progenitores multipotentes y oligopotentes de los ratones viejos exhiben menos H2AX, lo que sugiere el daño de ADN se limita a las células madre.31 Estos hallazgos sugieren un mecanismo mediante el cual las células madre pueden servir de reservorio para la adquisición de eventos mutacionales requeridos para la patogénesis de enfermedades o la transformación oncogénica.

Esta perspectiva es particularmente inquietante en el contexto de la biología de las células madre ya que, en contraste a la acumulación de daño en las células somáticas, la auto-renovación y la diferenciación potencial de las células madre ofrece la oportunidad de potenciar el impacto de las alteraciones genéticas en toda la progenie hematopoyética y trasmitir a los progenitores derivados. Teniendo en cuenta la larga vida de los seres humanos, lesiones genéticas acumuladas en el comportamiento de las células madre con el tiempo puede jugar un papel importante en los orígenes de una gran variedad de patologías en los ancianos. La evaluación directa del daño del ADN durante el envejecimiento de las células madre en los seres humanos es por tanto de claro interés.

Control Extrínseco del Envejecimiento de las Células Madre Hematopoyéticas.

La capacidad funcional de las células madre en el organismo envejecido está determinada por factores intrínsecos y extrínsecos. Si bien nuestro objetivo final es entender el resultado final, es importante aprender a distinguir entre los distintos mecanismos que influyen en la actividad de las CMH. Un primer estudio usando implante subcutáneo de huesos de ratones jóvenes o viejos, demostró disminución de la repoblación de células jóvenes en los huesos viejos injertados en ratones jóvenes, lo que sugiere una atracción, retención y apoyo menos

favorable para la colonización en microambientes de ratones viejos.59 Este controlado experimento implica la función de factores adicionales in vivo como las citoquinas sistémicas para implantes de huesos jóvenes en ratones viejos y observar un mejor desempeño en términos de colonización de tejidos de donante jóvenes por las células de receptor viejos. Estos experimentos sugieren que el medio ambiente de la medula ósea vieja es menos capaz de soportar la función de células madre o progenitoras. Asimismo, en cultivos in vitro de largo plazo de medula ósea demuestra una menor capacidad del estroma viejo para soportar la actividad progenitora hematopoyética.60

La influencia de la edad sobre las células madre también ha sido objeto de un estudio reciente, que informó que las células jóvenes tienen una capacidad doble para migrar a la médula ósea comparado con las células de ratones viejos.18 Este estudio sugiere que el medio ambiente viejo es menos favorable para retener las células dentro de la médula ósea.

Mayores evidencias que el envejecimiento está asociado a cambios en la forma que interactúa con el microambiente de la médula ósea fue revelado por un estudio que reportó un aumento general de movilización de CMH y progenitores en ratones viejos debido a una menor adherencia a las células estromales.61

Un ejemplo claro de cómo las interacciones de las CMH y micro ambiente puede influir en la función del sistema hematopoyético proviene de estudios de ratones RAR deficientes, que desarrollan una enfermedad mieloproliferativa que no puede ser rescatado por transplante dentro de médula ósea normal. Mientras que las células de medula ósea deficientes en RAR si son trasplantados a receptores de tipo salvaje diferencian normalmente y no desarrollan la enfermedad mieloproliferativa. 62 Estos resultados demuestran que una patología hematopoyética puede ser derivada de células estromales. Es importante contrastar esta situación con el éxito clínico el transplante de médula ósea para corregir otras enfermedades que amenazan la vida.

En Resumen.

Las estrategias dirigidas a disminuir el impacto de las enfermedades infecciosas, junto con los avances en medicina, han logrado aumentar la esperanza de vida. De hecho, estudios demográficos indican que el porcentaje de ancianos se encuentra en su máximo histórico y seguirá creciendo. Sin embargo, este aumento ha llegado a un costo de condiciones degenerativas y malignas relacionadas con la vejez y la co-morbilidad es frecuente. La necesidad de de desarrollar estrategias terapéuticas dirigidas a mejorar las condiciones fisiopatológicas en las personas mayores es urgente. El enorme potencial terapéutico de las células madre en la medicina regenerativa ha suscitado gran entusiasmo para el desarrollo encaminado a tratar diversos condiciones degenerativas prevalentes en los ancianos. Cómo detener el envejecimiento de las células madre contribuye a declinar la fisiopatología asociada al envejecimiento y debe ser un paso crítico para obtener estos objetivos, ya que este tipo de investigación debería ser capaz de identificar los mecanismos subyacentes que declinan la funcionalidad de las células madre y al mismo tiempo informar las estrategias de intervención.

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