1 BIOTECNOLOGIA
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1BIO bios
BIOLOGIA:Ciencia que estudia la vida
TECNOLOGIA:Estudia las tcnicas,
herramientasy materiales en un
proceso
BIOTECNOLOGIA
+
BIOTECNOLOGIA
Uso integrado de la microbiologa, bioqumica y la ingeniera para obtener aplicaciones tecnolgicas de los microorganismos, clulas animales, clulas vegetales y de las fracciones derivadas.
Consiste en la explotacin industrial de microorganismos, clulas animales, clulas vegetales y de las fracciones sub-celulares.
La utilizacin de molculas obtenidas biolgicamente, estructuras celulares, clulas u organismos para llevar a cabo procesos especficos
B I O T E C N O L O G I A
NUMEROSAS APLICACIONES NUMEROSAS APLICACIONES
Industria de fermentacinIndustria agroalimentariaIndustria qumica y farmacutica
Tratamiento y valorizacin de sub-productos agroindustriales y de efluentes
Produccin de alcoholProduccin de biogas
ALGUNAS DEFINICIONESALGUNAS DEFINICIONES
-
2QumicaIngeniera enzimticaIngeniera genticaIngeniera
matemticasInformticaAutomatizacinEconoma
SE CARACTERIZA POR SU CARCTER INTERDISCIPLINARIO
ADEMAS:
MICR
OBIO
LOGI
A
INGENIERIA
BIO
QU
IMIC
ABIOLOGIAMOLECULAR
BIOTECNOLOGIA
ALGUNOS ACONTECIMIENTOS IMPORTANTES EN EL DESARROLLO HISTORICO DE LA BIOTECNOLOGIA
AO ACONTECIMIENTO
AC Cerveza, pan, vino, lcteos fermentados, pescado fermentado, kojiS XVII Produccin de vinagre y cido actico(inmovilizacin de clulas)1857 Fermentacin lctica (L. Pasteur)1908 Enzimas inmovilizadas sobre carbn1916 -D-fructofuranosidasa inmovilizada sobre almina1917 Karl Ereki acua el trmino biotecnologa1928 Primer transplante de nucleo en clulas embrionarias de salamandra1935 Cultivo in vitro de tejidos vegetales1940 Se crea la escuela de ingeniera biolgica en el MIT1943 Produccin industrial de penicilina1952 Clonacin de sapos mediante transplante de ncleos1953 Se determina la estructura del DNA (Watson y Crick)1958 Regeneracin de plantas a partir del cultivo de tejidos 1961 Publicacin de Biotechnology and Bioengineering1961-6 Se descifra el cdigo gentico .....
-
3AO ACONTECIMIENTO
1963 J.B.S. Haldane acuo el trmino CLON1964 Transformacin de esteroides por clulas inmovilizadas1967 Uso industrial de glucosa isomerasa inmovilizada1967 Se asla la DNA ligasa1969 James Shapiero y Johnathan Beckwith aislaron el primer gen1970 Howard Remin y David Baltimore, aislaron la primera enzima de restriccin
(transcriptas inversa)1972 Khorana y col. Sintetizan un gen de RNAt1972 Paul Berg crea la primera molcula de DNA recombinante1973 Stanley y Cohen y Herbert Boyer crean el primer organismo
recombinante (E. Coli)1975 Kholer y Milnstein describen la produccin de anticuerpos monoclonales1976 Se desarrollan tcnicas para secuenciar el DNA1978 Genentech produce insulina humana en E. coli1979 Sciences de la vie et socit (Gros, Jacob & Royer)1980 Se presenta el informe Spink1980 La corte suprema de EE. UU. Acepta patentar microorganismos manipulados
genticamente .....
AAOO ACONTECIMIENTOACONTECIMIENTO
1981 La federacin europea de biotecnologa da la definicin de trmino
Biotecnologa)
1982 Se aprueba en Europa el uso de la primera vacuna recombinante para
animales
1983 Transformacin en plantas con plasmidio Ti recombinado
1984 Kary B. Mulis desarroll la reaccin en cadena de la polimerasa: PCR
1985 S. Willadsen clona una oveja mediante transplante de ncleo
1986 S. Willadsen clona una vaca
S. Willadsen clona una vaca usando clulas embrionarias diferenciadas
1988 Se patenta en EE.UU. un ratn recombinado susceptible a cncer.// Se
publica el mtodo PCR
1990 Se aprueba una terapia gnica en humanos
1996 Ian Wilmut y Keith Cambell clonan a Dolly usando clulas mamarias
1997 Se clona Polly, una oveja, usando clulas de piel
-
4GRANDES ETAPAS EN EL DESARROLLO DE LA BIOTECNOLOGIA GRANDES ETAPAS EN EL DESARROLLO DE LA BIOTECNOLOGIA
BIOTECNOLOGIA DE SEGUNDA Y TERCERA GENERACION: AISLAMIENTO Y USO DE ALGUNOS MICROORGANISMOS,
EXTRACCION Y PURIFICACION DE ALGUNAS ENZIMAS Y LA ERA DE LOS ANTIBIOTICOS
BIOTECNOLOGIA DE CUARTA GENERACION: UTILIZACION OPTIMA DE MICROORGANISMOS Y ENZIMAS, CULTIVO DE TEJIDOS Y ANTICUERPOS MONOCLONALES, MEJORAMIENTO DE CELULAS, TECNOLOGIA DEL ADN
RECOMBINANTE
BIOTECNOLOGIA DE PRIMERA GENERACION: USO EMPIRICO DE MICROORGANISMOS Y ENZIMAS PARA PRODUCIR BEBIDAS ALCOHOLICAS,
LACTEOS, VINAGRE, FERMENTADOS TRADICIONALES
BIOTECNOLOGIA ALIMENTARIABIOTECNOLOGIA ALIMENTARIA
SE USA TECNICAS BIOLGICAS PARA LA PRODUCCIN, TRANSFORMACIN Y/O PRESERVACIN DE ALIMENTOS:
Produccin de bebidas alcoholicas, productos fermentados (yogourt, queso, embutidos)
protena unicelular, fermentacin de cacao, caf y t.
PRODUCCION DE MATERIAS PRIMAS, ADITIVOS Y COADYUVANTES EMPLEADOS EN LA INDUSTRIA ALIMENATRIA:
Produccin de aminocidos, vitaminas, enzimas, cidos orgnicos biopolmeros,
colorantes, potenciadosres de sabor, etc.
ES UTILIZADA EN ASPECTOS ANALTICOS Y DE CONTROL DE CALIDAD:Enzimas empleadas en la determinacin de componentes especficos, micoorga-nismos
empleados en evaluacin nutricional (vitaminas, aminocidos, coles-terol, etc.) y
biosensores enzimticos.
-
5LA BIOTECNOLOGIA TIENE VENTAJAS COMPARATIVAS, LA BIOTECNOLOGIA TIENE VENTAJAS COMPARATIVAS, RESPECTO A LA QUIMICA TRADICIONAL:RESPECTO A LA QUIMICA TRADICIONAL:
Se aprovecha las propiedades funcionales de los microorganismos.
Los microorganismos se multiplican rpidamente y tienen un metabolismo extremadamente activo.
Bajo ciertas condiciones producen grandes cantidades de sustancias (metabolitos), en relacin a su tamao.
Las bioconversiones son altamente especificas. Ejem. Transformacin de lactosa.
Las bioconversiones se realizan en un medio poco desnaturante, a temperaturas biolgicas, emplean agua como solvente y no tiene necesidad de catalizadores poluentes.
ALGUNOS APORTES IMPORTANTES DE LA BIOTECNOLOGIA EN DIFERENTES SECTORES
SSEECCTTOORR EEJJEEMMPPLLOOSS
AGRICULTURASeleccin de variedades, plantas y animales obtenidos pordiversas tcnicas incluyendo clonacin
ENERGETICO Produccin de biogas, produccin de etanol
MEDIO AMBIENTEDesarrollo de mtodos y procedimientos de monitoreoDesarrollo de tcnicas de tratamiento de desechos industriales
ALIMENTARIO
Nuevos mtodos de tratamiento y preservacin de alimentosProduccin de aditivosEnzimas utilizadas en el procesamiento de alimentosProduccin de protena unicelular
MEDICO
Desarrollo de mtodos de diagnstico utilizando enzimas,sensores enzimticosUso de microorganismos y enzimas en la elaboracin de drogascomplejas (ejemplo esteroides)Nuevos antibiticosUso de enzimas en terapias
MINERIA Extraccin de minerales (lixiviacin microbiana)QUIMICO Produccin de cidos orgnicos (ctrico, actico)
-
6ETAPA QUESO CERVEZA
Primera
generacin
Uso emprico de bacterias lcticas
Uso emprico de quimosina
Uso emprico de levaduras
Proceso emprico de malteado
Segunda
generacin
Aislamiento y uso de bacterias lcticas
Extraccin, purificacin y caracterizacin de quimosina
Uso de cultivos puros de levaduras
Esclarecimiento de la naturaleza enzimtica del malteado
Uso de papana para la clarificacin en fro
Tercera
generacin
Propagacin masiva de bacterias lcticas
Seleccin de cultivos lcticos mejorados
Sustitucin de quimosina por proteasa microbiana
producida en gran escala
Mejor control de la fermentacin
Fermentacin continua para la produccin de cerveza
Produccin y uso de amilasas y -glucanasas
Uso de enzimas para la produccin de cervezas ligeras
Cuarta
generacin
Tecnologa del ADN recombinante para la produccin de
quimosina y mejoramiento de bacterias lcticas
Utilizacin optima de enzimas y microorganismos para la
maduracin acelerada y generacin de sabores
Ingeniera gentica para la obtencin de levaduras amilolticas
Cultivo de tejidos e ingeniera gentica para el mejoramiento de
cebada
Procesos con microorganismos yenzimas inmovilizadas
IMPACTO DEL DESARROLLO DE LA BIOTECNOLOGIAEN LA PRODUCCION DE QUESO Y DE CERVEZA
ESQUEMA DE LA PRODUCCION E INTEGRACION DE LAS TECNICAS BIOTECNOLOGICAS
Man
ipu
laci
ng
ent
ica
Cultivo de clulas animalesClulas vegetalesMicroorganismos, etc...
Optimizacin de los fenmenos de transferencia AutomatizacinDesarrollo de nuevos sensores
TECNICAS DE ANALISISCromatografa:HPLC, CPG SondasAnticuerposElectroforsis
Microfiltracin tangencialUltrafiltracinCromatografa
liquida preparativa, HPLC.
PRODUCTOS AlimentariosFarmacuticos EnergaQumicos
Cl
ula
s y
enzi
mas
in
mov
iliza
das
CELULASPRE-CULTIVO
BIO-REACTOREXTRACCION Y
PURIFICACION
FERMENTADOR
Opt
imiz
aci
n
-
7ESQUEMA OPTIMO DE UNA PRODUCCION BIOTECNOLOGICAY DE LA UTILIZACION DE ENZIMAS
MANIPULACIONGENETICA
CELULASPRE-CULTIVO
BIO-REACTOR
EXTRA / INTRACELULAR
CELULAS(Biomasa)
INMOVILIZACION
METABOLITOAcido orgnicoAminocidoAntibitico
ENZIMA ENZIMA
REACTOR
PRODUCTOFINAL
EXTRACCION Y/OPURIFICACION
REACTOR INMOVILIZACIONINMOVILIZACION
EJEMPLOS DE PRODUCCION Y APLICACIONES DE BIOMASA
S. CerevisiaeS. Carlsbergensis
Chorela sp.Spirulina sp.Pseudomonas sp.Methalomonas sp.Candida sp.Aspergillus sp.Trichoderma sp.Lactobacillus sp.Pediococcus sp.Leuconostoc spLactobacillus sp.Bifidobacterias spStreptococcus sp.Bacillus sp.
Bacillus turingensisBcillus sphearicusSeudomonas fluorescensBacillus subtilisTrichoderma sp
Levadura de panificacinLevadura de cevecera
Algas
Bacterias
LevadurasHongos
Fermentos lcticos
Probiticos
Activadores de degradacin
Insecticidas
Fungicidas
Panadera y cervecera
Protena unicelular (SCP)
Starters
Biopesticidas
MICROORGANISMO EJEMPLOS APLICACIONES
-
8EJEMPLOS DE PRODUCCION DE METABOLLITOS POR EJEMPLOS DE PRODUCCION DE METABOLLITOS POR FERMENTACIONFERMENTACION
TIPO DE METABOLITO PRODUCTOS MICROORGANISMO
Aminocidos
- Acido glutmico- Leucina- Lisina- Triptofano
- Brevibacterium sp.- Corinebacterium sp.- Corinebacterium sp.- Corinebacterium sp.
Antibiticos
- Bacitracina- Cefalosporina- Cloranfenicol- Gramicidina- Mitomicina- Monensina- Neomicinas- Penicilinas- Polimixina- Streptomicina- Virginiamicina
- Bacillus subtilis- Cefaslosporium sp.- Streptomices venezuelae- Bacillus brvis- Streptomices caespitosus- Streptomices cinnamonensis- Streptomices fradiae- Penicilium crisogenum- Bacillus polimixa- Streptomices griseus- Streptomices virginiae
Alcoholes - Etanol
- Butanodiol/acetoina
- Sacharomices cerevisiae- Zymomonas movilis- Leuconostoc sp- Aerobacter aerogenes- Bacillus subtilis- Serratia marcenscens
Enzimas - Alfa-amilasa
- Celulasas
- Pectinasas
- Beta-galactosidasa
- Proteasas
- Lipasas
- Bacillus licheniformis- Aspergillus oryzae- Aspergillus niger- Trichoderma viride- Aspergillus niger- Aspergillus foetidus- Aspergillus niger- Kluyveromices marxianus
- Bacillus subtilis- Bacillus licheniformis
- Mucor miehi- Aspergillus niger,- Rhizopus oryzae
Acidos orgnicos - Acido actico- Acido ctrico
- Acido lctico- Acido mlico- Acido pirvico- Acido succnico
- Acetobacter sp.- Aspergillus niger- Candida lipolitica- Lactobacillus sp..- Lactobacillus brevis- Pseudomonas aeruginosa- Bacilluis sp
Polisacaridos - Dextrana
- Alginato- Xantana
- Acetobacter sp.- Leuconostoc mesenteroides- Pseudomonas, sp- Xantomonas sp.
Vitaminas - Caroteno (pro vita. A)
- B6- B12
- Choanefora sp.- Rhodotora sp.- Aspergillus sp.- Propionibacterium sp.
-
9MERCADO MUNDIAL DE PRODUCTOS BIOTECNOLOGICOS
INDUSTRIAALIMENTARIA (48 %)
AGRICULTURA(2%)
QUIMICA Y ENERGIA (8 %)
FAR
MA
CIA
(42
%)
Otros (6 %)Vitaminas (3%)Hormonas (9%)
VacunasReactivosde diagntico (30%)
Antibiticos (52%)
-
10
MERCADO MUNDIAL DE PRODUCTOS BIOTECNOLOGICOS MERCADO MUNDIAL DE PRODUCTOS BIOTECNOLOGICOS EN 1995EN 1995
1500
3100
900 800 7001000
3000
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Mill
ones
de
dola
res
ETA
NO
L
FR
UC
TOSA
A. C
ITR
ICO
GLU
TAM
ATO
MO
NO
SOD
ICO
LISI
NA
EN
ZIM
AS
QU
IMIC
OS
FIN
OS
ORGANISMOS UNICELULARES, CENOCITICOS O ORGANISMOS UNICELULARES, CENOCITICOS O MULTICELULARES SIN DIFERENCIACIONMULTICELULARES SIN DIFERENCIACION
BACTERIAS
PROCARIOTAS
ALGAS AZUL-VERDE
MOHOS, LEVADURAS
EUCARIOTAS
PROTOZOARIOS, ALGAS
-
11
PROCARIOTA EUCARIOTA
Estructuras genticas:
nmero de cromosomas membrana nuclear DNA nuclear unido a histonas DNA en organelos
Estructura citoplasmica:
naturaleza de los ribosomas citoplsmicos naturaleza de los ribosomas de los organelos mitocondrias cloroplastos
Cantidades relativas de DNA
1
-
-
-
70s*
ninguna
-
-
-5 x 10-15 g(1)
>1
+
+
+
80s
70s
+
+ o -
3 x 10-12 0.5 x 10-12
*S=UNIDADES SVEDBERG
DIFERENCIAS ENTRE CELULAS EUCARIOTAS Y PROCARIOTAS
COMPARACION DE LAS CARACTERISTICAS DE CELULAS ECUCARIOTAS Y PROCARIOTAS
(1) Indica el tamao del RIBOSOMA, medido por la velocidad de sedimentacion en ultracentrifugacion.S = Valor Svedberg
(2) La reproduccin parasexual incluye conjugacin, transduccin y transformacin.
1
2
-
12
EUCARIOTAS:
Protistas superiores
PROCARIOTAS:
Protistas inferiores
NU
CLE
O- Membrana nuclear
- Constituido de ADN asociado a protenas (Histonas)
- Organizado en muchos cromo-somas, visibles al microscopio
al momento de la divisin
- La forma y nmero de cromosomas son caractersticos de la
especie
- Sin membrana nuclear
- Nucleo difuso en el citoplas-ma
- Constituido de ADN Casi la totalidad
del ADN celular
- Cromosoma nico
CIT
OPL
ASM
A
- Estructura compleja: retculo endoplasmtico
- Movimiento continuo
- Numerosos ribosomas, libres o sobre los sitemas membranarios
- Sin retculo endoplsmatico
- Sin movimiento
- Numerosos ribosomas, lugar de
sntesis de protenas
PAR
ED
- No est presente en todos los protistas superiores
- Rol de proteccin
- Compuesta de una red macromolecular que asegura su rigidez
y resistencia
- No contiene mucopptidos parietales: en Algas Celulosa;Hongos quitina.
- Constante en todos los protistas
inferiores
- Rol de proteccin
- Red macromolecular
- Mucopptidos o glicopep-tidos
parietales
CARACTERSTICAS DIFERENCIALES ENTRE LAS CELULAS EUCARIOTAS Y PROCARIOTAS
RE
SPIR
AC
IN - Organos especializados: Mitocondrias - No tienen mitocondrias
- Las enzimas necesarias estn localizadas a nivel de la
membrana citoplsmica y de los mesosomas
RE
PRO
DU
CC
ION
- Divisin binaria de la clula
- Divisin nuclear: mitosis
- Posible reproduccin sexual por fusin de dos
clulas, con:
- Fusin nuclear, formacin de un zigote
- Divisin nuclear: meiosi
- Divisin binaria de la clula
- Divisin nuclear: amitosis
- Fenmenos sexuales raros y diferentes:
- Conjugacin sin fusin celular
- Transferencia de material gentico de una clula a otra
- No hay divisin nuclear
FOT
OSI
NT
ESI
S
- Algas eucariotas
- Transforman la energa solar en energa qumica, en
los cloroplastos
- Algas azul-verde
- Bacterias fotosintticas
- Sin cloroplastos
- Cromatoforos
MO
VIM
IEN
TO
- Ameboide sobre un soporte rgido para eucariotas sin
pared
- Contraccin de flagelos en el medio lquido
(protozoaris-algas)
- No tienen movimiento ameboide (Pared rgida)
- Posible movimiento por contraccin de flagelos (estructura
diferencial y simple)
-
13
G R U P O T IP O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1 0
1 1
1 2
1 3
1 4
1 5
1 6
1 7
1 8
1 9
B a c te rias fo to s in t ticas
B a c te rias d es lizan tes
B a c te rias con re ve s tim ien to
B a c te rias con ye m a s o ap n d ices
E sp iro q u e ta s
B a c te rias e sp ira le s o cu rva d as
B a c ilo s y co co s G ra m -ne g a tivo s ae rob io s
B a c ilo s G ra m -n e g a tivo s a na e ro b ios fa cu lta tivo s
B a c ilo s G ra m -n e g a tivo s a na e ro b ios
C o cos y co co ba c ilo s G ra m -ne ga tivo s
C o cos G ra m -ne ga tivo s an ae ro b io s
B a c te rias G ra m -n ega tiva s q u im io lito tro fa s
B a c te rias p ro d uc to ra s d e m e ta no
C o cos G ra m -po s itivo s
C o cos y b a c ilos fo rm ad ores de e sp o ra s
B a c te rias d e m o rfo lo g a b a c ila r G ra m -p os itiva s no fo rm a d oras d e e sp o ras
A c tin o m ice tos y o rga n ism os re la c io n ado s
R iq u e ts ia s
M icop lasm a s
FAMILIAS DE BACTERIAS IMPORTANTES EN LOS PROCESOS BIOTECNOLOGICOS
Fuente: Adaptado de Bergey,s Manual of Systeniatic Bacteriology, Vol 3. J.T. Staley, Ed. Baltimore: Williams & Wilkins, (1989)
GRUPO Y FAMILIA GENERO PROCESO7. Cocos y bacilos Gram-negativos aerobiosPseudomonaceae Pseudomonas Protena de origen unicelular (SCP) a partir de
metanol, oxidacin de esteroides / hidrocarburos,polisacridos (alginatos), oxidacin de alcoholes
Mythilomonadaceae MethilomonasMethylococcus
SCP a partir de metanolOxidacin del metano
Azotobacteriaceae Azotobacter Fijacin no simbitica del nitrgeno8. Bacilos Gram-negativos anaerobios facultativosEnterobacteriaceae Escherichia Muchos procesos diferentes, produccin de
aminocidos (lisina)Aerobacter Nucletidos, cido 2-cetoglutrico, pululanasa, cido
6-aminopenicilnico, quimosina recombinante12. Bacterias Gram-negativas quimiolitotrofas
Thiobacillus Lavado de cobre, cinc, hierro, manganeso, otrossulfuros
13. Bacterias metangenasMethanenobacteriaceae
Nocardiaceae
MethanobacteriumMethanococcusNocardia
Metano a partir de afluentes
Oxidacin de hidrocarburos, esteroides
ALGUNAS BACTERIAS DE IMPORTANCIA BIOTECNOLOGICA DE ENTRE LOS 19 GRUPOS BACTERIANOS
-
14
14. Cocos Gram-positivosMicrococcaceae Micrococcus Oxidacin de hidrocarburos, cultivos iniciadores para
productos crnicosStreptococcaceae Streptococcus
(Lactococcus)Produccin de cido lctico, diacetilo; cultivosiniciadores de quesos y otros productos lcteosfermentados
Pediococcaceae PediococcusLeuconostoc
Cultivos iniciadores para productos crnicosProduccin de dextrano; cultivos iniciadores paraquesos y vino (heterofermentacin)
15. Bacilos y cocos formadores de esporasBacillaceae Bacillus Antibiticos, enzimas, aminocidos y vitaminas (B2,
B12)Clostridium Butanol, acetona, cido butrico, toxina botulnica
16. Bacterias de morfologa bacilar Gram-positivas no formadoras de esporasLactobacillaceae Lactobacillus
Bifidobacterium
cido lctico, productos lcteos fermentados,embutidos y productos vegetales fermentados;ensilado, alteracin de alimentosBifidoyogur, bifidotabletas
17. Actinomicetos y organismos relacionadosGrupo Corineforme Corynebacterium
ArthrobacterCellulomonas
Oxidacin de hidrocarburos, aminocidosTransformacin de esteroidesFermentacin de la celulosa
Propionibacteriaceae Propionibacteria Vitamina B12; cido propinico, fermentacin delqueso
Mycobacteriaceae Mycobacterium Oxidacin de hidrocarburos y esteroides
GENERO PRODUCTOS
MucorRhizopusBlakesleaChoanephoraAshbyaCryptococcusCandidaRhodotorulaSaccharomycesSaccharomycopsisTorulopsisAspergillusCephalosporiumPenicilliumFusariumGibberella
Acidos orgnicos, enzimas Acidos orgnicos, enzimas -Caroteno -Caroteno Riboflavina Riboflavina cido ctrico Lpidos Etanol, vino, cerveza Protenas cido ctrico Enzimas, antibiticos, cidos orgnicos Antibiticos Antibiticos, cidos orgnicos, enzimas Protena, grasa Sustancias semejantes a hormonas, giberelinas
ALGUNOS HONGOS DE IMPORTANCIA BIOTECNOLOGICA
-
15
Cultivo puro, libre de otros microorganismos y de fagos Capaz de producir fcilmente clulas vegetativas y esporas u otras unidades
de propagacin
Que crezca vigorosamente en el medio, una vez inoculado en los fermentadores
Que permita obtener el producto de inters en corto tiempo Que permita obtener el producto deseado, preferiblemente slo, libre de
contaminantes txicos o no, y que sea de sea de fcil purificacin
En lo posible que se proteja de la contaminacin, por ejemplo creciendo a pH cido o a alta temperatura o que produzca inhibidores de otros
microorganismos
Capaz de ser modificado con agentes mutagnicos, pero estables en ausencia de estos
Fciles de conservar durante largos periodos de tiempo
CARACTERISTICAS ESENCIALES DE LOS CARACTERISTICAS ESENCIALES DE LOS MICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIALMICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIAL
Representa la evolucin de la poblacin celular durante el cultivo. Permite caracterizar la actividad de la poblacin celular.
La velocidad de divisin de las celular.Los cambios en estado fisiolgico.
Considerando un cultivo de microorganismo realizado en condiciones ideales:
EL cultivo es de tipo discontinuo (Batch).El fermentador es infinitamente mezclado, lo que permite
obtener un sistema homogneo.
Las condiciones de cultivo (pH, Temperatura, aireacin,...) son constantes y favorables al desarrollo del microorganismo.
En estas condiciones se obtiene las curvas de crecimiento siguientes:
CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANOCURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
-
16
N = Nmero de clulas por unidad de volumen. t= Tiempo.
ESQUEMA DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE UN MICROORGANISMO EN FERMENTACION BATCH
La curva de crecimiento puede ser dividida en seis perodos, cuatro de los cuales (I,
III, V, VI) constituyen fases en las que el microorganismo se encuentra en un estado
fisiolgico particular. Los estados II y IV constituyen transiciones entre dos fase
diferentes.
I II III IV V VI
t
Log
N
A
I II III IV V VI
t
N
B
I. FASE DE LATENCIA Ocurre inmediatamente despus de la inoculacin y constituye
un periodo de adaptacin de las clulas al sustrato presente en el medio.
No hay divisin celular. La duracin del perodo de latencia depende de varios factores,
naturaleza del medio, tamao del inoculo. Si el cultivo que se va a utilizar como inoculo se encuentra
en fase logartmica, puede no existir un perodo de latencia, sin embargo si el inoculo se toma de un cultivo que se ha detenido por limitacin de un sustrato el perodo de latencia puede ser grande
II. FASE DE ACELERACION Cuando la fase de adptacin se termina, se inicia el crecimiento
y aumenta la velocidad especfica de divisin.
-
17
III. FASE LOGARITMICA
La fase de crecimiento logartmica o exponencial es el perodo durante el cual la velocidad especfica (o tasa) de crecimiento exponencial alcanza un mximo y permanece constante.
La concentracin de las clulas aumenta exponencialmente. La composicin y fisiologa de las clulas permanecen invariables. Desde un punto de vista industrial es importante, ya que esta fase est
asociada a la produccin de protenas celulares, enzimas que intervienen en la hidrlisis de macromolculas (proteasas, celulasas, amilasa, pectinasas, .....) y otros productos asociados al metabolismo primario
IV. FASE DESACELERACIN
Hay disminucin de la divisin celular por agotamiento del medio de cultivo. En efecto desaparecen una serie de compuestos necesarios para el crecimiento y eventualmente hay acumulacin de inhibidores resultantes del metabolismo microbiano (alcohol, antibiticos, ....)
V. FASE ESTACIONARIA La concentracin de las clulas alcanza su nivel mximo El crecimiento celular se detiene pero conserva buena actividad metablica Se dan cambios fisiolgicos importantes y modificaciones en la estructura
bioqumica de las clulas. El desequilibrio en la composicin del medio, conduce a la acumulacin de
productos del metabolismo (metabolitos primarios). Tambin hay produccin de metabolitos secundarios (cidos orgnicos,
antibiticos,....). Las condiciones de cultivo durante esta fase son propicias para la
diferenciacin celular, es decir la formacin de clulas con estructuras particulares (espora, conidias, .....); esta diferenciacin puede tener gran inters en bio-industrias en la produccin de clulas resistentes (Bacillus, Clostridium, Streptomyces, hongos,....).
VI. FASE DE MORTALIDAD Esta fase resulta de una autlisis de las clulas vegetativas por accin de
las propias enzimas de la clula. Siempre existe una divisin celular por consumo de la materia orgnica
liberada por las propias clulas, sin embargo la velocidad de crecimiento es inferior a la de mortalidad.
-
18
t
Log NPS S
N
P
REPRESENTACION ESQUEMATICA DE LA CURVA DE CRECIMIENTO (N), CONSUMO DE SUSTRATO (S) Y
FORMACION DE PRODUCTO (P)
Considerando un cultivo discontinuo (batch) en un reactor infinitamente mezclado, durante la fase de crecimiento exponencial se tiene:
X = Cantidad de biomasa en g de materia seca /LN = Nmero de clulas / mL = Velocidad especfica de crecimiento (h-1)T = Tiempo (h)
Con la ecuaciones anteriores se define la velocidad o tasa de crecimiento ()
d X X Xd N N Nd T
d T=
=
X X 1
dTdX
=
-
19
De la ecuaciones anteriores se deduce que:
Integrando esta ecuacin entre el tiempo T0 y T, se tiene:
La velocidad especfica de crecimiento se puede calcular grficamente a travs de la pendiente de la recta ( /2.303) o tambin usando las ecuaciones:
La tasa de crecimiento, determinada en fase exponencial donde ningn elemento nutritivo es limitante, nos da la tasa de crecimiento mxima: =max.
d X X
d T=
L n X - L n X 0 = ( T - T 0 )
L o g X - L o g X 0 ( T - T 0 )
2 .3 0 3
X = X 0 e ( T - T 0 ) =
2 . 3 0 3 ( L o g X - L o g X 0 ) T
(L n X - L n X 0 ) T=
=
La tasa de crecimiento depende del tipo de microorganismo
Depende adems de las condiciones de cultivo
Naturaleza y concentracin de sustrato. Las condiciones aireacin (microorganismos aerobios).Temperatura y pH (en ciertos casos el potencial redox y la fuerza
inica).
Las condiciones de mezcla, cuando la transferencia de materia es un factor limitante.
La presencia de inhibidores.El tiempo de generacin, que representa el tiempo necesario para que
la poblacin microbiana se duplique (ejem. de X a 2X), est dado por:
(Ln2X - Ln X)=g T = 0.693
=
-
20
Microorganismo max (h-1) g (h)Bacilus subtilisPseudomonas putidaEscherichia coliNitrosomonas spCandida tropicalisSacaromices cerevisiaeAspergillus sp.
1.701.002.300.070.700.350.53
0.40.700.3010.01.002.001.30
TASAS DE CRECIMIENTO Y TIEMPO DE TASAS DE CRECIMIENTO Y TIEMPO DE GENERACIGENERACIN DE ALGUNOS MICROORGANISMOSN DE ALGUNOS MICROORGANISMOS
Por analoga a la ecuacin de MICHAELIS MENTEN, se estableci la ecuacin de MONOD en 1949.
Suponiendo que todos los elementos nutritivos son adicionados almedio en exceso, salvo el sustrato (S) considerado factor limitante, se tiene:
= max SKS + S = Tasa o velocidad especfica de crecimiento (h-1).max = Tasa de crecimiento mxima (h-1).S = Concentracin de sustrato limitante (g/L).Ks = Constante de saturacin (g/L). Concentracin de sustrato necesaria para obtener de la tasa de crecimiento mxima
CINETICA MICROBIANA
-
21
S
max
max/2
Ks depende del microorganismo y de la naturaleza del sustrato limitante
Un valor alto de Ksindica poca afinidad por el sustrato
Un valor bajo de Ksindica alta afinidad por el sustrato
A una concentracin determinada de sus-trato: a medida que Ksaumenta, disminuye la tasa de crecimiento
S
max
max/2
Los valores de Ks son pequeos para los compuestos normalmente usados en medios de cultivo. Estos valores son del orden de 10-5-10-6 M en el caso de azcares (como glucosa) e inferiores a 10-6
M para los aminocidos y vitaminas.
VALORES DE Ks PARA DIFERENTES MICROORGANISMOSMicroorganismo Sustrato limitante Ks (M)
Echerichia sp.
Aspergillus sp.
Candida sp.
Sacharomices sp.
Pseudomonas sp.
Aspergillus sp.
Glucosa
glucosa
glicerol
glucosa
metanol
arginina
2.2 . 10-5
2.8 . 10-5
4.9 . 10-5
14.0 . 10-5
2.0 . 10-5
2.9 . 10-6
De manera general los valores de Ks explican porque los microorganismos son capaces de
purificar rpidamente los medios en un determinado compuesto. por ejemplo alcanzando
concentraciones tan bajas, del orden de 10-5 M la velocidad de crecimiento (y por tanto la
velocidad de consumo de este) disminuyen a la mitad con respecto a las condiciones de sustrato no
limitantes (generalmente del orden de 0.05 m en sustrato). Las aplicaciones en el campo de la
contaminacin se basan en esta propiedad de asimilacin de los microorganismos.
-
22
Combinando las ecuaciones de la velocidad de produccin declulas y la cintica de crecimiento
d X Xd T
=r X =
Reemplazando por la ecuacin de MONOD:rX = m a x SK S + S X
En el caso microorganismos aerobios, el oxigeno es unelemento esencial que es considerado como sustrato, por tanto
se aplica la ley de Monod.
= max [O2]K + [O2][O2 ][O2] = Concentracin de oxgeno disuelto en el medio.
K[O2] = Constante de afinidad por el oxigeno.
rX = Velocidad de produccin de clulas (g/Lh)
CINETICA DE MONOD EN SISTEMAS PARTICULARES
Inhibicin del crecimiento por el sustrato
Inhibicin del crecimiento por productos del
metabolismo
Transferencia de masa limitante
-
23
La ecuacin de Monod considera que la tasa de crecimiento es mxima ( = max) cuando el sustrato S se aporta al medio de cultivo en exceso.
Sin embargo si se aporta sustrato a altas concentraciones, principalmente azcares, molculas orgnicas (alcoholes, cidos....) y sales, puede disminuir o detenerse la divisin celular.
S
r x1 /K i C re c ie n te
CASO DE INHIBICION DEL CRECIMIENTO POR EL SUSTRATO
La siguiente ecuacin es una variante de la ecuacin de Monod que tiene en cuenta el efecto inhibidor de ciertos sustratos.
= m ax SK S + S + S n +1K i
n
Ki = Constante de inhibicin del sustrato (g/L).n, en la mayora de casos es igual a 1.
Ki es menor cuando el efecto inhibidor del sustrato es altoCuando se utilizan sustratos con un alto efecto inhibidor como
etanol, cidos orgnicos ....., es necesario realizar procesos
particulares como el cultivo fed batch..
El efecto inhibidor es importante en procesos de desconta-minacin microbiolgica como en:
Degradacin bacteriana de hidrocarburos que contaminan aguas y suelos.
Destruccin de sustancias txicas presentes en zonas contaminadas.
Tratamiento de aguas de granjas pisccolas, reduccin del contenido de amoniaco y nitrito
-
24
La divisin celular es acompaada de la sntesis de metabolitos
que son excretados y acumulados en el medio de cultivo. Algunos
de estos metabolitos que se acumulan en el medio pueden tener
un efecto inhibidor y reducir la tasa de crecimiento, este es el caso
del etanol, los cidos orgnicos, los antibiticos......
La variante de la ecuacin de Monod en este caso es:
INHIBICION DEL CRECIMIENTO POR PRODUCTOS DEL METABOLISMO
= SK S + S
= m a x f (P )D o n d e
Segn el caso de inhibicin, la funcin f, puede ser:
Lineal
Exponencial
Hiperblica
= m a x (1 - K i P )
= m ax e ( -Ki P)
= m a x 11 +
P K i
= m a x K i + P
K i
P = Concentracin del producto responsable de la inhibicin (g/L)
Ki = Constante de inhibicin asociada al producto
El caso de las fermentaciones lcticas y
alcohlicas, son dos casos tpicos de
inhibicin por los productos formados
(cido lctico y etanol). En estos casos
se da un tipo de inhibicin hiperblica:
= SK S + S m a x K i + P K i ( () )
-
25
La transferencia de materia puede constituir un factor limitante para el crecimiento y desarrollo de un microorganismo, principalmente cuando las condiciones de mezcla en el fermentador son poco eficaces (alta viscosidad, fermentadores grandes..)En condiciones de transferencia ineficiente la velocidad especfica de crecimiento () depende de:t, relacionado con la transferencia del sustrato hacia la clula.max, relacionado con el metabolismo del sustrato en la clula.
TRANSFERENCIA DE MASA LIMITANTETRANSFERENCIA DE MASA LIMITANTE
La ecuacin general de transferencia de masa est dada por:
S = Flujo de sustrato por unidad de superficie (Kg/m2 s)S = Concentracin de sustrato en el medio (Kg/m3 )SC = Concentracin de sustrato alrededor de la clula (Kg/m3 )hS = Coeficiente de transferencia de masa entre el medio de cultivo y la superficie
de la clula (m/s)
+
= 1 +
1 =
1
tmax
maxt
tmax
)S-(S h = csS
La velocidad de consumo de sustrato (rs = -(dS/dT)), es funcin del flujo de transferencia de masa (S) y la superficie de transferencia entre las clulas y el medio (AC m2/m3 ):
CSS Ar = (Kg/m3 s)
Reemplazando S en la ecuacin anterior, se tiene la ecuacin global de transferencia de sustrato entre el medio y la clula:
)SS(hAr CSCS =
La superficie celular por unidad de volumen de clulas se determina de la
siguiente manera:- Para los microorganismos esfricos (cocos y levadura....): 6/dc- Para los microorganismos bastonados (Bacillus y Clostridium....): 1/0.22dc- Para los microorganismos miceliares (hongos y Streptomyces....): 1/0.25dc
Donde dC es el dimetro medio de las clulas
En el primer caso AC est dado por: CCC
Xd
6A =Donde:
Ac= Superficie celular por unidad de volumen de cultivo (m2/m3)X = Concentracin de clulas en el medio (Kg/m3)c= Densidad de las clulas (Kg/m3)
-
26
Reemplazando Ac en la ecuacin de transferencia de masa se obtiene el consumo de sustrato:
)SS(Xd
h6Ar C
CC
SCSS ==
= rX
YS X / Sr X =
rr = Y
SS
Xx/s
)S-(S Y d
h 6 = C /SXCC
ST
La tasa de crecimiento puede representarse tambin por:
Donde YX/S, es el coeficiente de transformacin de sustrato (S) en
biomasa (X) (Kg de clulas formadas/Kg de sustrato consumido).
Reemplazando rs en la ecuacin anterior se tiene el componente
t:
)S-(S ]Y d
h 6[ +
)S-(S ]Y d h 6[
= C /SX
CC
Smax
C /SXCC
Smax
Reemplazando t en la ecuacinglobal de la tasa de crecimientose tiene:
+
= 1 +
1 =
1
tmax
maxt
tmax
Si se supone que Sc
-
27
La temperatura ejerce una influencia determinante sobre el metabolismo celular.
El crecimiento microbiano , al igual que las reacciones enzimticas, se bloquea a baja temperatura y se acelera por el aumento de este parmetro, a temperaturas altas se perturba dicho crecimiento por la alteracin de ciertos componentes (enzimas, cidos nucleicos) o estructuras celulares (membrana citoplsmica).
La tasa de crecimiento es optima en un rango estrecho de temperatura, segn esta se distingue tres categoras de microorganismos:
Sicrfilos: Tiene una temperatura optima de crecimiento prxima a los 5 C. No crecen a temperaturas mayores a los 25 C.
Mesfilos: Temperatura optima de crecimiento prxima a los 30 C. No crece a temperaturas < a 15 C y > a 45 C.
Termfilos: Se desarrollan favorablemente a temperatura prximas a los 55 C no crecen a temperaturas < a 37 C y >65 C.
INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA DEL MEDIO SOBRE EL INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA DEL MEDIO SOBRE EL CRECIMIENTOCRECIMIENTO
EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO DE DIVERSOS MICROORGANISMOSDE DIVERSOS MICROORGANISMOS
TEMPERATURA (C)MICROORGANISMO
Mnima Optima Mxima
Bacillus subtilis
Escherichia coli
Lactobacillus casei
L. termfilus
Nitrobacter sp.
Pseudomonas aeruginosa
Streptococus pirogenes
Streptomices termofilus
Candida parapsilosis
Sacaromices cerevisiae
Aspergillus niger
Btritis cinera
Rizopus sp.
15
10
10
30
-
0
15
20
0
0-5
-
0
7
30-37
30-37
28-30
50-63
25-28
37
37
40-45
20-25
28-36
37
20-25
25-30
55
45
40
65
-
42
40
50
30
40-42
-
28
max = A exp H1* ER ( )
LA ECUACILA ECUACIN DE ARRHENIUSN DE ARRHENIUSEl crecimiento microbiano es debido a un conjunto de reacciones enzimticas, donde una de ellas limita al complejo. Esta reaccin limitante determina la tasa de crecimiento mxima. La dependencia de la tasa de crecimiento de la temperatura se establece por analoga a la cintica enzimtica a travs de la relacin de ARRHENIUS:
E = Fraccin msica de la enzima especfica referida a la biomasa H1* = Entalpa de activacin de la reaccin limitante (Kj / mol)A = Constante (h-1)R = Constante universal de los gases ( 0.00831 Kj K / mol)T = Temperatura absoluta (K)
Esta expresin es valida en una rango estrecho de temperatura, prximo a la temperatura optima de crecimiento.
Diferentes modelos se han propuesto para evaluar la influencia dDiferentes modelos se han propuesto para evaluar la influencia de e la temperatura sobre el crecimiento de las cla temperatura sobre el crecimiento de las clulas. A continuacilulas. A continuacin n
dos de ellosdos de ellos
K exp H 2R ( )I = A
A = 1 + K e x p
H 2 R ( )
1
m a x = A ex p H 1* E R ( ) A
m a x = A e x p H 1 * E
R ( )1 + K e x p
H 2 R ( )
La ecuacin de Arrhnius se puede modificar, de manera que se pueda aplicar a un rango muy grande de temperatura. Para esto se supone que la enzima que limita el crecimiento puede existir sobre dos configuraciones distintas: una forma activa y otra inactiva. El equilibrio de estas dos formas depende de la temperatura y puede ser formulado como sigue:
I = Fraccin de la enzima inactivaA = Fraccin de la enzima activaK = ConstanteH2 = Entalpa de inactivacin (Kj / mol)
Por definicin: A + I = 1, considerando esto enla ecuacin anterior queda:
Considerando la fraccin de enzima activa enla ecuacin de Arrhnius, se tiene:
Reemplazando A en la ecuacin precedente setiene la expresin general de tasa de crecimientomxima:
GENERALIZACION DE LA ECUACION DE ARRHENIUS
-
29
Esta ltima relacin se representa en la siguiente figura:
EFECTO DE LA TEMPERATURA DE INCUBACION SOBRE LA TASA DE CRECIMIENTO MAXIMA DE UN MICROORGANISMO MESOFILO
10 20 30 40 50
maxCurva de activacin
Curva de inactivacin
T (C)
T1
R*H)AE(LnLn 1max
=
A =1 + K exp H2
R ( )1
max = A exp H1 * E
R ( )1 + K exp H2
R ( )
=
1*H
H.KLn.R
H)optima(T
1
2
2
Linearizando la ecuacin de Arrhenius,se tiene:Donde -H1*/ R representa la pendiente de la recta semilogartmica.
Los valores de H1 * encontrados en la literatura estn comprendidos entre 45 y 130 Kj/mol.
Los valores de H2 se puedencalcular a partir de la ecuacin:
Los valores de H2 reportados en laliteratura, se encuentran entre 188 y388 Kj/mol
Encontrados los valores de cambioen las entalpas se puede encontrarla temperatura optima de crecimientode la siguiente manera:
(dmax/dT) = 0, se obtiene
-
30
La tasa de crecimiento de un microorganismo dado, en ciertas condiciones toma un valor mximo para un pH o una zona de pH optima.
Las bacterias son generalmente neutrfilas, es decir crecen mejor a pH prximo a 7. Algunas de ellas que tienen metabolismo acidgeno (produccin
de cidos orgnicos por vas metablicas: cido lctico, actico,...) crecen
bien a pH 3. Algunas de ellas que oxidan los compuestos azufrados en
sulfatos (thiobacillus) bajan el pH a 1.
Las levaduras y hongos se desarrollan bien en una amplia zona de pH comprendida entre 3 y 8
La constante Ks no es afectada significativamente por el pH ni la temperatura.
INFLUENCIA DEL pH DEL MEDIO DE CULTIVO SOBRE EL CRECIMIENTO INFLUENCIA DEL pH DEL MEDIO DE CULTIVO SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANOMICROBIANO
EVOLUCION DE LA TASA DE CRECIMIENTO EN FUNCION DEL pH PARA LA MAYORA DE BACTERIAS
4 7 1 0 p H
m a x
En la literatura se reportan diversas ecuaciones que relacionan la tasa de crecimiento con el pH. La ms utilizada es la ecuacin polinomial siguiente:
max = a (pH)2 + b (pH) + c.
En la figura se representa dicha ecuacin
Donde a, b y c son constantes
Las constantes a, b y c se encuentran con medidas experimentales. El pH optimo se encuentra igualando la primera derivada de la ecuacin
anterior a 0:
d(max/pH) = 0 pH (optimo) = -b / 2a
-
31
dTdPr P =
En muchos procesos de fermentacin nos interesa la produccin de un metabolito determinado.
El seguimiento de estos procesos se hace a travs de la evolucin de la concentracin del producto formado.
En paralelo a la determinacin de la curva de crecimiento celular se traza la curva del producto formado (P, en g/L).
La velocidad de produccin se determina, en cualquier momento a partir dicha curva:
rp = Velocidad de produccin (g/L de medio . h)P = Producto formado (g/L)T = Tiempo (h)
CINETICA DE PRODUCCION DE METABOLITOS
dTdP
X1
Xr
..........XdTdPr pP ====
TtotalP=DADPRODUCTIVI f
De la misma manera que la velocidad especfica de crecimiento (), se define la velocidad especfica de produccin del metabolito como:
= Velocidad especfica de produccin del metabolito (g/g de biomasa . h)
En industria de fermentacin se utiliza la nocin de productividad orendimiento horario, que se define como la relacin entre la cantidad de producto obtenido y la duracin total del ciclo de produccin.
Donde:Pf = Concentracin de producto final (g/L de medio)Ttotal = Duracin total del proceso (h).
En un proceso batch la duracin total (Ttotal) se determina como:Ttotal = TN + TR + TS +TC +TV
TN = tiempo de lavado del fermentadorTR = tiempo de llenado de fermentadorTS = tiempo de esterilizacinTC = tiempo de cultivoTV = tiempo de vaciado del fermentador
-
32
La productividad permite evaluar el proceso de fermentacin: sirve para estudiar la rentabilidad y dimensionamiento de la instalacin.
La tendencia de la curva de produccin de metabolitos depende de la curva de crecimiento. La relacin existente entre las dos curvas vara de un metabolito a otro segn:
Su naturaleza Su lugar en la actividad bioqumica celular Los mecanismos de las reacciones metablicas que lo
originan.
La clasificacin de Gaden de 1955 distingue tres tipos de metabolitos
Metabolitos de primer tipoMetabolitos de segundo tipometabolitos de tercer tipo
t
Log XX
P
PS S
t
Log XX
P
PS S
t
Log XX
P
PS S
Metabolitos de primer tipo: la sntesis est ligada directamente al crecimiento de las clulas y por lo tanto al metabolismo del sustrato principal (S).
Metabolitos de segundo tipo: tambin estn ligados al crecimiento celular, pero son diferentes en el tiempo con respecto a la degradacin del sustrato.
Metabolitos de tercer tipo: No estn ligados al crecimiento ni al catabolismo del sustrato principal.
-
33
dTdXY
dTdP
dTdX
dTdP
S/P==
Los productos del primer y segundo tipo provienen del metabolismo primario, estn constituidos por compuestos esenciales al metabolismo de sntesis de
los constituyentes de la clula:Ejemplos: Primer tipo produccin de etanol (Fermentacin alcohlica)
Segundo tipo produccin de cido lctico (fermentacin lctica)
Primer o segundo tipo, excrecin de enzimas
Primer tipo produccin de aminocidos
Los productos del tercer tipo provienen del metabolismo secundario y no son esenciales para el crecimiento celular.
El estudio de la cintica de produccin de metabolitos consiste en establecer las relaciones matemticas (modelos) que caracterizan la curva de produccin.
La velocidad produccin de metabolitos de primer tipo ligada al crecimiento microbiano:
YP/x = Cantidad de metabolito producido por unidad de biomasa
(g de producto / g de clulas).
X+dTdX
dTdP =
P-X+dTdX
dTdP n=
La velocidad de produccin de metabolitosde segundo tipo, parcialmente ligado
al crecimiento , se representa por:
Cuando hay inhibicin como conse-cuencia del aumento de metabolitosen el medio se utiliza:
, y son parmetros que dependen de las condiciones de cultivo es decir:Son parmetros que dependen de las condiciones de cultivo:
= 1 (pH, T, [O2 ],......) = 2 (pH, T, [O2 ],......) = 3 (pH, T, [O2 ],......)
En lo que concierne a los metabolitos del tercer tipo (metabolitos secundarios), las ecuaciones muy complejas y establecidas empricamente.
-
34
El aumento de la poblacin microbiana resulta de la reproduccin de las clulas.
Los organismos unicelulares como las bacterias y levaduras se reproducen por fisin celular (reproduccin asexual).
Las dos clulas bacterianas resultantes de la fisin son idnticas. sin embargo algunas levaduras pueden dar lugar a dos clulas diferentes (clula madre y clula hija), lo que conduce a una poblacin heterognea.
Los hongos, bacterias y levaduras filamentosas, crecen alargamiento y ramificacin. de acuerdo a las condiciones del medio se puede formar micelio difuso o pellet.
El comportamiento de la poblacin microbiana debe considerarse para seleccionar una tcnica de medicin de la biomasa.
TECNICAS PARA DETERMINAR POBLACION TECNICAS PARA DETERMINAR POBLACION MICROBIANAMICROBIANA
Existen diversas tcnicas para determinar biomasa, sin embargo ninguna de ellas es aplicable a todos los casos y los resultados que se obtienen no son totalmente satisfactorios ya que probablemente estn sujetos a errores
y posibles interferencias.
Los mtodos se clasifican en dos categoras:
DIRECTOS: Determinan la concentracin de clulas presentes en el medio, se aplican en el caso de levaduras y bacterias no filamentosas.
INDIRECTOS: Utilizan indicadores bioqumicos relacionados con el aumento de la biomasa (constituyentes celulares) o propiedades asociadas al crecimiento (consumo de oxigeno, aumento de la viscosidad.....).
Se emplean cuando los mtodos directos no son aplicables (microorg. filamentosos) o cuando se desea simplificar la determinacin con el objetivo de una automatizacin. Es necesario establecer una correlacin adecuada entre la biomasa y el parmetro considerado.
-
35
Las clulas se cuentan en un microscopio con la ayuda de una clula de numeracin. Existen diferentes tipos de clulas de numeracin:
La eleccin de un tipo de clula de numeracin depender del tamao de microorganismo. Entre los tamaos promedio de los diferentes microorganismos se tiene:
Algas unicelulares....................> 20 m.Levaduras................................. 8 10 mBacterias....................................1 4 m
RECUENTO EN MICROSCOPIORECUENTO EN MICROSCOPIO
Ventajas y desventajas del recuento en Ventajas y desventajas del recuento en microscmicroscpiopioVentajas Desventajas
Mtodo simple y rpido Resultados inmediatos
Difcil de utilizar en caso de clulas pequeas(
-
36
La suspensin celular se inocula sobre placas Petri que contienen un medio cuya composicin tiene agar y otros elementos que favorecen
el desarrollo de los microorganismos.
Se incuba a la temperatura optima de crecimiento del microorganismo y se cuentan las colonias despus de 24 48 horas.
RECUENTO EN AGARRECUENTO EN AGAR
VENTAJAS DESVENTAJAS
Solo se enumera las clulasvivas
No hay problema por slidossolubles en el medio
Puede ser utilizada para toda lagama de concentraciones
celulares (a condicin de utilizar
diluciones adecuadas)
Requiere de tiempo prolongado ygran cantidad de material (placas con
agar, tubos de dilucin,...)
Resultados por defecto cuandoexisten clulas asociadas
Riesgo de imprecisin por lapreparacin de numerosas diluciones
No utilizable para microorganismosfilamentosos
La biomasa se recupera por centrifugacin o filtracin, se lava con agua destilada para eliminar los slidos retenidos entre las clulas y se seca a 105 C hasta peso constante.
DETERMINACION DE LA MATERIA SECADETERMINACION DE LA MATERIA SECA
VENTAJAS DESVENTAJAS
Mtodo riguroso
Tcnica simple y fcil de utilizar
Utilizable para microorganismosfilamentosos
No permite distinguir clulas vivas declulas muertas
Poco reproducible a bajasconcentraciones celulares
No utilizable en para medios conmaterial insoluble
No permite un resultado inmediato(secado +- 24h)
Resultados por defecto debido aperdidas durante la separacin y
secado
-
37
Se basa en la dispersin de un rayo luminosos debido a las partculas en suspensin.
En este caso se establece una relacin entre la DO y la materia seca (g/l).
En la zona lineal se puede escribir la siguiente ecuacin:
DO= densidad ptica = coeficiente de turbidez(l/g cm)l = ancho de la clula de medicin (cm)X = concentracin de biomasa (g/l)
El coeficiente de turbidez depende de: La longitud de onda elegida (generalmente
se trabaja entre 500 y 700 nm). De la forma y la talla (estado fisiolgico)
del microorganismo.
TURBIDIMETRIA (DETERMINACION OPTICA)TURBIDIMETRIA (DETERMINACION OPTICA)
DO= l X
DO
X(g/L)
CORRELALINEAL.
PARA UNA LOGINTUDDE ONDA DETERMINADA
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA TURBIDIMETRIATURBIDIMETRIA
Ventajas Desventajas
Tcnica simple y fcilde utilizar
Mtodo rpido y deresultados inmediatos
Posible uso enautomatizacin
Mtodo no destructivo
No permite diferenciar clulas muertas declulas vivas
Las medidas son sensibles a los cambiosfisiolgicos del las clulas
Es necesario establecer una curva decalibracin de materia seca
No utilizable en medios que contienenmaterial insoluble o emulsiones
Es necesario suspensiones homogneas No utilizable para microorganismos
filamentosos
-
38
Dentro y fuera de un tubo, que contiene un orificio calibrado, se encuentran dos electrodos de platino inmersos en un electrolito.
Se aplica una tensin continua en los bornes de los electrodos. Las clulas pasan a travs del orificio, gracias a una aspiracin, y desplazan
un volumen de electrolito igual a su propio volumen.
RECUENTO ELECTRONICORECUENTO ELECTRONICO
Esto genera un impulso elctrico cuya amplitud es proporcional al volumen de la clula.
Permite numerar hasta 5000 clulas /s, adems permite diferenciarlas segn su volumen. los resultados se presentan en una curva de distribucin de tamaos
Es importante para las levaduras ya que adems de numerarlas permite dimensionarlas
Electrodos
Clulas
Dispositivode medida
Electroltos
Vaco
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL RECUENTO VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL RECUENTO ELECTRONICOELECTRONICO
Ventajas Desventajas
Mtodo rpido Resultados instant-
neos
Tcnica sofisticada No permite diferenciar clulas vivas de
clulas muertas
Resultados por defecto cuando hay clulasasociadas
No aplicable en medios con partculasinsolubles
Riesgos de obstruccin del orificiocalibrado
-
39
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS METODOS VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS METODOS INDIRECTOS INDIRECTOS
Mtodo Ventajas Desventajas
Determinacin de
protenas Se utiliza para todos los microorganismos Tcnica simple y rpida
No permite diferenciar clulasvivas de clulas muertas
Interferencia con las protenas delmedio
Determinacin de
ADN Se utiliza para todos los microorganismos Est ausente en el medio de cultivo
Tcnica difcil y costosa No permite diferenciar clulas
vivas de clulas muertas
ATP- Se utiliza para todos los microorganismos Ningn riesgo de interferencia con el medio de
cultivo
Mtodo rpido y simple Se distingue clulas muertas de clulas viva
Tcnica costosa Resultados influenciados por el
estado fisiolgico de las clulas*
NADH por fluorimetra Se utiliza para todos los microorganismos
Ningn riesgo de interferencia con el medio
de cultivo
Mtodo rpido y simple
Se puede utilizar para medidas en lnea
Se distingue clulas muertas de clulas viva
Tcnica sofisticada
Resultados influenciados por el estado
fisiolgico de las clulas*
Determinacin de una
actividad enzimtica
Se utiliza para todos los microorganismos
Ningn riesgo de interferencia con el medio
de cultivo
Mtodo rpido y simple
Mtodo aproximado y poco
reproducible
Algunas interferencias debido a las
clulas muertas
Resultados influenciados por el estado
fisiolgico*
Consumo de sustrato y
variacin Parmetros
del cultivo
Utilizable para determinaciones en lnea. Mtodo de estimaciones groseras
-
40
Se puede distinguir , sobre la base de la tcnica de
alimentacin de sustrato, diferentes principios de cultivo en
fermentador.
Cultivo "Batch" (Sistema cerrado): Es la tcnica ms simple
donde la totalidad de elementos nutritivos estn presentes en
el medio de cultivos antes de la inoculacin. Ningn elemento
MODELIZACION DE CULTIVOS EN MODELIZACION DE CULTIVOS EN FERMENTADOR FERMENTADOR FERMENTADORFERMENTADOR
esencial es adicionado durante el cultivo.
Las clulas se desarrollan hasta agotar
completamente los sustratos del medio o
sufrir inhibicin por los productos de
reaccin.
El ciclo de produccin en el cultivo discontinuo o "batch" consta de las siguientes etapas:
Llenado del fermentador con el medio de cultivo completo Esterilizacin del fermentador y del medio Inoculacin del fermentador Perodo de cultivo con agotamiento del medio Recoleccin de la biomasa y/o del medio conteniendo uno o ms metabolitos Lavado del fermentador
Cultivo "Feed batch" (Sistema semi-abierto) : Se procede a un aporte progresivo de sustrato al medio de cultivo, con el objetivo de mantener constante la concentracin de un sustrato esencial (ejemplo : fuente de carbono) o fragmentar el aporte de este de manera que se evite riesgos de inhibicin.
Cultivo contnuo (Sistema abierto) : Se aade solucin nutritiva estril continuamente al bioreactor y se retira una cantidad estril equivalente de solucin utilizada de los nutrientes con microorganismos. Se mantiene constante el volumen en el reactor.
-
41
SKS
Smax +=
XSK
Sr ......SK
S........XdTdX
dTdXr
dTVr=VdX dTdXr
SmaxX
SmaxX
XX
+=+===
=
V, S, X
Hiptesis:El fermentador es infinitamente mezclado (homogneo)No hay mortalidad celular.No hay formacin de producto.El nico sustrato limitante es la fuente de carbono.Se aporta oxgeno en exceso.
En estas condiciones se aplica la ecuacin de Monod:
V = Volumen de cultivo (m3)S = Concentracin de sustrato limitante (g/L), con una variacin de S0 a SfX = Concentracin de biomasa (g/L), con una variacin de X0 a Xf.
X y S son medidos durante el cultivo; mientras max y Ksson parmetros caractersticos de las cepas. Estos sonconstantes si las condiciones no se alteran durante la fermentacin.
MODELO DE CULTIVO EN MODELO DE CULTIVO EN BATCHBATCH
S
XS/XS
S/X
XS r
rY ..Siendo,..........XmY
rdTdSr =+==
El consumo de sustrato se expresa de la siguientes manera:
rS = Velocidad de consumo de sustrato (g/L h)
rX = Velocidad de produccin de biomasa (g/L h)
YX/S = Coeficiente o rendimiento de conversin de sustrato
en biomasa (g de biomasa/ g de sustrato).
mS = Constante de mantenimiento (g de sustrato/g clulas.h)
mS =Representa la velocidad de consumo de sustrato que proporciona la energa indispensable para mantener una actividad metablica mnima de las clulas cuya divisin se ha detenido.
mSx =Representa el consumo total de sustrato para mantener la biomasa (g de sustrato/L.)
-
42
Es un cultivo discontinuo que es alimentado en elementos nutritivos durante la fermentacin (sistema semi-abierto).
Estos elementos nutritivos pueden ser la fuente de carbono, ciertos precursores o el medio completo, ..... .
La alimentacin puede ser intermitente o continua y de flujo constante o variable.
El cultivo fed batch se utiliza en la produccin de biomasa, aminocidos, cidos orgnicos, alcoholes y algunas enzimas
Es importante en el caso de sustratosinhibidores, cuando hay represincatablica o efecto glucosa
MODELO DE CULTIVO MODELO DE CULTIVO FED BATCHFED BATCH
V PS X
Q, Sa
VoVF
V=Volumen de cultivo en el fermentador (L)
Q= Flujo o caudal de alimentacin (L/h)
Sa=Concentracin de sustrato limi-tante en la alimentacin (g/L).
EMPLEO DE LA FERMENTACION EMPLEO DE LA FERMENTACION FED BATCHFED BATCH EN LA EN LA PRODUCCION DE METABOLITOSPRODUCCION DE METABOLITOS
Se utiliza en el caso de metaboltos no asociados al crecimiento de las clulas (segundo y tercer tipo)
Las condiciones de sntesis del producto no son compatibles con el crecimiento de las clulas
Sin embargo se requiere alta concertacin de biomasa para lograr la sntesis de gran cantidad de producto
Una solucin frecuentementeutilizada consiste en realizar
la fermentacin en dos perodos:
primero un perodo de crecimiento
seguido de un periodo de produccin
del metabolto
PERIODO DE CRECIMIENTO PERIODO DE PRODUCCION
X
PV
T(h)
X, P
, V
Batch Fed-batch
XP
-
43
XmY
r =r rdTdS
X+SK
S= r rdTdX
SS/X
XSS
S
maxXX
+=
=
HIPOTESIS:
No hay mortalidad celular. Se aporta oxgeno en exceso La fuente de carbono es el sustrato limitante Los otros nutrientes se aportan en cantidades suficientes
La mayor parte de las ecuaciones utilizadas para los cultivos batch, se aplican al periodo fed-batch.
Periodo de crecimiento (batch): V= cteSe utiliza las siguientes ecuaciones
Periodo de produccin del metabolto (fed batch)
0dTdV ConstanteV >
La poblacin total de clulas en el fermentador permanece constante:V X = Constante (g)
El incremento en clulas es nulo:
La variacin de la concentracin de biomasa depende de la dilucin por adicin de sustrato:
Balances de masa en el proceso:S 0 : Durante el cultivo fed-batch el sustrato es completamente consumido a
medida que se va adicionando.V0 (V = V0 ) : Volumen del medio de cultivo al inicio de la produccinVF (V < VF ) :Volumen al final de la produccin XP: Concentracin de las clulas al inicio del periodo de produccin
o)crecimient hay (no 0=r con .... 0dT
)VX(dX=
VX
dTdV
dTdX =
BALANCE DE BIOMASA:
-
44
)VS
dTdV(
)VSaQ(
VSaQ
VS
dTdVr
dTdS
S +=
La variacin de la concentracin de sustrato en el fermentador depende de:La velocidad de consumo de sustrato por la clula (rS)La dilucin del medio por la adicin de sustrato:El aporte de sustrato al fermentador: Con estas consideraciones la variacin en la concentracin de sustrato est
dada por:
Considerando que la concentracin en sustrato permanece constante y prxima a 0 (S 0), la ecuacin anterior se reduce a :
BALANCE DE SUSTRATOBALANCE DE SUSTRATO
)VP
dTdV(
Xr con VP
dTdVr
dTdP
PP ==
La variacin en la concentracin del metabolito depende de:La velocidad de produccin est dada por rpLa dilucin del producto por la adicin de sustrato, est dada por
BALANCE DE PRODUCTOBALANCE DE PRODUCTO
Constante)=(Q QdTdV =Adems ,
VSaQ
VS
dTdVr
dTdS
S +=
CONSIDERANDO LA MORTALIDAD CELULAR:
Kd: Es la tasa de mortalidad celular (h-1)
La mortalidad celular tiene un efecto sobre la amplitud de la fase de produccin, pero no afecta la concentracin final de producto. Por tanto slo la productividad global del proceso es afectada.
En resumen:Las ecuaciones del periodo de
produccin de metabolitos de uncultivo fed batch son:
En el periodo de crecimiento(correspondiente al cultivo batch),se tiene:
En el periodo de produccin se tiene:YP/S: Rendimiento de conversin de sustrato en producto (g de
producto/g de sustrato)
VXQXKr
dTdX
dX ==
( )XrPVPQr
dtdP
0dtdS
VSaQr
0dtdX0r
P
S
X
==
==
==
XmY
rr SS/P
PS +=
XmY
rr SS/X
XS +=
-
45
EMPLEO DE LA FERMENTACIN FED BATCH EN LA PRODUCCION DE BIOMASA
Las hiptesis son similares a las mencionadas para la produccin de metabolitos:
Presenta tambin dos perodos: Perodo de cultivo batch que corresponde a la constitucin celular (pie de cuva) Perodo de cultivo fed-batch donde se procede al aporte progresivo de sustrato.
Las ecuaciones para el periodo batch se vieron anteriormente y para el periodo fed batch son las siguientes:
PARA LA BIOMASA
La variacin de la concentracin de clulas depende de lo siguiente:
Velocidad de divisin celular (rX)
La dilucin de las clulas en el medio
PARA EL SUSTRTATO
PARA EL VOLUMEN
VX
dTdV
XVQX
VX
dTdVr
dTdX
X ==
VSa
dTdV
VS
dTdVr
dTdS
S += [ ] SS rSSaVQ
VSaQ
VSQr
dTdS =+=
QdTdV = Variacin del volumen de V0 a VfCaudal variable de Qmin a Qmax
Caso de un sustrato inhibidorLa alimentacin (Q) se efecta de tal manera que se mantenga la concentracin en sustrato (S) por debajo de un valor crtico. La instalacin consta de un sistema de medicin en lnea de dicho sustrato. El equipo ajusta continuamente el flujo de alimentacin (Q) de manera que la concentracin (S) se mantenga por debajo del valor crtico. [ ]
SKSyX
VQX
dtdX
biomasalaPara
XmY
rr
rSSaVQ.........0
dTdS.......constante. =S
Smax
SS/X
XS
S
+==
+=
==
INICIO DE LAALIMENTACION
S=CONSTANTE
PIE
DE
CU
VA
S
T0 T0
INICIO DE LAALIMENTACION
X
T0 T0
PIE
DE
CU
VA
-
46
Caso de una levadura (ejm. Sacharomices cerevisiae) sensible al efecto glucosa:En este caso el fermentador es alimentado por una solucin concentrada de glucosa (Sa) en funcin de un parmetro que caracteriza el estado fisiolgico de la levadura. El parmetro elegido es el cociente respiratorio (QR), que se define como la cantidad de CO2 producido por la levadura y la cantidad de oxgeno consumido. QR debe estar prximo a 1 para un buen funcionamiento del fermentador
Si QR > 1... El regulador disminuye la alimentacin de glucosa
Si QR = 1... El regulador mantiene constante la alimentacin de glucosa
Si QR < 1... El regulador aumenta la alimentacin de glucosa
VENTAJAS DEL CULTIVO VENTAJAS DEL CULTIVO FEDFED--BATCHBATCH
Permite la utilizacin de sustratos que a cierta concentracin inhiben el crecimiento celular. Ejemplo hidrocarburos, etanol, ....
Aumenta la concentracin de biomasa y la productividad, respecto a la produccin batch.
Favorece un metabolismo en detrimento de otro (fermentacin o respiracin).
La produccin de metaboltos asociados a la fase estacionaria gracias a la modulacin del aporte de un sustrato (antibiticos, hormonas, enzimas).
Un cultivo fed-batch presenta menos riesgos de contaminacin y mutacin que el cultivo continuo.
Un cultivo fed-batch necesita de un sistema de regulacin y de control ms costoso que en modo batch y adems es ms difcil de poner a punto.
-
47
PRODUCTO TIPO DE ADICION
LevaduraGlicerolAcetona y butanolRiboflavinaPenicilinaProteasasNovobiocinaAcido glutmicoGriseofulvinaRifamicinaGiberelinaVitamina B12TetraciclinaAcido ctricoLisinaProtena unicelularEstreptomicina
Melaza, fuente de N, P y MgAzcar, carbonato de NaMostoCarbohidratosGlucosa y amonioGlucosa e hidrolizado de caseinaVarias fuentes de C y NAmonioCarbohidratosGlucosa, cidos grasosGlucosaGlucosaGlucosaCarbohidrato y amonioEtanol y urea; etanol y amonioMetanolGlucosa y amonio
PROCESOS EN LOS QUE SE HA UTILIZADO LA PROCESOS EN LOS QUE SE HA UTILIZADO LA FERMENTACION FERMENTACION FEDFED--BATCHBATCH
Se trata de un sistema abierto donde se aade continuamente solucin de nutrientes y se retira una cantidad equivalente de suspensin celular (medio utilizado + clulas). De esta manera el volumen de medio en el fermentador permanece constante.
Se caracteriza por establecer un estado estacionario (estable) permaneciendo todas las condiciones constantes (medio en que se encuentran las clulas, poblacin celular y estado fisiolgico).
CULTIVO CONTINUOCULTIVO CONTINUO
V: Volumen de cultivo en el fermentador (L)Q: Caudal de alimentacin (L/h)Sa: Concentracin en sustrato limitante (g/L).
Generalmente (dV/dt)=0Qa = Qs = Q
V
P
S
X
Qa, Sa
V
Qs, X,S, P
-
48
Ejemplo:Ejemplo: si D = 0.5 h-1, significa que el caudal de alimentacin es tal que en una hora se renueva la mitad del volumen del fermentador. En este caso el tiempo de permanencia es de 2 horas.
La concentracin de biomasa (X), de sustrato (S) y de producto (P) dependen del caudal de alimentacin (Q) y por tanto de la tasa de dilucin (D):
BALANCE DE BIOMASACambio neto en la biomasa = Crecimiento - salida
X)D(DXXDXrdTdX
X ===
La tasa de dilucin est dada por:
El tiempo de permanencia del medio en el fermentador est dado por:
(h) D1
QV ==
)(h VQ D 1-=
Una fermentacin continua se inicia con un cultivo en batch, el que continua hasta que las clulas alcancen una concentracin o estado fisiolgico dado. Luego se empieza la fermentacin continua propiamente dicha.
El cultivo continuo se diferencia del cultivo batch o fed-batch por una alimentacin continua de sustrato y retiro de una cantidad equivalente de suspencin celular, manteniendo constante el volumen en el fermentador
BALANCE DE SUSTRATO
Cambio neto en la concentracin de sustrato = Entra - Sale - Consumo
BALANCE DE PRODUCTO
SS rD)SSa(rDSDSadTdS ==
DPrdTdP
P =
-
49
DDcDmax
DX
S
X
g
Sa
00
En un cultivo continuo la evolucin de la biomasa, sustrato y
producto depende de la tasa de
dilucin D.Dmax: Tasa de dilucin correspondiente a la productividad mxima.Dc: Tasa de dilucin crtica. Dc=max
S
XX 0
S S a
B AT CH CO N T IN U A D > D C
SX
T
Siempre D < Dc.
En efecto si D >Dc o D > D max
La concentracin de cae hasta desaparecer y ser
reemplazada por medio fresco. Entonces se
dice que se ha lavado completamente el
cultivo.
( ) 0dTdX........XD
dTdX...max.......>D >>=
So)D(SartantoloPor
SaSoconrSo)D(SadTdS
S
S
>>=
(dX/dt) >>> 0, que significa que la biomasa
aumenta rpidamente
(dS/dt)
-
50
LnX
T
Xeq
Seq
Batch Quimiostato
Inicio de laalimentacin
< max
En el caso del quimiostato la tasa de crecimiento alcanzada en el equilibrio eq < max, es el resultado de una concentracin limitante en sustrato Seq. Es entonces la concentracin en sustrato limitante en el equilibrio lo que controla el cultivo continuo.
El nombre quimiostato se debe a que el estado estacionario resulta de la accin limtante de un elemento qumico
QUIMIOSTATOQUIMIOSTATO
( )D < max... .. . . . . . dXdT
= >D X dXdT
...... . . 0
SE INCREMENTA LA BIOMASA: XXeq; SSeq eq
ESTABLECIMIENTO DEL EQUILIBRIO EN UN CULTIVO CONTINUO TIPO
QUIMIOSTATO
El Cultivo es controlado por la concentracin en sustrato. En efecto la estabilidad del sistema se basa en la limitacin de la tasa de
crecimiento por la concentracin en sustrato limitante (C, N, P, S,
O2.....).
Al iniciar el quimiostato los parmetros de cultivo varan hasta alcanzar el estado estacionario (equilibrio).
El estado estacionario resulta de la accin limitante de un elemento qumico del medio de cultivo (sustrato limitante).
Consideremos un modelo simple con un slo sustrato limitante (fuente de carbono) el oxgeno se aporta en exceso y la mortalidad celular es despreciable. En estas
condiciones:
X = Xeq (concentracin de biomasa en el equilibrio)
S = Seq (concentracin de sustrato en el equilibrio)
-
51
En equilibrio se aplican las siguientes ecuaciones:En equilibrio se aplican las siguientes ecuaciones:
0DSaDSrdTdS
0DXXdTdX
S =+=
==
+
=+=+=
+=
SX/S
SX/S
SX/S
X
SX/S
XS
S
mY
DXeq
XeqmYDXeqXeqm
Yr
Seq)D(Sa
XeqmY
r=r
rSeq)D(Sa
XeqY D
D m YSa SeqX S
S X S
= + /
/
( )
DmaxDK
Seq..........SeqK
SeqmaxD
D= .....equilibrio el ........en SK
Smax
S
S
S
=+=
+=
La concentracin de sustrato limitante en el equilibrio, depende nicamente de la tasa de dilucin {Seq = KS (D/max-D)}. Es independiente de la concentracin del sustrato limitante en la alimentacin (Sa). Como KS, es muy pequea, Seq ser muy pequea cuando D
-
52
Considerando que Seq es muy pequea (Seq
-
53
La tasa de dilucin se puede elegir de tal manera que se igual a a tasa de crecimiento
mxima : D = max
.cteXoXquePuesto0X)D(dTdX
max ====
En estas condiciones el sustrato no es un factor limitante y la concentracin de clulas en el equilibrio puede elegirse
arbitrariamente.
En trminos generales, en el quimiostato la tasa de crecimiento () es controlada por la tasa de dilucin (D) que mantiene la concentracin
en sustrato limitante constante.
En el turbidostato, la concentracin en biomasa (X) es con frecuencia controlada a travs de la regulacin de la tasa de dilucin.
TURBIDOSTATOTURBIDOSTATO
Se basa en mantener constante la concentracin celular (turbidez).
Las variaciones en la turbidez indican modificacin de la biomasa y se miden gracias a un dispositivo ptico alimentado por una bomba..
De esta forma al biomasa requerida se mantiene constante regulando la tasa de dilucin (D).
El turbidostato contiene en exceso todos los elementos nutritivos y el microorganismo crece con una tasa prxima a max.
El turbidostato es menos empleado que el quimiostato, debido a la dificultad de medir la turbidez en fermentadores de paredes opacas. Actualmente se
emplean mtodos indirectos como la produccin de CO2 el consumo de O2que responden a los cambios ocurridos en la poblacin microbiana.
-
54
LnX
T
X
Batch
INICIO DE LAALIMENTACION
3 TU
RB
IDO
STA
TOS
DIF
EREN
TES
=max1
2
3
Como el cultivo est en fase de crecimiento exponencial:
La tasa de dilucin se elige de tal manera que esta sea igual igual a max
( )
D= =
0=D-
xma
max
== 0XD
dTdX
TASA DE
DILUCION
TIPO DE CULTIVO
CONTINUO
EVOLUCION DE LOS
PARAMETROS
D > max LavadoX--0S--Sa
D < max Quimiostato
X ---- XeqS----- Seq
-- eq = D
D = max TurbidostatoX = Cte
= max
EN RESUMEN LOS DIFERENTES MODELOS DE FERMENTACION CONTINUA SON
-
55
Contaminacin e inestabilidad gentica La contaminacin es un serio problema principalmente cuando la fermentacin
se realiza por largos perodos.
La contaminacin y aparicin de mutantes depender de la tasa de crecimiento de estos (c) respecto al microorganismo original (o) .Hay tres posibilidades:
o < c: La poblacin de microorganismo mutante o contaminante aumenta rpidamente y reemplaza progresivamente al microorganismo original. Es un problema del cultivo continuo de pequea tasa de crecimiento.
o = c: La poblacin de microorganismo mutante o contaminante tiene una tasa de crecimiento igual a la del microorganismo original. Se puede controlar si la velocidad de entrada del contaminante o de mutacin son bajas mutante Es un problema del cultivo continuo de pequea tasa de crecimiento.
o > c: La poblacin de microorganismo mutante o contaminante es baja. No ocasiona problemas salvo que la velocidad de entrada del mutante o velocidad de mutacin sean altas.
La contaminacin en el cultivo continuo es un problema difcil de resolver a escala industrial. Sin embargo ciertos medios o condiciones de cultivo (pH cido o alcalino, medio mineral, sustratos especficos,....) limitan considerablemente las infecciones.
Las mutaciones espontneas son muy difciles de controlar.
PROBLEMAS ASOCIADOS AL CULTIVO CONTINUOPROBLEMAS ASOCIADOS AL CULTIVO CONTINUO
PRODUCCIN DE VINAGRE (FERMENTACIN ACTICA) Produccin de cido actico a partir de soluciones de etanol y otros
nutrientes. La presencia de etanol y el pH bajo durante la produccin limitan el
riesgo de infecciones.
TRATAMIENTO BIOLOGICO DE AGUAS RESIDUALES
APLICACIN DEL CULTIVO CONTINUO
REACTORREACTORAEROBIOAEROBIO
DECANTACIONDECANTACION
RECIRCULACION DE BIOMASARECIRCULACION DE BIOMASA
AGUA TRATADAAGUA TRATADA
-
56
PRODUCCIN DE PROTENA UNICELULAR (SINGLE-CELL PROTEIN)
Secado
Centrifugacin
Reciclaje
Preparacindel medio
Esterilizacincontinua
Fermentacincontinua
MetanolAguaNaKMg
Single-cell protein
EL PROCESO BIOTECNOLOGICOEL PROCESO BIOTECNOLOGICO
RE
CU
PER
AC
ION
, EX
TR
AC
CIO
NPU
RIF
ICA
CIO
N
PRIMERA ETAPA DE MULTIPLICACIONSOBRE MEDIO LIQUIDO
(15 a 24 h)
SEGUNDA ETAPA DE MULTIPLICACIONEN FERMENTADOR
24 a 36 h
PRODUCCION EN FERMENTADOR PRINCIPAL
(24 a 150 h)
CONSERVACION AMPOLLALIOFILIZADA
(VARIOS MESES)
REGENERACION SOBRE CALDO NUTRITIVO Y REPIQUE EN AGAR
INCLINADO (24 h-10 DIAS)
-
57
ESQUEMA DE UNA INSTALACION AUTOMATIZADA DE FERMENTACIONESQUEMA DE UNA INSTALACION AUTOMATIZADA DE FERMENTACION
PREPARACION DEL INOCULO
BIO-REACTORESTERILIZACION
PREPARACION DELMEDIO DE CULTIVO
COMPRESOR
FILTRO DE ACEITE
FILTRO ESTERILIZANTE
GAS
CONTROLESTPpHCaudal de gasEspumaAgitacin,.....
MEDIDASCO2O2T cultivoT esterilizacinVelocidad de agitacinPotencia consumidapHViscosidadPotencial redox
BASES TECNOLOGICAS Y MICROBIOLOGICAS EN LA CONCEPCION DE BASES TECNOLOGICAS Y MICROBIOLOGICAS EN LA CONCEPCION DE BIORREACTORESBIORREACTORES
FenFenmenos de menos de transferenciatransferencia
N, P/V; TN, P/V; TMM, K, KTT, , QQaa, , KKLLaa
CinCinticatica
rrXX, , rrSS, r, r00
PP P,XP,X
SustratoSustratoReactivosReactivos
AgitaciAgitacinn--aireaciaireacinn
rrPP
XX
MedioMediopH, pH, TT, , CCLL,,,,
-
58
BIORREACTORBIORREACTOR
MANTIENE EN CONTACTO: CELULAS-LIQUIDO (S)-GAS
TRANSFERENCIA DE MASA:
SUSTRATOS: MEDIO CELULAS
PRODUCTOS: CELULAS MEDIO
REACTIVOS: MEDIO MEDIO
O2: GAS MEDIO CELULAS
TRANSFERENCIA DECALOR
MEDIO INTERCAMBIADOR
CLULAS MEDIO INTERCAMBIADOR
ASEPTICOMANTENER LA INTEGRIDAD DE LAS CLULAS
Addition de Addition de base et/ou acidebase et/ou acide
Broyeur de mousseBroyeur de mousse
Sortie dSortie dairair
PrPrllvementsvements
Milieu de cultureMilieu de culture
ArrivArrive de dair filtrair filtr
MoteurMoteur
Circuit de Circuit de refroidissement refroidissement et maintien de et maintien de temptempraturerature
Sonde tempSonde temprature rature Sonde OSonde O2 2 et/ou pHet/ou pH
SystSystme dme dagitation agitation palettespalettes
ArrivArrive de le de linoculuminoculum
schschma gma gnnral dral dune une cuve de fermentationcuve de fermentation
-
59
Es esencial en el metabolismo aerobio productor de energa: aceptor final de elctrones y protones producidos por las reacciones de oxidacin.
Ciertas bacterias (Clostridium), no poseen las enzimas necesarias para el metabolismo aerobio. De otra parte el H2O2 que ciertas ciertas bacterias producen y no pueden eliminar inhibe su crecimiento.
El oxgeno interviene en mecanismos de regulacin del metabolismo de manera directa, como inductor o represor de las enzimas respiratorias. Pero tambin de manera indirecta por su rol en le metabolismo energtico
La demanda de oxgeno es representada por Qo2 que se define como la cantidad de oxgeno consumida por unidad de tiempo, volumen y por unidad de biomasa.
QO2X (mmoles de O2/L h)
Igualmente la cantidad de Co2 producida durante la fermentacin se representa por:
QCO2X (mmoles de CO2/L h)
TRANSFERENCIA DE OXIGENO
QO2X
QO2
CL
KLaC*
X
EVOLUCION DEL CONSUMO DE OXIGENO DURANTE EL EVOLUCION DEL CONSUMO DE OXIGENO DURANTE EL CRECIMIENTO MICROBIANOCRECIMIENTO MICROBIANO
22O
2m OK
O+=La tasa de crecimiento se puede escribir:
Se puede deducir que si concentracin de O2 es inferior a la concentracin crtica (O2), la tasa de crecimiento es inferior a la tasa de crecimiento mxima y proporcional a la concentracin de oxgeno.
-
60
Etapas en la transferencia de oxgenoEtapa 1
Pelcula gaseosa
ClulaEtapa 2
Pelcula lquida
Etapa 4
Etapa 5BURBUJABURBUJAGASEOSAGASEOSA
MODALIDADES DE LA TRANSFERENCIA DE OXIGENOMODALIDADES DE LA TRANSFERENCIA DE OXIGENO
Las teorias ms importantes para establecer la ecuacin de transferencia de oxgeno son:
La teora de las pelculas laminaresLa teoria de la difusin continua
Etapa 3
Al interior de la burbuja de gas se establece un gradiente de presin parcial de oxgeno debido a la presencia de la pelcula gaseosa
La prsein parcial de oxgeno en la interfase Pi, esta en equilibrio con la concentracin Ci de oxgeno disuelto
En el lquido se establece un gradiente de concentracin de oxgeno disuelto debido a la pelcula liquida.
TEORIA DE LAS PELICULAS LAMINARES
FASE LIQUIDA
FASE GASEOSA
INTERESA GAS-LIQUIDO
Pelculagaseosa
Pelculalquida
P
Pi CL
Ci
-
61
Para establecer la ecuacin de transferencia se supone que:
Que el regimen es estacionario (independiente del tiempo) y que equilibrio
entre Pi y Ci se alcanza instantaneamente cuando el gas y el lquido se
ponene en contacto.
La ecuacin de transferencia es: )C*(CaKP*)(PaKdtdC
LLGL ==
Donde:
dCL/dt = Velocidad de transferencia de oxgeno (mmoles de O2/L h)KG = Coeficiente global de trnasferencia de masa respecto a la pelcula gaseosa
(Cm/h)KL = Coeficiente global de trnasferencia de masa respecto a la pelcula lquida
(Cm/h)a = Superficie especfica de transferencia (Cm2/Cm3)P* = Presin parcial de oxgeno (atm) en equilibrio con CLC* = Concentracin de oxgeno disuelto (mmoles de O2/L) en equilibrio con la
presin parcial de oxgeno en la fase gaseosa (P)
e
BURBUJADE GAS
LIQUIDO
C*
CL
La transferencia de oxgeno se da a travs de una pelcula nica de pequeo espesor y en regimenestacionario
TRANSFERENCIA DE OXIGENO SEGUN LA TEORIA DE DIFUSION CONTINUA
)C*C( a K d
dCLL
t
L =
Suponiendo un mecanismo de transferencia unidireccional, la ley de Fick se escribe:
Donde:
dCL/dt = Velocidad de transferencia de oxgeno (mmol O2/Lh)
KL = Coeficiente de transferencia de masa (cm/h)
a = Superficie especfica de transferencia (Cm2/Cm3)
CL = Concentracin de O2 disuelto en el lquido (mmolO2/L)
C* = Concentracin de O2 disuelto, en equilibrio con la burbuja de gas (mmolO2/L)
En todas las ecuaciones C*, representa la concentracin de oxgeno disuelto correspondiente a la saturacin.
-
62
XQo)C*(CaKdt
dC2LL
L =
)C*(CaKdt
dCLL
L =
XQodt
dC2
L =
0dt
dCL =L
2L C*C
XQoaK =
Durante la ferementacin:
Donde Qo2X representa la cantidad de O2 consumido por unidad de volumen (mmoles/Lh)
En ausencia de microorganismos se tiene:
Si la transferencia de O2 es cero (no hay agitacin aireacin):
Si no hay variacin en la concentracin de O2 disuelto (CL, cte):
METODOS PARA DETERMINAR KLa
La medicin de KLa (h-1), denominado tambin coeficiente volumterico, permite determinar la capacidad de transferencia de oxgeno del reactor
Los factores sobre los que se puede actuar para influir en la velocidad de transferencia son: KLa y C* -CL
Reemplazando el air por oxgeno puro se aumenta el potencial de transferencia C* -CL
Para aumentar KLa es necesario trabajar sobre la agitacin
Mtodo del sufito Mtodo de la glucosa oxidasa Mtodo microbiolgico Mtodos de determinacin con sensores
Mtodo esttico Mtodo dinmico
-
63
OXIDACION DEL SULFITOOXIDACION DEL SULFITO Se basa en la oxidacion del sulfito a sulfato en presencia de un catalizador. Se aade al medio de fermentacion Na2SO3 (1N) y catalizador (10-3 M Cu2+ o Co2+) y se
inicia la aireacin en las condicones que se quiere determinar Kla. La reaccin de oxido reduccin es la siguiente es la siguiente:
SO3 -- + H2O SO4-- + 2 H + + 2 e -
1/2 O2 + H2O + 2 e - 2 OH -
La velocidad de la reaccin es limitada por la velocidad de disolucin del oxgeno A diferentes intervalos de tiempo se toma una muestra y se determina el sulfito residual
por yodometriaSO3 -- + n I2 + H2O SO4-- + 2 I - + 2 H + + (n-1) I2
El yodo en exceso se determina por :2 S2O3 -- S4O6 --- + 2 e - I2 + 2 e -
2 I -
Siempre que se tenga sulfito CL es cero (reaccin rpida)
sulfito deloxidacion de Velocidad *CaK L =Pendiente de la recta concen. de sultifo vs tiempo
Es un metodo simple y poco costoso. Es necesario evitar que las muestras tomadas esten expuesta al aire
Tiene la desventaja de que la solucin de sulfito no reacciona de la misma manera que el cultivo
XQo)C*(CaKdt
dC2LL
L =
En ausencia microorganismos y en las condiciones en que se desarrollar la fermentacin se determina el KLa.
Despus de saturar el medio en oxgeno disuelto, se detiene la aireacin y se inyecta N2 en la solucin.
La concentracin de O2 disuelto tiende a cero
Despus de retomar la aireacin, la concentracin de O2 disuelto aumenta; este aumento depende de la capacidad de transferencia del equipo.
METODOS ESTATICOS (EN AUSENCIA DE MICROORGANISMOS) O DE DESGASIFICACION ESTATICA
t
CL
0
Detener laaireacin einyectar N2
Retomar laaireacin
-
64
XQo)C*(CaKdt
dC2LL
L =
)C*(CaKdt
dCLL
L =
)C*(CaKdt
dCLL
L =
= dtaKC*CdC LLLtaK
-C*C*CLn L
L=
Mtodo 1:
Considerando que:
Pero Qo2X=0
Mtodo 2:
Integrando la ecuacin:
Al momento de retomar la aireacin t0 y CL = 0, para un tiempo t el valor CL
Luego grficamente se obtiene
De dos maneras se puede determinar KLa
dtdCL
= KLa)
C*-CL
Ln
C*/
(C*-
CL
)
t
) = KLa
XQo-)C*(CaK0dt
dC2LL
L ==
aKXQo*CC
L
2L =
XQo-dt
dC2
L =
*C1CL ++= )XQodtdC(
aK 2L
L
Tiene la gran ventaja de determinar el KLa durante el desarrollo de la fermentacin. Consta de las siguientes etapas:
En primer lugar se debe llegar alequilibrio entre la transferencia yconsumo de oxgeno (CL=cte).
Despejando se obtiene:
En segundo lugar se detiene laaireacin y por tanto KLa = 0; luego
En tercer lugar se reestablecelas condiciones de aireacin yla ecucin se puede escribir :
METODO DINAMICO (DESGASIFICACION DINAMICA)
t
CL
0
CL
Detener laaireacin
Retomar laaireacin
(Qo2X
-
65
Para diferentes intervalos de tiempo se determina CL a travs del sensor y los clculos se realizan segn la grfica siguiente:
CL
XQodt
dC2
L +
1/KLa (
El problema tambin se puede resolver matemticamente
*C1CL ++= )XQodtdC(
aK 2L
L
Es un mtodo interesante ya que permite la determinacin del KLa en linea y su siguimiento durante la fermentacin. Se basa en la ecuacin global de transferencia de oxgeno.
Puesto que en el equilibrio CL es constante, se tiene:
A travs del balance gaseoso, se determina el consumo de oxgeno:
XQo-)C*(CaKdt
dC2LL
L =
L
2L C*C
XQoaK =
=
1
111
0
0005
2 TYQP
TYQP
V10.31,7XQo
METODO DEL BALANCE GASEOSO
VCL
Q1 (L/min)P1 (atm)T1 (K)F1 (molO2)
Qo (L/min)Po (atm)To (K)Fo (molO2)
Midiendo a travs de sensores CL y conociendo C*, se puede determinar KLa
-
66
Cuando se emplea grandes fermentadores, es necesario
tener en cuenta ciertas precauciones. En efecto el aire que
es introducido en la base del