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VIAS DE SUPERVIVENCIA CELULAR ACTIVADAS POR LA INFECCIÓN CON VIRUS RABIA EN NEURONAS SENSORIALES
JUAN CARLOS GARCÍA BETANCUR Trabajo de Grado presentado como requisito
para optar al título de Microbiólogo
Director
JAIME EDUARDO CASTELLANOS MSc, PhD Codirectores
HELENA GROOT DE RESTREPO MSc MYRIAM LUCÍA VELANDIA MSc
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PREGRADO EN MICROBIOLOGÍA
Bogotá D.C Febrero 27 de 2006
VIAS DE SUPERVIVENCIA CELULAR ACTIVADAS POR LA INFECCIÓN CON VIRUS RABIA EN NEURONAS SENSORIALES
JUAN CARLOS GARCÍA BETANCUR
APROBADO
______________________________
Jaime Eduardo Castellanos MSc, PhD Director
_________________________ ______________________________
Helena Groot De Restrepo MSc Myriam Lucía Velandia MSc
Codirectora Codirectora
_________________________
Alejandro Malagón PhD
Universidad de los Andes
A Mi Padre, Heliodoro García Ángel y a Mi Madre, María Lucydalba Betancur Cardona; Por Ser Mis Amigos, Mis Héroes, Mis Fuerzas, Mis Consejeros y Mi Infinito Apoyo. Su incalculable amor ha hecho posible todo en mi vida… y que todo sea posible valioso y sagrado.
AGRADECIMIENTOS Ante todo a Myriam Lucía Velandia del Instituto de Virología, mi mejor jefa, maestra y
compañera. Por brindarme abiertamente su amistad, su consejo y su conocimiento.
Al Doctor Jaime Eduardo Castellanos, por abrirme las puertas del Instituto de Virología
bajo su dirección, por su valiosa crítica y consejo para la realización de este trabajo.
A la Doctora Helena Groot de Restrepo, la Doctora Nhora Rodríguez de Sánchez y la
Doctora Marina Ordóñez del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de
los Andes quienes depositaron su confianza en mí y en este trabajo y cuya enorme
colaboración, compromiso y consejo lo hizo posible.
A todos mis compañeros del Instituto de Virología de la Universidad El Bosque pues de
cada uno de ellos aprendí no solo lecciones académicas, sino lecciones para mi vida.
Finalmente, a cada una de las personas que estuvo al tanto de la realización de este
trabajo y cuyo ánimo y compromiso me permitió no desfallecer en los momentos difíciles,
especialmente a María Angélica Vargas, a quien más que un agradecimiento le dedico
con todo mi corazón este trabajo.
A todos ustedes, mil gracias.
TABLA DE CONTENIDO Página
RESUMEN INTRODUCCIÓN LISTA DE ABREVIATURAS 1. VIRUS RABIA 1
1.1. ENTIDADES VIRALES 1 1.2. RABDOVIRUS 1
1.2.1. ESTRUCTURA Y GENOMA 1 1.2.2. GENÉTICA MOLECULAR 7 1.2.2.1. TRANSCRIPCIÓN 8 1.2.2.2. REPLICACIÓN 12 1.2.3. PROTEÍNAS VIRALES 16 1.2.3.1. PROTEÍNA N 16 1.2.3.2. PROTEÍNA P 17 1.2.3.3. PROTEÍNA M 19 1.2.3.4. PROTEÍNA G 20 1.2.3.5. PROTEÍNA L 21
1.3. VIRUS RABIA (RABV) 22 1.3.1. EPIDEMIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN 22 1.3.2. DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO 26 1.3.3. PATOGÉNESIS 30
1.3.3.1. ADSORCIÓN DEL VIRUS 34 1.3.3.2. ENTRADA 36 1.3.3.3. ENSAMBLAJE Y GEMACIÓN 37 1.3.3.4. RESPUESTA INMUNE 40
2. LA APOPTOSIS O MUERTE CELULAR PROGRAMADA 42 2.1. INTRODUCCIÓN Y CARACTERÍSTICAS GENERALES 42 2.2. LA APOPTOSIS Y LA HOMEOSTASIS CELULAR 44
2.3. RUTAS CELULARES DE ACTIVACIÓN APOPTÓTICA 47 2.3.1. RUTA EXTRÍNSECA 58 2.3.2. RUTA INTRÍNSECA 53 2.4. PROTEÍNAS PRINCIPALES EN LA APOPTOSIS 55
2.4.1. ASPECTOS GENERALES DE LAS CASPASAS 55 2.4.1.1. CASPASA 8 58 2.4.1.2. CASPASA 3 60 2.4.1.3. CASPASA 9 61
2.4.2. Bcl-2 PRO Y ANTI APOPTOSIS 64 2.4.3. FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN Nk-β 68
2.5. REMOCIÓN DE LAS CÉLULAS APOPTÓTICAS 70 2.5.1. TRANSPORTADORES ABC 70 2.5.2. RECONOCIMIENTO Y REMOCIÓN 72
2.6. LA APOPTOSIS Y LAS INFECCIONES 75 2.6.1. ARN COMO INDUCTOR DE APOPTOSIS 77
2.6.1. REGULACIÓN DE LA APOPTOSIS POR VIRUS 78 3. NEURONAS SENSORIALES 84 3.1. NEURONAS DEL GANGLIO DE LA RAIZ DORSAL 85 3.2. CLASIFICACIÓN DE LAS SUBPOBLACIONES 86 3.2.1. CLASIFICACIÓN MORFOLÓGICA 88 3.2.2. CLASIFICACIÓN FISIOLÓGICA 89 3.2.3. CLASIFICACIÓN BIOQUÍMICA 91 3.2.3.1. NEUROFILAMENTOS 91 3.2.3.2. NEUROPÉPTIDOS 92 3.2.3.2. ENZIMAS 96 3.2.3.3. RECEPTORES Y OTRAS MOLÉCULAS 99 3.3. DESARROLLO DE LAS NEURONAS SENSORIALES 103 3.3.1. BASES CELULARES Y MOLECULARES 103 3.3.2. REGENERACIÓN Y PLASTICIDAD IN VITRO 104 4. VIAS APOPTÓTICAS Y DE SUPERVIVENCIA NEURONAL ACTIVADAS POR INFECCIÓN CON VIRUS RABIA 106 4.1. FENÓMENOS DE APOPTOSIS EN LA INFECCIÓN POR RABV 108 4.2. FENÓMENOS INMUNES EN LA INFECCIÓN POR RABV 115 5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS 121 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 122
RESÚMEN
El Virus Rabia (RABV) es un virus ARN con sentido negativo perteneciente a la familia de
los Rabdovirus. Es altamente neurotrópico y produce una parálisis focal y/o ceguera así
como una encefalitis de carácter letal. Los mecanismos de transcripción y replicación de
este virus junto con la interacción de proteínas virales con factores celulares específ icos
encierran características especiales de regulación que le permiten llevar a cabo un
proceso de evasión de la apoptosis. De igual manera, la interacción de estas proteínas
virales con componentes específ icos de las neuronas hospederas genera mecanismos
altamente eficientes de evasión de la respuesta inmune. Como resultado, el RABV infecta
neuronas sensoriales de los Ganglios de la Raíz Dorsal y motoras de la Médula Espinal
(ME) sin influir aparentemente en la f isiología neuronal y se transporta de forma
retrógrada hasta el SNC donde causa daño f isiológico en prácticamente todas las
subpoblaciones neuronales. La apoptosis o muerte celular programada es un proceso
autoregulatorio de las células eucariotas que responde a diferentes tipos de estímulos
tanto de carácter interno como externo. La activación de la apoptosis es un proceso
multifactorial que encierra la proteólisis de la mayoría de los compuestos extracelulares y
que se diferencia de la necrosis por la ausencia de respuesta inflamatoria. Fenómenos
durante el desarrollo, selección inmune e infecciones son los estímulos más comunes
para este tipo de control celular. Los GRD son agregados celulares ubicados en los
espacios intervertebrales a lo largo y a cada lado de la médula. Estas neuronas constituyen junto con las neuronas de la raíz ventral la base de la comunicación a través
de la columna vertebral. Teniendo en cuenta el papel crítico que las neuronas del GRD
juegan en el proceso de captura y transporte del RABV desde la periferia hasta el SNC,
se plantea la participación de las diferentes rutas involucradas en los procesos de
apoptosis y supervivencia neuronal, así como la participación de las células satélite no
neuronales en este proceso. Las características morfológicas, f isiológicas y bioquímicas
de las diferentes subpoblaciones neuronales presentes en el GRD pueden ser las
determinantes en conjunto con las proteínas virales en el comportamiento antiapoptótico y
la subversión inmune que desencadena este virus.
INTRODUCCIÓN
La enfermedad rábica continúa siendo un problema de salud pública considerable. Según
estimaciones de la OMS, en el mundo anualmente cerca de un millón de personas
reciben tratamiento antirrábico post-contacto con el virus y alrededor de 50000 personas
mueren anualmente como resultado de la infección. La fase aguda de la enfermedad es
generalmente intratable y f inalmente los mecanismos exactos de patogénesis y la biología
molecular de la interacción virus-hospedero no están descritos por completo.
Como parte del proyecto investigativo que se inició en el Instituto de Virología de la
Universidad El Bosque, esta revisión abordará los temas más relevantes asociados a la
inmunopatogénesis del virus. Contar con una descripción exacta sobre los conceptos
básicos del problema (biología molecular del virus y sus interacciones con la célula
hospedera, el programa de muerte celular y el modelo de neuronas sensoriales) brinda
una perspectiva preeliminar mucho más amplia y una base teórica fuerte que permite
focalizar el problema de transporte viral y evasión de la respuesta apoptótica e inmune y
proponer soluciones innovadoras.
Dividida en 4 Capítulos fundamentales, esta revisión abordará a profundidad y basada en
artículos originales, revisiones especializadas y bibliografía actualizada, todos los
aspectos relacionados con los Rabdovirus haciendo especial énfasis en el Virus Rabia,
con los procesos y mecanismos a nivel celular que determinan la apoptosis, las
características principales de la neuronas sensoriales del GRD y f inalmente una revisión de los avances en el entendimiento del procesos apoptóticos e inmunes que rigen la
patogénesis del Virus Rabia.
LISTA DE ABREVIATURAS
AIF Factor Inductor de Apoptosis.
CD Células Dendríticas.
CMH Complejo Mayor de Histocompatibil idad.
CPA Células Presentadoras de Antígenos.
CTL Linfocitos T Citotóxicos.
CVS Cepa viral Challenge Virus Standard del RABV.
ERA Cepa viral Evelyn Rotkitniki Abelset del RABV.
GRD Ganglios de la Raíz Dorsal.
IFN Interferón.
L Neuronas Grandes.
MCP Muerte Celular Programada.
nAChR Receptor Nicotínico Acetilcolina.
NCAM Molécula de Adhesión Neuronal.
NF Neurofilamento.
NGF Factor de Crecimiento Nerviosos.
ORF Marcos de Lectura Abiertos.
p75NTR Receptor de baja afinidad de Neutrofinas p75.
PV Cepa viral Pasteur del RABV.
RABV Virus Rabia (Según la nueva nomenclatura de la ICTV).
RE Retículo Endoplasmático.
RIG Regiones Intergénicas.
RNP Complejo Ribonucleoprotéico.
SAD Cepa Viral Street Alabama Dufferin del RABV.
SD Neuronas Oscuras y Pequeñas.
SHBRV Cepa viral Silver Haired Bat Rabies Virus del RABV.
SNC Sistema Nervioso Central.
SNP Sistema Nervioso Periférico.
SP Sustancia P.
STAT Transductor de Señales y Activador de la Transcripción 1.
TNF Factor de Necrosis Tumoral.
TNFR Receptores del Factor de Necrosis Tumoral.
TRAIL Ligando Inductor de Apoptosis Relacionado con TNF.
UFP Unidades Formadoras de Placa.
1
1. VIRUS RABIA 1.1. ENTIDADES VIRALES Los virus son entidades submicroscópicas cuyo tamaño varía entre los 0,1 y los 0,00001
um3. Son cuerpos parasitarios compuestas por proteínas, algunos por bicapa de
fosfolípidos (obtenidas de la membrana celular de su hospedero), un solo tipo de ácido
nucleico que forma genomas entre los 3 y 300 kb -sea de cadena sencilla o doble- (Heller
et al., 2000) y que se caracterizan por ser parásitos intracelulares altamente infecciosos,
acelulares, no cultivables en medios sintéticos y f iltrables (Beijirinick, 1988); cuyo proceso
de replicación solo se puede llevar a cabo dentro de una célula hospedera, debido a que
utilizan su maquinaria de replicación, transcripción y traducción.
Aunque la gran mayoría de su ciclo replicativo requiere la maquinaria molecular de su
hospedero, el genoma viral posee la información genética necesaria para redireccionar
dicha maquinaria a la generación de nuevos viriones, así como macromoléculas
específ icas y ausentes en una célula: sea ARN polimerasa dependiente de ARN, proteínas de iniciación para la replicación de su genoma y/o proteínas que interf ieren con
el mecanismo de defensa celular, sea respuesta inmune o apoptosis (Strauss, 2002).
Con orígenes evolutivos presuntamente independientes, los virus se han clasif icado en
tres grandes clases: virus de DNA con replicación a DNA, virus de ARN con replicación de
su genoma a ARN y f inalmente virus de ARN con replicación a DNA (o retrovirus). Dentro
de estas tres clases encontramos gran cantidad de familias, las cuales están definidas por
el tamaño, sentido (dirección 5´ - 3´ o viceversa) y número de fragmentos de su genoma
(Strauss, 2002). El Comité Internacional para la Taxonomía de Virus (ICTV por sus siglas
en inglés) estableció la taxonomía y nomenclatura viral según el tipo y sentido de su
material genético, como se observa en la Tabla 1.
1.2. RABDOVIRUS
1.2.1. ESTRUCTURA Y GENOMA La familia Rabdoviridae (de la raíz griega Rabdo, que signif ica en forma de bala),
perteneciente al grupo de los virus con genoma ARN de cadena sencilla y sentido
negativo (orden Mononegavirales) evocan evolutivamente al genoma de la familia
Paramyxoviridae y esta formada por aproximadamente 200 diferentes especies virales
caracterizadas por su morfología tubular, como se observa en la Figura 1. Sin embargo,
su estructura no suele ser muy regular, debido en parte a que la envoltura lipídica no está
en contacto directo con la nucleocápside y tanto esta membrana lipídica como la proteína
2
antigénica de superficie G se unen al complejo de la ribonucleoproteína (RNP) por medio
del “puente” que forma entre ellas la proteína de matriz, o proteína viral M. Los viriones
están compuestos por una membrana externa que se deriva de la célula hospedera donde
el virus gema, por un núcleo interno conocido como la ribonucleoproteína -compuesto por
tres diferentes proteínas-, una única glicoproteína que atraviesa la membrana y que en
arreglos triméricos forma aproximadamente 400 prolongaciones extramembranales
alrededor del virus y f inalmente alrededor de 1800 moléculas de la proteína de matriz, o
proteína M, cuyo papel fundamental es la unión entre el complejo ribonucleoprotéico
(RNP) y la membrana viral.
Tabla 1. Principales Familias Virales
Tipo de Ácido Nucleico Tamaño del Genoma
Segmentos del Genoma
Familias
DNA de Cadena Doble ds DNA
5 a 400 kpb 1
Poxviridae Asfariviridae Iridoviridae Herpesviridae Adenoviridae Polyomaviridae Papillomaviridae
DNA de Cadena Sencilla ss DNA
4 a 6 kb 1 Parvoviridae
ARN de Cadena Doble ds ARN
4,6 a 30 kpb 1 a 12 Reoviridae Birnaviridae
ARN de Cadena Sencilla Sentido 5´- 3´ ss (+) ARN
8 a 33 kb 1
Coronaviridae Arteriviridae Togaviridae Flaviviridae Piconarviridae Astroviridae Calciviridae
ARN de Cadena Sencilla Sentido 3´- 5´ ss (-) ARN
6 a 23 kpb 1 a 8
Paramyxoviridae Filoviridae Rabdoviridae Bornaviridae Orthomyxoviridae Bunyaviridae Arenaviridae
ARN de Cadena Sencilla Transcriptasa Reversa ss ARN RT
7 a 10 kb Dímero Retroviridae
DNA de Cadena Doble Transcriptasa Reversa ds DNA RT
3 a 8 kpb 1 Hepadnaviridae Caulimoviridae
Tabla acorde y modif icada de Granoff and Webster (1999).
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Dentro del núcleo ribonucleoprotéico se aloja el genoma viral que consta de una sola
molécula de ARN de sentido negativo con un tamaño entre los 11 y 12 kb, dependiendo
del género y especie dentro de la familia. Todos los miembros de esta familia poseen
genomas sumamente similares, que codif ican para las proteínas N, P, M, G y L en el
sentido 3´ a 5´. Las proteínas N, P y L están involucradas con la transcripción y
replicación del genoma viral, siendo L una ARN polimerasa dependiente de ARN con
función 5´-capping y 3´-poliadenilación e involucrada fuertemente en el reconocimiento,
iniciación y regulación de la transición replicación-transcripción. La proteína nominal P es
la fosfoproteína del virus y con la proteína de la nucleocápside N, sirven como
transcriptasa y replicasa viral (Harty et al., 2003. Ruigrok et al., 2004). Por otro lado
están las proteínas de membrana: la G o Glicoproteína y la M o proteína de Matriz. La
proteína G está dirigida hacia la parte más exterior del virus, es de carácter trimérico -
como peplómeros-, se encuentra intercalada entre la bicapa lipídica y es la responsable
de la unión a los receptores de la célula hospedera, de allí su gran carácter antigénico. La proteína M es bien conocida por se la proteína de puente entre la envoltura del virus
(tanto G como la bicapa lipídica) y la proteína de Nucleocápside, así como por ser la
unidad estructural responsable de la invaginación del virus dentro de la bicapa lipídica de
su hospedero en el momento de la gemación (Fields 2001. Whitt et al., 2000. Wills et al.,
1999. Cupp et al., 1999). Aunque las funciones son completamente conservadas entre
todos los miembros de la familia Rabdoviridae, existen variaciones signif icativas en la
estructura de los genomas, especialmente dependiendo de la especie hospedera. Es así
que los Rabdovirus que infectan peces poseen un pequeño gen extra entre los genes G y
L, los que infectan plantas pueden tener un gen extra entre los genes P y M y los virus
sigma que infectan Droshopila tienen tres genes extra entre N y G así como una región
sobrelapada de 33 nts entre el gen G y el gen que le precede (Fields, 2001).
La partícula viral es de aproximadamente 180 nm de largo por unos 75 nm de ancho, a
excepción de los Rabdovirus baciliformes, generalmente virus cuyos hospederos son
plantas y cuyo tamaño es de aproximadamente el doble (Fields, 2001).
El ARN genómico se dispone de una forma muy particular, cuya organización ha sido
vislumbrada a través de técnicas de cuantif icación bioquímica y microscopía electrónica.
Básicamente el genoma viral se encuentra envuelto dentro de un complejo estrecho con
aproximadamente 1200 moléculas de la proteína de nucleocápside (N) que se organiza a
manera de esferas a lo largo del ARN, cada molécula N cubriendo exactamente 9
nucleótidos. Esta organización forma una hélice con aproximadamente 35 giros dentro
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del virion. Adicionalmente, la ARN polimerasa dependiente de ARN, compuesta por la
proteína viral L y su cofactor conocido como la fosfoproteína (P), se asocian con la
proteína N formando el complejo RNP y se encuentran 50 y 500 moléculas por virion,
respectivamente (Jackson A et al., 1987). Como se discutirá posteriormente, en el
subcapítulo pertinente a los fenómenos de replicación y transcripción del genoma de los
Rabdovirus, se generan ARN mensajeros (ARNm) separados para cada uno de los
genes. Sorprendentemente, aún durante los procesos de transcripción y replicación del
ARN genómico, este se encuentra estrechamente relacionado con el complejo RNP
(Fields, 2001).
Según su rango de hospederos, los Rabdovirus se dividen en cinco (5) géneros:
Epherovirus, CytoRabdovirus, Lyssavirus y Vesiculovirus; siendo los dos últimos, los
géneros presentes en ciertas patologías humanas, mientras que los dos primeros infectan
gran rango de animales y plantas, respectivamente (Harty et al.. 2003).
Esta familia viral es considerada como la más simple de todos los virus con genoma ARN no segmentado perteneciente al orden de los Mononegavirales. La organización genética
de los Rabdovirus es similar al de las familias Paramyxoviridae y Filoviridae, familias
pertenecientes al mismo orden. Debido a que los genomas de estas familias son de
sentido negativo, y por ende no codif icante, una característica fundamental es la
presencia de la ARN polimerasa dependiente de ARN como plantilla molecular. Debido a
esta característica, la replicación del genoma viral requiere la síntesis inicial de proteínas
virales –polimerasa incluída- que resulta en la síntesis de copias completas de
antigenomas, base de la transcripción, y posteriormente la síntesis de compias completas
de genomas (ARN de sentido negativo) que son subsecuentemente empaquetados dentro
del complejo proteínico que da origen a la progenie viral (Chaffotte et al., 1996).
Los virus pertenecientes a esta familia están ampliamente distribuidos en la naturaleza y
poseen un extenso rango de hospederos, infectando desde vertebrados e invertebrados
hasta varias especies de plantas. Aunque el mayor problema de salud pública y por ende
económico lo representa las infecciones por virus rabia, existen otros Rabdovirus que
causan grandes pérdidas económicas en las industria pesquera. Estos virus parecen
tener ciclos de infección restringidos a vertebrados. Sin embargo, otros virus miembros
de esta familia son transmitidos hacia vertebrados y plantas por medio de artrópodos,
organismos que se cree por estudios hechos a nivel de f ilogenia molecular de virus fueron
el hospedero original desde el cual todos los Rabdovirus evolucionaron.
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En 1987, Shope y Tesh publicaron una excelente revisión sobre la ecología y la
clasif icación de esta familia de virus, enfatizando aquellos que infectan mamíferos,
aproximadamente unas 70 especies clasif icadas dentro de los géneros Vesiculovirus y
Lyssavirus (Jackson et al., 1987). Sorprendentemente, de la revisión hecha por Shope y
Tesh se puede resaltar la alta capacidad que tienen estos virus para infectar una gran
cantidad de hospederos, característica que no comparten con casi ninguna otra entidad
viral, ya que los virus suelen ser especie-específ icos.
Figura 1. Modelo general de la morfología de la familia Rhabdoviridae. Se observa la forma tubular que oscila entre los 180nm largo x 75nm ancho; caracterizada además por la terminación planar generada por la gemación de la célula infectada. La parte más exterior está compuesta por una bicapa lipídica que forma la envoltura del virus y que obtienen de la membrana plasmática de su hospedero. Esta envoltura está cubierta parcialmente por trímeros de glicoproteína viral (de aproximadamente 67KDa) que le dan su apariencia puntiaguda, además de ser el mayor antígeno de superficie. Al mismo tiempo, dicha cobertura está unida a la nucleocápside viral por una proteína membranal de matriz de aproximadamente 26KDa. Interiormente se encuentran las proteínas N, P y L, encargadas de cubrir el ARN viral, servir como proteína de transcripción y como ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente. Figura tomada de Smith et al., 1988. Sin embargo, ciertas especies de Rabdovirus poseen un hospedero específ ico y solo son
infectivos a determinadas temperaturas ambientales. Algunos de los Rabdovirus del
género Vesiculovirus son transmitidos por insectos hematófagos (Letchw orth et al., 1999),
lo que en parte puede explicar la naturaleza cíclica y temporal de algunas enfermedades
de importancia como la estomatitis vesicular, causada por el virus que lleva dicho nombre,
VSV (Vesicular Stomatitis Virus por sus iniciales en inglés), Rabdovirus endémico en
Centro América, el norte de Sur América, India y Medio Oriente. Aunque este virus infecta
principalmente animales domésticos, se han presentado casos de infección en personas
que han estado en contacto con el virus en condiciones naturales o de laboratorio,
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causando síntomas muy similares a los causados por el virus Influenza (Tesh et al.,
1969).
El nivel de clasif icación por serotipos, como ocurre con el VSV New Jersey y el VSV
Indiana se realiza con base en la similitud existente entre la secuencia de ARN genómico
para la secuencia codif icante para la glicoproteína, también conocida como proteína viral
G. Por ejemplo para estos dos serotipos se estima una similitud tan solo del 50%, lo que
permite subclasif icarlos con certeza ya que las tasas de mutación en infecciones naturales
en areas geográficas delimitadas es considerablemente menor que en cepas virales
pasajeadas en laboratorio (Bilsel et al., 1990).
Una de las características más sorprendentes de los virus pertecientes a esta familia es
su sistema de genética reversa, particularidad que ha sido crucial para el conocimiento de
sus fenómenos de replicación y ensamblaje, así como una herramienta vital en biología
molecular, pues genes extraños adicionales pueden ser introducidos en virus
recombinantes logrando genes de expresión muy estable como lo reportan Mebatsion y Schnell en trabajos individuales en 1996 (Mebatsion et al., 1996 y Schnell et al., 1996).
Un ejemplo muy interesante de la utilización de estos vectores recombinantes lo presenta
el VSV como vector de la vacuna contra la inf luenza, expresando el gen de la
hemaglutinina. La aplicación intranasal de una cantidad correspondiente a 100 unidades
formadoras de placa (UFP) confirió resistencia inmunológica a los ratones sometidos a
esta prueba experimental (Roberts et al., 1998). Recientemente se ha reportado algunos
estudios hechos contra el VIH utilizando vectores Rabdovirales, específ icamente el VSV,
y los resultados obtenidos en macacos muestran la ausencia total de patogénesis por
VIH y la generación de una respuesta inmune muy fuerte y específ ica contra este
retrovirus (Fields, 2001).
Schnell y su grupo de colaboradores presentaron en el año de 1997 en la revista Cell un
estudio muy interesante, donde a partir de virus VSV recombinantes los cuales no
poseían la secuencia genómica para producir la glicoproteína G y en lugar de esta ARN
codif icante para la molécula receptora y coreceptora del VIH, estos virus efectivamente se
unieron específ icamente a células infectadas In vitro, las infectaron y por ende las
asesinaron (Schnell et al., 1997). Finalmente, otros trabajos con Rabdovirus
recombinantes han permitido establecer los dominios de fusión de los receptores y
coreceptores de las células hospederas con la glicoproteína de virus tan peligrosos como
el Ebola sin la necesidad de trabajar bajo condiciones de bioseguridad tipo 4 (Ito et al.,
1999).
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1.2.2. GENÉTICA MOLECULAR
Con una sola molécula de ARN de aproximadamente -aproximadamente 12000 bases-, y
con sentido negativo, lo que signif ica una dirección 3´ - 5´, el genoma de los virus
pertenecientes a esta familia se caracteriza por poseer una región líder de
aproximadamente 50 nucleótidos (nts) en su extremo 3´ que funciona como sitio único de
entrada de la ARN polimerasa viral; y una región no transcribible de aproximadamente 60
nts en su extremo 5´. En cuanto al fenómeno de transcripción del ARNv a ARNm, dentro
de estas dos regiones reguladoras se encierran los cinco genes monocistrónicos para las
tres proteínas estructurales (G, M y N) y las proteínas funcionales (P y L) del virus. Entre
cada gen existen regiones intergénicas o no codif icantes y señales de poliadenilación
para el extremo 3´ de cada uno de los cinco ARNm como se puede observar claramente
en la Figura 2.
Figura 2. Genoma Rhabdoviridae. ARN sentido negativo o dirección 3´- 5´. El genoma de los miembros pertenecientes a esta familia del orden Mononegavirales (Mono por poseer un genoma con un solo segmento y nega por ser antisentido) se caracteriza por generar ARNm monocistrónicos para cinco proteínas virales, cada uno con secuencias que forman estructuras secundarias de ARN conocidas como cap en su extremo 5´ y poliadeniladas en el 3 ́generadas por la ARN polimerasa viral. Estos genes están separados por regiones intergénicas (RIG) altamente conservadas en el número y secuencias de nucleótidos entre cada gen. Figura tomada de Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995.
La estrategia para descubrir las bases de la genética molecular de los Rabdovirus y los
mecanismos moleculares involucrados en la patogénesis de enfermedades tan
importantes para la salud humana como la rabia ha tomado un rumbo diferente al de otros
virus pues ha requerido el desarrollo de sistemas de ADN copia (ADNc) para la
recuperación de viriones infecciosos, logro alcanzado para el RABV en 1994 por Matthias
Schnell, Teshome Mebatsion y Karl-Klaus Conzelmann del Centro Federal de
Investigación de Enfermedades Virales en Animales en Alemania, quienes con ADNc del
RABV y bajo el promotor T7 lograron entidades infecciosas gracias a la síntesis de la
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polimerasa del bacteriófago T7 insertada como ADN por el sistema vaccinia antes de la
transfección del ADNc del genoma del RABV (Mebatsion T et al., 1994).
La necesidad de obtener ADNc se debe a que ni el ARNv ni el ARNvc pueden generar
ARNm en la ausencia de la ARN polimerasa viral. Además, el ensamblaje In vitro de ARN
diseñado dentro del complejo RNP es prácticamente imposible dado la complejidad de las
interacciones ARN-proteína y proteína-proteína, así como del gran tamaño de los
genomas virales. Sin embargo, la exitosa estrategia de utilizar ADNc no ha sido la única.
Como es ampliamente referenciado por Roberts y Rose en 1998, otra estrategia utilizada
antes de la utilización del ADNc fue el diseño de mini genomas de ARN, donde uno o más
genes eran f lanquados por secuencias naturales en los extremos 5´y 3´ de sistemas de
expresión de plásmidos de ADN como el del virus vaccinia (Roberts A y Rose JK, 1998).
Desafortunadamente, ninguna de estas estrategias permitía generar virus infectantes a
partir de ARN de sentido negativo.
1.2.2.1. TRANSCRIPCIÓN El primer evento para la síntesis de nuevos virus después de la liberación del complejo
RNP es la transcripción del genoma viral para la generación de los ARNm
monocistrónicos para cada uno de las proteínas virales. Es conveniente aclarar que el
complejo RNP no es una entidad aislada de la maquinaria celular y que se encuentra
accesible a proteínas celulares. Debido al carácter negativo del ARNv y como
característica principal del orden de los Mononegavirales, esta transcripción es llevada a
cabo por la proteína L -una ARN polimerasa dependiente de ARN- en conjunto con tres
unidades de la fosfoproteína P (antes conocida como NS) que actúa como cofactor de la
polimerasa viral dependiendo de su estado de fosforilación. Como fuera publicado en
PNAS por Barik y su grupo de colaboradores en 1992, la fosforilación de los residuos
Serina y Treonina en el dominio l del extremo N-terminal de la proteína viral P por la
caseína kinasa ll celular activaba transcripcionalmente a dicha proteína y por ende a la
polimerasa viral en ensayos de transcripción In vitro (Barik S et al., 1992). Sin embargo,
estudios posteriores hechos de igual manera en el VSV por Spadafora y su grupo cuatro
años más tarde pusieron en tela de juicio esta teoría estableciendo que aunque la
fosforilación de P era importante para la modulación del complejo transcripcional no era
una proteína esencial para la transcripción (Spadafora D et al., 1996). Una vez más, el
disponer de ADNc del genoma del VSV permitió establecer que definitivamente la
fosforilación de P en el dominio establecido para 1994 es esencial para el fenómeno de
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transcripción y no está involucrada en la replicación (Pattnaik et al., 1997). Esta
activación parece darse debido a que la fosforilación permite la trimerización de unidades
de P y este trímero es funcionalmente activo para activar a la polimerasa viral. Con la
proteína L activa, la transcripción se lleva a cabo en un complejo formado por el genoma
viral y la proteína estructural de nucleocápside o proteína N. Hipotéticamente, este
complejo se forma para evitar que las ribonucleasas celulares degraden este ARN de
cadena sencilla (Fields, 2001). Sin embargo, la disposición del ARN dentro del complejo
permitiría postular que existen también características estructurales para el
reconocimiento del genoma viral y su posterior transcripción una vez dentro del
citoplasma de la célula hospedera. Aunque los ensayos In vitro con ARNv y las proteínas
virales purif icadas mostraban transcripción positiva, trabajos hechos por Gupta y su
equipo de colaboradores permitió establecer que existen proteínas celulares, como los
factores de elongación de la transcripción como EF-1a, EF-1b y EF-1g, esenciales para
un proceso de transcripción similar al que ocurre In vivo (Gupta AK et al., 1998). Seguido a la entrada del virus a su célula blanco y la posterior liberación del ARN viral en
el complejo RNP, se inicia la transcripción de la región líder, secuencia de nucleótidos
que dispara la transcripción de los genes estructurales. Aunque esta región líder no
posee la estructura cap en su extremo 5´ ni poliadenilación en el 3´, cuando existen
concentraciones suficientes de las proteínas N y P en complejo es encapsidada,
contribuyendo posiblemente en el mecanismo de autorregulación de los fenómenos de
replicación-transcripción mediante su interacción con la proteína de nucleocápside N
(Fields, 2001). Se propone que el ARNv nunca se separa de la proteína N y que es
esencial como unidad de transcripción junto con las proteínas L y P, pues se probó que el
ARNv desnudo transfectado en células In vitro no es infeccioso (Pattnaik et al., 1990).
Se ha determinado, por lo menos para el VSV (Vesicular Stomatitis Virus), que el
complejo RNP posee alrededor de 1200 copias de la proteína N, 500 de la fosfoproteína P
y tan solo 50 de la ARN polimerasa o proteína L. Sin embargo, estos niveles basales de
la ARN polimerasa dependiente de ARN y los otros dos factores involucrados en
transcripción y replicación son suficientes para generar ARNv de novo y todas las demás
proteínas contenidas en su genoma, incluyendo la glicoproteína G y la proteína de matriz
M (Strauss, 2002).
Tan pronto como la ARN polimerasa viral se une al único sitio de entrada en el extremo 3´
del ARNv se inicia la transcripción y se libera un ARN no codif icante de la región líder.
Este proceso continúa con la síntesis secuencial de los cinco ARNm con estructuras cap
10
en su extremo 5´, generadas por la ARN polimerasa viral, y poliadenilados en su extremo
3´ que facilitan la traducción y generan protección contra ARNasas celulares,
respectivamente. Como se observa en la Figura 2, el primer ARN mensajero que se
genera es el que dará origen a la proteína de nucleocápside N. Inmediatamente inicia el
proceso de transcripción adquiere la secuencia cap en el extremo 5´ como resultado de la
acción de la ARN polimerasa viral o proteína L. Al f inal de este gen se encuentra la
secuencia de reconocimiento AUACU7 donde la ARN polimerasa comienza a perder
afinidad por el ARNv y produce una secuencia de adeninas, conocida como Poli(A) que
queda ubicada en el extremo 3´ del ARN mensajero. De manera similar ocurre la síntesis
secuencial de ARNm de los otros cuatro genes virales donde la ARN polimerasa viral no
perderá afinidad al menos que encuentre la secuencia AUAC justo antes de una
secuencia U7 con y no se unirá al menos que se tope con la secuencia UUGUC, que se
encuentra después de los nucleótidos de la RIG, pues estas secuencias intergénicas son
obviadas por la proteína L. Estudios de transcripción In vitro han demostrado que la polimerasa viral tiene un periodo
de pausa que va desde 1 hasta 2 minutos en las RIG y luego, con una frecuencia del 70%
al 80% reinicia la transcripción del siguiente gen. Estos mismos estudios postulan que
este tiempo de pausa se debe al periodo que toma la proteína L en copiar la secuencia U7
que dará origen a la secuencia poli(A) en cada uno de los ARNm del VSV (Iverson LE et
al., 1981).
Las proteínas N, M, G y L son traducidas como un solo polipéptido, mientras que P se
traduce como tres proteínas de masas moleculares diferentes debido a la presencia de
codones de inicio alternativos. El codon AUG genera la proteína nominal P funcional, sin
embargo existen otro dos codones de inicio AUG dentro del gen que generan polipéptidos
de 55 y 65 aminoácidos, donde la proteína más corta es la versión truncada de la proteína
de 65 aminoácidos (Strauss, 2002). Se probó que estas versiones truncadas de la
proteína P poseen señales especiales de localización en membrana nuclear y de exporte
núcleo-citoplasma lo que permite hipotéticamente asociarlas con mecanismos de
fosforilación y oligomerización de la proteína P completa y relacionarlas también procesos
de regulación del transporte de otras proteínas virales como L y N en posibles fenómenos
de evasión de la respuesta antiviral mediante la interacción con proteínas nucleares
(Blondel et al., 2002 y 2005).
Aunque la síntesis de la proteína G se inicia, al igual que para todas la proteínas de los
Rabdovirus, en ribosomas libres, la proteína activa y su glicosilación ocurre en el retículo
11
endoplasmático y el aparato de Golgi (Centers for Disease Control: Compendium of
animal rabies control, 1995).
En cada una de las trascripciones del genoma viral ocurre un fenómeno de atenuación
como resultado de un gradiente en la acumulación de ARNm, así como elementos tipo cis
como la presencia de las estructuras secundarias de ARN en el extremo 5´ conocidas
como cap, la metilación del ARN y la poliadenilación en el extremo 3´, donde las proteínas
virales recién sintetizadas y proteínas celulares interf ieren directamente con el ARNv.
Estudios realizados por Stillman y sus colaboradores en 1997 con mini genomas
recombinantes del VSV permitieron establecer que los primeros tres nucleótidos de la
secuencia conservada 3´UUGUC….5´ de cada gen –secuencia complementaria al cap-
AACAG al inicio de cada gen en el ARNm) eran esenciales para la expresión genética,
pues el Uracilo en la posición 1 y la Guanina en la posición 3 permitían la acumulación de
transcritos de los genes virales en células infectadas debido a que los nucleótidos
correctos en estas posiciones hacían posible la generación de la estructura cap en el extremo 5´ mediante la adición, mediada por la polimerasa viral, de la secuencia 5´-
7mGpppG, responsables de dar forma a la estructura cap y de facilitar el inicio de la
transcripción (Stillman EA et al., 1997 y 1999). A diferencia de los retrovirus o de los virus
ARN de sentido positivo para los cuales el mecanismo de generación de la estructura cap
y las proteínas virales como los factores celulares involucrados han sido descritas, para
los Rabdovirus, el sistema por el cual los ARNm adquieren la secuencia de nucleótidos
que dará origen a la estructura cap y las proteínas involucradas no han sido definidas
completamente a la fecha, sin embargo, debido a que el ciclo de vida de esta familia de
virus se lleva a cabo completamente en el citoplasma de la célula hospedera, se pueden
descartar enzimas nucleares, al menos que exista tráfico desde el núcleo mediado por la
localización de las formas truncadas de la fosfoproteína P, opción no considerada por
Blondel y su grupo en su estudio del año 2005 (Blondel et al., 2005).
Análisis de la estructura cap de los transcritos del VSV han revelado que los dos primeros
fosfatos que constituyen la unión 5´-5´ de la Guanosina son contribuidos por la enzima
guanosina difosfato (GDP) a diferencia de los eucariota donde esta reacción es llevada a
cabo por la enzima guanosina monofosfato (GMP) (Abraham G et al., 1975). A partir de la
evidencia recogida, se ha propuesto que la polimerasa viral o proteína L está involucrada
en el proceso capping, pues aunque la proteína L tiene homología de secuencia con
proteínas de unión a nucleótidos, no parece tener relación con la enzima GDP, una
enzima nucleotidil transferasa (Shuman S, 1997). Sin embargo, virus deficientes para la
12
acción metiltransferasa han resultado tener mutaciones mapeadas dentro del gen para la
proteína L (Hercyk N et al., 1988), se sugiere entonces que existe relación entre la
proteína L y factores celulares con propiedades de unión a GDP como EF-1 (Gupta AK et
al., 1998).
En los virus ARN de sentido negativo esta característica de secuencial y polar es una
propiedad inherente de la polimerasa y garantiza que las proteínas esenciales y de las
cuales se necesita una mayor cantidad para el correcto ensamblaje de viriones infectantes
se produzcan en un mayor número de copias que aquellas que cuyo número es más
reducido dentro de los mismos, como la proteína L. De esta manera se controla que las
proteínas que se necesitan en mayor cantidad, y que se encuentran en las primeras
posiciones dentro del genoma, como N, M y G sean producidas en mayor cantidad, y
proteínas como L sean producidas en menor cantidad, corroborando las concentraciones
de proteína viral encontradas para VSV y haciendo más eficiente el ciclo de vida del virus
(Strauss, 2002).
1.2.2.2. REPLICACIÓN El otro evento crítico y fundamental para la correcta proliferación del virus es la replicación
del genoma viral. Los miembros pertenecientes a la familia Rhabdoviridae se caracterizan
por poseer una replicación dependiente de la producción de una hebra complementaria -
con sentido positivo- al genoma conocida como ARN viral complementario (ARNvc) o
antigemoma que constituirá el templado para el ARNv del nuevo virion. En contraste con
la transcripción, en el proceso de replicación del genoma la polimerasa viral debe ignorar
los codones de inicio y parada, las señales para el capping y poliadenilación y todas
aquellas señales que dan origen al ARN líder y ARNm monocistrónicos. A diferencia de la
transcripción, la replicación de los Rabdovirus sucede simultáneamente con la traducción,
particularmente de las proteínas que forman la nucleocápside viral: la proteína N y la
proteína P. Esta característica fue reportada por Davis y Wertz en 1982 donde en
ensayos In vitro inhibiendo la síntesis de proteínas con cicloheximida encontraron que la
síntesis de nuevas moléculas de ARN de sentido negativo era también inhibida, a
diferencia de ARNm que eran producidos de manera regular (Davis & Wertz, 1982). Al
igual que el ARNv el ARN antigenómico nunca se encuentra libre en el citoplasma; es así
que el proceso de replicación, al igual que el de transcripción, se lleva a cabo dentro del
complejo RNP. A diferencia que en otros sistemas, en los Mononegavirales el proceso de
replicación deber ir paralelo al de transcripción y traducción de proteínas pues el nuevo
13
genoma debe ser encapsidado de inmediato. A diferencia del ARNm que se genera a
partir del templado, el antigenoma posee secuencias señal para ser encapsidado. La
ausencia de estas señales es lo que permite, tempranamente post-infección, al ARNm
viajar hasta los ribosomas y traducirse, generar la suficiente cantidad de proteína
requerida para que luego por la acumulación de estas mismas, exista un cambio o switch
de transcripción a replicación. Este switch molecular se atribuye al cambio en la relación
de concentraciones existentes entre el ARNv y las proteínas del complejo RNP,
especialmente N, pues se ha postulado que a altas concentraciones de N, P y L, el ARNv
es encapsidado y la ARN polimerasa viral copia indiscriminadamente ignorando codones
de inicio y parada, generando ARN con sentido 5´ - 3´ o ARNvc que dará, gracias a la
polimerasa viral, origen a copias exactas del ARN de hebra sencilla sentido negativo
dentro del complejo, es decir, nuevos genomas del virus (Centers for Disease Control:
Compendium of animal rabies control, 1995). Este cambio genera ARNvc que servirá
como templado para la generación de ARNv genómico (Strauss, 2002). Adicionalmente, la presencia de este antigenoma resuelve el dilema de como los ARNm no interf ieran
mediante hibridización con el ARN genómico antes de la formación del complejo RNP,
pues si los genomas de ARN se sintetizaran fuera del complejo RNP, inmediatamente
habría interferencia de los mensajeros de ARN presentes en el medio y la formación del
complejo RNP y su posterior complementación a viriones infectivos no sería exitosa. De
manera breve, la Figura 3 muestra el esquema de replicación de los Rabdovirus como el
RABV.
El mecanismo molecular que gobierna este switch transcripción-replicación hasta ahora
está comenzando a ser descifrado, y el grupo de Raul Ladino de la Universidad de
California en San Francisco descubrió en 1998 para el virus Polio, un virus ARN de
sentido positivo, las bases moleculares y proteínas celulares y virales involucradas en el
fenómeno (Ladino et al., 1998). Dentro de estas bases moleculares están las secuencias
presentes en los extremos 3´ y 5´ del genoma viral que además de promover la unión de
los ribosomas y generar sitios poli(A) cumplen funciones estructurales, ya que para los
Bunyavirus, cuyo genoma lo constituye una sola hebra de ARN con sentido negativo, se
comprobó por microscopía electrónica la existencia de estructuras secundarias de ARN
que podrían estar fomentando, como promotores, la ciclización del ARNv para su
replicación (Strauss, 2002). El modelo propuesto para el switch de transcripción a
replicación propone que la molécula de ARN líder es encapsidada por la proteína N de
novo causando un evento de antiterminación que señala a la polimerasa para ignorar las
14
señales que dan origen a los ARNm. Una vez la polimerasa viral ha generado suficientes
copias complementarias al genoma y existen la cantidad necesaria de proteínas N y P,
este ARNvc es encapsidado y dentro de este complejo RNP (+) se inicia la síntesis de
hebras sencillas de ARN genómico que dará origen a la progenie viral, que se encuentra
de 20 a 50 veces más que el ARNvc (Fields, 2001).
Recientemente se ha propuesto un nuevo modelo donde la proteína P es la polimerasa
involucrada en replicación mientras que la proteína L es la polimerasa que actúa en
transcripción. Esta teoría surgió de estudios realizados con virus recombinantes mutantes
en el domino C-terminal de la proteína P. Estos virus permitieron la correcta replicación
del genoma del VSV mientras que la transcripción se vio fuertemente afectada debido a
que estas mutaciones abolían la correcta interacción de la fosfoproteína con la polimerasa
viral por la ausencia de una correcta fosforilación de la proteína mutada (Das et al.,
1997).
Debido a que la encapsidación de los genomas y antigenomas de los Rabdovirus ocurre simultáneamente con su síntesis, se ha propuesto que la señal de antiterminación y de
encapsidación reside en el extremo 5´ del genoma viral, región donde se encuentra la
secuencia líder, específ icamente cinco Adeninas que se repiten cada tercera posición
(Blumberg et al., 1983).
Recientemente, el grupo de Pattnaik descubrió mediante técnicas moleculares que
involucraban ARN subgenómico derivado de ADNc que las señales necesarias para la
encapsidación y la replicación se encuentran dentro de los 36 primeros nucleótidos en el
extremo 5´ y los últimos 51 nucleótidos en el extremo 3´, respectivamente (Pattnaik et al.,
1995). Para el RABV, la encapsidación y el switch molecular tienen una característica
especial: el estatus de fosforilación de la proteína N. A diferencia de otros Rabdovirus
como el VSV, la proteína N del RABV se fosforila en determinados residuos del
aminoácido Serina y la forma no fosforilada de esta proteína tiene una mayor afinidad por
la hebra de ARN líder, al menos en estudios In vitro (Dietzschold et al., 1999).
Específ icamente, una vez el ARNvc es encapsidado, las estructuras formadas por el
extremo 3´ del ARNvc encapsidado (5´ del ARN genómico) promueven la unión de la
polimerasa viral y se inicia la síntesis de la hebra complementaria, que dará origen al
genoma de la progenie viral.
Durante el proceso de replicación del genoma, la existencia de la proteína N es
fundamental, es así que para el VSV existe una relación de 1200 copias de N por cada
500 copias de P y cada 50 copias de L. La ausencia de la proteína estructural N
15
promueve indirectamente la degradación del ARNvc que da origen al ARNv, mientras que
por otro lado, junto con la proteína M, promueve su encapsidación.
Figura 3. Mecanismo de replicación de los Rabdovirus. Posterior a la entrada de viriones infectantes a una nueva célula hospedera el complejo RNP es liberado y una pequeña cantidad de proteína N de ARN polimerasa y su cofactor (proteína P) inician la transcripción de la cadena del ARNv de sentido negativo para la generación de proteínas virales. Por mecanismos de autorregulación de la transcripción mediados por la concentración de proteínas virales y ARNm viral se dispara un switch molecular que desencadena la síntesis de ARN antigenómico con sentido positivo. Este ARN es empaquetado dentro del complejo RNP inmediatamente y sirve como plantil la para la generación de nuevo ARNv genómico el cual es ensamblado dentro del RNP y transportado a membrana donde se fusiona con la proteína G que se encuentra anclada a la membrana celular. Los viriones son secretados y transportados a una nueva célula. Figura tomada de Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995.
Finalmente, el proceso de replicación involucra la maduración de los viriones dentro de su
hospedero. Un paso fundamental para la infectividad de los nuevos viriones es el correcto
procesamiento de sus proteínas, especialmente de la glicoproteína G, conocida como la
proteína de unión y fusión a la célula hospedera y el mayor antígeno de los virus pertenecientes a esta familia. La proteína G recién trascrita a ARNm viral posee una
secuencia de 16 nucleótidos, a modo de secuencia señal, en el extremo que dará origen
al dominio proteínico N-terminal que lidera su entrada en el retículo endoplasmático. Tan
16
pronto esta señal en el ARNm para G es reconocida, es cortada -por acción de enzimas
endógenas de retículo endoplasmático conocidas como signalasas- para dar origen al
péptido viral: una proteína de 495 residuos aminoacídicos con un dominio
transmembranal de 20 amino ácidos en su extremo C-terminal y uno citoplasmático de 29
amino ácidos en su extremo N-terminal. Esta proteína membranal tipo l es glicosilada en
dos residuos del aminoácido Asparagina y transportada hacia la membrana celular, donde
los viriones son ensamblados, adquiriendo su forma final e infectiva, forma que se
observa en la Figura 4 (Strauss, 2002).
Aunque inicialmente se creía que las 5 proteínas existentes en los Rabdovirus eran
exclusivamente estructurales, exceptuando la ARN polimerasa dependiente de ARN
(proteína L) y su cofactor (proteína P), se ha comprobado que tienen funciones en la
regulación de la replicación del virus, así como papeles sorprendentes en el ingreso a la
célula, transporte intercelular y evasión de la respuesta inmune.
1.2.3. PROTEÍNAS VIRALES 1.2.3.1. PROTEÍNA N Proteína de Nucleocápside. La proteína de nucleocápside posee la función crítica de
envolver estrechamente el ARN genómico viral dentro de un estructura resistente a
ARNasas celulares. A su vez, esta estructura o core proteína-ARN sirve como plantilla
para los procesos de transcripción y replicación. A partir de estudios hechos en el VSV,
se ha estimado que cada unidad de la proteína cubre alrededor de 9 nucleótidos de ARN
y que este complejo proteína-ARN interactúa durante la replicación y la transcripción con
los otros dos componentes de la nucleocápside viral: la fosfoproteína P y la ARN
polimerasa viral L, así como con la proteína de matriz M durante la condensación de la
nucleocápside, la unión a membrana y la gemación.
La proteína viral N reconoce secuencias específ icas para empaquetamiento dentro del
extremo 5´ del ARN viral genómico y antigenómico, regulando así los procesos de
transcripción y replicación viral mediante el switch molecular discutido anteriormente.
Debido a que la función fundamental de esta proteína es meramente estructural y otras
funciones relacionadas con patogénesis viral, evasión de la respuesta celular o regulación
genética propia o de su célula hospedera no han sido descritas, se sabe muy poco sobre
su estructura (Fields, 2001). Sin embargo, la supresión o mutación de cinco residuos
dentro de su extremo C-terminal elimina por completo su actividad de unión al ARN así
17
como la interacción con la proteína P, complejo proteínico esencial que evita la
agregación de monómeros de N (Das et al., 1993 y 1999).
1.2.3.2. PROTEÍNA P Fosfoproteína. Como se discutió anteriormente en el capítulo de transcripción, el gen P
codif ica para la proteína P así como para formas truncadas, una de ellas, recientemente
definida como la proteína C para el VSV (Fields, 2001). La proteína P o fosfoproteína en
combinación con la polimerasa viral forma el complejo transcriptasa-replicasa donde P
cumple la función de cofactor no catalítico de la polimerasa viral. La unidad proteínica se
compone de 265 residuos de aminoácidos y se encuentra en diferentes formas de
fosforilación dentro de las células y dentro de los viriones. Su estructura fundamental se
compone de un dominio ácido N-terminal que se compone de 150 residuos de
aminoácidos donde se encuentran los sitios de fosforilación. Desde el residuo 150 al 210
existe una región altamente variable entre las diferentes especies y diferentes cepas virales que se conoce como hinge o punto de giro. El segundo dominio, comprendido
entre el aminoácido 210 y el 244, también posee sitios de fosforilación. Finalmente se
encuentra el extremo C-terminal compuesto por 21 aminoácidos (Fields, 2001).
Los diferentes fenómenos de fosforilación que sufre la proteína P y que son la base para
la acción de la ARN polimerasa (proteína L), son llevados a cabo por proteínas
citoplasmáticas como las Caseína Kinasa ll sobre los residuos de Serina y Treonina
localizados en el dominio l ácido N-terminal (Barik et al., 1992). Estudios recientes han
determinado que la f ina regulación que se lleva a cabo durante la replicación está
mediada por fenómenos de fosforilación dentro del dominio ll, proponiendo que los
patrones diferenciales de fosforilación de la proteína P son la base de la regulación del
switch molecular entre transcripción y regulación (Hw ang et al., 1999). La formación de
trímeros es el requisito principal para la unión de esta fosfoproteína a la polimerasa viral y
al complejo proteína N-ARNv, formando la unidad de transcripción funcionalmente activa
L-P3-N-ARN (Gao et al., 1996). Como se estableció al principio de este capítulo, el gen
que codif ica para la proteína P en los Rabdovirus tiene un segundo marco de lectura que
da origen a dos pequeñas proteínas de carácter básico de 55 y 65 aminoácidos.
Estudiadas principalmente en el VSV, pero presumiblemente presentes en la gran
mayoría de los Rabdovirus del orden de los Vesiculovirus y algunos Lyssavirus, estas
proteínas tomaron los nombres de proteína C y proteína C´ (Fields, 2001). Estudios
realizados eliminando los codones de inicio para estas formas truncada de la proteína P
18
en el VSV mostraron que no existían diferencias en la cinética de crecimiento del virus, ni
en la cantidad de ARNm producido, ni en la concentración de proteína virales presentes,
ni en la disminución de las funciones celulares en comparación con el virus silvestre, al
menos en modelos In vitro (Schnell et al., 1996).
Figura 4. Proteínas y estructura de los virus pertenecientes a la familia Rhabdoviridae. La proteína de mayor tamaño es la ARN polimerasa dependiente de ARN (proteína L), seguida por la proteína antigénica de membrana y principal receptor viral para la entrada a la célula (proteína G). Continúa en orden descendente: la proteína fundamental para la estructura y función del complejo RNP debido a sus dominios de unión al ARN (proteína N), la fosfoproteína o cofactor de la ARN polimerasa viral (proteína P) y finalmente la proteína de matriz, encargada de la unión entre el complejo RNP y la membrana viral (proteína M). Figura tomada de Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995. Estudios de patogénesis y de transmisión In vivo han demostrado que tampoco existen
diferencias entre las cepas silvestres y sus contrapartes mutantes para la producción de
las proteínas C y C´ por lo que el papel de estas unidades parece no se esencial para los
fenómenos replicativos, transcripcionales, de patogénesis y transmisión del virus, o por lo
menos, no se ha descubierto todavía. Sin embargo, estudios realizados en RABV, donde
adicionalmente a P se producen cuatro formas truncadas conocidas como P2, P3, P4 y
19
P5, mostraron que estas versiones poseen señales especiales de localización en
membrana nuclear y de exporte núcleo-citoplasma lo que permite hipotéticamente
asociarlas con mecanismos de fosforilación y oligomerización de la proteína P completa y
relacionarlas también en procesos de regulación del transporte de otras proteínas virales
como L y N en posibles fenómenos de evasión de la respuesta antiviral mediante la
interacción con proteínas nucleares (Blondel et al., 2002 y 2005).
1.2.3.3. PROTEÍNA M Proteína de Matriz. Es la proteína de menor tamaño y con mayor abundancia dentro del
virion de los Rabdovirus. Aunque su función principal es servir de puente de unión entre
la membrana de virion y la nucleocápside (Mebatsion et al., 1999), como se observa en la
Figura 4, se ha descrito que también está fuertemente involucrada en la condensación de
la nucleocápside durante el ensamblaje del virus, en la disrupción del citoesqueleto de la
célula hospedera, y en la inhibición de muchas de las funciones celulares (Fields, 2001). Esta proteína es altamente básica y no posee dominios hidrofóbicos, excepto en su
extremo N-terminal, característica que le permite interactuar con la bicapa lipídica que la
partícula viral adquiere de la membrana de su hospedero justo antes de gemar (Lenard et
al., 1990). Adicionalmente, la proteína M sufre fenómenos de fosforilación en los
aminoácidos Serina y Treonina presentes entre las posiciones 20 y 35. Sin embargo, la
disrupción de estos sitios de fosforilación no afecta la funciones de ensamblaje de
viriones, por lo que el papel de esta fosforilación debe ser determinado (Lyles et al.,
1995). Una de las aproximaciones más interesantes a las funciones no estructurales de la
proteína M fue hecha por el grupo de Justice en 1995, cuando mediante la expresión del
gen M del VSV en un sistema de expresión In vitro lograron probar que regiones
conservadas del un dominio rico en prolina de esta proteína viral tenían la capacidad
intrínseca de inducir exocitosis mediante la vesiculación de la membrana de las células
transfectadas con dicha secuencia genética mediante la unión específ ica a dominios WW
determinados de proteínas celulares (Justice et al., 1995 y Harty et al., 1999). Mediante
estudios de microscopía confocal se ha descrito que una fracción de la proteína M se
encuentra asociada a la membrana celular, una fracción mayoritaria se localiza en el
citoplasma y una tercera fracción se localiza dentro del núcleo (Lyles et al., 1988).
Aunque no existen estudios reportados sobre características de la proteína de matriz para
ser transportada a núcleo, puede existir relación entre las características encontradas por
Blondel en el 2005 para las versiones truncadas de la fosfoproteína P, al menos para el
20
RABV (descritas en el capítulo anterior). Recientemente se ha descrito que la proteína M
está involucrada en la disrupción del tráfico nucleocitoplasmático mediante su interacción
específ ica con la nucleoporina Nupp98 así como en la regulación del switch molecular
(Finke et al, 2004). Regresando a la función estructural de la proteína M, reportes muy
convincentes muestran que esta proteína es fundamental para la estabilización de los
trímeros de la glicoproteína G y que solo las membranas de células que expresan formas
silvestres de la proteína M tienen la capacidad de unirse a la nucleocápside viral (Lyles et
al., 1992 y Rose et al., 1993) reafirmando la idea que la proteína M es el puente de unión
entre la membrana y la nucleocápside del virus.
1.2.3.4. PROTEÍNA G
Glicoproteína. Esta proteína transmembranal típica tipo l con la mayoría de sus
aminoácidos expuestos sobre la superficie del virion se distribuye a través de toda la
superficie del mismo con aproximadamente 400 unidades triméricas, para un total de 1200 unidades, como se observa en la Figura 4. Debido a que es la proteína viral más
antigénica ha merecido la mayor parte de los estudios para los Rabdovirus, especialmente
para el VSV y su homólogo RABV. La proteína G está asociada tanto con la envoltura
viral como con el complejo RNP y es considerada como la proteína fundamental de
ensamblaje de los Rabdovirus (Centers for Disease Control: Compendium of animal
rabies control, 1995). El gen G codif ica para una proteína de aproximadamente 500
aminoácidos en una sola cadena peptídica (Fields, 2001). En muchos Rabdovirus, esta
proteína se sintetiza como un precursor con aproximadamente 16 residuos adicionales a
modo de péptido señal en su extremo N-terminal que le permiten a la pre-proteína
asociarse con la chaperona BiP (GRP 78) en el retículo endoplasmático celular para la
adquisición de su conformación correcta (Bole et al., 1990). Posteriormente, los
oligosacáridos glicosilados de esta proteína entran en contacto con una segunda
chaperona molecular, la calnexina, en una acción secuencial de plegamiento a la
realizada por la chaperona BiP, migrando al aparato de Golgi, para 30 minutos más tarde
a su síntesis, aparezca anclada en forma trimérica a la membrana celular de la célula
hospedera (Blobel et al., 1978 y Helenius et al., 1994). Los sitios de glicosilación
mencionados anteriormente son dos ligados a sitios amino, uno de ellos en la posición
117 están fuertemente ligados tanto al correcto plegamiento así como una secuencia de
19 aminoácidos no cargados entre las posiciones 118 y 136 pare el VSV (y entre los
residuos 103 a 179 en el RABV) parecen estar relacionados con las características de
21
inserción a membrana y fusión de este glicoproteína de una manera pH dependiente
(Ghosh et al., 1993 y Whitt et al., 1995). Adicionalmente posee un dominio altamente
hidrofóbico de 20 aminoácidos que sin duda alguna es aquel que se encuentra
atravesando la membrana y un dominio citoplasmático de 29 aminoácidos que se ubican
en la parte interior del virion en posible contacto con la proteína M (Fields, 2001).
Estudios mutacionales de los dominios extracelulares y transmembranales de la proteína
G, como la disrupción de sus sitios de glicosilación, han mostrado que esta proteína se
mantiene como monómeros altamente agregados, plegados incorrectamente y unidos a la
chaperona BiP dentro del retículo endoplasmático. Si por el contrario las mutaciones se
llevan a cabo en el dominio citoplasmático de esta glicoproteína, aunque no se afecta el
correcto plegamiento molecular, la tasa de transporte de la proteína se ve afectada
signif icativamente, indicando que el dominio citoplasmático de la proteína posee la señal
de salida del retículo endoplasmático, posiblemente una señal diacídica conformada por
los aminoácidos Asp-X-Gly (Balch et al., 1997) mientras que la fracción extra y transmembranal poseen las señales de plegamiento y procesamiento (Machamer et al.,
1988).
La organización de los trímeros a través de la membrana citoplasmática es un proceso pH
dependiente donde solo a valores inferiores a pH 6.1 se induce el cambio conformacional
que dará origen a los trímeros estables debido posiblemente a que este bajo pH expone
un dominio hidrofóbico –no definido hasta el momento por falta de homología con otras
proteína transmembranales virales, pero donde el extremo N-terminal es un fuerte
candidato- que se inserta exitosamente dentro de la membrana celular (Helenius et al.,
1993 y Rose et al., 1984).
1.2.3.5. PROTEÍNA L Proteína Larga. Secuenciado por primera vez en 1984 por Schubert y su grupo de
colaboradores (Schubert et al., 1984), esta proteína esta conformada por un poco más de
2100 aminoácidos organizados en una sola cadena polipeptídica. Siendo la proteína viral
más grande, es razonable pensar en la multifuncionalidad de esta enzima de origen viral.
Como se observó en los capítulos referentes a transcripción y replicación, la ARN
polimerasa dependiente de ARN tiene funciones adicionales como el capping del ARNm,
la metilación de la estructura 5´ cap y la poliadenilación del ARN viral (Fields, 2001).
Aunque se han probado todas estas funciones para la polimerasa viral, no se han
reportado estudios de mapeo de los dominios involucrados en cada una de estas
22
funciones ni de los aminoácidos esenciales para las mismas, a excepción del dominio
metiltransferasa, involucrado en la metilación de las estructuras 5´ cap (Moyer et al.,
1988). Las mutaciones dentro de la proteína L causan poliadenilación aberrante en cada
uno de los ARNm, confirmando la función de esta proteína en este proceso (Hunt et al.,
1983). Adicionalmente, el uso del compuesto S-adenosil homocisteína, reconocido por
ser un fuerte bloqueador de la metilación en las estructuras cap, ha demostrado promover
la poliadenilación aberrante de ARNm del VSV (Rose et al., 1977).
1.3. VIRUS RABIA (RABV) 1.3.1. EPIDEMIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN Análisis detallados basados en reactividad cruzada con antígenos específ icos anti-
proteína N o mediante análisis de secuencias de ARN permiten incluir al virus dentro del
genero Lyssavirus el virus de rabia (RABV según la nueva nomenclatura establecida por
el Comité Internacional de Taxonomía Viral ICTV). Este virus es sin duda el virus perteneciente a la familia Rabdoviridae de mayor interés clínico. El género Lyssavirus
también contempla entidades como el Virus Mokola, el Virus del murciélago de Lagos, el
Virus Duvenhage, el Virus del Murciélago australiano y los Virus del Murciélago europeo
número 1 y número 2 (Baer, 1991).
Conocida desde el sigo XXlll A.C, la rabia es una enfermedad fatal y ampliamente
diseminada entre humanos y otro mamíferos, caracterizada por la transmisión horizontal,
donde el virus se encuentra principalmente en la saliva del animal rábico que la transmite
por su mordida (Strauss, 2002). El ciclo de transmisión a humanos se observa en la
Figura 5. Las primeras evidencias de la presencia del RABV como agente etiológico de la
encefalitis que lleva su nombre vinieron de reportes histopatológicos que mostraron la
existencia de agregados citoplasmáticos en neuronas y que se llamaron cuerpos de Negri.
La existencia de estos cuerpos se atribuye a la acción de las proteínas G y M,
principalmente de la glicoproteína, pues son estas las proteínas relacionadas con la
envoltura del virus y por ende las únicas capaces de inducir respuesta antiviral mediada
por anticuerpos neutralizantes. Aunque la transmisión ocurre exclusivamente por la
mordida de animales infectados y la penetración directa del virus a las células
musculares, se han reportado casos de infección por contacto por mucosas, donde ocurre
la contaminación de una herida abierta previamente, por rasguños, lamidas o inhalación
de aerosoles del animal infectado, donde una mordida no está involucrada. A modo de
ejemplo, datos estadísticos en Estados Unidos presentados a mitades de los años 90,
23
revelaron que tan solo el 3% de la infecciones con RABV, equivalente a cinco casos de
los 154 reportados entre 1950 y 1980, fueron debidas a exposiciones sin mordidas.
Específ icamente, cuatro de ellos fueron por contacto con aerosoles donde el RABV
estaba altamente concentrado, dos de ellos en exploradores de cuevas y los otros dos en
investigadores de laboratorio (Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies
control, 1995). Sorprendentemente, y como caso clínico que abrió una nueva rama de
investigación en el RABV, el quinto caso reportado ocurrió en un paciente quién recibió un
transplante de córnea proveniente de un paciente moribundo de encefalitis quién nunca
fue diagnosticado RABV positivo, como lo reporta el Centro para el Control de
Enfermedades (CDC por sus siglas en inglés) en su informe de RABV en 1995 (Centers
for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995).
Figura 5. Ciclo de la infección por RABV. Caracterizada por ser una enfermedad viral de transmisión horizontal, el virus tiene un ciclo de mantenimiento endozootico donde sus vectores son mamíferos que sufren de síntomas igualmente pronunciados pero con tiempos de incubación y desarrollo de la enfermedad rábica muchos menores. Generalmente por mordida, contacto con mucosas y/o saliva o muy raramente por aerosoles el RABV alcanza su hospedero humano, donde, dependiendo del lugar de contacto, especie y condiciones del animal infectado, condición de salud e inmune del paciente y de la cepa viral inoculada, la enfermedad, caracterizada por parálisis focal y/o encefalitis aguda, puede desarrollarse entre los 5 días hasta más de 2 años. Figura tomada de Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995.
24
En un tema que se tratará con más profundidad en el capítulo concerniente a
patogénesis, la infección por RABV se inicia en la periferia, donde se ha recibido la
mordida, y mediante mecanismos de transporte y evasión de la respuesta defensiva e
inmune innata de la célula todavía no comprendidos en su totalidad alcanza el Sistema
Nervioso Central (SNC) llegando hasta el cerebro donde causa una encefalitis muy aguda
y fatal, liderando la enfermedad conocida como rabia (Strauss, 2002).
Aunque mucha literatura reporta a receptores de Acetilcolina como la molécula blanco
para la entrada del RABV a las neuronas, es muy claro por los resultados entregados por
la evidencia In vitro, que este Rabdovirus utiliza diferentes receptores de membrana
celular para su transporte desde la periferia, generalmente células musculares, hasta el
SNC. Toda esta evidencia permite plantear la hipótesis de receptores diferenciales
dependiendo del contexto celular, de la fase de la infección y transporte y de las
características de virulencia de la cepa que ha ingresado (Strauss, 2002, Fields, 2001 y
Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995). Continuando con el proceso de desarrollo de la enfermedad, se ha estimado que la probabilidad de
desarrollar rabia a partir de una mordida por un animal rábido depende tanto de la
localización de la mordida, la especie de mamífero rábico que causa la mordida, así como
la virulencia de la cepa de RABV. Mordidas en la cara sin tratamiento antirábico
inmediato desencadenan rabia entre el 40% y el 80% de los casos; mientras que
mordidas en las extremidades inferiores desencadenan en rabia tan solo entre el 0% al
10% de los casos. Otro factor determinante en la severidad de la enfermedad radica en el
tiempo de incubación del virus. Estudios epidemiológicos han revelado que la
enfermedad puede progresar a rabia en periodos que van desde una semana hasta varios
años; pero que tan pronto el virus alcanza el cerebro, la tasa a la que alcanza los demás
órganos es muy elevada. El órgano por excelencia para la correcta transmisión del virus
son las glándulas salivales, dado que la única forma de transmisión natural del virus es
por los f luidos salivales, pues los cambios en el comportamiento inducidos por la infección
cerebral hacen que el animal infectado se torne muy agresivo y tienda a morder a otros
animales. Mientras este es el comportamiento generalizado de otras especies de
mamíferos infectadas con el RABV, en humanos este enfermedad se caracteriza por
causar parálisis generalizada o parcial, ceguera y cambios neurológicos no específ icos
pero muy marcados, caracterizados por ansiedad excesiva, agitación y delirio.
Afortunadamente, la agresividad y beligerancia como consecuencia de la infección no se
desarrolla en humanos, así que la transmisión entre personas no se ha reportado; sin
25
embargo su severidad es igual o quizás peor, dado que, de dos a siete días después que
los síntomas característicos de la enfermedad rábica aparece, el estado comatoso y
posterior muerte son prácticamente inevitables. Tan solo se han reportado tres o siete
casos de humanos con enfermedad rábica que se han recuperado de los miles que
ocurren año tras año (según la fuente consultada) (Strauss, 2002 y Centers for Disease
Control: Compendium of animal rabies control, 1995).
Epidemiológicamente, se ha reportado la presencia de RABV prácticamente en todas las
regiones y prácticamente en todos los países del mundo. Hasta hace menos de una
década, se consideraba que la única región donde el RABV no era endémico era
Australia, país donde no se habían reportado casos de animales salvajes o domésticos
infectados. Sin embargo, recientemente se demostró que una gran variedad de
murciélagos hematófagos australianos son portadores de un virus perteneciente al género
Lyssavirus, conocido como Virus del Murciélago australiano, que desde su reporte han
causado dos episodios fatales de rabia en humanos (Strauss, 2002). Por otro lado, existen países donde el RABV se ha eliminado por completo, caso del Reino Unido, que
tras procesos de vacunación de vida salvaje y doméstica ha erradicado prácticamente por
completo este virus y las estadísticas no revelan caso alguno de rabia en humanos desde
hace varias décadas. Finalmente, países como Estados Unidos y otros muchos en
Europa, tras procesos similares al de Reino Unido llevados a cabo desde las décadas 40
y 50 del siglo pasado, han reducido la población de animales rábicos a menos del 10% de
la población total en riesgo, incluyendo tanto la fauna salvaje como doméstica (Centers for
Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995). Aunque estas medidas
han surgido gran efecto en la incidencia de la enfermedad desde mediados del siglo
pasado, desde hace un par de décadas en países donde la enfermedad se creía
controlada en porcentajes mayores al 90%, ha habido un inesperado incremento de la
enfermedad en animales salvajes con un ligero pero considerable aumento en los casos y
muertes humanas, como se observa en la Figura 6 (Strauss, 2002). Estos índices pueden
estar relacionados con el gran dilema que han afrontado los epidemiólogos con respecto a
la persistencia del RABV en la naturaleza: teniendo en cuenta que el mecanismo de
transmisión involucra un animal infectado y sintomático que muere rápidamente, dicha
persistencia puede estar asociada a un fenómeno poco estudiado: la infección latente. De
hecho, en humanos, se ha reportado media decena de casos donde la enfermedad se ha
desarrollado tras siete años o más tras la exposición, y al menos, en uno de ellos, debido
a cambios hormonales durante la pubertad. Teniendo en cuenta estos reportes, sería
26
razonable pensar que existe dentro de las especies salvajes, un reservorio natural y
asintomático del virus, fenómeno que se encuentra en muchas especies virales
antropogénicas. Un candidato para esta función son los murciélagos pues se ha
comprobado que post-infección, estos animales demoran mucho más tiempo en morir que
otros mamíferos, tiempo durante el cual son un reservorio y vector viable para la
dispersión del RABV, sea por su mordida o por medio de aerosoles debidos a sus heces o
su saliva. Sin embargo, análisis a nivel de ARN genómico han demostrado que los virus
encontrados en los murciélagos, como el virus Mokola, dif ieren signif icativamente de los
Lyssavirus encontrados en otros mamíferos salvajes y domésticos; y la mezcla de
diferentes especies de Lyssavirus, casi todos asociados a enfermedad rábica es muy
poco frecuente (Strauss, 2002).
La enfermedad rábica continua siendo un problema de salud pública considerable,
especialmente en países en desarrollo por varias razones: los animales domésticos
siguen siendo los principales vectores de esta enfermedad para los humanos, los regímenes de vacunación contra este virus no son obligatorios para toda la población, la
fase aguda de la enfermedad es generalmente intratable y f inalmente los mecanismos
exactos de patogénesis y la biología molecular de la interacción virus-hospedero no está
descrita por completo. Así, aunque existen las medidas para el control coyuntural de la
enfermedad, en el mundo anualmente más de un millón de personas reciben tratamiento
antirrábico post-contacto con el virus y lastimosamente, 50000 personas mueren
anualmente como resultado de la infección (Strauss, 2002).
1.3.2. DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO Durante siglos, la experiencia permitía inferir que la saliva de los animales infectados con
el virus era el vehículo transmisor de la enfermedad, pero solo hasta 1804 Zinke pudo
transmitir la enfermedad a partir de este f luido corporal. Posteriormente, a f inales del siglo
XIX, Louis Pasteur logró establecer el concepto de vacuna profiláctica contra el RABV a
partir de una cepa adaptada a animales de laboratorio que tras sucesivos pasajes In vivo
perdió por completo sus características virulentas y neurotrópicas sin perder su carácter
antigénico. Una anécdota muy interesante y que se convirtió en el primer reporte hecho
sobre la efectividad de las vacunas profilácticas en humanos es que el día 6 de julio del
año 1885, el joven francés Joseph Miester, quien había sido mordido 14 veces por un
perro rábico fue inmunizado exitosamente con los preparados disecados hechos por Louis
Pasteur a partir de médula espinal de conejos. Posteriormente, mediante virus cultivado
27
en tejido nervioso e inactivado con fenol en lugar de ser desecado, se constituyó como la
vacunación aceptada contra virus rabia durante décadas. Sin embargo, dado los altos
índices de accidentes rábicos producto de la introducción de animales domésticos a áreas
urbanas, la investigación para la generación de vacunas menos riesgosas continuó, y así
a principios los años 60 apareció la vacuna rábica inactivada derivada de virus cultivados
en líneas celulares humanas (Strauss, 2002).
Figura 6. Casos de enfermedad rábica en Estados Unidos en animales domésticos y salvajes (escala de la derecha) contra casos humanos (escala de la izquierda) durante la segunda mitad del siglo pasado, desde el año de 1940 hasta el año 2000. Datos recopilados por Smith et al., 1995 y publicados por Strauss en 2002. Figura tomada de Strauss, 2002. Sin embargo, actualmente líneas celulares animales como la línea de riñón de mono
verde africano (VERO) estandarizadas en los laboratorios del Instituto Pasteur en Francia
también han generado vacunas altamente efectivas contra el RABV. En Estados Unidos,
la Administración de Drogas y Alimentos (FDA por sus siglas en inglés) ha concedido
licencia a las vacunas logradas en células humanas diploides como la HDCV y a la
vacuna rábica adsorbida (Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies
control, 1995). Otra característica que hace única a la vacuna antirrábica es que además
de ser profiláctica es también terapéutica. Tras la exposición al virus, la vacuna es
efectiva, e introducida con el suero antirrábico brinda protección inmune. Esta
característica se debe a que el lapso de tiempo entre la exposición y el desarrollo de la
28
enfermedad y mucho más amplio que para cualquier otro virus (Strauss, 2002), lo que
permite que la vacunación genere y potencie la respuesta inmune mucho más rápido que
lo que el RABV tarda en llegar al sistema nervioso.
Además del RABV, el virus Mokola, el virus del murciélago de Lagos, el virus Duvenhage,
el virus del murciélago europeo número 1 y número 2 y el virus del murciélago australiano
son causantes de enfermedad rábica en mamíferos. Sin embargo, aunque todos estos
virus pueden causar enfermedad rábica en humanos, la vacuna profiláctica y el
tratamiento terapéutico existente es exclusivo para RABV, hecho que debido al aumento
de casos de transmisión y enfermedad de las otras seis especies abre un nuevo y
promisorio campo de investigación básica y aplicada para la generación de vacunas así
como para la comprensión y asociación de la biología molecular de estos virus y sus
mecanismos moleculares de patogénesis (Strauss, 2002).
Mediante análisis de secuencias de ARN, mediante anticuerpos monoclonales que
permiten diferenciar las cepas f ijas, mediante las características de adaptación a ciertas especies así como a líneas celulares se ha podido discernir entre las diferentes especies
y cepas –silvestres o cepas calle- de estos Lyssavirus. Este tipo de diagnóstico permite
establecer en ciertos casos, el lugar y animal transmisor en los episodios rábicos. Por
otro lado, en el contexto clínico, aunque la detección temprana es difícil, el diagnóstico se
lleva a cabo mediante la detección de antígeno viral, principalmente la proteína G de
superficie, de anticuerpos específ icos, de ARN viral o mediante el aislamiento directo de
partículas virales. Debido a la cinética de la infección, una sola técnica de diagnóstico
suele ser insuficiente, así que organizaciones de salud internacional recomiendan que si
existe sospecha de enfermedad rábica se deben llevar a cabo el siguiente protocolo de
diagnóstico estandarizado: muestras de suero seriadas de pacientes que no hallan sido
vacunados para la detección de anticuerpos mediante la técnica rápida de inhibición de
foco por f luorescencia (RFFIT por sus siglas en inglés) anti RABV, muestras de f luido
cerebroespinal -aunque el antígeno viral aparece 2 a 3 días después de aparecer en
suero- que suele ser conveniente en pacientes vacunados, muestras de saliva durante las
primeras 2 o 3 semanas de enfermedad para el cultivo de virus en líneas celulares de
neuroblastoma o en animales de laboratorio por inoculación directa de la muestra y
f inalmente biopsias de piel tomadas específ icamente de la base del cuello, para la
detección de antígeno viral mediante inmunofluorescencia. Aunque, en etapas
tempranas de la enfermedad, las biopsias de piel o de cerebro suelen ser negativas, la
inmunofluorescencia se considera el método de diagnóstico antemortem más sensible.
29
Sintomatología y enfermedad debida al RABV se sospecha generalmente en casos de
encefalitis viral no explicada en conjunto con una historia de contacto con f luidos salivares
de algún mamífero, especialmente en zonas endémicas para el virus, debido a que la
rabia humana suele manifestarse de manera similar a encefalitis por herpesvirus,
arbovirus, tétanos, malaria cerebral, enfermedades rickettsiales o tifoideas, síndrome de
Guillan-Barre, polineuropatía inflamatoria aguda, intoxicación por drogas o venenos o
parálisis por poliomielitis y botulismo (Centers for Disease Control: Compendium of animal
rabies control, 1995).
El control de esta enfermedad se fundamenta en la vacunación regular de las especies
animales susceptibles, especialmente las domésticas como perros y gatos. A mitades del
siglo pasado, se llevaron a cabo en Estados Unidos y Europa jornadas de vacunación
masiva de animales domésticos, programa que en pocos meses mostró una disminución
dramática tanto en los casos de rabia animal como en humanos. Sin embargo, hacia esa
misma época se incrementaron los reportes de casos de rabia en animales salvajes como se observa en la Figura 6 debido en parte a que al mismo tiempo se inició un mejor
control epidemiológico del virus en escenarios silvestres. Actualmente se estima que la
incidencia del RABV en animales silvestres es aproximadamente 10 veces mayor que en
animales domésticos y en humanos (Strauss, 2002 y Centers for Disease Control:
Compendium of animal rabies control, 1995). Debido a que actualmente los animales
silvestres se constituyen como el mayor riesgo de infección en humanos, la vacunación
oral con virus atenuados o vacunas recombinantes mediante el novedoso uso de
murciélagos como vectores ofrece una esperanza para la disminución de la transmisión
del virus y por ende, desarrollo de la enfermedad en animales salvajes. En cuanto a
humanos se refiere, el mejor control de la enfermedad es la prevención, evitando la
exposición a la enfermedad pues la vacunación masiva contra el virus en humanas es
inusualmente baja debido a los altos costos de generación de la vacuna y la protección
temporal que esta ofrece, así como la baja probabilidad de adquirir la enfermedad.
Existen poblaciones de alto riesgo donde la vacunación se hace necesaria: veterinarios,
cazadores, trabajadores en áreas silvestres de alta incidencia y personal de laboratorio
que manipula el virus. Bajo este criterio de prevención adoptado prácticamente en todo el
mundo, la metodología de control suele ser post-exposición. Esta consiste en la limpieza
local de la herida, la aplicación de suero hiperinmune antirábico y la vacunación
profiláctica (Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995).
30
1.3.3. PATOGÉNESIS A diferencia de la enfermedad causada por el VSV que generalmente es de rápido
progreso y eficientemente eliminada del hospedero gracias al sistema inmune, la
enfermedad causada por el RABV de de lento progreso, de respuesta inmune tardía y con
un diagnóstico por lo general letal. Los modelos moleculares obtenidos a partir del VSV
son por lo general extrapolables al RABV independiente del género al que pertenezcan y
a las grandes diferencias en la patología que causan en las diferentes especies de
mamíferos que infectan. La citopatogénesis de estos virus parte de la experiencia
recogida en los muchos tipos de líneas celulares de vertebrados y algunos invertebrados
que son infectadas tanto por el VSV como por el RABV. Entre estas se encuentran: la
línea de riñón de cría de hámster BHK-21, la línea tumoral humana HeLa, la línea
linfoblastoide humana Raji y las células de cornea de conejo. Sin embargo, solo la línea
BHK-21 ha ofrecido una replicación efectiva de las partículas virales (aproximadamente
100000 por célula) con un porcentaje de infección del 10% de las células en cultivo. Las otras líneas presentan bajos porcentajes de infección (5% o menos), baja producción de
partículas virales (con valores de hasta 1 partícula por células), con producción de ARN
genómico alterada, generación de proteínas virales de composición alterada y sin la
presencia de efectos citopáticos evidentes (Fields, 2001).
Durante mucho tiempo se creía que la única y más potente proteína antigénica del RABV
era la glicoproteína G, sin embargo se ha demostrado que el complejo RNP del virus
purif icado o recombinante en forma de vacuna protege contra dosis letales de la cepa
Challenge Virus Strain (CVS por sus siglas en inglés) una de las más letales y
neurotrópicas (Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995).
Por lo general la citopatogénesis se caracteriza por cambios estructurales en las células
conocidos como cell rounding y que son debidos a la expresión de la proteína de matriz
M. Esta proteína causa la disrupción de las uniones célula-célula por la rápida
depolimerización de la actina, tubulina y vimentina. Esta depolimerización del
citoesqueleto celular causa el rompimiento de las f ibras membranales, de los microtúbulos
y de los f ilamentos intermedios (Blondel et al., 1990). Adicionalmente, se ha probado que
la glicoproteína G es también altamente tóxica para la célula probablemente debido a la
disrupción de la membrana celular (Rose et al., 1983).
Una de las características evolutivas más conservadas entre los virus es la capacidad que
tienen estos para inhibir las síntesis de proteínas celulares como resultado de la
desviación de los mecanismos moleculares de la célula hospedera a su favor. La
31
infección por el VSV y por RABV In vitro resulta en la inhibición substancial de la síntesis
de proteínas celulares dentro de las 4 primeras horas, periodo de tiempo que coincide con
aquel donde se encuentra la mayor cantidad proteínas virales lo que sugiere que existen
mecanismos de competencia generados por el virus. Precisamente Lodish y Porter
encontraron que esta competencia puede deberse a una sobresaturación de los
ribosomas por la gran cantidad de ARNm viral que corresponde a aproximadamente al
75% del ARNm total encontrado en la célula (Lodish et al., 1980). Aunque esta estrategia
puramente pasiva de disrupción propuesta por Lodish y Porter parecía dar solución al
problema de la relación proteína viral-proteína celular, Reichmann y colaboradores en
1983 encontraron un mecanismo un poco más específ ico basado en la selectividad que
ciertas secuencias de nucleótidos presentes en los extremos 5´ y 3´ de los ARNm ejercían
sobre los ribosomas celulares (Reichmann et al., 1983).
Además de la disrupción del citoesqueleto y una inhibición evidente en la síntesis de
proteínas, la citopatogénesis se caracteriza por una inhibición en la transcripción, en el transporte del ARNm del núcleo al citoplasma y la síntesis de ADN en la célula hospedera
(Fields, 2001). Además de la depolimerización del citoesqueleto, trabajos realizados por
Lyles y su grupo de trabajo en 1992 lograron establecer que la proteína de matriz M
parece estar involucrada también en la inhibición de la síntesis de ARNm y su posterior
expresión fuera del núcleo. Posteriormente, en 1998 el mismo Lyles profundizó en el
tema y junto a otro grupo de investigación pudo concluir que la proteína M interfería con la
ARN polimerasa ll celular mediante la inactivación del factor de transcripción TFllD (Lyles
et al., 1992 y Lyles et al., 1998). Adicionalmente, puede existir relación entre las formas
truncadas de la proteína P que fueron descritas por Blondel y colaboradores en el 2005
como proteínas de transporte y exporte citoplasma-núcleo (Blondel et al., 2005) y la
proteína M, pues Dahlberg y Her reportaron en la revista Science en el año de 1997 que
esta proteína viral inhibía el transporte celular mediado por la familia de proteínas Ran
GTP dependientes, específ icamente la Ran-TC4 y sus factores asociados (Dahlberg et
al., 1997). La relación existente radica en que hipotéticamente la forma adicional de P (P2
a P5) puede transportar a M del citoplasma al núcleo para que inicie su inhibición del
transporte del ARNm al citoplasma. Adicional a la función que la proteína de matriz M
descrita anteriormente, otros estudios sugieren que la secuencia de ARN líder viral está
implicada en la inhibición de la síntesis de ARNm celular. Aunque no existen estudios
concluyentes que asocien a la secuencia de ARNv líder con la inhibición de ARNm
síntesis, estudios realizados con luz UV mostraron que viriones tratados con este tipo de
32
radiación eran capaces de transcribir esta región del ARN y de inhibir la síntesis de ARNm
celular así como la síntesis del ADN celular (MacGow an et al., 1988), de la misma forma
la transfección In vitro de células con oligodeoxinucleótidos homólogos a esta secuencia
líder causó una disminución sustancial en el ARNm generado en la célula tratada (Wagner
et al., 1983 y 1984) y trabajos realizados en 1982 por Keene y su grupo de colaborados
mostró que el ARN líder se localizaba al núcleo de las células infectadas poco tiempo
post-infección, resultados que podrían confirmar la función de esta secuencia no
traducible de ARN viral en la inhibición del ADN y por lo tanto del ARNm celular (Keene et
al., 1982). Sin embargo como se ha reportado para la proteína viral M la inhibición de la
síntesis de proteínas celulares no se puede deber únicamente a la interferencia mediada
por la secuencia líder del ARNv.
En los párrafos anteriores se revisó la patogénesis desde una perspectiva molecular. A
continuación se revisará de manera general los aspectos f isonómicos que caracterizan la
patología del RABV. Como se sabe, la infección por este virus se caracteriza generalmente por una invasión y daño agudo del SNC. Se han descrito cinco etapas
generales para esta viremia en humanos: incubación, prodrómica, periodo neurológico
agudo, estado de coma y muerte con diferentes títulos virales como se observa en la
Figura 7. Usualmente el virus se incuba y comienza a manifestarse dentro de los tres
primeros meses. Tan pronto la infección se ha manifestado, no existen agentes
antirrábicos específ icos, así que solo la aplicación inmediata de la vacuna profiláctica
acompañada de la vacuna terapéutica y suero antirrábico son las únicas herramientas
existentes para prevenir la aparición de la enfermedad.
Tras la inoculación, el virus ingresa al Sistema Nervioso Periférico (SNP) después de un
periodo de tiempo variable dentro del tejido muscular donde ocurre replicación viral a muy
bajas tasas. Este periodo se conoce como incubación. En esta fase de la infección, los
datos clínicos han demostrado que no es posible encontrar antígenos virales, lo cual hace
aún más intrigante el proceso de patogénesis del RABV (Campbell, 1988). Desde las
células musculares migra a través de las uniones neuro-musculares, hacía el SNC y luego
directamente hacia el cerebro mediante lo que se cree es un proceso de activación de la
supervivencia neuronal y evasión de la respuesta inmune, hipotéticamente fundamentado
en tasas de replicación viral por debajo del estándar óptimo. Específ icamente este tema
se analizará con más profundidad en el capítulo 4 (Vías Apoptóticas o de Supervivencia
Neuronal Activadas por Infección con Virus Rabia). Ya en el cerebro, activa mecanismos
de respuesta celular muy agresivos que se manif iesta con una encefalitis aguda que
33
conlleva a estado comatoso y muerte del paciente. Antes de la aparición de los síntomas
neuronales específ icos de la enfermedad, en la fase prodrómica generalmente aparecen
síntomas no específ icos tales como malestar general, f iebre y fatiga; acompañados a su
vez por síntomas que involucran el sistema respiratorio como dolor de garganta,
expectoración y disnea; el sistema gastrointestinal como anorexia, disfagia, nauseas,
vómito, dolor abdominal y diarrea; y el sistema nervioso como dolor de cabeza, vértigo,
ansiedad, aprehensión, irritabilidad y neurosis. Otro rasgo que generalmente acompaña
las etapas medias de la infección es el dolor y la parálisis del sitio de inoculación viral que
acompañado por una historia de contacto reciente con un animal sugiere fuertemente el
desarrollo de la enfermedad. Finalmente, la encefalitis aguda se manif iesta con
anormalidades físicas de carácter neurológico como agitación, fotofobia e hidrofobia,
priapismo, libido aumentada, insomnio, pesadillas y depresión así como perturbaciones
marcadas de carácter psiquiátrico (Centers for Disease Control: Compendium of animal
rabies control, 1995). Los análisis patológicos han revelado congestión en los vasos meníngeos, daño
perivascular, necrosis tisular focalizada, inclusiones intracitoplasmáticas neuronales
acidofílicas y en algunos casos neurofagia. Desde el cerebro el virus inicia un proceso de
transporte hacia los demás órganos y tejidos del cuerpo donde ya no se limita a células
del SNC (Campbell, 1988).
Existen dos tipos de clasif icación para la fase neurológica aguda dependiendo del
comportamiento del paciente. Se clasif ica como rabia “furiosa” si predominan
anormalidades neurológicas como hidrofobia e hiperactividad; mientras que se conoce
como rabia “tonta” si en el cuadro clínico predomina la parálisis focal o generalizada,
convulsiones e hiperventilación. Estos dos comportamientos clásicos generados por la
infección están fuertemente relacionados con la genética del virus debido a que cuadros
clínicos de rabia “furiosa” son característicos de una infección por RABV que se manifestó
a nivel celular exclusivamente en el cerebro y que durante su transporte a través del SNC
activó vías de supervivencia y subversión celular. Por otro lado, cuadros clínicos de rabia
“tonta” permiten inferir sobre el carácter menos virulento de la cepa inoculada ya que la
parálisis de ciertas partes del cuerpo es el reflejo del daño neuronal causado por la
respuesta del sistema inmune adaptativo (linfocitos T citotóxicos, células asesinas
naturales y macrófago) e innato (mediado por la activación de las cascadas de
señalización pro-apoptóticas). La producción de citoquinas, interferón e inmunoglobulinas
(IgM e IgG) está muy bien documentada durante procesos de infección y de vacunación y
34
se ha probado que erradican la infección si se generan en etapas tempranas de la
enfermedad (Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995).
Este tema se revisará en el capítulo de respuesta inmune.
1.3.3.1. ADSORCIÓN DEL VIRUS La patogénesis causada por cualquier entidad viral está en íntima relación con la forma
como esta ingresa y se desarrolla dentro de las células hospederas. La infección por
RABV se inicia por la adhesión de la partícula viral a los receptores específ icos presentes
en la superficie celular.
Para este Rabdovirus, los receptores diferenciales parecen depender del entorno celular y
entre ellos se encuentran el receptor nicotínico acetilcolina (nACh) (Lentz et al., 1983), la
molécula de adhesión neuronal (NCAM) (Thoulouze et al., 1998) y el receptor de
neurotrofina (p75NTR) (Tuffereau et al., 1998). Estos receptores han sido difíciles de
identif icar debido al amplio rango de hospederos, a las diferentes propiedades de unión de la glicoproteína G y principalmente del entorno celular (Lafon, 2005).
Existen otros factores que dif icultan los estudios cuantitativos de adsorción del virus,
como los valores de pH extracelular. Por ejemplo, para el VSV al igual que para RABV
existe un valor máximo de tolerancia a pH para la unión eficiente (entre pH 6.5 y pH 6.0).
A un pH de 6.3 la infectividad In vitro se aumenta aproximadamente 20 veces en
comparación con la eficiencia a pH neutro (Whitt et al., 1998). Sin embargo, aún dentro
de este estrecho rango de pH la unión del virus no es completa y no presenta el equilibrio
calculado teóricamente para los Rabdovirus (Simons K et al., 1982).
A nivel molecular se ha propuesto que esta unión se debe a los cambios
conformacionales de la proteína G inducidos por la acidez del medio sugiriendo que el
sitio de unión de esta proteína viral se expone solo durante un periodo de transición del
medio de básico a ácido (Whitt et al., 1998). Estudios hechos por Rose en 1980 y
posteriormente por Pastan y su equipo en 1982 mostraron que para el VSV existen al
menos dos sitios de unión uno de ellos saturable y otro no saturable. Mediante ensayos
de competencia en células Vero se comprobó que el receptor de membrana se trataba de
un fosfolípido, específ icamente fosfatidilserina.
Estudios posteriores para otros Rabdovirus, como el virus de la hemorragia septicémica
viral, un Rabdovirus animal, demostraron que la unión de la glicoproteína viral con
receptores fosfolipídicos es un parámetro conservado para esta familia viral (Coll et al.,
1996). Desafortunadamente para el Rabdovirus de mayor importancia clínica, el RABV, la
35
determinación de sus receptores celulares ha sido más controversial y solo la evidencia
recientemente recopilada por Monique Lafon permite postular los tres receptores
específ icos anteriormente mencionados. La metodología adoptada para la postulación del
receptor nicotínico (AChR) como receptor para el RABV se basó en la similitud de
secuencias entre la glicoproteína viral y las neurotoxinas presentes en el veneno de las
serpientes, como la a bungarotoxina o a-BGT (Smith et al., 1982).
Figura 7. Etapas de la infección por RABV: incubación, prodrómica, periodo neurológico agudo, estado de coma y muerte. Aunque, el periodo de incubación puede ser de varios años, usualmente el virus se incuba y comienza a manifestarse dentro de los tres primeros meses. En el periodo de incubación y prodrómico el virus se encuentra secuestrado en las células musculares dentro del sitio de inoculación en un proceso de replicación sub-óptimo. Posteriormente, inicia un proceso de transporte a través de las uniones neuro-musculares ingresa al SNC llegando hasta el cerebro donde causa encefalitis aguda de carácter letal. Desde el cerebro inicia su migración hacia otros órganos, incluidos glándulas salivares, órgano crítico para su transmisión vertical. Figura tomada de Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995.
Posteriormente esta hipótesis fue corroborada por varios grupos de investigadores que
mediante el uso de inhibidores del AChR o trabajando con líneas celulares defiencientes
para AChR. Sin embargo, estos mismos trabajos permitieron establecer que no solo este
receptor constituía el sitio de unión de este virus y solo hasta hace unos pocos años se
pudieron describir con exactitud dos receptores adicionales para la entrada del virus: el
receptor de neurotrofinas p75 (p75NTR) y la molécula de adhesión celular neuronal
(NCAM) (Tuffereau et al., 1998 y Toulouse et al., 1998).
36
1.3.3.2. ENTRADA Los viriones infecciosos se fusionan a la membrana de la célula hospedera por un
proceso conocido como adsorción. Varios estudios han probado que para el ingreso del
RABV a las células musculares y/o neuronales existe una interacción directa de trímeros
de la glicoproteína G (Whitt et al., 1991 y Gaudin et al., 1992) viral con receptores
específ icos dependiendo del ambiente y contexto celular. Se postula que después de la
adsorción el virus penetra al citoplasma por endocitosis y se agrega en endosomas que
posteriormente se fusionan con la envoltura viral causando la liberación del complejo RNP
en el citoplasma de la célula hospedera como se observa en la f igura 8 (Centers for
Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995). De manera similar que
para los demás miembros de la familia Rabdoviridae, posterior a la entrada del ARNv del
RABV dentro del complejo RNP, se inicia una transcripción controlada que parece regular
las concentraciones de proteínas virales en lo que parece hacer parte de un fenómeno de
evasión de la respuesta inmune del hospedero. El complejo RNP es fundamental en el proceso de infección de una nueva célula, pues como Pattnaik y su grupo lo comprobaron
en 1997, el ARNv desnudo inyectado en células susceptibles no es infeccioso (Pattnaik et
al., 1997).
Después de la unión a la membrana de la célula los viriones son endocitados por una vía
dependiente de Clatirina proteína encargada del tráfico de sustancias –principalmente
proteínas- a través de la membrana en forma de vesículas (Schmid et al., 2005). Este tipo
de endocitosis fue probada por Simons y su grupo de colaboradores en 1982 junto con los
hallazgos referenciados sobre el estrecho rango de pH al cual los viriones se unen y son
internalizados dentro de la célula satisfactoriamente. Trabajando con la línea celular
MDCK observaron por microscopía electrónica que la internalización de los viriones del
VSV se da en forma de vesículas dependientes de Clatirina que le confieren al virus
resistencia a proteasas y que lo transportan hasta los lisosomas donde el pH bajo genera
una reacción de fusión que libera el ARNv al citoplasma (Simons et al., 1982).
Adicionalmente en 1991 Lenard y sus colaboradores descubrieron que tan pronto los
viriones han ingresado al citoplasma a única proteína que se solubiliza es la proteína de
matriz M, mientras que la proteína de nucleocapside N y la glicoproteína G permanecen
dentro del complejo RNP y asociadas al citoesqueleto de la célula hospedera dentro de
endosomas y lisosomas. Esta distribución especial del complejo RNP planteó para Lenard
y su grupo la hipótesis que estos endosomas constituían el sitio primario de transcripción
viral, sin embargo no definieron función alguna para la distribución de la proteína M
37
(Lenard et al., 1991). Aunque todavía no se conocen las causas por las cuales solo la
proteína M se disocia, evidencia reciente permite inferir que esta proteína estructural de
matriz está involucrada en otras funciones esenciales para la supervivencia viral y en el
caso del RABV en posibles funciones de evasión de la respuesta celular.
1.3.3.3. ENSAMBLAJE Y GEMACIÓN Después que el virus ha entrado al citoplasma de la célula y ha liberado su genoma
dentro del complejo RNP se llevan a cabo los procesos de transcripción y replicación que
ya se revisaron en capítulos anteriores. Tan pronto se ha generado suficiente ARNv y
proteínas virales inicia el proceso de ensamblaje. Según Fields en Virology el proceso de
ensamblaje se puede dividir en tres fases diferentes: Encapasidación del nuevo genoma
viral de ARN dentro de la proteína de nucleocápside N, condensación del complejo RNP y
asociación con la membrana plasmática mediante la proteína de matriz M y liberación de
la partícula viral envuelta. La encapsidación ocurre dentro del citoplasma y ocurre debido a que la cadena de ARNv
genómico que se genera a partir del ARNvc es cubierta inmediatamente por las proteínas
N, P y L recién sintetizadas para formar el complejo RNP. Además de ser un proceso
fundamental para la generación de nuevos viriones, y como se describió en capítulos
anteriores, la encapsidación del ARNv asegura que los mecanismos de transcripción y
replicación viral sean eficientes (Fields, 2001). Después de la encapsidación del genoma
viral, el complejo RNP se asocia con la membrana citoplasmática (y con la glicoproteína G
viral que se encuentra anclada) mediante la proteína de matriz M, en una estructura
fuertemente condensada conocida como esqueleto viral. Brow n y New comb en 1981
utilizaron una estrategia novedosa para estudiar la integridad y estructura del complejo
RNP. Este equipo de investigadores sometió viriones purif icados a un detergente iónico
simulando el proceso de entrada y liberación del RNP. Bajo estas condiciones el
esqueleto viral pierde su estabilidad y condensación producto de la disociación de la
proteína de matriz M. La adición de proteína M purif icada junto con la eliminación del
detergente devolvió la estabilidad y la estructura condensada al complejo RNP (Brow n et
al., 1981). Adicionalmente la adición de proteína M al complejo ribonucleoprotéico inhibe
la transcripción del ARNv como fue probado por Wagner en 1979. Siguiendo una
estrategia similar a la utilizada en el estudio anterior se observó que los fenómenos de
ensamblaje y desensamblaje relacionados con la proteína de matriz inf luían de manera
signif icativa en la infectividad y eficiencia de transcripción del virus (Wagner et al., 1979 y
38
Lyles et al., 1998). Estas ideas junto con los fenómenos de regulación descritos en los
capítulos de transcripción y replicación permiten la construcción de un entorno genético y
estructural que rige el contexto completo de cómo virus los Rabdovirus como el RABV
generan el switch molecular de transcripción a replicación y adicionalmente cómo generan
cantidades de ARNv y proteínas por debajo del umbral de reconocimiento de los
mecanismos de defensa como la vía IFN, la presentación del antígenos virales mediante
el CMH y hasta de un sistema tan sensible como el ARN de interferencia (ARNi).
Hipotéticamente, la condensación del RNP no ocurre hasta que este complejo no este en
contacto con la membrana citoplasmática (Lyles et al., 1989). En segundo lugar este
contacto está mediado por la presencia inicial de una fracción (10% a 20% según lo
reportado por Rose y Chong) de proteína M anclada a la membrana (Rose et al., 1993)
probablemente mediado por la glicoproteína.
Tan pronto se ha condensado el ARNv dentro del RNP las partículas Rabdovirales se
liberan de la célula hospedera en un fenómeno conocido como gemación. Este proceso depende en gran parte del correcto empaquetamiento del RNP dentro de la membrana
citoplasmática y el acople perfecto de la fracción citoplasmática de los monómeros de
glicoproteína G anclados a la membrana con la proteína de matriz M que sirve de puente
entre la nucleocápside y la envoltura viral. Adicionalmente, estudios hechos Lyles en
1996 mostraron que virus mutantes para la proteína M generaban un porcentaje mucho
menor de viriones infectantes y aún mas interesante, aquellos que lograban gemar
satisfactoriamente poseían una forma esférica. La adición de la proteína silvestre
mediante transfección transitoria con ADN plasmídico regresaba las características de
forma de bala a las partículas virales (Lyles et al., 1996). Estudios realizados un año
antes por Li y colaboradores mostraban que la transfección transitoria con el gen
codif icante para la proteína M, en ausencia de cualquier otra proteína viral, promovía la la
invaginación de la membrana y la formación y gemación de vesículas (Li et al., 1995),
demostrando otro de las funciones intrínsecas de este producto viral relacionadas con la
gemación.
En cuanto a la glicoproteína G que se encuentra transmembranalmente anclada se ha
demostrado que solo la interacción con el RNP permite su trimerización (forma funcional y
estructuralmente activa) y que posee dominios en su fracción intracelular involucrados con
la gemación de los viriones infectantes, posiblemente dominios que fomentan la curvatura
de la membrana para su correcta fusión y posterior gemación. Finalmente, el proceso de
liberación de las partículas virales parece estar relacionado con ciertos factores celulares.
39
Figura 8. Ciclo de infección y replicación del RABV. Los viriones infecciosos penetran la membrana de la célula hospedera por adsorción. Se han postulado receptores específicos para el RABV como el nACh, el NCAM y el p75NTR. Después de la adsorción el virus penetra al citoplasma y se agrega en endosomas que se fusionan con la envoltura viral causando la liberación del complejo RNP en el citoplasma de la célula hospedera. Figura tomada de Velandia M, 2005.
Harty y su grupo de investigación probó en 1999 que existe un dominio rico en Prolina
dentro de la proteína M que interacciona con los dominios WW de ciertas proteínas
celulares y cuyo resultado es la liberación de las partículas virales fuera de la célula
infectada (Harty et al., 1999).
40
1.3.3.4. RESPUESTA INMUNE La respuesta inmune es una de las características fundamentales en la patogénesis
causada por enfermedades virales debido a que es esta reacción la causante de los
fenómenos inflamatorios y apoptóticos que alteran la función de células, tejidos y órganos.
Aunque el modelo más utilizado para el estudio de los Rabdovirus es el VSV, este modelo
no es viable para el estudio del mayor Rabdovirus de importancia clínica en el mundo: el
RABV. Sin embargo, a partir de la respuesta esencial que este Rabdovirus genera es
posible establecer analogías con los procesos que ocurren a nivel molecular en el resto
de los Rabdovirus. En un capítulo posterior se tratarán más a profundidad los fenómenos
de respuesta inmune, apoptóticos y de supervivencia celular característicos de la
infección por RABV.
Entre los fenómenos inmunes generalizados se encuentra la respuesta vía interferón
(IFN). Al igual que para la mayoría de los patógenos virales, en las infecciones por
Rabdovirus los interferones proveen la primera y más crítica línea de defensa. Aunque la respuesta por IFN –y de hecho, todo tipo de respuesta inmune-, varía dependiendo de la
cepa y por supuesto de la especie viral, una característica que comparten todos los
Rabdovirus es la sensibilidad que la replicación tiene en respuesta a estas moléculas,
trayendo como resultado la disminución de la tasa de expansión del virus hasta que la
respuesta por anticuerpos surge efecto (Fields, 2001). Esta idea fue corroborada por
Schertler y sus colaboradores en el año de 1996 utilizando ratones transgénicos
deficientes para IFN-a y para el receptor IFN-b. En estos ratones observaron una
diseminación rápida y masiva del VSV en todos los órganos con muerte en un par de días
(Schertler et al., 1996). En cuanto a la respuesta inmune humoral mediada por
anticuerpos, basada en la presencia de inmunoglobulinas neutralizantes que reconocen
diferentes sitios dentro del dominio extramembranal de la glicoproteína G, esta parece
estar en íntima relación con la respuesta primaria generada vía IFN. En el mismo trabajo
de Schertler se comprobó que la administración pasiva de anticuerpos anti-glicoproteína
G devolvía a estos ratones la capacidad de eliminar la infección por VSV y evitar su
diseminación sistémica. En relación a la segunda rama de la respuesta inmune, la
administración de linfocitos T específ icos contra el VSV no tuvo efecto alguno sobre los
ratones infectados. En un estudio anterior se había demostrado el papel secundario que
la respuesta inmune celular mediada por linfocitos T tiene en las infecciones por
Rabdovirus. Utilizando ratones deficientes en linfocitos T CD8+ se demostró que estos
eran igual de resistentes a los ratones con niveles normales de linfocitos T CD8+ a la
41
infección por VSV (Moss et al., 1987). Aparentemente contradictorios resultan los
diferentes estudios relacionados con este tema. Mientras que los trabajos del Moss no
mostraban función alguna de los linfocitos T citotóxicos en la neutralización de la infección
por Rabdovirus, la experiencia de Rose y su grupo de trabajo un año antes mostraba que
existían epítopes dentro de las proteína N y G específ icamente reconocidos por linfocitos
T citotóxicos vía CMH clase l. De hecho este epítope, conocido como N52-59 y
perteneciente al VSV fue uno de los primeros epítopes virales identif icados y
secuenciados (Rose et al., 1986). Adicionalmente, se han descrito varios epítopes
específ icos para linfocitos CD4+ (vía CMH clase ll) localizados dentro de la glicoproteína
viral G (Castro et al., 1994).
Por su lado, para el RABV, como es reportado por Craig Hooper en la revisión hecha en el
2005, la respuesta inmune mediada por linfocitos T CD4+ está definida según la cantidad
de glicoproteína G expresada por la cepa viral. En este caso, las cepas más
neuropatogénicas y letales se caracterizan por expresar cantidades limitadas de proteína G y por no estimular poblaciones de linfocitos T CD4+ ni anticuerpos neutralizantes,
debido quizás a un menor impacto sobre el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH)
clase ll, elemento encargado del reconocimiento del antígeno viral a través de los
linfocitos T CD4+; mientras que las cepas menos letales y por ende más pro-apoptóticas
se caracterizan por cantidades altas de proteína G y por estimular la respuesta de
poblaciones de linfocitos T CD4+ específ icos así como de anticuerpos neutralizantes
(Hooper, 2005). De esta manera pareciera establecerse que aunque la respuesta
mediada por linfocitos T CD8+ (asociados a el CMH tipo l) no es la principal línea de
defensa contra los Rabdovirus, la respuesta por linfocitos T CD4+ juega un papel
determinante en la patogénesis y en el progreso de la infección. Sin embargo, 10 años
atrás Zinkernagel y su grupo mostraron que la infección por Rabdovirus como el VSV
generaba una respuesta rápida de anticuerpos neutralizantes tipo IgM independientes de
la activación de linfocitos CD4+ seguida por la aparición inmunoglobulinas IgG
dependientes de linfocitos CD8+ en respuesta a la presencia de la glicoproteína G sobre
las partículas virales (Zinkernagel et al., 1995). Una conclusión preeliminar basada en los
estudios anteriormente referenciados permite establecer que el VSV y el RABV divergen
en cuanto a la estimulación de la respuesta inmune y aunque siempre se ha querido
homologar al VSV con el RABV, estos trabajos muestran que la biología molecular de
este último es mucho más compleja y que sus características patogénicas pueden ser
producto de dicha divergencia.
42
2. LA APOPTOSIS O MUERTE CELULAR PROGRAMADA 2.1. INTRODUCCIÓN Y CARACTERÍSTICAS GENERALES Hace un poco más de 100 años Paul Ehrlich acuñó el término “horror autotoxicus” a los
desórdenes autoinmunes. Hace solo hasta un par de décadas se pudo definir que este
“horror autotóxico” se debía en la mayoría de los casos a procesos celulares mediados
por la deregulación del fenómeno de Muerte Celular Programada (MCP) que solo fue
llamado formalmente Apoptosis en el año de 1987 por Wyllie con base en sus
características citopatológicas (Wyllie AH, 1987). La apoptosis es definida como un
proceso de autolimitación de la expansión de los tejidos y de eliminación de las células
que ya han cumplido su ciclo (Anaya, 2005) o que por condiciones genéticas o de
infección se encuentran alteradas estructural y funcionalmente. La apoptosis es un
proceso f isiológico contínuo caracterizado por una muerte celular programada que no
causa fenómenos de inflamación debido a que no se expone material intracelular al
espacio extracelular, característica que preliminarmente permite establecer ciertas características bioquímicas del fenómeno (Harrington y Schultz, 2003 y Anaya et al.,
2005).
Actualmente el estudio del fenómeno apoptótico ocupa la mayoría de la investigación en
inmunología clínica debido a su altísima relevancia en enfermedades tan importante como
el cáncer, una enfermedad claramente causada por el crecimiento y supervivencia
desmesurados de ciertas poblaciones celulares (revisado por Przedborski et al., 2001).
Ha sido tal su importancia en la medicina actual que la investigación en esta área ha sido
reconocida con el premio Nobel en Medicina. El día 7 de octubre de 2002 el
estadounidense Robert Horvitz y su equipo del MIT (Massachussets Institute of
Technology) y los ingleses Sydney Brenner y John Sulton del Salk Institute for Biological
Studies (San Diego, California) y del Sanger Institute (Cambridge, Inglaterra)
respectivamente, recibieron este galardon por las investigaciones hechas en
Caenorhabditis elegans que permitieron descubrir las bases moleculares involucradas con
la apoptosis durante el crecimiento de órganos y tejidos (Harrington y Schultz, 2003). En
los capítulos posteriores se referenciarán algunos de los estudios realizados por Horvitz,
la mayoría de ellos publicados en la revista Science.
Se ha establecido que la apoptosis, en general, es un proceso genético predeterminado
que no esta solamente involucrado en la homeostasis del sistema inmune sino también en
la regulación de la f isiología celular (Herrmann y Kalden, 2003). Durante siglos la muerte
celular por apoptosis había sido observada pero solo hasta hace un siglo se comenzó a
43
comprender los mecanismos celulares y solo hasta hace un par de décadas los
fenómenos bioquímicos, moleculares y genéticos que rigen la supervivencia y muerte
celular. Los mecanismos por los cuales las células generan su propia muerte y como
luego sus restos son eliminados del entorno celular son eventos cruciales para el correcto
desarrollo y funcionamiento del organismo y de su sistema inmune. Entre estos
mecanismos se incluyen la eliminación de las células malignas o infectadas mediante la
activación de linfocitos T citotóxicos y células asesinas naturales (Natural Killers o NK por
sus siglas en inglés) y tan pronto la respuesta del sistema inmune ha pasado o en los
sitios inmuno-privilegiados como los ojos o el cerebro, la inactivación de las células
encargadas de la respuesta inflamatoria y la eliminación de las linfocitos T activados.
Dixit y Ashkenasi, autores pertenecientes al departamento de oncología molecular de la
empresa californiana Genentech publicó en el año de 1998 en la revista Science una
revisión muy interesante sobre uno de los hallazgos más signif icativos en relación al
fenómeno apoptótico: los ligandos del Factor de Necrosis Tumoral (TNF por sus siglas en inglés) que hasta ese año contaba ya con 16 miembros, casi todos sintetizados como
precursores de proteína transmembranales tipo ll o como moléculas solubles que se unen
a la superfamilia de genes de los receptores de TNF, todos ellos conocidos como
receptores de muerte o DEATH como Fas (CD95 o Apo1) o el receptor TNFR-1 (p55 o
CD120a), dos de los receptores de muerte mejor caracterizados. Al unirse a sus ligandos
respectivos, estos receptores de membrana transmiten las señales apoptóticas mediante
la interacción del dominio citoplasmático con alugunas proteínas citosólicas ricas en
Cisteína y con una extraordinaria capacidad proteolítica conocidas como caspasas (Dixit
et al., 1998). De la proteasas ricas en Cisteína que cumplen el requisito de homología
estructural y de secuencia establecido por Horvitz desde 1998, 17 proteínas han sido
asociadas con el programa de muerte celular por apoptosis y adicionalmente con el
control de la proliferación de linfocitos T así como el correcto progreso del ciclo celular
(Los et al., 2003 y Aggarw al et al., 1999). Sin embargo las caspasas no son la únicas
proteasas involucradas en el proceso de apoptosis. A propósito de este tema, el Doctor
David E. Johnson de la Universidad de Pittsburg publicó una revisión en septiembre de
2000 en Leukemia donde se recapitula la experiencia genética y bioquímica que ha
podido demostrar la existencia e importancia de las proteasas no caspasas como las
catepsinas (proteasas lisosomales), calpainas, granzimas y el complejo proteasoma en el
fenómeno de muerte celular programada (Johnson, 2000).
44
En los capítulos posteriores se revisará detalladamente algunas de las características y
algunos de los componentes más importantes del fenómeno de apoptosis para en un
capítulo posterior relacionarlo con la evidencia existente para la infección por RABV.
2.2. LA APOPTOSIS Y LA HOMEOSTASIS CELULAR La MCP consta de cuatro pasos fundamentales según Herrmann y Kalden en su libro
Apoptosis and Autoimmunity publicado en el 2003. Estos pasos son: la iniciación que
puede estar mediada por un receptor específ ico para muerte celular en unión a una
proteína ligando o mediada por mitocondria. La activación de las caspasas y por último la
ejecución, donde se incluyen los fenómenos de activación de las nucleasas y los cambios
membranales para culminar con la fagocitosis y la remoción de los cuerpos apoptóticos
(Herrmann y Kalden, 2003) como se observa de manera esquemática en la Figura 9.
Debido a que un fenómeno celular tan relevante requiere de innumerables pasos y rutas
moleculares, se ha descubierto que tanto los procesos de activación de la apoptosis como los procesos de inhibición están altamente regulados por proteínas específ icas lo que
confirma el carácter genético y la modulación ambiental de la apoptosis los cuales se ven
alterados en desordenes inmunes como el cáncer o la diabetes Mellitus tipo-l. De hecho
esta revisión realizada por Behrens en el 2001 aporta un dato muy interesante donde se
afirma que el aumento desmesurado y aparentemente epidémico de este tipo de diabetes
(donde las células pancreáticas son blanco de destrucción del sistema inmune) puede
estar asociado al aumento de las prácticas higiénicas y a la baja exposición a
microorganismos comunes por lo cual el sistema inmune se torna inusualmente sensible
(Behrens et al., 2001).
Durante mucho tiempo se han tratado de marcar las diferencias bioquímicas y
estructurales entre la necrosis y la apoptosis, y aunque la prueba estándar en el
diagnóstico de enfermedades autoinmunes caracterizadas por la apoptosis es la prueba
de TUNEL o el ensayo de tinción para las roturas de la hebra de ADN, aunque esta última
no se puede considerar específ ica para el diagnóstico de MCP. Un análisis bastante
acertado para la diferenciación entre estos dos tipos de muerte celular ha sido la
observación que tras la muerte por apoptosis no se presentan reacciones inflamatorias
pero este criterio no se puede tomar solo en el diagnóstico de apoptosis en enfermedades
infecciosas o autoinmunes.
Por otro lado, la presencia de moléculas ejecutoras y receptores tipos DEATH tampoco
garantiza la activación exclusiva de vías apoptóticas. Existen moléculas como TNF o vías
45
como la de la perforina/granzima que son sobreexpresadas tanto en procesos de necrosis
como de apoptosis, mientras que moléculas exclusivamente apoptóticas como FasL, una
proteína que se encuentra de forma soluble o anclada a membrana y cuyo receptor
específ ico es Fas/APO-1, sirven como moléculas señal para el reclutamiento de células
neutrofilas que una vez activadas causan muerte celular por necrosisd del tejido (Nabel et
a, 1998).
Figura 9. Esquema de los pasos apoptóticos. La existencia de receptores específicos para la muerte programada, como Fas (CD95+) o daños en la mitocondria vía Bax o Bak-dependiente activan los fenómenos proapoptóticos que desencadenan la activación de las caspasas, proteasas encargadas de degradar más de 100 constituyentes celulares. Esta proteólisis l idera cambios estructurales y funcionales en la célula entre los que figura la exposición sobre la superficie celular de ligandos fagocito-específicos, el colapso de la estructura nuclear y la activación de nucleasas y la inactivación de la maquinaria transcripcional y traduccional. Figura tomada de Randhawa y Afford, 2000.
Aunque la experiencia patológica hace muy difícil la diferenciación entre estos dos tipos
de muerte celular, estudios histopatológicos han permitido establecer que los linfocitos T
CD8+ son importantes ejecutores de la muerte celular, mucho más que las poblaciones
celulares constituyentes de la respuesta inmune innata como los macrófagos, células
dendríticas, células asesinas naturales y hasta los neutrófilos (Herrmann y Kalden, 2003).
46
Así, queda establecido que la consolidación de una teoría única para la apoptosis es una
tarea que requiere la disección de los componentes bioquímicos, moleculares y genéticos
exclusivos que interactuan para causar la muerte celular con la participación activa de la
misma célula que está muriendo.
Dadas las características moleculares (bioquímicas y genéticas) de la apoptosis, queda
establecido que este proceso se inicia debido a un rango amplio de señales tanto de
carácter intrínseco como extrínseco y aunque la primera impresión que el término
“apoptosis” genera se relaciona con infecciones, queda claro que esta MCP es un
fenómeno fundamental para el desarrollo, supervivencia y homeostasis del contexto
celular y no exclusivamente en episodios patológicos como cuando se subregula en el
cáncer o se sobrerregula en fenómenos degenerativos (Herrmann y Kandel, 2003). La
evidencia experimental ha revelado que la MCP es fundamental en los procesos de
maduración y funcionalidad de las poblaciones de linfocitos T y B, eliminando aquellas
células no funcionales que no expresan receptores para antígenos, receptores con muy baja afinidad o aquellas que expresan receptores que reaccionan contra el propio CMH
(para los linfocitos T) o que producen autoanticuerpos (para los linfocitos B) en un proceso
conocido como selección negativa y positiva. (Bevan et al., 1998 y Kruisbeek et al.,
1999).
De una manera similar dentro del sistema inmune maduro, la inhibición de las rutas
apopóticas fomenta la supervivencia y reproducción de una línea linfocitaria especializada
mediante la expresión de la familia de proteínas Bcl-2 antiapoptótica durante una infección
y tan pronto la infección es superada procesos apoptóticos mediados por Fas/APO-1 se
encargan de eliminar la sobrepoblación de dicha línea como lo evidenció Cory y su grupo
de investigación en 1995, donde con una estrategia in vivo de diferentes infecciones
inducidas a modelos animales, evaluaron la expresión de moléculas involucradas en la
apoptosis (Fas/APO-1) y en la supervivencia celular (Bcl-2) de los clones linfocitarios
patógeno-específ icos antes, durante y después de la infección (Cory et al., 1995). En los
linfocitos T CD4+ el fenómeno apoptótico se activa mediante la estimulación repetitiva de
sus receptores (RCT o TRC en inglés) o mediante un proceso que involucra la ausencia
de citoquinas, en el cual los linfocitos mueren por ausencia de estos factores troficos. Por
otro lado la inducción de apoptosis en los linfocitos B se induce por la estimulación el los
RCB (o BCR por sus siglas en inglés) (Pape et al., 2001 y Krammer, 2000).
Los estudios anteriores permiten poner en evidencia la íntima y compleja relación que se
abordará en un capítulo posterior: el papel de la apoptosis durante las infecciones como
47
mecanismo de defensa y de mantenimiento de la homeostasis del contexto tisular y en lo
que concierne a esta revisión, a la infección por RABV (Lafon, 2004).
2.3. RUTAS CELULARES DE ACTIVACIÓN APOPTÓTICA El gran avance en el entendimiento de la apoptosis ha venido a partir del descubrimiento
de las caspasas como las proteínas activadoras de los fenómenos de muerte celular
programada y por ende por ser también estas proteínas de acción proteolítica los blancos
para la inhibición de este proceso celular. Una vez transmitidas las señales apoptoticas
como resultado de la reacción ligando TNF-receptor DEATH ocurre una activación
mediada generalmente por autoprocesamiento de las caspasas. Sin embargo la
activación de estas proteasas ejecutoras puede provenir de mecanismos intrínsecos como
cambios de permeabilidad en la mitocondria, proceso conocido como la ruta apoptótica
dependiente de la mitocondria o ruta intrínseca. En cualquiera de los dos casos el
fenómeno apoptótico se caracteriza en estados f inales por la fragmentación del ADN cromosomal, la posterior fragmentación de la membrana citoplasmática y a diferencia del
fenómeno necrótico, la ausencia de moléculas pro-inflamatorias. Una vez la célula se ha
suicidado los procesos de limpieza de los cuerpos apoptóticos convergen con los de
limpieza de los necróticos; ambos llevados a cabo por las células dendríticas (CD) y por
los macrofagos. Las células dendríticas son células presentadoras de antígenos
profesionales y se constituyen comom la primera línea de defensa celular. Una vez
“cargadas” con el antígeno específ icos, las CD promueven la estimulación de los linfocitos
T CD4+ cooperadores y la activación de los linfocitos T CD8+ a linfocitos T citotóxicos
capaces de destruir las células infectadas (Herrmann y Kandel, 2003).
Como en muchos de los estudios recientes en biología celular de eucariotas, el nematodo
Caenorhabditis elegans ha servido como el modelo más sencillo de experimentación con
mayor homología con los humanos. Estudios realizados preeliminares en 1986 revelaron
que durante el desarrollo de este organismos 131 de las 1090 células que lo componen
morían por apoptosis y mediante el rastreo genético de organismos defectuosos para esta
característica se encontraron mutaciones en proteínas que serían conocidas como CED-3
y CED-4 (Caenorhabditis Elegans Development protein 3 and 4). Posteriormente en 1992
el mismo Horvitz identif icó una proteína (CED-9) que actuaba en pasos anteriores a las
proteínas CED-3 y CED-4 y cuya mutación causaba un exceso en la apoptosis de los
embriones de este nematodo. Lo más interesante de este estudio fue que al mutar
conjuntamente CED-3, CED-4 y CED-9 se evitaba el exceso de apoptosis causado por
48
CED-9, mostrando las características pro y antiapoptóticas de estas proteínas y trazando
a su vez las rutas por la cual la MCP se activa y se inhibe. Finalmente, el mismo Horvitz
encontró en 1998 otra de las moléculas involucradas EGL-1. La mutación y subsecuente
pérdida de función en EGL-1 generaba un aumento desmesurado en la supervivencia
celular por la falta de unión a la proteína CED-9). De este modo se planteó a CED-9
como un regulador negativo de la apoptosis (o inhibidor) el cual que une y suprime la
acción apoptótica de CED-4. Sin embargo, cuando EGL-1 se induce, se une a CED-9
evitando la unión de esta proteína con CED-4 y permitiendo su fusión con CED-3,
formando un complejo proapoptótico. Todas estas moléculas en C. elegans resultaron
tener homologías completas en organismos superiores como el hombre como se observa
en la Figura 10.
Análisis de homología f ilogenética, estructural y funcional realizados en 1996 identif icaron
a CED-3 como una caspasa y con homología con la enzima convertidota de interleukina 1
(ICE por sus siglas en inglés), la proteasa rica en Cisteína CPP32 o en otras palabras, con la caspasa 1 (Horvitz et al., 1986, 1992, 1996, 1998). Bajo este contexto y con
metodologías muy similares se inició una carrera tecnológica para el descubrimiento de
estas proteasas ricas en Cisteína de mamíferos que se conocerían con el nombre de
caspasas y que hasta el año de 2003 contaba con 14 proteínas en su lista, todas ellas
cumpliendo con un rol fundamental en el proceso de apoptosis y haciendo cada vez más
extenso y complicando el panorama de las rutas que rigen este fenómeno celular como se
observa en la Figura 11 (Herrmann y Kalden, 2003).
2.3.1. RUTA EXTRÍNSECA Como se dijo anteriormente, la activación de las rutas de MCP o apoptosis se inician por
la unión de una proteína ligando específ ica a un receptor específ ico transmembranal
conocido como receptor DEATH perteneciente a la superfamilia de genes TNF como el
que se observa en la Figura 11. Estos ligandos pueden ser activados por diferentes
agentes como: luz ultravioleta que altera el ADN, eliminación de los factores de
crecimiento en el medio o fármacos utilizados en quimioterapia (Hannun et al., 1997). Por
su parte, los receptores se caracterizan por: 1) Poseer un dominio extracelular rico en
Cisteína compuesto por tres regiones extracelulares, 2) Por estar conformados por tres
cadenas polipéptidas idénticas y 3) Por compartir características de unión y de
señalización similares. A la fecha se conocen seis diferentes receptores DEATH: Fas,
49
TNFR1, DR3, TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand) también conocido como
TRAIL-R1 o DR4, TRAIL-2 o DR5 y DR6 (Dixit et al., 1998).
Figura 10. EGL-1 es definido como una proteína proapoptótica que se une a CED-9 evitando su unión con CED-4 a la vez que fomenta la unión de esta molécula apoptótica con CED-3 para formar un complejo de activación de la apoptosis. Estudios bioquímicos similares y análisis de secuencias de ADN así como análisis traduccionales encontraron homologías en células de otros mamíferos. Figura tomada de Herrmann y Kalden, 2003. Análisis de homología fi logenética, estructural y funcional realizados en 1996 identificaron a CED-3 como una caspasa y con homología con la enzima convertidota de interleukina 1 (ICE por sus siglas en inglés), la proteasa rica en Cisteína CPP32 o en otras palabras, con la caspasa 1 (Horvitz et al., 1986, 1992, 1996, 1998). Bajo este contexto y con metodología muy similares se inició una carrera tecnológica para el descubrimiento de estas proteasas ricas en el residuo Cisteína en mamíferos que se conocerían con el nombre de caspasas y que hasta el año de 2003 contaba con 14 proteínas en su lista, todas ellas cumpliendo con un rol fundamental en el proceso de apoptosis y haciendo cada vez más extenso y complicando el panorama de las rutas que rigen este fenómeno celular como se observa en la Figura 11 (Herrmann y Kalden, 2003).
Cada uno de estos receptores posee un dominio intracelular de 80 aminoácidos
localizados en el extremo C-terminal que funciona como un módulo de unión proteína-
proteína que reacciona diferencialmente con factores citoplasmáticos exclusivos para las
diferentes rutas del proceso apoptótico (Herrmann y Kalden, 2003).
Uno de los receptores de membrana tipo DEATH mejor caracterizados y con mayor
relevancia en la inducción de la vía extrínseca de la apoptosis es Fas, molécula
perteneciente a la superfamilia TNF/factor de crecimiento nervioso. Esta glicoproteína de
50
319 aminoácidos perteneciente al tipo l de proteínas transmembranales activa la
señalización apoptótica al unirse con su ligando natural, FasL o con anticuerpos agonistas
tanto en una célula vecina así como en la misma célula que está expresando y secretando
el ligando (efecto exocrino o autocrino, respectivamente).
Figura 11. Rutas apoptóticas establecidas e hipotéticas que involucran caspasas. Figura tomada de Herrmann y Kalden, 2003.
FasL es una proteína transmembranal tipo ll cuya forma activa es la proteína soluble.
Aunque principalmente es expresada por linfocitos T CD4+ y CD8+ activados, la mayoría
de las células modif icadas genéticamente o por una infección son capaces de expresarla
y secretarla. Después del rompimiento facilitado por metaloproteinasas, esta proteína es
clivada perdiendo su dominio de unión a membrana y se solubiliza en el medio
extracelular en forma de trímeros antes de unirse a Fas (Nagata et al., 1993). Una vez
FasL se une a Fas causa la oligomerización del mismo (Dixit et al., 1998). La estrategia
utilizada por Nagata y su grupo de colaboradores para describir las características
bioquímicas y la ubicación celular de FasL se basó en la utilización de una forma soluble
51
de su receptor (Fas) unido a la fracción cristalizable (Fc) de la inmunoglobulina humana
para su detección. Posteriormente una población celular con alta expresión de FasL fue
separada por citometría de f lujo y su ADNc fue aislado. Los análisis computacionales
revelaron que la secuencia de aminoácidos correspondía a una proteína transmembranal
tipo ll perteneciente a la familia TNF. Cuando el dominio oligomerizado de Fas es
activado por su unión con el ligando, el dominio intracelular recluta proteínas adaptadoras
como FADD (Fas Associated DD) que además de tener un dominio C-terminal similar al
del receptor DEATH (en este caso Fas) tiene un dominio de interacción proteína-proteína
en su extremo N-terminal conocido como el dominio ejecutor de muerte. En un
mecanismo que pareciera simular un rompecabezas, el dominio ejecutor de muerte de
FADD se une a un dominio ejecutor de muerte o también conocido como predominio de la
procaspasa 8 como se observa en la Figura 12. Esta unión forma el complejo DISC
(Death Induced Signalling Complex por sus siglas en inglés) o complejo de señalización
inducido por muerte que promueve la autocatálisis de la procaspasa 8 a su forma activa o caspasa 8, paso esencial de señalización que desencadena los procesos de proteólisis y
nucleólisis (Hellbardt et al., 1996) que continúan con la activación de las otras proteasas
corriente abajo como la caspasa 3 cuyo blanco proteolítico es la proteína inhibidora de la
enzima ribonucleasa activada por caspasa o CAD que se encuentra junto con la ICAD o
inhibidor de la enzima ribonucleasa activada por caspasa como un complejo inactivo cuya
activación como endonuucleasa –y por ende su entrada al núcleo y fragmentación del
ADN que conduce a la inminente muerte celular- depende del efecto proteolítico de la
forma activa de la procaspasa 3 (Nagata et al., 1998 y 1999 en Nature) mostrando la
relevancia que la forma activa de la caspasa 3 tiene como marcador molecular de
inminente MCP.
Por otro lado y a diferencia de Fas, los receptores TNFR1 y TNFR2 no poseen el dominio
citoplasmático de 80 aminoácidos característico de esta familia de proteínas aunque
TNFR1 reacciona con FADD bajo un mecanismo similar al de Fas. En lugar del dominio
citoplasmático poseen un mecanismo alternativo que involucra una proteína de
interacción con el receptor del tipo Serina-Treonina kinasa que promueve la apoptosis.
Adicionalmente estos receptores son algo más promiscuos que sus homólogos, pues por
ejemplo, TNF-a interactua tanto con TNFR1 (p55) como con el TNFR2 (p75) para
estimular multiples respuestas críticas en la célula receptora (Seed et al., 1999 y Dixit et
al., 1998).
52
Estos datos permiten inferir la compleja naturaleza del fenónemo apoptótico pues rutas
independientes a los receptores DEATH y/o sus moléculas ejecutoras actúan en paralelo
a los mecanismos DEATH-dependiente dependiendo del contexto celular y de la señal de
estrés que originó la señal apoptótica. Esto hace relación a los fenómenos que
promueven la supervivencia celular mediante el bloqueo de los dominios ejecutores de los
receptores DEATH.
Figura 12. Activación de la vía extrínseca de la apoptosis mediada por FasL y su receptor DEATH Fas (CD95). La unión de FasL promueve la oligomerización de Fas y su activación. Una vez activado, el dominio de muerte intracelular recluta a la proteínad de señalizació FADD y a su vez esta activa al complejo DISC donde la procaspasa 8 es transformada por autolsis en la proteasa caspasa 8. A su vez esta activa a la caspasa ejecutora o caspasa 3 cuyo blanco es el inhibidor de la endonucleasa CAD, enzima encargada de fragmentar el ADN como pasa crítico de la apoptosis. Adicionalmente está c-FLIP, una proteína homóloga a la caspasa 8 pero a diferencia de esta proteasa, encargada de fomentar la supervivencia celular mediante la activación de NF-kB promovida por la unión con molécular como TRAF1 y TRAF2. Figura tomada de Ralph Budd, 2002.
Uno de estos fenómenos se debe a la presencia una proteína de 55 KDa conocida como
c-FLIP (cellular Fas-Associated DD-Like Interleukin-1-converting enzyme inhibitory protein
53
por sus siglas en inglés) que es un homólogo enzimáticamente inactivo de la caspasa 8,
que se une mediante sus dos dominios ejecutores de muerte a FADD por un lado y con la
caspasa 8 por el otro. Esta unión bloquea la fusión FADD-caspasa 8 y por ende toda la
señalización apoptótica, promoviendo a su vez la supervivencia celular, como se observa
en la Figura 12 (Steiner et al., 1997). Uno de los mecanismos más efectivos de evasión
de la respuesta inmune y de subversión celular presente en los virus se basa en la
presencia de una proteína homológa conocida como v-FLIP. En estos casos, cuando la
apoptosis vía receptores DEATH está alterada, la célula contraresta este efecto mediante
la inducción de vías apoptóticas por caspasas asociadas a la mitocondria o mediante la
inducción de proteínas proapoptóticas pertenecientes a la familia Bcl-2 (Tomaselli et al.,
1998).
2.3.2. RUTA INTRÍNSECA
También conocida como la ruta apoptótica asociada a mitocondria, esta vía es crítica para
la correcta regulación de los fenómenos de apoptósis. Partiendo de las características
f isiológicas de la mitocondria como sitio del metabolismo oxidativo en los eucariota y
como el organelo proveedor de ATP mediante fosforilación oxidativa y citocromo c, es
correcto pensar que las características altamente oxidativas de este organelo están en
relación con el desecadenamiento de la respuesta apoptótica. La apoptosis vía 1 o
extrínseca se da en presencia de caspasa 9 y la apoptosis vía 2 o intrínseca se da en
presencia de caspasa 8. Tomaselli y su grupo de investigación identif icaron dos tipos celulares que utilizan el mecanismo de señalización apoptótica mediada por Fas de dos
formas diferentes. Las células tipo l se caracterizan por activar la caspasa 8 rápidamente
seguido por una activación de las caspasa 3 después de la unión Fas-FasL. Por otro lado,
las células tipo ll sufrieron la activación tanto de caspasa 8 y caspasa 3 aproximadamente
en 60 minutos después de la unión Fas-FasL. Sin embargo, ambos tipos celulares se
caracterizan por desencadenar fenómenos de pérdida del potencial transmembranal de la
mitocondria, aunque solo en las células tipo ll la sobreexpresión de Bcl-2 y Bcl-xL bloquea
la caspasa 8. Estos resultados permiten inferir que, aunque las vías apoptóticas
convergen para permear la membrana mitocondrial lo hacen aproximandose por caminos
diferentes donde el tipo l es dependiente de caspasa 8 y la activación de DISC mientras
que en el tipo ll la apoptosis parece ser independiente del complejo DISC (Tomaselli et al.,
1998).
54
Sin embargo la evidencia existente permite agregar otras funciones a la caspasa 8 dentro
del contexto apoptótico. En agosto del año de 1998 la revista Cell publicó un estudio muy
elegante realizado por el Doctor Jiangang Yuan y su grupo de trabajo de la Escuela de
Medicina de la Universidad de Harvard (Boston, Massachussets) donde por primera vez
se reportó a BID, una proteína de la familia Bcl2 proapoptótica, como un substrato para la
caspasa 8 en la ruta de señalización vía Fas. Existe una forma inactiva de BID que se
encuentra soluble dentro del citoplasma. Sin embargo la proteólisis mediada por caspasa
8 genera una proteína BID truncada (tBID) que es translocada a la membrana
mitocondrial donde su función es servir de proteína señalizadora de eventos apoptóticos
entre ellos el agrupamiento de la mitocondria alrededor del núcleo así como la liberación
de citocromo c (en un evento independiente de caspasas donde están involucradas las
proteínas Bak y Bax) y por ende la pérdida de potencial de membrana (delta Ψ m) y los
efectos f isionómicos que este hecho conlleva (contracción celular y condensación
nuclear). Estos dos procesos se observan de manera esquemática en la Figura 11.
Adicionalmente se comprobó que la coexpresión de BclxL inhibió todos los cambios de
tipo apoptótico inducidos por tBID (Yuan et al., 1998). Junto con BID la ceramida es otro
de los factores involucrados en la liberación de citocromo c de la mitocondria. Siguiendo
los parámetros generales no específ icos las ceramidas promueven la liberación de
citocromo c oxidándolo. Una vez liberado se reduce signif icativamente el consumo de
oxígeno, el delta psi m y la retención de iones bivalente de calcio (Rocha et al., 1999).
Una vez la mitocondria ha sufrido cambios en su membrana debido a moléculas como
tBID o las ceramidas, se liberan moléculas como citocromo c, AIF y Smac/DIABLO que
son las proteínas encargadas de desencadenar el fenómeno apoptótico. Por su parte, la
liberación de citocromo c es conocido por ser el paso limitante para la formación del
apoptosoma. Esta molécula de origen mitocondrial junto con el factor de apoptosis por
caspasas (Apaf1), la deoxiadenosina trifosfato (dATP) y la procaspasa 9 forman este
cuerpo proapoptótico. Específ icamente, una vez se libera el citocromo c del espacio
intramitocondrial y entra en contacto con Apaf 1 promoviendo la multimerización y
activación de esta molécula adaptadora. Dicha activación lleva al reclutamiento, lisis y
activación dATP-dependiente de la procaspasa 9 cuya función es activar la procaspasa 3, punto de convergencia de esta ruta con la ruta extrínseca que termina por desencadenar
el evento f inal de la apoptosis: la fragmentación del ADN nuclear (Harrington y Schultz,
2003).
55
Otros de los factores que se liberan debido al cambio de potencial y de permeabilidad de
la mitocondria son: la f lavoproteína conocida cmo AIF (Apoptosis Inducing Factor por sus
siglas en inglés), una proteína de origen nuclear similar a las oxidoreductasas bacterianas
y Smac/DIABLO (Smac en Humanos, DIABLO en Murinos), una proteína que elimina el
efecto inhibitorio sobre las caspasas que tienen las IPAs (IAPs por Inhibitor of Apoptotic
Proteins), una famila de proteína involucradas en la supervivencia celular cuya expresión
es promovida por el factor nuclear KB dentro del núcleo de la célula. Shi y su grupo de
investigación en la Universidad de Princeton (New Jersey, EEUU) publicó en Nature en
agosto de 2000 un interesante artículo describiendo las bases estructurales (mediante
cristalografía) y bioquímicas (mediante mutaciones dirigidas) de la activación apoptótica
mediada por Smac/DIABLO, la cual no solo se basa en activar proteolíticamente a la
procaspasa 3 sino también en modular la actividad enzimática de la caspasa 3 mediante
la interacción con las IPAs descrita anteriormente (Shi et al., 2000).
Curiosamente, más no en contraposición a los fenómenos y a la ruta descrita
anteriormente, citopatológicamente se ha observado que durante los fenómenos de
apoptosis la mitocondria permanece estructuralmente intacta –así existan cambios
apreciables de potencial, permeabilidad y bioquímicos- y no sufre los fenómenos de
contracción y destrucción que si sufren la membrana citoplasmática y nuclear (Wyllie,
1986). Otras moléculas importantes en el fenómeno apoptótico descrito anteriormente, y
que se revisarán con más cuidado en un capítulo posterior, son las proteínas de la familia
Bcl-2 pro y anti-apoptóticas que se localizan en la membrana exterior de la mitocondria y que juegan un papel fundamental en la delicada regulación de la apoptosis permitiendo o
previniendo la liberación de citocromo c. Por esta razón han sido señaladas como las
únicas proteínas con la capacidad de bloquear cualquier señal intra o extracelular que
vaya dirigida a desencadenar la apoptosis (Reed et al., 1994).
2.4. PROTEÍNAS PRINCIPALES EN LA APOPTOSIS 2.4.1. ASPECTOS GENERALES DE LAS CASPASAS En los capítulos anteriores se revisaron las características y procesos generales de la
apoptosis. En estos capítulos se mirará con más profundidad las familias de proteínas
más importantes y mejor estudiadas dentro del fenómeno de inducción y regulación de la
muerte celular programada.
56
Figura 13. Esquema general y simplificado de las vías apoptóticas y las proteínas involucradas. La vía extrínseca mediada por Fas y otros receptores tipo DEATH o receptores de muerte pertenecientes a la superfamilia TNF. La vía intrínseca mediada por las caspasas asociadas a la mitocondria. Con las caspasas 8 y 9 respectivamente, las dos vías convergen en la activación de la caspasa ejecutora o caspasa 3 que es la proteasa encargada de activar a la endonucleasa CAD mediante la proteólisis de su inhibor ICAD. Figura tomada de Harrington y Schultz, 2003 Aunque no existen criterios f ijos que definan la apoptosis, existen ciertas características
morfológicas que permiten diferenciarla de la necrosis. Entre estas se encuentran:
condensación de los cromosomas y de los organelos citoplasmáticos, fragmentación del
57
núcleo, decrecimiento del volumen citoplasmático, fusión del retículo endoplasmático con
la membrana celular y f inalmente la fragmentación de toda la célula en lo que se conoce
como “cuerpos apoptóticos” que son engolfados por las células circundantes para
posteriormente ser eliminados del espacio extracelular. Acompañando a estos cambios
morfológicos se presentan algunos indicadores subcelulares como el cambio de potencial
de membrana en la mitocondria y la exposición de fosfatidilserina en la membrana celular
externa. Sin embargo, todos estos cambios no son más que el resultado de la proteólisis
de substratos específ icos que es llevada a cabo por las caspasas. Algunas de estas
enzimas cumplen funciones diferentes a las apoptóticas durante la estimulación y
proliferación de linfocitos T vías Fas (para mayor información sobre los papeles no
apoptóticos de las caspasas revisar Budd et al., 1999), su principal se encuentra en
regular los procesos de MCP (Herrmann y Kalden, 2003). Algunos de estos substratos
son presentados en la Tabla 2.
Las caspasas se encuentran entre las proteínas que poseen una de las mayores
especif icidades entre las proteasas celulares debido a que siempre llevan a cabo su lisis
hacia el lado carboxil de los residuos de Aspartato. Adicional a esta característica estas
proteínas tienen la cualidad de tener dentro de su sitio catalítico posiciones conservadas y
específ icas para residuos de Cisteína, Glicina e Histidina, como lo reporta Salvesen y su
grupo en Cell Death and Differentiation en el año de 1999 (Salvesen et al., 1999).
Estructuralmente, las caspasas se encuentran como zimógenos monoméricos inactivos
solubles en el citosol que consisten de un predominio en su extremo N-terminal, una subunidad larga y una subunidad pequeña. El sitio de autoprocesamiento o de
procesamiento mediado por otras caspasas se da exactamente en los residuos de
Aspartato presentes en cada extremo. Seguido a este evento se da la formación de la
forma activa heterotetramérica consistente de dos subunidades largas y dos cortas con
dos sitios catalíticos diferentes. El procesamiento y ensamblaje se muestra
esquemáticamente en la Figura 14 (Raybuck et al., 1994 en Nature).
Los prodominios han sido caracterizados como las estructuras responsables de la
interacción con las proteínas adaptadoreas (como Apaf1 o FADD), y dependiendo de su
tamaño se ha observado que inteaccionan con Dominios Ejecutores de Muerte (DDE por
sus siglas en inglés) o con Dominios de Reclutamiento de Caspasas (CARD),
característica que en gran mediada influencia la ruta de activación de la apoptosis y la
posición de cada caspasa dentro de dicha ruta; donde las caspasas con prodominios
58
largos –como las caspasas 1, 2, 4, 5 y 8 a 13- son consideradas como iniciadoras y
aquellas con prodominios cortos –como las caspasas 3, 6, 7 y 14- son consideradas como
las ejecutoras del programa de muerte celular (Herrmann y Kalden, 2003).
Tabla 2. Principales Substratos Intracelulares de las Caspasas
Inv olucrados en la Reparación Celular Poli-ADP Ribosa Polimerasa Proteína quinasa dependiente de ADN MDM2 Inv olucrados en el Control del Ciclo Celular Retinoblastoma Quinasas dependientes de ciclinas Oncongen c-abl Inv olucrados en la Traducción de Señales PAK Inv olucrados en la Integridad Estructural de la Célula Lamininas Fodrina Gelsolina Actina
Tabla tomada de Anaya et al., 2005.
2.4.1.1. CASPASA 8 Caspasa 8 y la ruta de señalización mediada por Fas (CD95). Al igual que para los
capítulos referentes a las proteínas rabdovirales, estos capítulos iniciarán con un subtítulo
donde se resalta la relevancia de la molécula en revisión. Perteneciente a la familia de
receptores TNF o receptores DEATH, Fas (APO1 o CD95) es una proteína transductora
de señales que se activa tras su unión a FasL como se explicó en capítulos anteriores. La
asociación con la caspasa 8 se debe a que solo el procesamiento del complejo DISC
mediado por Fas activa los zimógenos de caspasa 8 (Dixit et al., 1998). Dependiendo del
contexto celular, el mecanismo de señalización mediado por la caspasa 8 toma dos vías
diferentes como se explicó en un capítulo anterior: la vía de las células tipo l (dependiente
de DISC) y la vía de las células tipo ll (independiente de DISC). La vía dependiente de
DISC resulta en la activación de la caspasa 3; mientras que en la variación de esta
cascada, la caspasa 8 corta y activa a la proteína BID que se encarga de la formación del
poro mitocondrial vía Bak o Bax.
59
Figura 14. Procesamiento y ensambleje general de las caspasas. Los homodímeros inactivos se componen de un predominio, una subunidad larga y una pequeña. El autoprocesamiento o procesamiento mediado por otras caspasas genera la fomación de un heterotetrámero compuesto por dos subunidades largas y dos pequeñas con dos sitios catalíticos diferentes. El sitio de procesamiento se caracteriza por poseer un residuo específico de Aspartato. Figura tomada de Herrmann y Kalden, 2003.
Así, aunque la activación apoptótica mediada por la mitocondria puede ocurrir en los dos
tipos celulares, en el tipo l generalmente ocurre por la vía estrictamente extrínseca
(dependiente de CD95). Regresando al mecanismo de acción de la caspasa 8, un trabajo
muy extenso realizado en agosto de 1998 por Davida Wallach y su grupo de
colaboradores del Instituto Weizman (Rehoboth, Israel) presentado en Immunity, reveló el
modelo linear de activación extrínseca de la apoptosis dependiente de caspasa 8
mediante la utilización de ratones knock out o nulos (caspasa 8 -/-) para esta proteasa. A
diferencia con ratones nulos para Fas, TNFR1, TNFR2 o BID los cuales se desarrollaban
normalmente y cuyos fenómenos apoptóticos revelaban la sobreexpresión de caspasa 8,
los resultados con este modelo nulo permitieron interpretar que esta caspasa es
fundamental para cualquier proceso de apoptosis, tanto por la señalización mediada por
receptores DEATH como por la ruta que involucra la liberación de citocromo c
(dependiente de BID). Continuando con las pruebas que han dado validez a este modelo,
en este mismo estudio se lograron ratones nulos para la molécula adaptadora de la
60
caspasa 8, FADD bajo el mismo sistema de mutagénesis dirigida. Los resultados
mostraron que el fenotipo de los ratones FADD-/- era bastante similar al de los ratones
caspasa 8 -/-, caracterizados por la letalidad embrionaria (Wallach et al., 1998).
Mediante las mismas estrategias de ratones nulos para Fas, para otros receptores
DEATH, para FADD y para la misma caspasa 8, se ha podido determinar el papel de esta
proteasa en la regulación de otros fenómenos complejos como la selección negativa de
las poblaciones linfocitarias en el timo. Los resultados han podido esbozar el panorama
que rige este fenómeno como un proceso delicadamente balanceado entre una apoptosis
parcial y una supervivencia parcial muy pronunciada. Por una parte, ratones nulos para
Fas, TNFR1 y TNFR2 mostraron procesos de eliminación normales de los timocitos
autoreactivos (Boehmer et al., 1992), postulando que el proceso de desarrollo dentro del
timo es independiente de la vía extrínseca; mientras que ratones nulos para FADD
mostraron procesos acelerados de selección negativa y una proliferación desmesurada en
el estadío de diferenciación CD4- y CD8- a CD4+ y CD8+ (Strasser et al., 1998 y Winoto
et al., 2001) permitiendo establecer que los fenómenos de diferenciación linfocitaria en la
periferia son dependientes de los receptores DEATH y de la vía extrínseca. Estas
características de la vía regulada por la caspasa 8 y su molécula adaptadora FADD
permite esclarecer muchos de los fenómenos que rigen patologías tan complejas como
ciertos tipos de cáncer y los desordenes autoinmunes.
2.4.1.2. CASPASA 3 Caspasa 3 o Caspasa Ejecutora. Como se ha venido resaltando a través de estos
capítulos, la caspasa 3 es considerada como el “punto de no retorno” de la respuesta
apoptótica. Ubicada en la posición central esta proteasa es conocida por ser la única
caspasa esencial para que el proceso de apoptosis se lleve a cabo totalmente, debido a
que a ella convergen tanto la ruta extrínseca mediada por la caspasa 8, como la ruta
intrínseca mediada por la caspasa 9 (Harrington y Schultz, 2003). La procaspasa 3 es
activada por: la caspasa 3, la caspasa 8, la caspasa 9, la caspasa 10, la proteína
activadora de proteosoma CPP32, la granzima B entre otras. Una vez activada la forma
activa o caspasa 3 se encarga de activar a la procaspasa 6 y la 9, así como a proteínas
como la DNA-PK, PKCy, PARP, D4-GDI, el elemento de respuesta a esteroides, ICAD,
etc. A nivel de genética molecular, debido a fenómenos de unión diferencial (splicing) del
ARNm, se traducen en todos los tejidos humanos una forma completa y una caspasa más
61
corta conocida como caspasa-3S que parece proteger a las células de la apoptosis
mediada por la inhibición del proteosoma (Yuan et al., 2002).
Sin embargo, aunque la función de la caspasa 3 esta bastante clara en los fenómenos
apoptóticos y de maduración de las poblaciones linfocitarias, recientemente se ha
establecido que existen mecanismos de compensación que soportan la ausencia de la
caspasa 3 mediante la sobreexpresión de caspasas alternativas como la caspasa 6 y la
caspasa 7 (Flavell et al., 2000). En el contexto de desarrollo de las subpoblaciones de
linfocitos T, la caspasa 3 parece no tener gran influencia como lo demostraron estudios
donde se inhibió la acción de esta proteasa mediante la adición del inhbidior de caspasas
zVAD a cultivos de primarios de timocitos murinos. Sin embargo en este mismo estudio
se probó que el desarrollo correcto depende de otras proteínas como p53 y la proteína
asociada a la ruta intrínseca de la apoptosis, Bcl-2. En este trabajo se reportó que ni la
caspasa 1 ni la caspasa 3 son esenciales para el proceso de apoptosis espontánea de
timocitos (STA por sus siglas en inglés) aunque se activen durante este (Glant et al.,
2000). Adicionalmente en otro estudio, utilizando la enterotoxina estafilococia A en
ratones caspasa 3-/- se encontró una respuesta inmune normal en cuanto a la
proliferación de los linfocitos T específ icos durante la inoculación del antígeno bacteriano,
sin embargo al momento de reducir la población linfocitaria cuando el antígeno ha sido
neutralizado completamente, los índices de apoptosis no son tan eficientes como en los
ratones silvestres (Herrmann y Kalden, 2003).
2.4.1.3. CASPASA 9
Activación mitocondrial y formación del Apoptosoma. En los capítulos anteriores se
han descrito de forma breve algunos estudios que han permitido conocer más a fondo los
mecanismos y fuciones por los cuales y de que forma las caspasas 8 y 3 activan las rutas
apoptóticas durante procesos de desarrollo o infección. En el mismo estudio donde se
describió por primera vez a BID como substrato de la caspasa 8 y como miembro de la vía
apoptótica dependiente de mitocondria, los resultados mostraron indicios sobre la
relevancia en apoptosis de la caspasa 9. A estos mismos extractos celulares -de
crecimiento normal- se les adicionó dATP. Sorprendentemente la adición de esta
molécula aceleró los procesos de activación de la caspasa 3 y la subsecuente
fragmentación del ADN (Yuan et al., 1998). Análisis bioquímicos posteriores realizados
por Gabriel Nuñez y su grupo de investigación de la Universidad de Michigan permitieron
62
establecer que el reclutamiento y activación de la procaspasa 9 se da exclusivamente en
la presencia de un complejo formado por la proteína Apaf1 y citocromo c durante la
activación de la vía intrínseca, y que este complejo solo se forma como resultado de
hidrólisis de dATP. Mediante la utilización de ADNc identif icaron la proteína Apaf-1 de
1248 residuos con dominios para la hidrólisis de ATP (ATPasa) que mediante la hidrólisis
de dATP se unía al citocromo c para el reclutamiento y procesamiento de la procaspasa 9.
Adicionalmente se comprobó que la activación de la caspasa 9 genera la señal para el
reclutamiento y procesamiento de la procaspasa 3 en el proceso de inducción de la
apoptosis. A partir de la interpretación de estos resultados ellos proponen el modelo que
se presenta en la Figura 15 (Nuñez et al., 1999 en The EMBO Journal).
Figura 15. Mecanismo de formación del apoptosoma y activació de la procaspasa 9. La hidrólisis de dATP y la unión de citocromo c genera cambios conformacionales en Apaf-1 que le dan la capacidad de oligomerizarse. Posterior a su dimerización adquiere la capacidad de reclutar y procesar a la procaspasa 9. Una vez activada, la caspasa 9 inicia la formación del apoptosoma mediante el reclutamiento y activación de la procaspasa 3 y posiblemente la procaspasa 7. Modelo propuesto y Figura tomad de Nuñez et al., 1999.
Aunque generalmente las caspasas poseen dominios autocatalíticos, el procesamiento de
la procaspasa 9 no incrementa su capacidad catalítica. A diferencia de las demás
caspasas, el requerimiento para activarse se basa fundamentalmente en su asociación
con sus proteínas cofactores: Apaf-1 y citocromo c. Estas tres proteínas juntas forman
una holoenzima como se muestra en la Figura 15 conocida como el apoptosoma. (Mak et
al., 1998). En 1999 Rodriguez y Lazebnik encontraron que la actividad proteolítica de la
caspasa 9 en complejo con Apaf-1 era varios ordenes de magnitud mayor que la de la
caspasa libre, proponiendo a Apaf-1 como el regulador alostérico de la subunidad
catalítica caspasa 8. Además en este mismo estudio corroboraron la importancia de la
dATP como molécula inductora de la formación del complejo (Rodríguez y Lazebnik,
1999). Así, ensayos de TUNEL para ratones Apaf-/- y/o Caspasa 9-/- muestran una
ausencia total de apoptosis inducida por la vía intrínseca o dependiente de la mitocondria
63
en conjunto con una proliferación maligna de células post-mitóticas con un fenotipo muy
similar al que presentan los ratones Caspasa 3-/- –con malformaciones cerebrales y
letalidad embrionaria- pues de hecho, la ausencia de caspasa 9, estando corriente arriba
en la cascada enzimática, conlleva a la no acitivación de la caspasa 3 (Flavell et al.,
1998).
Sorprendentemente y en contraste con el efecto crítico que tiene la caspasa 9 en los
procesos de apoptosis inducida dependiente de mitocondria, el desarrollo linfocitario en
ratones nulos para Apaf-1 y/o para Caspasa 9 es normal. Adicionalmente, al someter
estos modelos (Apaf-1 y Caspasa 8 -/-) a estímulos apoptóticos que dañan la integridad
mitocondrial se observa que son completamente resistentes a la apoptosis pero, al
someterlo a estímulos que involucran la activación de la vía Fas son igual de susceptibles
que sus parentales silvestres. Estos resultados permiten establecer que la vía por la cual
se lleva a cabo el desarrollo, maduración y regulación de la proliferación de los linfocitos
T fuera del timo involucra al menos en parte a los receptores tipo DEATH y es por ende
independiente de la caspasa 9 y Apaf; hipótesis que se relaciona con lo establecido para
la ruta regulada por la caspasa 8 y por la proteína adaptadora FADD (Flavell et al., 1998).
Sin embargo, un estudio posterior parece ir en contra de lo que han establecido los
modelos de Flavell y su grupo. Mediante la utilización de ratones knock out (nulos) para
Apaf-1 y para Caspasa 9 se observó que los fenómenos de apoptosis que regulan la
selección negativa de linfocitos inmaduros dentro del timo se veía afectada como
consecuencia de un papel putativo de estas dos proteínas corriente abajo de la ruta de apoptosis dependiente de p53 (Low e et al., 1999). Es bien conocido que p53 puede
promover la apoptosis en respuesta a la expresión de oncogenes durante la mitosis.
Igualmente, durante el proceso de maduración de los linfocitos T en el timo el factor de
transcripción E2F1 controla la expresión de p53 para la eliminación de las células
autoinmunes (DeGregori et al., 1999). Lo realmente interesante del trabajo de Low e y su
grupo fue que los resultados mostraron una gran similitud en el desarrollo de hiperplasia
en el timo tanto en los ratones nulos para p53, como para Apaf 1 o para caspasa 9.
Finalmente y con la intención de introducir el próximo capítulo, la evidencia ha mostrado
que la vía de activación mitocondrial de la apoptosis no está controlada exclusivamente
por la caspasa 9 y Apaf. La existencia de la familia Bcl-2 –que comprende miembros pro
y antiapoptóticos- ha revelado que la vía de MCP dependiente de mitocondria puede estar
regulada de una manera más fuerte por estas proteínas. Ratones deficientes para la
64
proteína antiapoptótica Bcl-2 presentan letalidad postnatal pero con un desarrollo
linfocitario inicial regular. En contraste los ratones deficientes para Bcl-xS (proapoptótica)
y para Bcl-xL (antiapoptótica) sufren un daño apoptótico neuronal y linfocitario muy
marcado que les causa la muerte en el estado embrionario (Fujii et al., 1995). Por otro
lado, la ausencia del otro miembro de la familia, Bim (proapoptótico) conlleva al aumento
en linfocitos inmaduros, a hiperplasia y a desarrollar un síndrome autoinmune (Strasser et
al., 1999). Si se comparan los efectos generados por la ausencia de la caspasa 8 y Apaf
1 con los generados por la ausencia de los miembros de la familia Bcl-2, claramente se
observa que la apoptosis vía mitocondrial no es un evento que dependa de la activación
de la procaspasa 9 y que por el contrario las moléculas de la familia Bcl-2 juegen un papel
más importante en este fenómeno.
2.4.2. PROTEÍNAS Bcl-2 Como se introdujo en el capítulo anterior, las proteínas del tipo Bcl-2 son una familia de
factores con actividad tanto pro como antiapoptótica que comparten características
f ilogenéticas y genéticas, funcionales y estructurales (ver Figura 17) que les permiten
agruparse en una gran familia así sus funciones antagónicas, como se observa
esquemáticamente en la Figura 16.
Figura 16. Diagrama esquemático representativo de la familia de proteínas Bcl.2. La homología entre estas proteínas se conocen como BH (Bcl-2 Homology) mientras que el dominio transmembranal que también comparten se conoce como TM (Transmembrane). Figura tomada de Packham y Stevenson, 2005.
Las proteínas de la familia Bcl-2 se caracterizan por la presencia de hasta cuatro
secuencias cortas de menos de 20 residuos con altísima homología y que son conocidas
65
como dominios de homología Bcl-2 (BH por sus siglas en inglés), así el contenido total de
aminoácidos muestre una homología casi nula. A la fecha se han descrito más de 20
miembros que con el f in de facilitar su estudio se han dividido en tres subfamilias con
base en características funcionales y estructurales, tal como se observa en la Figura 16.
La subfamilia anti-apoptótica esta conformada por Bcl-2 y Bcl-xL y se caracterizan por
poseer los cuatro dominios BH (BH1 a BH4) así como por Mcl-1 que aunque está
involucrada en fenómenos de supervivencia celular no presenta el dominio BH4 clásico
que sí comparten Bcl-2 y Bcl-xL.. En el dominio BH4 parece residir toda la actividad que
fomenta la supervivencia. Este dominio tiene la propiedad de unirse a proteínas no
pertenecientes a la familia Bcl-2 incluyendo calcineurina, una fosfatasa dependiente de
calcio involucrada en la activación de linfocitos T mediando la sobreexpresión de CD4 en
la superficie celular.
Figura 17. Estructura tridimensional de la estructura general de las proteínas pertenecientes a la famila Bcl-2. En esta figura se muestra específicamente la proteína antiapoptótica Bcl-xL con sus tres de sus cuatro dominios BH así como el dominio de unión a Bak, la proteína encargada de inhibir su función antiapoptótica. Figura tomada de Packham y Stevenson, 2005.
Por otro lado estan las proteínas pro-apoptóticas como Bax, Bak, Bok, Bim, Bad y Bid de
las cuales las tres primeras conforman la subfamila conocida como multidominio y
caracterizada por la presencia de BH1, BH2 y BH3; mientras que las tres últimas son la
subfamilia que solo posee BH3. El dominio BH3 ha probado ser el responsable de la
66
liberación de citocromo c del espacio intramembranal así como de la unión a estructuras
lipídicas conocidas como rafts involucradas en mecanismos de señalización y tráfico de
proteínas.
Un estudio realizado por Ayllon y su grupo de investigadores demostró mediante técnicas
de inmunocoprecipitación y microscopía confocal que una forma truncada de la proteína
Bad -constituída únicamente por su dominio BH3- tenía la propiedad de unirse a estos
rafts lipídicos en cultivos celulares solamente bajo la estimulación con IL4 dando como
resultado la inhibición de la apoptosis. Estos resultados permitieron concluir que existen
vías alternativas de regulación apoptótica dependiendo del contexto celular y del tipo de
señalización de estrés que la célula reciba (Ayllon et al., 2002); en el contexto de Bad,
evitando que esta proteína se una a Bcl-2 e inhiba cierto tipo de respuestas
antiapoptóticas. Adicionalmente, un estudio realizado por Cottin en 2002 reveló que no
solo moléculas pertenecientes a la famila Bcl-2 tenían la capacidad de ser reguladas por
la acción de los rafts lipídicos. También el dominio intracelular del receptor TNF-a (CD120
o TNFR1) posee secuencias específ icas que son reconocidas por estos rafts y cuya
interacción controla la activación de la apoptosis vía extrínseca (Cottin et al., 2002).
Adicionalmente algunas de las proteínas Bcl-2 poseen un dominio transmembranal en su
extremo C-terminal que es el responsable de su localización celular.
Historicamente, la proteína Bcl-2 humana (homóloga a la ya descrita CED-9 en
C.elegans) fue identif icada y descrita como el primer protooncogen hace ya 20 años; su
función es proteger a las células del fenómeno de la apoptosis. Mediante una estrategia estándar de obtención del ADNc del gen bcl-2 fusionado a una inmunoglobulina debido a
la translocación conocida como t(14:18) que solo se presenta en algunos linfomas
foliculares de los linfocitos B, se lograron describir acertadamente algunas de las
características estructurales y funcionales de esta proteína. La translocación a la que se
hizo referencia anteriormente fusiona el marco de lectura abierta del gen bcl-2 con
algunas secuencias reguladoras de las imununoglobulinas causando la sobreexpresión de
la proteína Bcl-2 intacta, fenómeno muy apropiado para la obtención de ADNc a partir de
los mensajeros de ARN (Sklar et al., 1986). Tanto en los mamíferos como en C.elegans,
Bcl-2 se encuentra localizada generalmente sobre la membrana exterior de la mitocondria,
característica que parece tener mucha relación con la liberación de citocromo c y la
regulación apoptótica de la vía intrínseca (o dependiente de mitocondria), pero también –
por razones que hasta el momento no han sido aclaradas- es usual hallarla en la
67
membrana del retículo endoplasmático o sobre la membrana de la membrana nuclear,
como lo presenta la revisión hecha para Science por Cory y Adams en 1998 (Cory y
Adams, 1998). A raiz del descubrimiento de Bcl-2 y en virtud que el fenómeno apoptótico
estaba siendo descrito de manera general como una delicada cascada enzimática, un año
más tarde fue descrita la primera proteína proapoptótica asociada a Bcl-2: Bax (Bcl-2
Associated protein X ). Esta proteína promotora de muerte celular, así como las otras
pertenecientes a esta familia, actúan de forma concomitante formando heterodímeros y
ocasionalmente homodímeros. Estudios más profundos han permitido establecer que el
mecanismo por el cual estas proteínas sufren el fenómeno de heterodimerización esta
gobernado por una titulación funcional, sugiriendo que la concentración relativa de las
diferentes proteínas de esta familia en un evento celular dado, es la clave para la
activación de la apoptosis o por el contrario de la supervivencia celular (Harrington y
Schultz, 2003). Una de las características funcionales más importantes de las proteínas
Bcl-2 es que su regulación está mediada por citoquinas y otro tipo de moléculas de
señalización y se puede dar durante cualquier paso dentro del fenómeno de inducción de
la MCP. Una vez se han iniciado los fenómenos citopatológicas característicos de la
apoptosis como la fragmentación y contracción de la membrana citoplasmática y nuclear y
la fragmentación del ADN se ha probado que Bcl-2 es capaz de bloquearlo por completo
mediante la regulación de la permeabilidad de la membrana mitocondrial y la inhibición de
la liberación de la proteína AIF y de citocromo c como resultado de un control sobre el
tráfico del dATP (Korsmeyer et al., 1990 y Cai et al., 1997). Sin embargo, también es bien conocido que junto con Apaf-1 y su cofactor citocromo c, AIF y dATP son fuertes
inductores de la vía intrínseca de la apoptosis. Interesamente se ha visto que moléculas
supresoras de la muerte celular como Bcl-2 causan efectos radicalmente diferentes
dependiendo de la membrana celular donde se localicen. Mediante la utilización de
modelos celulares, específ icamente MDCK y Rat-1/Myc, sobreexpresando Bcl-2 humana
por acción retroviral, se observó que esta molécula se localiza sobre diferentes organelos
citoplasmáticos. Al restrigir su expresión mediante proteínas de fusión recombinantes
(cambiando el extremo C-terminal de Bcl-2 por dominios de unión específ ica a organelos
como el del citocromo b5 y el de ActA) exclusivamente a organelos como el retículo
endoplasmático (RE) y la mitocondria, los investigadores observaron que en cada uno de
los tipos celulares la ubicación intracitoplasmática determinaba la protección
antiapoptótica. En las células MDCK solo la proteína silvestre o unida a mitocondria
68
poseía acción antiapoptótica, mientras que en las células Rat-1/Myc solo la ubicación en
el RE promovía la supervivencia celular. Estos resultados permitieron establecer la
hipótesis que no solo la unión de Bcl-2 a la proteína Bax era la causante de la inhibición
apoptótica (Andrew s et al., 1996 en The EMBO Journal).
2.4.3. FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN Nk-B El término NF-kB hace referencia a una familia de proteínas involucradas en las
reacciones inflamatorias, desarrollo de los órganos linfoides y en la activación de la
respuesta inmune innata y adaptativa. Estas proteínas se caracterizan por ser un factor
de transcripción de genes de conformación activa dimérica que en respuesta a estímulos
celulares son liberadas por sus factores de inhibición (IkBs) como homo e heterodímeros
y migran del citoplasma al núcleo donde se terminan de activar debido a la presencia del
ADN. Dentro de la familia NF-kB existen hasta la fecha cinco miembros reconocidos: p50
(NF-kB1), p52 (NF-kB2), c-Rel, Rel-A y Rel. (Maniatis et al., 2001).
En relación con la apoptosis y sus proteínas asociadas, se ha probado que Bcl-3, un
miembro de la familia Bcl-2 es un IkB que interactua con NF-kB1 y NF-kB2 y promueve su
localización nuclear. Bajo un estímulo proapoptótico como una infección viral o la
presencia de interleuquinas este IkB se fosforila como resultado de su interacción con
proteínas conocidas como IKKs (IkB Kinase complex por sus siglas en inglés) y sus
proteínas adaptadoras y se transloca al núcleo donde promueve la sobreexpresión de
muchos genes involucrados en la respuesta inmune como se observa en la Figura 18. En este mismo contexto apoptótico se sabe que las señales para que las IKKs se activen
dependen de la señalización mediada por TNFR, la proteína fuertemente involucrada con
la transducción de señales proapoptótica vía extrínseca. En un escenario apoptótico claro
como lo es la eliminación de las células malignas causantes del cancer, algunos trabajos
han mostrado que las regiones codicantes de las proteínas NF-kB están involucradas en
rearreglos cromosomales y amplif icación de ciertos genes involucrados en la inhibición y
regulación de la muerte celular (Li et al., 2002). Es sabido que la unión de TNF a su
receptor promueve la activación de NF-kB y subsecuentemente la activación de genes
antiapoptóticos mediante un mecanismo que involucra la inactivación de la caspasa 8. Lo
interesante de este trabajo publicado en Science radica en que por primera vez
identif icaro las moléculas que mediaban este fenómeno: los factores asociados al TNFR
TRAF1 y TRAF2; cIAP-1, cIAP-2, xIAP, Bcl-x y A1. (Baldw in Jr et al., 1998).
69
Adicionamente algunos estudios han mostrado que NF-kB colabora en la activación
transcripcional de la que es responsable p53, una proteína muy estudiada por estar
fuertemente relacionada con fenómenos de reparación del ADN, por ser una molécula
supresora de cáncer y por ser una reguladora de la expresión de los genes que codif ican
para los receptores DEATH. Bajo esta hipótesis algo paradójica, se podría proponer que
la activación de los receptores de muerte promueven la actividad antiapoptótica mediada
por p53 y NF-kB. Lo que puede inferirse es que existen una serie de substratos
diferenciales que activan una u otra vía dependiendo de su origen y naturaleza en dentro
del contexto celular.
Figura 18. NF-kB y la activación por TNFR1. En este modelo el complejo IKK se activa debido a la transducción de señales mediada por el receptor DEATH TNFR1. Paradójicamente, la activación de NF-kB vía TNFR1 promueve la expresión de genes antiapoptóticos. Figura tomada de Maniatis et al., 2001.
70
2.5. REMOCIÓN DE LAS CÉLULAS APOPTÓTICAS 2.5.1. TRANSPORTADORES ABC
La apoptosis, además de eliminar células no viables, es el mecanismo encargado de
refinamiento de la estructura neuronal, de la formación de los tejidos y f inalmente de la
remoción del material inservible y de las células muertas. En los casos cuando las células
mueren víctimas de fenómenos apoptóticos en respuesta a infecciones, debe existir una
relación íntima entre las señales apoptóticas y los mecanismos de respuesta para que los
patógenos no se diseminen una vez la célula se ha eliminado. Desde C.elegans hasta los
mamíferos superiores, se han encontrado una molécula encargada de relacionar estos
dos fenómenos: CED-7 o ABCA1 (para C.elegans y mamíferos respectivamente), una
proteína perteneciente al grupo de transportadores ABC.
ATP-Binding Cassette o los transportadores ABC son una de las familias más grandes de
proteína de membrana y su función radica en el transporte de una serie de substratos
mediante un mecanismo dependiente de ATP. Estructuralmente esta familia se
caracteriza por poseer un par de dominios de unión a nucleótidos (NBDs) así como otro
par de dominios membranales compuestos por 6 hélices transmembranales como se
observa en la Figura 19.
Figura 19. Representación topológica para el transportador ABC de la clase A al cual pertenecen las proteínas CED-7 en C.elegans y la proteína ABCA-1 en humanos. Se caracterizan por poseer dos dominios intracelulares de unión a nucleótidos (NBDs) y dos grandes dominios membranales, cada uno compuesto por 6 hélices transmembranales. Figura tomada de Herrmann y Kalden, 2003
A la fecha se han descrito 48 genes ABC dentro del genoma humano, mientras que para
otros organismos como levaduras y plantas el número de genes supera el medio centenar
y el centenar, respectivamente. De estos 48 genes solo se han identif icado 17 proteínas
71
codif icadas como transportadoras, pero de estas 17 solo 1 proteína (AtAOH1 homóloga a
la proteína humana ABCA1) esta organizada como un transportador completo y cuyo
origen es la codif icación lineal de un solo gen. Adicionalmente, 14 de estos genes
putativos para transportadores ABC han sido asociados con desórdenes genéticos entre
los que se incluyen principalmente la f ibrosis quística , la degeneración neuronal, defectos
en el metabolismo de lípidos, resistencia a la insulina y hasta anemia (Herrmann y
Kalden, 2003). En el contexto apoptótico la asociación de estas proteínas de transporte
con el fenómeno de muerte celular programada, se logró establecer a mitad de los 90s
por Chimini y Luciani, quienes reportaron la presencia de un número elevado de
transcritos (ARNm) del gen que codif ica para ABCA1 durante los procesos apoptóticos y
desarrollo celular mediante técnicas de hibridización in Situ (Chimini y Luciani, 1996).
Inicialmente los transportadores ABC habían sido descritos como proteínas involucradas
en la adquisión del fenotipo fagocítico, propiedad que permitía asociar a estas moléculas
con procesos de endocitosis, fagocitosis o engolfamiento de moléculas. Y desde el punto
de vista estructural, la presencia o ausencia de ABCA1 en la membrana celular, modif ica
el arreglo f isiológico y el transporte de las especies lipídicas a lo largo de la bicapa; entre
estas la fosfatidilserina (FS) que necesita ser transportada de la cara interna a la externa
de la membrana celular quizás bajo la inf luencia del transportador ABC.
Estas hipótesis, permitieron a este grupo de investigadores proponer a estas moléculas
como mediadoras del estadío f inal de la apoptosis: la remoción de los cuerpos
apoptóticos. Sorprendentemente, mediante ensayos de neutralización utilizando anticuerpos (Acs) anti-ABCA1 se observó que las células fagocíticas tratadas perdían la
capacidad de engolfar los residuos de las células apoptóticas sin alterar su capacidad de
fagocitar patógenos, en este caso levaduras (Klein et al., 1999). Teniendo en cuenta
estos trabajos preeliminares y las propiedades intrínsecas de esta molécula
transportadora, Hamon y su grupo de colaboradores publicaron en Nature un modelo que
explica el papel de las moléculas transportadoras ABC como ABCA-1 en los fenómenos
de engolfamiento de los cuerpos apoptóticos y que se resume en la Figura 20.
Básicamente este modelo se fundamenta en la capacidad que poseen las proteínas
transportadores ABC para modif icar local y transitoriamente las propiedades biofísicas de
los lípidos de membrana, explicando adecuadamente como es que moléculas como CED-
7 son capaces de modif icar la movilidad lateral de los receptores involucrados en el
reconocimiento de las células apoptóticas. Así, en una situación basal los receptores de
72
engolfamiento membranales se encuentran uniformemente distribuidos sobre la superficie
de la célula fagocítica. Una vez en contacto con un cuerpo apoptótico sufren una
reorganización facilitada por las proteínas transportadoras ABC que le permite a esta
célula acelerar los procesos de fagocitosis así como de señalización para el
reconocimiento de la célula apoptótica.
Figura 20. Modelo esquemático propuesto por Hamon en 2000 para explicar el fenómeno de engolfamiento de las células apoptóticas mediado por las proteínas transportadoras de la familia ABC. En este modelo los receptores fagocíticos (R) sufren una reorganización facil itada por los transportadores ABC que les permite entrar más rápido y fácil con los cuerpos apoptóticos catalizando su eliminación y promoviendo una cascada de reacciones que permiten a la célula caracterizar el residuo como apoptótico. Figura tomada de Herrmann y Kalden, 2003.
2.5.2. RECONOCIMIENTO Y REMOCIÓN
De la gran cantidad de fosfolípidos distribuidos en la membrana de las células viables solo
la FS aniónica esta localizada totalmente sobre una sola cara de la membrana,
específ icamente solo sobre la cara intracitoplasmática. Por esta razón nunca está en
contacto con el medio extracelular y por ende fuera del alcance de los componentes
sanguíneos. Sin embargo, durante los procesos f inales de la apoptosis esta fosfatidil se
transloca al espacio extracitoplasmático y queda completamente expuesta. Una vez allí,
este fosfolípido sirve como señal apoptótica de reclutamiento de macrofagos y
especialmente Células Dendríticas (CDs) que se encargan de eliminar las citoquinas
liberadas así como cualquier sustancia autoreactivas. Si estas células no reciben la señal
apoptótica inmediatamente, la liberación de sustancias tóxicas y proinflamatorias, así
como un evento secundario de necrosis de estos cuerpos apoptópticos, provoca una
respuesta violenta mediada por la rama humoral y celular de la respuesta inmune
73
(Harrington y Schultz, 2003). Sin embargo, no todas las CDs tienen las características
que permiten ubicarlas dentro del fenómeno apoptótico. Una de esta características es
que las células encargadas de eliminar los cuerpos apoptóticos no seguen los parámetros
normales de maduración a diferencia de los macrófagos y las CDs que eliminan células
necróticas (Albert et al., 1998).
De manera general, las CDs (dendrítico signif ica “dividido de”) son un grupo de células
con una enorme capacidad de presentar antígenos y modular la respuesta inmune celular
mediante su interacción con los linfocitos T y B. La ingestión de células apoptóticas y la
toma de antígenos mediada por las CDs se limita a un estado de desarrollo temprano de
esta población celular debido a que en este estado de maduración estas células expresan
de una manera muy baja el grupo de proteínas que conforman el CMH así como las
moléculas estimuladoras de respuesta inmune mediada por linfocitos T. Sin embargo
durante la eliminación de los cuerpos apoptóticos se ha observado que las CDs expresan
receptores pertenecientes a la superfamilia de lectinas tipo-C. Este tipo de lectinas se
caracterizan por poseer un dominio de unión a un tipo específ ico de carbohidrato
mediante un mecanismo dependiente de Calcio, propiedad muy importante si se
considera que muchos de los fenómenos apoptóticos son desencadenados por la
presencia de patógenos intracelulares perfil específ ico de carbohidratos en sus
membranas. Sin embargo, estos carbohidratos no parecen ser presentados como
antígenos para la activación de la respuesta inmune lo que permite inferir que existen
mecanismos ajenos al estado de maduración de las CDs que les permiten -una vez en el sitio donde está ocurriendo la muerte celular- diferenciar si el proceso es una necrosis o
apoptosis. Uno de estos mecanismos puede estar relacionado con la secreción y
expresión de la molécula proinflamatoria IL12. Cuando una célula sufre fenómenos de
infección bacterial o viral que conllevan a la necrosis, eleva los niveles de IL12 como
mecanismo de señalización para la producción de IFN. Bajo este criterio se ha observado
que IL12 tiene un efecto exocrino y autocrino sobre las CDs, y que solo la exposición a
esta molécula le permite a estas células madurar y funcionar como verdaderas células
presentadoras de antígeno y por ende modular la respuesta inmune celular (Tadokoro et
al., 2000). En un contexto diferente se ha visto que la CDs sufren fenómenos apoptóticos
acelerados para garantizar que la respuesta inflamatoria del hospedero no sea excesiva y
resulte en un daño tisular descontrolado. Mediante la adición de LPS bacteriano se
comprobó que una vez las CDs son estimuladas por los antígenos (Ags) migran de las
74
zonas marginales hacia las zonas con presencia de linfocitos T para acelerar la respuesta
inmune.
Figura 21. Reconocimiento fagocítico de las células apoptóticas. Aunquen en la actualidad se desconoce la totalidad de las interacciones entre los fagocitos y los cuerpos apoptóticos, se han podido describir moléculas de importancia como la fosfatidilserina y otros fosfolípidos aniónicos y la moléculas de adhesión intracelular (ICAM3) del lado de los cuerpos apoptóticos, así como la molécula transportadora de la familia ABC (ABCA1), el receptor de vitronectina (CD36) mediado por trombospondina y CD14 del lado del fagocito. Figura tomada de Herrmann y Kalden, 2003. Sin embargo, una vez en dicha localización y habiendo presentado los Ags sufren
fenómenos acelerados de apoptosis (Leo et al., 1998). Estudios posteriores permitieron
asociar estos fenómenos apoptóticos en la CDs con la molécula transmembranal tipo ll de
40 KDa asociada a la familia de receptores DEATH TNF, TRAIL. Las células que sufren
apoptosis vía TRAIL han mostrado una gran dependencia de la expresión de reacciones
que involucren a la familia de proteínas Bcl-2 y a la activación de la vía mitocondrial que
esta familia promueve. Con respecto a las CDs se comprobó que este tipo celular es
mucho más sensible a sufrir apoptosis vía TRAIL que a las vías extrínsecas asociadas a
Fas o a TNFR (Sneller et al., 1999). Para f inalizar, en la Figura 21 se presenta
esquemáticamente como se lleva a cabo el proceso de reconocimiento y remoción de los
células apoptóticas.
75
2.6. LA APOPTOSIS Y LAS INFECCIONES
El fenómeno apoptótico se caracteriza en gran parte por la ausencia de moléculas pro-
inflamatorias y por ende por la ausencia de respuesta inmune. Esta propiedad de “pasar
desapercibida” frente al sistema inmune es una de las estrategias que utilizan los
microorganismos para dispersarse sin ser combatidas. Sin embargo esta estrategia
puede ser considerada como la más elemental y menos evolucionada, pues como se
tratará a profundidad en el último capítulo de esta revisión, algunas infecciones virales se
caracterizan por llevar a cabo un programa de subversión celular altamente evolucionado
que evade por completo tanto la respuesta apoptótica como inmunológica. De igual
manera ocurre durante las infecciones parasitarias por protozoos como Trypanosoma
cruzi donde el fenómeno apoptótico es aprovechado para la dispersión y liberación del
parásito. El parásito promueve la apoptosis de los neutrófilos que infecta en el primer
paso de su ciclo. Una vez la respuesta mediada por macrófagos se inicia, T.cruzi utiliza
los cuerpos apoptóticos de los neutrófilos como “Caballos de Troya” para entrar en su
hospedero definitivo que parece no activarse adecuadamente post-infección. Así el
proceso apoptótico es aprovechado en una doble vía: inicialmente como señal para atraer
a la célula hospedera y adicionalmente como mecanismo de evasión de la respuesta
inmune (Freire-de-Lima et al., 2000).
En un contexto general, los patógenos intracelulares capaces de elicitar respuesta
inmnune activan los linfocitos T citotóxicos (CTLs por sus siglas en inglés) mediante un
mecanismo que involucra la “busqueda” de los antígenos presentados en la superficie de la célula infectada mediante el sistema CMH clase l. Sin embargo, los patógenos
extracelulares también pueden elicitar esta respuesta CTL (CD8+) mediante los procesos
de fagocitosis, migración hacia los nódulos linfáticos y presentación alternativa vía CMH
clase l que llevan a cabo las Células Presentadoras de Antígeno (CPAs) como
macrófagos y CDs las cuales se derivan de la médula ósea como precursores inmaduros
(Rock et al., 1999). Sin embargo esta claro que las CPAs capaces de presentar
antígenos exógenos vía CMH clase l poseen una característica especial: la expresión de
un transportador funcional asociado al sistema de procesamiento de antígenos conocido
como TAP. Una vez el patógeno extracelular es detectado por una CD o un macrofago, se
inicia un proceso el proceso de fagocitosis y de formación del proteasoma en el
citoplasma que conduce a la destrucción dell microorganismo y permite la generación de
los péptidos antigénicos o sus precursores. En este punto, TAP se encarga de transportar
76
los Ags hacia el Retículo Endoplasmático (RE) donde se asocian con las moléculas del
CMH clase l que están siendo sintetizadas. Durante muchos años se creyó que
solamente el dímero formado por la microglobulina Beta 2 (b2m) era necesario para el
correcto ensamblaje del CMH al Ag. Sin embargo a raiz de los estudios en CPAs se logró
establecer que TAP1 y TAP2 así como la tapasina, una proteína de membrana codif icada
por genes CMH, eran subunidades esenciales para la correcta presentación de antígenos.
El modelo propone que antes de la unión del péptido, la b2m forma un complejo junto con
TAP, la tapasina, la chaperona calretuculina y la oxidoreductasa ERp57 dentro del RE
(revisado por Dierich et al., 1999). Esta teoría representa la respuesta de como células
que han sufrido apoptósis como resultado de una infección intracelular pueden
desencadenar indirectamente una respuesta inmune patógeno-específ ica y generar una
cascada de reacciones linfocitarias restringidas al CMH clase l mediada por linfocitos T
CD8+ o al CMH clase ll mediada por linfocitos T CD4+. Para corroborarla esta hipótesis
se han publicado estudios independientes, donde se ha demostrado que células
apoptóticas infectadas con el virus Influenza, con Citomegalovirus, con el Virus Epstein-
Barr o con Salmonella typhimurium son substratos apropiados para CDs y que como
resultado de esta fagocitosis se produce una respuesta inmune tanto celular como
humoral específ ica para el patógeno en estudio (revisado por Harrington y Schultz, 2003).
En un estudio realizado por Marie Larsson y su grupo de investigación de la Escuela de
Medicina de la Universidad de Nueva York y publicado en The European Journal of
Immunology en diciembre de 2001 se comprobó que la eficiencia a la que una célula dendrítica toma Ags pertenecientes al virus Vaccinia en una célula apoptótica equivale a
la adición de 10 nM de péptido sintético mostrando la gran eficiencia de este mecanismo
de presentación con la subsecuente activación de linfocitos T CD8+ y la secreción de IL-2
e IFN-gama (Larsson et al., 2001). Aunque se acepta que cuando una CD fagocita a una
célula apoptótica infectada existe un reconocimiento directo de los Ags vía TLRs (Toll Like
Receptors) la evidencia ha mostrado que existen señales adicionales para este proceso
entre las que se encuentran las citoquinas como IL-1 o TNF involucradas en la respuesta
inmune innata inflamatoria que genera como resultado el reclutamiento de más células
fagocíticas y las Proteínas de Shock Térmico (HSPs), que son expresadas por la célula
infectada como resultado del estrés que esta genera y que estan involucradas en los
fenómenos de maduración de las CDs mediante su interacción con proteínas de
membrana de estos fagocitos y en procesos de limitación de la respuesta
77
inmunosupresora (Gough et al., 2001). Precisamente en este estudio se postula la
participación de estas moléculas señalizadoras en la transmisión de la información que les
permite a las células fagocíticas diferenciar entre una célula que sufrió fenómenos de
apoptosis debido a una infección y una que la sufrió como resultado de un proceso normal
de desarrollo y control celular.
Todos estos resultados de estudios independientes permiten sugerir, que aunque en un
principio, la apoptosis como resultado de una infección parece no tener funcionalidad
alguna en la eliminación del parásito, existen mecanismo celulares algo más
evolucionados que mediante la existencia de células centinelas como las CDs permiten
descubrir a los patógenos ocultos tras la cortina apoptótica. Sin embargo, la evidencia
también muestra que entidades como los virus han evolucionado de una manera
asombrosa para evitar cualquier tipo de respuesta durante la infección, entre ellas, la
apoptosis. Esta afirmación introduce el tema del capítulo f inal de esta revisión: el
fenómeno de evasión de los sistemas de control de la MCP y de respuesta inmune
mediada por el RABV en el SNC.
2.6.1. ARN COMO INDUCTOR DE APOPTOSIS Debido a que muchos virus, incluyendo el RABV, poseen genomas compuestos
exclusivamente por ARN, esta revisión creyó pertinente tocar aunque fuera brevemente al
ARN como una molécula activadora de procesos apoptóticos y altamente antigénica
según el contexto y el estado de desarrollo y estrés celular. Aunque hace unas décadas pareciera descabellado proponer a un ácido ribonucleico como un elemento involucrado
en la muerte celular, desde el descubrimiento en 1998 del fenómeno de ARN de
interferencia o ARNi (para más información revisar Mukherjee et al., 2003) la hipótesis
que lo postula como un neoepitope está ganando bastante fuerza. Adicionalmente,
durante los procesos apoptóticos se ha observado una modif icación sustancial de las
estructuras de ARN celular y que los ácidos nucleicos virales en conjunto con proteínas
del hospedero o proteínas propias están activando esta respuesta celular apoptótica de
maneras alternativas. Algunas de estas respuestas son altamente específ icas y
selectivas en relación al tipo de ARN que procesan y sorprendentemente, se ha
observado que las proteínas encargadas de procesar este material genético son las
caspasas a las cuales hasta el momento se les ha reportado actividad ARNasa (Cohen
GM, 1997). Así, aunque la función del ARN desnudo, su localización dentro de la
78
cascada enzimática y sus modif icaciones exactas durante el proceso del apoptosis son
comprendidas parcialmente, la Figura 22 presenta esquemáticamente lo descrito hasta el
año 2003.
2.6.2. REGULACIÓN DE LA APOPTOSIS POR VIRUS Aunque la apoptosis es un mecanismo que no induce respuesta inmune per se la
presencia de patógenos activa una respuesta igual o más agresiva que la presentación de
antígenos sin presencia de apoptosis. Bajo este criterio, la apoptosis no es el mecanismo
adecuado para evitar la respuesta inmune del hospedero. Para solucionar esta estrategia
defensiva los virus han desarrollado estrategias subversivas aún mejores que
complementan los mecanismos moleculares de interacción célula-virus como: la
disrupción de las funciones celulares normales, las interacciones ARNv/ADN con
proteínas celulares como la proteína La (que interactúa con el material genético de virus
como el HCV, el HIV y el EBV), las interacciones proteína viral-proteína celular, las
modif icaciones de proteínas celulares por acción de enzimas virales y f inalmente la
respuesta inmune y apoptótica como resultado de la infección (Herrmann y Kalden, 2003).
Sin embargo estas estrategias se basan en la especialización de proteínas virales y
aparentemente multifuncionales como se ha comenzado a describir para el RABV en el
cual se consideraba que las 5 proteínas eran exclusivamente de carácter estructural. Sin
embargo los estudios moleculares de la última década proponen que para muchas de
estas proteínas papeles adicionales en la regulación de la respuesta de las neuronas infectadas, un ejemplo son los trabajos realizados por Blondell y colaboradores en la
fosfoproteína P (Blondell et al, 2005).
A lo largo de este capítulo se ha observado que la apoptosis contiene una serie de pasos
individuales y un virus determinado solo tiene que influenciar uno solo de estos pasos
para afectar el progreso del proceso de MCP. Adicionalmente muchos virus,
especialmente los de ARN, llevan a cabo una estrategia aún mucho más simple:
replicarse rápidamente antes que una respuesta inmune sea activada o por el contrario,
mantener tasas de replicación muy bajas, en lo que se conoce como una infección
críptica, para que la infección no sea advertida.
79
Figura 22. ARN, mimetismo molecular y neoepítopes. Las infecciones virales introducen ARN foráneo al medio celular. Además de activar el mecanismo de ARNi este ARN viral induce la producción de anticuerpos con ayuda de linfocitos T ayudadores (Th). Adicionamente algunos linfocitos B permanecen como células de memoria inmunológica. En otro contexto, cuando una célula infectada sufre procesos de apoptosis o necrosis sirve de blanco para la acción de los linfocitos T citotóxicos y células fagocíticas. La granzima B introducida a estas células genera fragmentos antigénicos de ARN que pueden dar origen a anticuerpos ARN. Sin embargo en episodios de mimetismo molecular y autoreactividad, las células que han sido activadas contra ARN foráneo pueden reconocer ARN ribosomal (ARNr) y desencadenar fenómenos de apoptosis. Finalmente, un linfocito B puede internalizar un complejo ribonucleoprotéico y presentar separadamente tanto ARN como proteínas a los l infocitos T reactivos quienes inducen la maduración de la célula B. Figura tomada de Herrmann y Kalden, 2003.
Entre las estrategias más utilizadas por los virus están la inhibición de los mediadores de
señalización de la ruta extrínseca de la apoptosis como TNF y Fas. En particular, las
proteínas E3-10.4K y E3-14.5K de los Adenovirus reducen la expresión del Fas en la
membrana de la célula infectada. Por otro lado, algunos virus inhiben el mecanismo IFN
como el HSV, virus que afecta esta ruta de respuesta innata mediante la inhibición tanto
de la kinasa PKR así como de la ARNasa L, enzimas que normalmente se activan por la
presencia de ARN de cadena doble. La evidencia existente también ha permitido
80
descubrir que algunos Adenovirus bloquean la apoptosis mediada por los miembros pro-
apoptóticos de la familia Bcl-2, como Bad o Bax. La proteían E1B-19K inhibe una forma
específ ica de Bax y como resultado bloquea la ruta de MCP mediado por TNF-a. De igual
manera la proteína BHRF1 (17KDa) del EBV cumple un papel similar al de la proteína del
Adenovirus. De igual manera existen proteínas virales que cumplen con funciones como:
suprimir la acción de las caspasas, manipular el ciclo celular (oncoproteínas virales),
regular el estrés oxidativo o modif icar la función de algunos factores de transcripción
celulares. Para una lista detallada de las proteínas virales que modif ican el fenómeno de
MCP y sus blancos moleculares, la revisión publicada por el Journal of General Virology
en el año 2002 (vol 83, páginas 1547 a 1564) por Stew art Hay y George Kannourakis es
una excelente y actualizada fuente (Hay y Kannourakis, 2002).
Esta estrategia evolutiva no podía obviar uno de los mecanismos más críticos para la
eliminación de patógenos en los eucariota: la apotosis. Por ejemplo, el virus de la viruela
bovina. Dentro del genoma de este se encuentra la secuencia para codif icar crmA, una
proteían antiapoptótica que inhibe potencialmente la actividad de las caspasas mediante
el bloqueo de los receptores Fas y TNF (Cunnion KM, 1999). Otros virus como el HHV-8
(Herpervirus asociado al Sarcoma de Kaposi) expresan una proteína altamente homóloga
a c-FLIP (ver Figura 13) conocida como v-FLIP que se encarga de bloquear la activación
de la procaspasa 8 mediante su interacción con el complejo DISC. De igual manera otros
virus codif ican moléculas homólogas a las IAPs celulares (ver capítulo 2.3.2) con la
capacidad de bloquear la activación de las caspasas (Medema et al., 1999 y Glykofrydes et al., 2000). En otro casos como en el HHV-8 o el EBV la actividad antiapoptótica se basa
en la inhbición del factor de transcripción NF-kB; y una vez se desbloquea este factor las
células infecadas y tumorales desaparecen como resultado de la reactivación del
fenómeno apoptótico (Keller et al., 2000).
En el caso específ ico del EBV se ha identif icado la proteína responsable del fenotipo
antiapoptótico que conduce a los desordenes linfoproliferativos: LMP-1 (Latent Membrana
Protein-1 por sus siglas en inglés). Esta oncoproteína se une a los factores asociados a
TNF así como al dominio de muerte del mismo TNFR para prevenir la muerte celular y a la
vez promueve la supervivencia celular mediante la sobreregulación de proteínas Bcl-2
(Schultheiss et al., 2001).
Por otro lado, aunque el mecanismo por el cual el HHV-8 desregula la activada de NF-kB
no está descrito totalmente Friborg y su grupo de colaboradores reportaron en Nature que
81
la proteína viral LANA (Latency-Associated Nuclear Antigen por sus siglas en inglés) tenía
la capacidad de de reprimir la expresión de p53 y promover la supervivencia cellular
(Friborg et al., 1999). Adicional a la capacidad del HHV-8 de codif icar proteínas
inhibidoras, este virus contiene diferentes marcos de lectura abiertos (Open Readings
Frames u ORFs por sus siglas en ingles) que codif ican para una serie de factores
conocidos como vIRFs encargados de regular la expresión de las proteinas involucradas
en la respuesta vía IFN (Mamane et al., 1999). Finalmente, al igual que en el EBV en el
HHV-8 se ha descrito la existencia de una molécula análoga a Bcl-2 que no se
heterodimeriza con Bax y no procesada por las caspasas celulares, características que le
permiten a esta proteína viral interferer fuertemente con el proceso de MCP (Sarid et al.,
1997). Así, además de promover un proceso de replicación viral más efectivo –lo cual ya
es nocivo para el hospedero- estas proteínas convierten el tejido infectado en tejido
canceroso. En un contexto similar, muchos de estos virus codif ican también para
proteínas homólogas a factores de crecimiento celular y para receptores de estos factores
(comentado por Richard F. Ambinder, 2000 en America Journal of Pathology). En la
Figura 23 y 24 se resume de forma esquemática los mecanismos más comunes utilizados
por los virus para la evasión de la respuesta apoptótica.
A diferencia de los virus con genoma ADN, los virus ARN como el HTLV-1 posee una
cantidad mucho inferior de genes. Sin embargo aunque su ARN o complejos
ribonucleoproteícos pueden despertar reacciones de muerte celular como se propuso en
el capítulo inmediatamente anterior, pueden codif icar para proteínas de subversión de la respuesta celular como en el caso de este virus causante de leucemia –de ahí su nombre
Human T Leucemia Virus Type l- la proteína Tax, una fosfoproteína celular que
transactiva factores asociados a NF-kB y elementos de respuesta al AMPc,
desequilibrando tanto la respuesta celular como su patrón de expresión genética (Yoshida
M, 2001).
82
Figura 22. Regulación viral de la ruta extrínseca de activación apoptótica. Los eventos de bloqueo de la señalización vía TNF y sus receptores asociados es una estrategia altamente utilizada por los poxvirus. Este tipo de virus producen receptores falsos que aunque sufren procesos de unión no desencadan señalización alguna y a su vez bloquean posibles señales futuras. Otro mecanismo altamente util izado es la síntesis de FLIP viral (o vFLIPs) que al igual que su contraparte celular contiene dominios de interacción con moléculas adaptadoras como FADD o con las procaspasas 8 y 10. Adicionalmente el CMV produce una proteína conocida como vICA que se une directamente a la procaspasa 8 evitando su activación. Por otro lado, virus como el EBV codifican para productos como la proteína LMPl que se auto-agrega a moléculas como TRAF y TRADD dando como resultado la activación de la paradójica ruta antiapoptótica mediada por NF-kB (ver capítulo 2.4.3). Finalmente, los Adenovirus codifican en su región E3 para proteínas que forman un complejo heterogéneo encargado en facil itar la remoción de receptores tipo DEATH com Fas, TRAILR1 y TRAILR2, fenómenos con los cuales la célula se hace “inmune” a cualquier tipo de señalización extrínseca que la induzca a activar proteínas apoptóticas. Figura tomada de Ware et al., 2002.
83
Figura 23. Regulación viral de la ruta intrínseca de activación apoptótica. Virus oncogénicos como el HPV y ciertos Adenovirus bloquean vías intrínsecas de activación apoptótica mediante la síntesis de tipos específicos de inactivadotes de sensores de estrés celulares como p53. Adicionalmente muchos virus codifican para proteínas ortologas a las proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2 (ver capítulo 2.4.2) que antagonizan fuertemente con las proteínas proapoptóticas. Finalmente están las proteínas virales IAPs (vIAPs) que mediante intearacciones la proteína Smac/DIABLO cambian el equilibrio hacia la superviencia celular; o mediante interacciones con las procaspasasa inhiben su potencial apoptótico. Figura tomada de Ware et al., 2002.
84
3. NEURONAS SENSORIALES
Las neuronas sensoriales de los mamíferos han ocupado un lugar especial en el estudio
de la neurología debido a que son las encargadas de transmitir toda la información desde
la periferia hacia el SNC. La médula espinal (ME) se comunica con el sistema nervioso
periférico a través de las raíces anteriores y posteriores de cada segmento medular.
Estas, se unen a cada lado de la médula para formar los nervios raquídeos que salen del
canal vertebral a través de los agujeros de conjunción. La raíz anterior o ventral se
continúa con la médula por el asta anterior o ventral y consiste principalmente en f ibras
eferentes de cada segmento originadas en su mayoría en las grandes células motoras del
asta anterior. La raíz posterior o dorsal presenta una región llamada ganglio de la raíz
dorsal (GRD) o ganglio espinal que se localiza en los agujeros intervertebrales (Squire et
al.., 2002). Los GRD son agregados celulares ubicados en los espacios intervertebrales a
lo largo de las secciones cervicales, torácicas, lumbares, sacras y coccígeas a cada lado
de la médula como se observa en la Figura 24.
Debido a que los GRD son de gran tamaño y de fácil disección, han servido como modelo
para el estudio de la estructura y función de los receptores sensoriales y de otras
funciones neuronales que van desde los canales de transporte iónicos, hasta la
dependencia de factores neurotrópicos específ icos. Esta completamente claro que dentro
de este gran grupo de las “sensoriales” existe una gran variedad de subpoblaciones
definidas morfológica, f isiológica y bioquímicamente; y aunque han sido caracterízadas,
es claro para la comunidad científ ica comprometida con este tema que las características individuales son completamente ignoradas, afirmación que complica pero a la vez abre el
panorama en el estudio de las interacciones bioquímicas existentes para el transporte
sensorial y en lo que concierne a esta revisión, a los fenómenos de interacción entre virus
altamente neurotrópicos como el RABV y este tipo de neuronas. Debido a que durante
décadas se han estudiado las diferentes características celulares de esta población
neuronal y a la fecha se cuenta con una cantidad apreciable de información, en este
capítulo se hace una revisión sobre los hallazgos más relevantes en neurobiología
sensorial basados principalmente en el libro Sensory Neurons: Diversity, Development
and Plasticity (Oxford Press, 1992) que la Doctora Sheryl A. Scott del Departamento de
Neurobiología y Comportamiento de la Universidad Estatal de Nueva York publica en
colaboración de un gran número de colegas a lo largo de Europa, Norte América y
Cercano Oriente.
85
3.1. NEURONAS DEL GANGLIO DE LA RAíZ DORSAL
Estas neuronas constituyen junto con las neuronas de la raíz ventral la base de la
comunicación a través de la columna vertebral. En el siglo XIX Charles Bell (1811) y
Francois Magendie (1822) hicieron dos de los aportes más importantes para el
entendimiento de la organización y funcionamiento del sistema nervioso en los mamíferos.
Estos científ icos propusieron que cada segmento de la columna vertebral tenía una raíz
dorsal de tipo sensorial y una raíz ventral de tipo motor estableciendo lo que se conoció
como la Ley Bell-Magendie que establece el principio básico del transporte y conducción
aferente hacia el SNC. Estudios de carácter f isiológico y anatómico ligaron a los GRD
como un tipo específ ico de neuronas a los cuerpos celulares con las terminaciones
intervertebrales, las f ibras nerviosas periféricas y las terminales aferentes en los órganos
periféricos.
Si fuera necesario resumir en un solo concepto la función de las neuronas de los GRD,
podría decirse con certeza que son transductoras y transmisoras de información. Cada
una de las neuronas sensoriales del GRD junto con su proceso dendrítico, su f ibra
aferente y su terminal receptiva periférica, sus contactos sinápticos y su ramificación
axonal central, conforma una unidad aferente o unidad concerniente. En conjunto cada
una de estas unidades colabora para llevar el estímulo sensorial hacia el SNC lo que
permitió inferir desde el siglo XIX especialmente con Von Frey en 1897 y con Blix y
Goldscheider en 1884, que estas unidades dif ieren f isiológicamente así conforme un gran
sistema genérico. Mediante estudios anatómicos y sensoriales, Von Frey dio inicio a la definición funcional y estructural de estas unidades. Utilizando diferentes estímulos como
temperatura, dolor y contacto, este científ ico identif icó puntos específ icos que luego
correlacionó con la distribución diferencial de terminaciones neurológicas
morfológicamente diferentes. Posteriormente, una definición más concreta sobre estas
diferencias resultó de los trabajos realizados por Erlanger y Passer en la primera mitad del
siglo XX donde se encontró que las velocidades de conducción y potencial de acción de
las neuronas sensoriales periféricas estaban en estrecha relación con el diámetro de las
f ibras aferentes de cada unidad. Adicional a esta característica morfológica, Erlanger y
Passer, encontraron entre 1950 y 1955 que las neuronas con mayor tamaño
concentraban un mayor patrón de mielinización y que a lo largo del SNP este patrón
cambiaba, estableciendo así una diferenciación preeliminar con base en la velocidad de
transmisión como resultado del tamaño de las f ibras neuronales y la cantidad de mielina
86
presente (Pearl ER en Scott SA, 1992). A partir de este punto los estudios condujeron,
desde la segunda mitad del siglo XX a un análisis más profundo de tipo morfológico,
f isiológico y f inalmente bioquímico con la intención ahondar en las características básicas
que definieran las subpoblaciones neuronales y no neuronales presentes en el intrincado
sistema nervioso sensorial y específ icamente en los GRD.
3.2. CLASIFICACIÓN DE LAS SUBPOBLACIONES NEURONALES Las neuronas sensoriales son de carácter exclusivamente sensorial y con un tamaño que
varía entre los 20 y los 100 µm en modelos murinos, su desarrollo tiene origen en la
cresta neural desde donde migran como neuroblastos bipolares en estados iniciales del
desarrollo nervioso y tisular. Una vez establecidos adquieren características bipolares o
seudounipolares. Después del desarrollo estas f ibras neuronales se dividen en dos
ramas, una medial o central que forma la raíz dorsal que penetra la médula para
establecer conexión con las neuronas presentes en el asta dorsal, y otra lateral o
periférica que se une a la raíz ventral medular formando el nervio raquídeo y
posteriormente se dirigen a la periferia para dar origen a los diferentes receptores
sensitivos en músculo, articulaciones, piel u otros órganos (conocidos como vísceras) de
donde, en forma libre o encapsulados en células especializadas, captan cada uno de los
estímulos del medio y los convierten en impulsos nerviosos aferentes (Martin JH, 1996).
El avance logrado en histología durante más de 100 años permitió en la segunda mitad
del siglo XX definir que los GRD se componían de dos tipos celulares donde el primero y más común eran las neuronas y el segundo se componía de células no neuronales como
fibroblastos encargados de producir la matiz extracelular presenta en el tejido conjuntivo
del ganglio, y células satélites como las células de Schwann.
La función de estas últimas se puede definir como de protección debido a que son la glía
del SNP y por ende se encargan de cubrir cada uno de los axones de las neuronas
sensoriales del ganglio y definir su patrón de mielinización según su localización y función
(Law son SN en Scott SA, 1992). Por fuera de esta capa, las neuronas están rodeadas
por f ibras del tejido conjuntivo y tejido conjuntivo vascularizado (Escobar et al.., 1998).
87
Figura 24. Distribución de los GRD. El centro del ganglio está ocupado por fibras neuronales formadas por las prolongaciones medial y lateral. Las prolongaciones laterales de cada ganglio se dirigen a la periferia para dar origen a los receptores sensitivos para captar, convertir y transportar los estímulos del medio. Figura tomada de Microsoft Corporation.
Posteriormente los trabajos en neurobiología establecieron una clasif icación más rigurosa
de las poblaciones y subpoblaciones neuronales presentes en los GRD a nivel tanto morfológico, como fisiológico y bioquímico, esta última como resultado de la identif icación
de moléculas marcadoras expresadas de forma diferencial entre las neuronas de tamaño
pequeño –asociadas a nocicepción o al dolor- y neuronas medianas y grandes –
asociadas a mecanorecepción y proiocepción- (Martinez et al.., 2000). Como lo propone
Hali y su grupo de trabajo en la revisión publicada en The Journal of Neuroscience en
1997, la diversidad a cada uno de estos niveles está determinada por delicados factores
de regulación genética, más sin embargo los estímulos que los generan todavía son parte
de la investigación y discusión en neurobiología (Hali et al.., 1997).
La identif icación de las características bioquímicas y estructurales como resultado de la
búsqueda de parámetros clasif icatorios es de gran importancia al momento de trabajar
modelos tanto in vitro como in vivo. Es razonable pensar que un conocimiento profundo
88
del modelo celular sobre el cual se esta trabajando, conduce sin duda al establecimiento
de hipótesis acertadas sobre el comportamiento de ciertas interacciones como la del
RABV con las neuronas sensoriales durante el transporte retrógrado y con marcadas
características de entrada, inmunosupresión y subversión de la respuesta apoptótica
neuronal que definitivamente están en estrecha relación con la constitución bioquímica y
genética de la célula hospedera.
3.2.1. CLASIFICACIÓN MORFOLÓGICA
Las observaciones que se han llevado a cabo desde hace más de 100 años han
establecido y aceptado que la principal división morfológica de las neuronas presentes en
el GRD se define en dos tipos: las neuronas claras y grandes (L por sus siglas en inglés) y
las neuronas oscuras y pequeñas (SD por Small Dark). Esta clasif icación obtenida por
técnicas de microscopía de luz a mediados de los 90 por Andres KH quien las designara
incialmente como neuronas A y B (Andres KH, 1961), sin embargo recientemente se
definieron como neuronas L y SD. Estudios estadísticos llevados a cabo en 1984 por
Law son y sus colaboradores en GRD de ratas adultas, confirmaron que estas neuronas
tiene una distribución normal esperada en relación a su tamaño, donde las neuronas
claras son exclusivamente grandes y las neuronas oscuras exclusivamente pequeñas
(Law son et al.., 1984). Posteriormente se descubrió por microscopía de contraste de
fases y microscopía electrónica que esta característica de coloración estaba dada por la
presencia, dispersa en las neuronas L y concentrada en las neuronas SD, de unos agregados de RE rugoso a los que se les dio el nombre de sustancias de Nissl.
Adicionalmente se comprobó que Nissl se distribuía de una manera irregular en las
células L debido a la presencia de microtúbulos y altas concentraciones de neurofilamento
(NF), mientras que lo hacía de una manera compacta en las células SD debido a la alta
densidad de organelos citoplasmáticos así como a la poca cantidad de NF (Yamadori T,
1970). El estudio ultraestructural de estas poblaciones morfológicamente definidas se fue
ampliando y logró definir patrones diferenciales de impregnación con sustancias con
Osmio yodado de Zinc que permitieron a Rambourg y su grupo incluir una nueva
subpoblación neuronal conocida como C y que se caracterizaba por ser la más pequeña
de las neuronas dentro del GRD (Rambourg et al.., 1983).
Unos años después, estudios ultraestructurales y citoquímicos pudieron definir en un
modelo murino tres tipos de neuronas clasif icadas como A, B y C, cada una dividida en
89
los sutptipos A1 a A3, B1 a B3 y C morfológicamente divergentes e independientes de la
actividad y/o estimulación, mostrando que la divergencia morfológica y funcional es un
patrón establecido con posterioridad al desarrollo y gobernado por fenómenos genéticos y
epigenéticos. A nivel bioquímico, se encontró que estos tipos divergían de igual manera
según la actividad de la anhidrasa carbónica y la fosfatasa ácida, la distribución de los
organelos citoplasmáticos y la acumulación y respuesta al neurotransmisor Glutamina
(Sommer et al.., 1985), como se expondrá en un capítulo posterior. Aunque todas las
subpoblaciones están presentes en los GRD, se coincide en afirmar que las neuronas
medianas y pequeñas son predominantes debido quizás a que las células precursoras de
las neuronas grandes detienen su división mucho antes de lo que lo hacen las células
precursoras de las medianas y pequeñas. El desarrollo de los dos grandes subtipos
neuronales está relacionado con la distribución de las células según tamaño, y dicha
distribución ha permitido establecer que el destino tanto de neuronas L como de neuronas
SD desde la cresta neural depende del día de su nacimiento que es de aproximadamente
24 horas de diferencia entre las L y las SD (Law son et al.., 1979). A partir de esta gran
subdivisión se han podido establecer diferencias que sorprendentemente siguen
mostrando una gran brecha entre claras y oscuras tanto a nivel funcional como
bioquímico, demostrando que la división hecha ya hace casi 50 años por microscopía de
luz es un reflejo de las íntimas diferencias moleculares existentes entre las neuronas
sensoriales del GRD.
3.2.2. CLASIFICACIÓN FISIOLÓGICA Como fue establecido anteriormente, la clasif icación de tipo morfológico fue el primer paso
para mostrar que las diferencias que observadas “a simple vista” solo eran un reflejo de
las discrepancias funcionales y por ende bioquímicas y moleculares entre los diferentes
tipos neuronales presentes en los GRD. Según el sitio de recepción (piel, músculo o
vísceras) y el tipo de información sensorial que procesen y según la velocidad de
conducción a la que la transmiten dicha información, las neuronas pueden ser
caracterizadas y posteriormente clasif icadas bajo un criterio funcional como nociceptivo,
mecanoreceptivo o propioceptivo. Sorprendentemente los estudios en el área han
revelado que el tamaño del soma, el grosor de la f ibra axónica y la localización neuronal
están en una estrecha relación con su funcionalidad, estableciendo así el parámetro
f isiológico de clasif icación dentro del GRD. Estudios electrofisiológicos en asociación con
90
propiedades detectadas por inmunocitoquímica, mostraron que las neuronas grandes o L
(NF+ y f ibras mielínicas) poseían f ibras axónicas tipo A, caracterizadas por ser de
conducción rápida; mientras que las neuronas pequeñas o SD (NF- y f ibras amielínicas)
mostraban la presencia de f ibras C caracterizadas por ser de conducción lenta. Adicional
a esta velocidad de conducción se encontró que en las neuronas del GRD se presentaban
dos tipos principales de potencial de acción (PA o AP por sus siglas en inglés), uno de
larga duración caracterizado por inf lexiones en la fase de descenso así como por
corrientes de entrada de Na+ insensibles a Ca2+ y a la Tetrodotoxina (TTX), y un AP de
corta duración sin la presencia de dichas inflexiones y con sensibilidad en sus corrientes
de Na+ a la TTX. Posteriormente se encontró que este PA tenía una relación con la
velocidad de transmisión, pues solo las neuronas con f ibras tipo C poseían un PA con
inflexiones mientras que las neuronas con f ibras tipo A poseían los dos tipos de PA
(Yoshida et al.., 1979). Estudios f isiológicos y bioquímicos realizados a partir de
preparaciones intactas de segmentos periféricos del GRD donde los receptores podían
ser fácilmente aislados y caracterizados pudieron establecer una correlación entre la
clasif icación electrofisiológica, la velocidad de conducción, el potencial de acción y el tipo
de receptor presente. Las f ibras gruesas mielínicas de rápida conducción componen los
grupos funcionales l, ll y lll asociados generalmente al transporte de la información
propioceptiva y mecanoreceptiva, mientras que las f ibras delgadas amielínicas de lenta
conducción componen los grupos lV y V asociados a la conducción de las señales
nociceptivas y termoreceptivas (Law son et al.., 1985). Visto hasta el momento, las neuronas sensoriales exhiben diferentes propiedades a
muchos niveles lo que permite sugerir que esta divergencia es el resultado de
características intrínsecas que les permiten cumplir funciones diferentes pero
dependientes unas de otras para un correcto transporte de las señales nerviosas. A nivel
f isiológico estas diferencias parecen estar basadas en los patrones eléctricos de
conducción y potencial característicos y estos a su vez relacionados con las propiedades
morfológicas y de mielinización. A un mayor nivel, se ha sugerido que esta
especialización a nivel f isiológico central puede estar determinada en parte por las
propiedades membranales de las terminales y del soma neuronal (Koerber HR y Lorne
MM en Scott SA, 1992).
91
3.2.3. CLASIFICACIÓN BIOQUÍMICA La identif icación y clasif icación de péptidos, enzimas y carbohidratos específ icos dentro
de los diferentes tipos neuronales dentro del GRD, ha tenido un gran avance debido a la
técnicas de inmunocitoquímica e inmunohistoquímica. Sin embargo, y como lo expone
Weihe y su grupo de investigación en una revisión de 1989 que referenciada por Sally
Law son en el Capítulo 2 del libro de Sheryl Scott, han existido una serie de problemas en
la interpretación de los resultados debido a la alta reactivada cruzada de los anticuerpos
utilizados, tema que debería considerarse con mayor frecuencia en los estudios
inmunoquímicos. Para solucionar este problema en investigación en neurobiología, y
como una técnica que ha tomado mayor fuerza en la última década, la hibridización de
ARNm in situ (Law son SN en Scott SA, 1992) ha permitido el descubrimiento de una
cantidad adicional de moléculas neuronales específ icas además de sus patrones de
expresión en cada subpoblación, dando luces en los sistemas de regulación que
determinan la morfología y f isiología neuronal de los GRD.
3.2.3.1. NEUROFILAMENTOS Como fue descrito anteriormente los patrones de inmunoreactivadad que presenta el NF
hacen posible una distinción adicional entre las neuronas sensoriales tipo L y tipo SD
dentro del GRD. El citoesqueleto de las neuronas está formando por tres grupos de
f ilamentos altamente conservados f ilogenéticamente que se clasif ican según su diámetro
en: microtúbulos o neurotúbulos que tiene un diámetro promedio de 25 nm, en f ilamentos intermedios o neurofilamentos que poseen un diámetro hasta de 10nm y f inalmente en
microfilamentos que tienen un diámetro de tan solo 5 nm (Naves et al., 1996).
Los neurofilamentos son proteínas estructurales codif icadas por tres genes similares y
cuya función es mantener la morfología neuronal y regular el diámetro axonal.
Específ icamente se han descrito una serie de anticuerpos que reconocen de manera
diferencial epítopes en los diferentes tipos neuronales, al menos en un modelo murino.
Por una parte el anticuerpo RT97 reconoce específ icamente la forma fosforilada del NF en
la subunidad de 200 KDa en las neuronas tipo L (grandes) mientras que otros anticuerpos
reconocen cualquiera de las otras tres subunidades presentes tanto en neuronas L como
SD (pequeñas) pero con un patrón de fosforilación y distribución diferente donde
cualquiera de las subunidades fosforiladas tiene una mayor prevalencia en las neuronas L
(Perry et al., 1991). Los estudios f isiológicos descritos anteriormente mostraron que el
92
patrón de neurofilamentación estaba asociado a la velocidad de conducción del impulso
nervioso así como al potencial de acción neuronal: las neuronas grandes, con f ibras
mielínicas (tipo A) y de conducción rápida son positivas para NF mientras que las
neuronas pequeñas, con f ibras amielínicas (tipo C) y de conducción lenta son negativas
para NF. Además del NF existen otros f ilamentos intermedios como la periferina. Esta
proteína se encuentra exclusivamente en neuronas NF- así como proyectada hacia la
periferia, característica que además de darle valor agregado al momento de clasif icar las
células, parece estar relacionado con el estado de desarrollo neuronal (Troy et al., 1990).
3.2.3.2. NEUROPÉPTIDOS Desde que las técnicas en inmunoquímica y en separación, purif icación e identif icación de
proteínas lo permitieron, los neuropéptidos han sido los marcados bioquímicos más
importantes y eficaces para la clasif icación de las subpoblaciones neuronales en el GRD.
Son moléculas involucradas en la transmisión de los impulsos nerviosos desde la periferia
hasta el SNC, en la inflamación neurogénica que promueve la liberación de histamina vía
monocitos, la regulación del f lujo sanguíneo y la sobreexpresión de neurotrofinas
especiales en respuesta a lesiones de los nervios periféricos y f inalmente en la respuesta
inmunológica actuando como factores quimiotácticos e inmunes sobre las células inmunes
(revisado por Castellanos JE, 2002). A continuación se describirán de algunos de los
neuropéptidos que muestran una clara distribución diferencial entre las neuronas
sensoriales anteriormente clasif icadas como subtipos divergentes, conectando así los tres parámetros de clasif icación.
Taquicininas
Este tipo de neuropéptidos hace relación a un gen conocido como el gen
preprotaquikinina A que es expresado en la totalidad de las neuronas sensoriales
primarias como tres ARNm diferentes que dan origen a productos proteínicos que
contienen dentro de sus secuencia la sustancia P (SP). Los productos completos son la
neurokinina A producida por dos de los ARNm y el neuropéptido K producido por el
mensajero restante (Weihe et al., 1989). Interesantemente, altas concentraciones de
ARNm de este gen fueron encontradas dentro de las neuronas pequeñas en relación a la
densidad de mensajero encontrado en las células grandes. Específ icamente la sustancia
P, es el neuropéptido por el cual se pueden clasif icar las neuronas dentro del GRD debido
93
a que se encuentran principalmente en neuronas de diámetro pequeño y mediano.
Además de haber sido el primer neuropéptido en ser descrito en los GRDl como
neurotransmisor, sus porcentajes varían según la sección vertebral analizada, con
porcentajes mayores al 30% en los ganglios dorsales lumbares y menores al 10% en las
regiones cervicales, mostrando un patrón de distribución muy similar al del péptido
intestinal vasoactivo (VIP) (Anand et al., 1983). Junto con la SP se encuentran otro tipo de
neuropéptidos como el péptido relacionado al gen de la calcitonina (CGRP), la
somatostatina (SOM) y el VIP, lo que plantea una posible relación funcional entre estos
marcadores bajo un contexto dependiente de especie, dado que estas relaciones son más
fuertes en modelos felinos que en modelos murinos. Por otro lado, los estudios que
intentan asociar este neuropéptido con otros marcadores como enzimas o carbohidratos
no han mostrado ningún patrón claro de sobrelapamiento. En humanos, los porcentajes
de neuronas inmunoreactivas para SP en tejido de individuos mayores de 60 años ha
mostrado valores que superan los establecidos en ratas (44%), lo que permitiría asociar
preliminarmente (debido a la ausencia de tejido humano joven como control) los
fenómenos de senescencia con la disminución en las neuronas sensoriales grandes que
como resultado mostraría un porcentaje total mayor de neuronas pequeñas y medianas y
por ende unos resultados como los obtenidos por Holford y su grupo de colaboradores en
1994 (Holford et al., 1994). Sorprendentemente, los valores in vitro contrastan con los
datos anteriores. En cultivos de GRD, el número de neuronas positivas para SP
disminuye a valores cercanos al 28% por la ausencia de factores neurotróficos como en NGF (Neural Growth Factor o Factor de Crecimiento Nervioso) y otras moléculas que
regulan y mantienen el fenotipo neuronal que in vivo son suministrados por las células de
soporte periférico (Muldery PK, 1994) y que si son suministrados a cultivos de GRD en
desarrollo retoman sus niveles de reactividad a SP normales (Ninomiya et al., 1994). Por
otra parte, estudios mecanoceptivos y nocioceptivos han mostrado que la SP es liberada
durante fenómenos de inflamación desde las terminales periféricas en neuronas
desarrolladas, y desde las terminales centrales de las neuronas aferentes primarias en
procesos todavía no esclarecidos, lo que permite establecer, junto con datos que
muestran hasta cuatro veces más SP en terminales periféricas, que la función principal de
las sustancia P está relacionada con funciones periféricas más que centrales (Law son SN
en Scott SA, 1992).
94
Péptido relacionado al gen de la Calcitonina (CGRP) Presente entre el 30% al 50% de las neuronas del GRD en murinos, el CGRP se
encuentra mayoritariamente en neuronas pequeñas. Adicionalmente también presenta
una mayor densidad en este tipo de neuronas como lo demuestra la intensidad descrita
después de tratamientos de tinción citoplasmática (Castrignano et al., 1990). De las dos
isoformas existentes, aCGRP es predominante en neuronas grandes mientras que
bCGRP se encuentra en mayor proporción en las células pequeñas y medianas. Al igual
que la sustancia P este neuropéptido se encuentra en coexistencia con otros muchos
(SOM, VIP, FRAP, bombesina, etc) dependiendo de la especie de mamífero y sección
vertebral analizada. En relación a las velocidades de conducción (f ibras C y f ibras A) no
parece existir patrón alguno, pues sin importar la concentración o isoforma del CGRP las
velocidades cubren un amplio rango. Sin embargo, se ha visto que las neuronas
medianas y grandes con presencia de aCGRP son también RT97 positivas (NF+), poseen
f ibras principalmente del tipo A y poca SP en contraste con las neuronas pequeñas en las
cuales la concentración de SP es mayor, poseen tanto aCGRP como bCGRP y el
porcentaje de f ibras A y C parece ser igual . Funcionalmente se ha observado que el
CGRP también es sobreexpresado y liberado preferencialmente en comparación con
otros neuropéptidos en episodios de inflamación neurogénica (Law son SN en Scott SA,
1992) debido a que puede inhibir la endopeptidasa encargada de desactivar a la SP (Ju et
al., 1987).
Somatostatina Presente principalmente en la región lumbar y tan solo entre un 5% a un 15% de la
totalidad de las neuronas del GRD, la somatostatina o SOM está presente
mayoritariamente en la neuronas sensoriales pequeñas o medianas (Garry et al., 1989).
A diferencia del sobrelapamiento de casi todos los neuropéptidos en los diferentes
subtipos de neuronas, se ha observado que SOM se encuentra en ausencia con RT97 y
de CGRP, permitiendo corroborar los datos de Garry y colaboradores sobre la presencia
de este neuropéptido exclusivamente en un tipo de neuronas pequeñas probablemente
con presencia de f ibras C. Sin embargo, estos resultados también permiten plantear que
existen varios subtipos de neuronas pequeñas que utilizan por lo menos tres
neurotransmisores diferentes (Nagy et al., 1982). En cuanto a su localización tisular, se
ha visto la presencia de SOM en las neuronas de las terminaciones cutáneas, poca
95
presencia en la población muscular y casi nula en la visceral lo cual podría relacionarse
con una de las funciones de este péptido a nivel periférico: la atenuación de la respuesta
hiperinmune (O´Dorisio et al., 1985). Por otro lado, se ha visto a nivel central que la SOM
está involucrada en fenómenos de neurotransmisión termoreceptiva más no
mecanoreceptiva (Tiseo et al., 1990).
Otros Neuropéptidos Entre estos se encuentran polipéptidos como VIP (Péptido Intestinal Vasoactivo),
galanina, bombesina o péptido liberador de gastrina, colecitokinina (CKK), Arginina
vasopresina, oxitocina, serotonina/5HT, péptidos opioides, el péptido natriurética atrial y el
factor liberador de la hormona de crecimiento. Sin embargo la información es muy
limitada y nuevamente se ha corrido con resultados poco concluyentes debido a la
presencia de la reactividad cruzada.
La molécula VIP se encuentra involucrada en la glicogenólisis y la utilización de glucosa
en neuronas dañadas (Shehab et al., 1986) así como en fenómenos de vasodilatación, de
ahí que su hallazgo no sea generalizado a lo largo de los GRD. Sin embargo, localización
con la tinción colchicina ha revelado que se encuentra preferencialmente en neuronas
medianas y pequeñas de la sección torácica coexistiendo con la SP y CGRP, aunque
estudiado en modelos animales diferentes.
La galanina o GAL se encuentra principalmente en neuronas pequeñas, comprometiendo
el 15% de la población total de neuronas sensoriales, y ubicada en la región lumbosacral. Con un bajísimo porcentaje de colocalización con SP (0% al 2%) se ha visto que la GAL
está involucrada en la inhibición de la liberación de su transmisor clásico evitando
fenómenos de transmisión desde neuronas dañadas.
La Arginina vasopresina y la oxitocina han sido reportadas mediante el uso de técnicas de
radioinmunoensayo (RIA) en el 50% de las neuronas del GRD, principalmente en
neuronas RT97 negativas (Kai-Kai MA, 1989). Por otro lado y debido quizás a la falta de
técnicas más sensibles, hasta el año de 1992 los resultados para estas moléculas a nivel
de expresión del péptido o de presencia de su ARNm eran muy contradictorios y poco
concluyentes con lo que la interpretación de su funcionalidad queda por establecer.
Ciertos péptidos opioides como la prodinorf ina A y B así como la leuenkefalina han sido
identif icados hasta en el 7% de las neuronas del GRD, especialmente en células primarias
aferentes de diámetro pequeño. Análisis de RIA en GRD humanos han demostrando que
96
la concentración de derivados de la leuenkefalina es mucho mayor que la de la
prodinorf ina y adicionalmente que el 95% de las neuronas positivas para dinorf ina lo eran
también para SP (Wehie et al., 1989).
De los neuropéptidos descritos al inicio de este capítulo, algunos no cuentan con
información concluyente o relevante por lo cual se han obviado. Sin embargo, uno de los
objetivos de esta sección es mostrar que existen una serie de parámetros bioquímicos
que aunque a veces parecieran contradictorios o parcialmente irrelevantes, si se colocan
juntos y se relacionan con las características funcionales y morfológicas adquieren una
gran utilidad al momento de describir exactamente una neurona del GRD; y tratando de
plantear una homología, como lo hiciera una clave dicotómica en biología evolutiva.
3.2.3.3. ENZIMAS Mediante anticuerpos monoclonales y el uso de técnicas de inmunocitoquímica e
inmunohistoquímica, se han encontrado neuropéptidos específ icos en las neuronas
sensoriales del GRD. De igual manera se han encontrado también algunas enzimas que
varían sus concentraciones, isoformas y umbrales de catálisis según los tipos de
neuronas previamente clasif icadas según parámetros morfológicos y f isiológicos. A
continuación se describirán algunas de estas proteínas catalíticas con base en lo descrito
por Sheryl A Scott (Scott SA, 1992).
Acetil Colinesterasa (AChE) y Colina Acetiltransferasa Como su nombre lo indica, esta enzima está involucrada en la regulación del
neurotransmisor acetilcolina. Debido a que este neurotransmisor se encuentra asociado
principalmente a neuronas motoras, el papel dentro de las diferentes subpoblaciones
neuronales dentro del GRD es todavía tema de discusión. Sin embargo su producto de
reacción –que refleja la presencia de la enzima en al menos el 50% de las neuronas- se
encuentra principalmente en neuronas de diámetro pequeño con o sin mielina, como lo
demostraron estudios realizados por Pannese y su grupo en 1974 y reportados por
Law son SN en 1992 (Scott SA, 1992). Adicionalmente, mediante la utilización de un
anticuerpo monoclonal para la enzima colina acetiltransferasa se pudo comprobar la
existencia de neuronas colinérgicas dentro del GRD que comprenden alrededor del 66%
de las neuronas sensoriales de diámetro pequeño (Sann et al., 1995). Juntos, estos
estudios demostrarían que las neuronas sensoriales del GRD usan la acetilcolina como
97
neurotransmisor y además son capaces de sintetizarla. Sin embargo la función de este
neurotransmisor en neuronas sensoriales es a la fecha motivo de discusión.
Fosfatasas Ácidas Identif icadas en la mayoría de las neuronas pequeñas del GRD, son en su mayoría
isoenzimas extralisosomales que se encuentran presentes en las neuronas SD y solo en
ausencia de los neuropéptidos SOM y SP. Dentro de este grupo se encuentra FRAP
(Fluoride Resistant Acid Phosphatase) que solo hasta hace unos años fue identif icada
como la misma TMP o tiamina monofosfatasa debido a su actividad y distribución dentro
de las subpoblaciones neuronales. Estudios posteriores mostraron que otros nucleótidos
podían servir como substratos para FRAP, constituyéndose como 5´GMP, 5´IMP y
5´AMP. A lo largo del nervio sensorial se ha encontrado la presencia de FRAP en
neuronas proyectadas hacia el tejido muscular y de la piel (Law son SN en Scott SA,
1992).
Adenosina Deaminasa (ADA) y Proteínquinasa C La enzima ADA se ha reportado en una pequeña proporción de neuronas SD del GRD
que comprende del 7% al 13% en un modelo murino. Debido a sus características
catalíticas, su presencia presupone que estas neuronas pequeñas utilizan las purinas
como transmisores y co-transmisores. Al igual que para enzimas como la fosfatasa ácida
FRAP, la presencia de ADA se caracteriza por no sobrelapar con neuropéptidos como SP, pero a diferencia de esta primera, todas las neuronas con marcaje inmucitoquímico para
ADA lo mostraron también para SOM lo que podría establecer relaciones funcionales
entre enzimas y neuropéptidos (Nagy et al., 1985).
Por otro lado, la Proteínquinasa C se ha encontrado en altas concentraciones en
aproximadamente el 45% de las neuronas grandes de los GRD lumbares y especialmente
en f ibras con presencia de mielina, lo que podría relacionar la actividad catalítica de esta
enzima con fenómenos de conducción neuronal. (Roivainen et al., 1990).
Tirosina Hidroxilasa (TOH) Esta enzima se encuentra relacionada con la síntesis de los neurotransmisores del grupo
de las catecolaminas como la dopamina. Estas moléculas son sintetizadas principalmente
en la médula de la glándula suprarrenal y son considerados como los neurotransmisores
98
de la mayoría de las f ibras nerviosas simpáticas postganglionares. Las moléculas
sintetizadas por la TOH actúan sobre las células efectoras al unirse a unos receptores
específ icos del tipo adrenérgicos que intervienen en la relajación intestinal, la
vasoconstricción, la dilatación de las pupilas, en el aumento de la frecuencia y
contractilidad cardiacas, la vasodilatación, la broncodilatación y la lipólisis. En el contexto
del GRD se ha observado que esta enzima participa en los fenómenos de desarrollo
neuronal y posiblemente en respuesta a neurotransmisión de carácter quimioceptivo y
propioceptiva debido a que se encuentra exclusivamente en neuronas pequeñas
dopaminérgicas y en concentraciones limitadas no mayores al 5% en secciones espinales
específ icas (Price et al., 1983 y Katz et al., 1985).
Anhidrasa Carbónica (CA) Esta enzima se encuentra presenta en una gran variedad de GRD. Hasta mitad de los 80
se creía que estaba presente exclusivamente en células gliales, sin embargo técnicas de
microscopía electrónica mejorada mostraron su presencia y localización entre el 20% y
38% de las neuronas grandes y medianas del GRD. Adicionalmente se ha probado que
aproximadamente el 95% de las neuronas CA+ son NF+ (probadas con el anticuerpo
RT97) y con presencia de mielina. La función de esta enzima, como de la mayoría de las
enzimas marcadoras neuronales, es incierta, pero se postula que está involucrada en
reacciones de decarboxilación en la síntesis de neurotransmisores y en la salida de estos
de la célula. Adicionalmente se cree que la CA también ayuda a regular el pH intracelular y los niveles de Cl- y H+ durante procesos metabólicos como la glicólisis y de
neurotransmisión (revisado por Castellanos JE, 2002).
Prostaglandina D Sintetasa La Prostaglandina D2 (PGD2) es el neuromodulador sintetizado por esta enzima. En un
contexto general, estas moléculas son derivados de los ácidos grasos que se encuentran
en casi todos los tejidos del cuerpo humano. Identif icadas por primera vez en 1935 por el
f isiólogo sueco Ulf von Euler, las investigaciones sobre su composición, estructura,
funciones y utilidad médica comenzaron a f inales de la década de 1960. En 1971, el
farmacólogo británico John Robert Vane demostró que las múltiples aplicaciones médicas
de la aspirina derivan de su capacidad para bloquear la producción de ciertas
prostaglandinas. A f inales de la década de 1970 se demostró que la acción de las
99
prostaglandinas era la causante del dolor, de los calambres musculares, de procesos de
inflamación y de la regulación en la coagulación sanguínea (Squire et al., 2002). Dentro
de las neuronas del GRD se ha encontrado que la PGD2 actúa sobre las f ibras
nocioceptivas tipo C (de conducción lenta) inhibiendo la conducción de Potasio activada
por Calcio así como promoviendo la liberación de neuropéptidos como la SP (Vesin y
Droz, 1995 en Castellanos JE, 2002).
3.2.3.4. RECEPTORES Y OTRAS MOLÉCULAS Receptor para Neurotrofinas Dentro del grupo de las neurotrofinas -proteínas de carácter heterogéneo encargadas de
mantener la homeóstasis neuronal y promover los procesos de desarrollo y diferenciación,
supervivencia y mantenimiento de neuronas centrales y periféricas-, la más conocida y
estudiada es el Factor de Crecimiento Nervioso (NGF). Sin embargo estudios
ontogénicos del SNP han demostrado que durante los diferentes estados de desarrollo
neuronal se encuentra la presencia diferencial de otras neurotrofinas como la Neurotrofina
3 (NT3) y el Factor Neurotrófico Derivado del Cerebro (BDNF), y que la ausencia de estas
promueve fenómenos apoptóticos (Rich KM, 1992 y Mannes et al., 1994 en Castellanos
JE, 2002). En relación a los receptores para estas proteínas, se han descrito dos tipos
principales: los receptores de alta afinidad caracterizados por la presencia de un dominio
tirosina quinasa (Trk A para NGF, Trk B para NT3 y Trk C para BDNF) y los receptores de
baja afinidad como p75NTR. Dentro de las neuronas pequeñas (CGRP+, SOM- y TMP-) aproximadamente el 40% son inmunoreactivas para el receptor de NGF (Trk A) lo que
coincide con los niveles de ARNm que varían entre el 35% y el 40%. Los otros dos
receptores se encuentran entre el 5% y el 17% de las neuronas sensoriales,
especialmente grandes y medianas. Todas las neuronas positivas para alguno de los
receptores de neurotrofinas muestran marcaje para el receptor de baja afinidad, lo que
permite postular que p75NTR esta asociado con la formación y funcionalidad de los Trk
(Kashiba el al, 1997 en Castellanos JE, 2002).
Receptor Nicotínico de Acetilcolina (RNACh) A nivel molecular se han descrito 11 genes diferentes que se expresan exclusivamente a
nivel neuronal que codif ican para las subunidades que forman los diferentes isotipos de
este receptor (Castellanos et al., 2001). En neuronas de todos los tamaños dentro de los
100
GRD se ha encontrado mediante técnicas de hibridización in situ, la presencia de la
subunidad a3 en el 19% de las neuronas y a4 en el 8% de las mismas. Desde esta
perspectiva el RNACh parece no tener las características necesarias para constituirse
como un parámetro de clasif icación de las subpoblaciones del GRD, sin embargo,
estudios más profundos podrían encontrar diferencias en la constitución del RNACh entre
las diferentes subpoblaciones de neuronas en los GRD.
Receptor de Glucocorticoides Los glucocorticoides son hormonas esteroides derivadas de la corteza de las glándulas
suprarrenales. Son moléculas esenciales para el metabolismo y la reacción del organismo
ante situaciones de estrés. También inhiben diferentes mecanismos del sistema inmune a
múltiples niveles. Son potentes antiinf lamatorios e inmunosupresores, características que
podría relacionarlos con neuropéptidos como la SP y el CGRP. Estas hormonas son
empleadas en cuadros clínicos graves como asma, enfermedades autoinmunes o rechazo
de transplantes. En el GRD el receptor para esta hormona se encuentra en neuronas
GAL+, SP+ y CGRP+ con porcentajes de localización que varían entre el 30% y el 50%
(revisado por Castellanos JE, 2002) lo que lo relaciona con neuronas de diámetro
pequeño.
Serotonina y Glutamato
También conocida como 5-Hidroxitriptamina la Serotonina es un neurotransmisor que interviene en la transmisión de mensajes a través de las sinapsis o uniones entre células
nerviosas adyacentes. Actúa como vasoconstrictor, inhibe la producción de ácido
clorhídrico en el tracto digestivo y estimula la contracción de la pared intestinal. Su función
en el sistema nervioso central y sus efectos en los cambios de comportamiento están
siendo objeto de distintos estudios de investigación. La serotonina se forma a partir del
triptófano y en el proceso de neurotransmisión es liberada de una célula nerviosa o
neurona a otra, dando lugar a la formación de un impulso nervioso, que puede traducirse
en la estimulación o inhibición, según los casos, de una actividad celular. La serotonina,
después de su actuación, pasa de nuevo del espacio sináptico a la neurona que la liberó,
para ser reciclada y reutilizada en otra ocasión, o bien es procesada y convertida en una
molécula inactiva. Durante mucho tiempo se creyó que las neuronas del GRD no
presentaban Serotonina. Sin embargo, en 1983 mediante el uso de una prueba de
101
f luorescencia con triptófano marcado se encontró que una pequeña cantidad de células
utilizaba este neurotransmisor (DiCarlo V, 1983). Sorprendentemente, dentro del GRD no
solo las neuronas presentan niveles considerables de Serotonina. Los mastocitos, células
no neuronales presentes en el ganglio, también son inmunoreactivas para esta molécula.
Debido a que el fenotipo de estos mastocitos es muy similar al de las neuronas pequeñas
fue necesario implementar el método de coloración con Azul Alción al 1% en el que a pH
ácido solo las células no neuronales pequeñas se tiñen. Bajo este criterio se pudo
estimar que entre el 7% y 9% de la población total de neuronas en los GRD utilizan este
neurotransmisor, posiblemente durante fenómenos de transmisión sensorial nocioceptiva
(Kai-Kai et al., 1985 en Castellanos JE, 2002). Estudios llevados a cabo a principios de
las década de los 90 mostraron que en modelos In vitro de GRD los porcentajes de
Serotonina se elevaban a valores superiores al 40% quizás en relación a fenómenos de
regeneracion neuronal. In vivo, se ha probado que la expresión de Serotonina es inhibida
por el contacto de las células del ganglio con secciones vertebrales más externas (Sheryl
SN en Scott SA, 1992).
En cuanto al Glutamato, sintetizada por la enzima Glutamina sintetasa, los estudios no
han sido muy concluyentes, pues como es de esperarse, la presencia o ausencia de un
aminoácido esencial dentro de un subtipo neuronal definido no puede ser considerado
desde el punto de vista funcional. Sin embargo este aminoácido se ha encontrado en
neuronas grandes del GRD de la sección lumbar mediante el uso de anticuerpos dirigidos
hacia un conjugado coloidal glutamato- oro y entre el 16% al 18% de las neuronas pequeñas de las secciones torácicas y cervicales mediante el uso de un anticuerpo
dirigido hacia un conjugado glutamato-hemocianina así como mediante la determinación
indirecta mediante la cuantif icación de la enzima Glutamina sintetasa o Aspartato
aminotransferasa (Cangro et al., 1985 en Castellanos JE, 2002). Por otro lado, dentro de
las poblaciones no neuronales del ganglio se ha encontrado la presencia en el 53% de las
mismas en forma de L-Glutamato que es convertido a L-Glutamina y transferido al 40% de
las neuronas SD donde vuelve a su forma original (Duce et al., 1983 en Castellanos JE,
2002).
GAP-43/Neuromodulina y Proteínas de Unión de Calcio
GAP-43 (o B50) es una fosfoproteína asociada al desarrollo y crecimiento neuronal así
como en la regeneración del GRD. Análisis de hibridización In Situ han mostrado la
102
presencia de ARNm para GAP-43 en correlación con el ARNm para NGF corroborando
así su función complementaria en el desarrollo neuronal. Sin embargo, como parámetro
de clasif icación neuronal no es muy útil pues se ha demostrado que virtualmente todas las
neuronas del GRD expresan esta proteína (Verge et al., 1990 en Scott SA, 1992).
La calbindina y la parvalbúmina son las dos proteínas de unión a Calcio de mayor
importancia en el contexto de clasif icación neuronal. La primera de estas se encuentra
principalmente en neuronas pequeñas en relación con la segunda, mientras que la
parvalbúmina se encuentra exclusivamente en neuronas tipo L (o grandes). Se ha
propuesto que estas proteínas están involucradas en los fenómenos de conducción de
señales eléctricas a través de las neuronas mediante la regulación de los iones Ca2+
(Carr et al, 1989), propiedad que podría relacionar la presencia de estas proteínas con el
patrón de mielinización de las neuronas y la presencia de f ibras axónicas tipo C y tipo A
(ver capítulo 3.2.2).
Moléculas de Superficie Celular Principalmente oligosacáridos, estos marcadores membranales son ampliamente
utilizados en la identif icación y clasif icación de subpoblaciones neuronales en el GRD
debido a su alta reactividad ante lectinas y anticuerpos de unión específ ica. Durante
muchos años se ha sugerido que estos glicoconjugados están involucrados en la
recepción y transmisión de señales de desarrollo neuronal y axonal mediante
interacciones célula-célula específ icas determinadas por la presencia de epítopes únicos (Scott et al, 1990). Esta última característica es de especial interés en el contexto de
clasif icación neuronal. Trabajos llevados a cabo con la ayuda de técnicas
inmunocitoquímicas, han revelado que las terminaciones lactosa son predominantes en
las neuronas pequeñas del GRD mientras que las terminaciones glucosa son expresadas
en neuronas de tipo mediano y grande. Aunque existen una gran cantidad de anticuerpos
y lectinas –de origen vegetal, especialmente granos- para la identif icación de las neuronas
en relación a sus moléculas no proteínicas de membrana, la mayoría solo corroboran los
resultados que fueron resumidos en función de terminaciones lactosa o glucosa (Regan et
al, 1986 en Castellanos JE, 2002).
103
3.3. DESARROLLO DE LAS NEURONAS SENSORIALES
El origen de los GRD se remite a la cresta neural. Trabajos publicados en la mitad del
siglo XIX hacían referencia a la cresta neural como cresta gangliónica, a raíz de estudios
ontogénicos que relacionaban estas dos estructuras. Sin embargo, solo hasta 1924 se
pudo comprobar la relación directa. RG Harrison reprodujo modelos anfibios sin la
presencia de GRD tras la extirpación de la parte más dorsal del tubo neural en etapas
iniciales del desarrollo. Sin embargo, solo las técnicas de marcaje específ ico con timidina
H3 logradas a mitades del siglo pasado pudieron trazar con exactitud el desarrollo y
distribución del precursor neural y su relación con la formación y desarrollo de los cuerpos
espinales (Teillet et al., 1992).
3.3.1. BASES CELULARES Y MOLECULARES Los métodos clásicos de substitución de secciones específ icas del precursor neural por
una contraparte generalmente isotópica, abrió las puertas para la descripción de los
fenómenos de desarrollo desde una perspectiva general del GRD como órgano del SNP
que conduciría con los años al entendimiento del fenómeno a nivel celular y molecular.
En el curso de la tercera semana de desarrollo en los mamíferos se forma el tubo neural,
precursor del sistema nervioso. En la cara dorsal del embrión empiezan a formarse masas
de tejido muscular llamadas somitas, de las que surgirán los principales órganos y
glándulas. Con un origen ectodermal, las células que han de dar origen a cada uno de los
GRD provienen de la cresta neural y colonizan cada una de las secciones anteriores de las somitas (Teillet et al., 1987). El fenómeno de colonización es un fenómeno de
migración lateral y longitudinal desde la cresta neural y la somita anterior hacia el tejido
muscular nuevo, corroborando la hipótesis sobre la intrincada red que rige el SNP.
Recientemente se ha probado la existencia de macromoléculas específ icas cuya función
está fuertemente relacionada con la correcta migración de las células precursoras desde
la cresta neural a través de los cuerpos somíticos. Muchas de estas moléculas han sido
descritas desde hace un par de décadas y comprenden grupos heterogéneos de enzimas,
proteínas estructurales o proteínas con funciones putativas de receptores.
Específ icamente, la enzima butirilcolinesterasa, la laminina, las proteínas extracelulares
tenascina/citotactina y los epítopes relacionados a adhesión HNK-1/L2 han sido descritas
durante la fase migratoria de las células de la cresta neural en una localización tanto
rostral como caudal. Aunque hipotéticas, sus funciones se han visto relacionadas con la
104
regulación en la migración celular y axonal y la inhibición del sobrecrecimiento neuronal,
así como en la regulación del tamaño f inal del GRD. De igual manera, el entorno somítico
que rodea las células precursoras de la cresta neural determina la morfología y f isiología
de las neuronas que han de dar origen al GRD. La segregación celular parece estar
determinada por un tipo de precursor que da origen a la línea sensorial y a la línea
adrenérgica (autonómica). Después de la migración del precursor bipotencial, la
gangliogénesis da origen a células sensoriales cerca del SNC de donde obtienen
probablemente un patrón de factores de crecimiento específ ico y a células no neuronales
inespecíf icas provenientes de la línea adrenérgica. Por otro lado, las células que se
encuentran fueran del perímetro bioquímico establecido por el SNC, son principalmente
del tipo adrenérgico pero sin embargo, en esta localización esta línea precursora da
origen a células del sistema neuronales pertenecientes al sistema nervioso autónomo. A
nivel bioquímico se ha reportado que factores como BDNF, NGF, NT3 y bFGF (Factor de
Crecimiento de Fibroblastos) son en parte los encargados de dirigir a las poblaciones
pluripotenciales que migran desde la cresta neural hacia un fenotipo de neurona sensorial
y fomentar la supervivencia de las células y sus prolongaciones neuríticas (Teillet et al. en
Scott SA, 1992).
3.3.2. REGENERACIÓN Y PLASTICIDAD IN VITRO La capacidad de regeneración neurítica en las neuronas del GRD es una característica
esencial que favorece la representatividad de los cultivos que se obtienen. Así, las neuronas sensoriales primarias generan alteraciones celulares seguidas del daño axónico
periférico. Dentro de estas alteraciones se encuentra la reorganización del metabolismo
del soma, la reducción de la síntesis de sustancias asociadas con la transmisión neuronal
y un aumento en la expresión de proteínas, neuropéptidos y otras moléculas asociadas al
crecimiento axónico; así como una posible sobreexpresión de moléculas antiapoptóticas
que favorecen la supervivencia celular. Hay una sobreregulación en la síntesis y
transporte axonal de actina y tubulina y una desregulación de la síntesis y transporte de
NF. Así, la desintegración parcial del citoesqueleto formado por NF axónico conduce a
una extensión de las ramificaciones terminales, al mismo tiempo que la sobreregulación
de la actina, tubulina y periferina provee la base para la producción de nuevos elementos
axónicos (Scott SA, 1992).
105
Los cultivos de GRD representan un buen modelo para el estudio de la función de las
terminales sensoriales primarias, las cuales son de difícil acceso debido a su tamaño, así
como para estudios de comportamiento neuronal como la plasticidad, supervivencia y
regeneración. Así mismo, son útiles para el estudio de la función de factores de
crecimiento, sustancias tóxicas y patógenos, especialmente virales.
Los GRD pueden ser extraídos a partir de diversos animales y diferentes estados de
desarrollo. Inicialmente fueron muy utilizados los GRD de embriones de pollo, ya que
estos proporcionan una alta cantidad de neuronas por ganglio y la remoción y disección
de los embriones es muy fácil de realizar, además, de su fácil mantenimiento y
disponibilidad. Luego se empezaron a utilizar los cultivos de ratones, los cuales aunque
ofrecían menos neuronas por cada ganglio pero de tamaño relativamente mayor. Aunque
los cultivos embrionarios de ratón son ampliamente usados para muchos estudios
relacionados principalmente con el desarrollo y diferenciación del sistema nervioso, los
estudios de adultos también ofrecen numerosas ventajas para otros tipos de estudios,
como el de factores extrínsecos que controlan la regeneración nerviosa, y los implicados
con variaciones del ambiente, estados de una enfermedad y efectos de la edad en el SN.
Además, a diferencia de los embrionarios, los cultivos de ratón adulto presentan células
no neuronales que proliferan a una tasa muy baja durante los tres primeros días del
cultivo y las neuronas se degeneran menos que en ratones embrionarios haciendo a este
modelo más representativo. Para estudios de interacción con receptores virales, por
ejemplo, es más conveniente el uso de ratones adultos pues los cultivos de ratones neonatales o embrionarios necesitan suplementos como factores tróficos cuyos
receptores pueden ser los mismos que para los virus estudiados (Castellanos et al, 2002
en Corso X, 2004).
106
4. VIAS APOPTÓTICAS Y DE SUPERVIVENCIA NEURONAL ACTIVADAS POR INFECCIÓN CON VIRUS RABIA Los capítulos anteriores tuvieron como objetivo servir de marco general para abordar
desde una perspectiva celular, bioquímica y genética el problema que desde hace unas
décadas viene desarrollando la investigación con el RABV. La rabia es una de las
enfermedades de las que se tienen registros más antiguos, y actualmente aunque los
casos de infección reportados son menores que en otras enfermedades virales, sigue
cobrando más de 50000 vidas humanas anuales según estimaciones de la OMS, sin
considerar el millón de personas que reciben tratamiento post-exposición (Strauss, 2002).
Además de su carácter letal, el RABV posee una característica muy especial de la cual se
hará cargo este capítulo: se transporta desde la periferia a través de las neuronas tanto
sensoriales como motoras hasta el encéfalo sin despertar ningún tipo de respuesta
antiviral: sea apoptótica, inf lamatoria o inmune. Una vez en el encéfalo se manif iesta
violentamente a través de una encefalitis letal en el 100% de los casos.
Aunque la vacuna profiláctica ha sido efectiva desde el año de 1885 y los casos de
enfermedad rábica post-vacunación han sido extensamente estudiados debido a su poca
prevalencia, solo hasta hace un par de décadas se ha estudiado el papel de la respuesta
inmune en la patogénesis de la enfermedad. Adicionalmente, hace un poco más de 20
años que la encefalitis viral por RABV es considerada como el resultado inmediato y
directo de una disfunción neuronal severa como lo revelan los estudios electrofisiológicos en el encéfalo (Chopra et al, 1980). En la f isiopatología de la infección, es necesario
aclarar que la infección por este Rabdovirus se manif iesta de dos formas clásicas: rabia
paralítica causada posiblemente por un virus poco neurotrópico e inductor de apoptosis y
subsecuentemente de respuesta linfocitaria en el SNP y rabia furiosa causada por lo
general por un virus altamente neurotrópico y con patrones de evasión de la respuesta
apoptótica e inmune elevados.
La manifestación paralítica durante mucho tiempo se ha venido diagnosticando
erróneamente como síndromes como el de Guillain-Barré o con desórdenes autoinmunes
de los nervios periféricos, pues aunque las Imágenes de Resonancia Magnética (MRI por
sus siglas en inglés) son bastante útiles en el diagnóstico, no puede considerarse como la
prueba estándar de infección por RABV ni tampoco explica la gran diversidad de síntomas
de la rabia humana, pues existen imágenes MRI muy similares en infecciones con
107
sintomatología paralítica con f lavivirus, poliovirus o el virus del Nilo Oriental (Hooper C,
2005); Por otro lado, ni la distribución de antígenos virales ni la reacción inflamatoria
explica en las infecciones por RABV las anormalidades observadas en la MRI. Otro
hecho muy intrigante en la f isiopatología de la infección por RABV es la demielinización
de las neuronas y por ende la disminución en la velocidad de transmisión que se ha
presentado en algunos casos de infección rábica del tipo paralítico. Sin embargo, todavía
no se puede determinar si esta demielinización es una causa directa de la alteración del
citoesqueleto de actina causado por su interacción con el complejo RNP. Por otra parte y
en contraposición al electrodiagnóstico de la rabia paralítica, los hallazos en pacientes con
rabia furiosa demostraron que los patrones de mielinización y de conducción motora y
sensoriales permanecieron normales. En relación al fenómenos de MCP, en la infección
con una cepa altamente neurotrópica del RABV (CVS o Challenge Virus Standard, una
cepa de laboratorio o “f ija” y altamente neuroadaptada) se ha encontrado que las
motoneuronas de la médula espinal son resistentes a la citolisis y tienen deregulado el
proceso apoptótico en comparación con las células del hipocampo (Guigoni y Coulon,
2002). Por otro lado, estudios a nivel de respuesta inmune han mostrado que en los
casos de rabia paralítica se presentan diferentes grados de infiltración linfocitaria,
principalmente linfocitos T CD3+ e inflamación en la raíz dorsal y los nervios espinales
mientras que, en los casos de rabia furiosa la inflamación fue mucho menor y la presencia
de infiltrados linfocitorios y/o células mononucleadas fue prácticamente nulo.
Como lo resaltan los alemanes Finke y Conzelman en una reciente revisión sobre las estrategias de replicación del RABV, la evasión de la respuesta apoptótica e inflamatoria
es de vital importancia para la diseminación f inal del virus dado que debe ir acompañada y
da como resultado una completa integridad de la red neuronal (Lafon M, 2005),
característica que hace suponer que este virus recurre a mecanismos de transporte y de
replicación no convencionales para migrar desde las extremidades hasta el SNC sin
alterar a las neuronas que infecta. Hasta hace muy poco se creía que el daño que se
presenta en algunas poblaciones neuronales del encéfalo era de tipo necrótico, pero las
diferencias genéticas, bioquímicas y estructurales que fueron establecidas para este
fenómeno en relación con la apoptosis permitieron establecer que el daño neuronal dentro
del SNC pertenecía a este segundo tipo de muerte.
108
4.1. FENÓMENOS DE APOPTOSIS EN LA INFECCIÓN POR RABV Desde hace muchos años se sabe que la Glicoproteína G del RABV es la proteína de
unión del virus a su célula hospedera. En la actualidad se han descrito a los receptores
neuronales nAChR, NCAM y p75NTR como los responsables de la entrada y patogénesis
del RABV. Un estudio presentado a principios de 2002 en Journal of Virology por Faber y
Dietzchold de la Universidad Thomas Jefferson (Pennsylvania, EEUU) demostró,
mediante el uso de técnicas de inmunoprecipitación y análisis por citometría de f lujo, que
un virus obtenido a partir de una cepa vacunal de ADNc conocida como SPNB (ver Figura
25) construído para expresar dos unidades idénticas de glicoproteína G, además de
expresar dos veces más proteína que su contraparte parental, inducía una activación muy
marcada la caspasa 3 así como un disminución notable de la oxidación mitocondrial,
signos características de la actividad apoptótica. A diferencia de este virus recombinante
(pSPBNGA-GA) el parental silvestre infectaba células de una manera exitosa sin
despertar reacción alguna, confirmando la hipótesis que son los dominios de G así como
su expresión, los factores determinantes de la activación de la MCP y de una respuesta
inmune mediada por anticuerpos neutralizantes (Faber et al, 2002).
Aunque los resultados permiten reconocer a la proteína G como un fuerte factor inductor
de apoptosis, no permiten establecer como es que su deregulación conduce a los
fenómenos de evasión de la apoptosis y de la respuesta inmune.
Figura 25. Diagrama esquemático del genoma del virus recombinante util izado por Faber y colaboradores para comprobar que la glicoproteína del RABV está involucrada, según su concentación, en la inducción de apoptosis y posterior respuesta inmune. El vector SPBNGA contiene una secuencia adicional exacta a su parental. Figura tomada de Faber et al, 2002.
109
A su vez, estos resultados permiten postular una de las hipótesis más referenciadas en
muchas de los reportes de investigaciones en RABV: que las cepas virales más
neuropatogénicas son las de más baja inducción de apoptosis y con las tasas más
atenuadas de replicación y transcripción viral. Así, las cepas virales que producen
grandes cantidades de proteínas o de ARNm inducen la activación apoptótica y son
fácilmente eliminados del contexto celular mediante la generación de altas
concentraciones de anticuerpos neutralizantes (Conzelman et al, 2005).
De ahí que cepas del virus no neuroadaptadas y/o parcialmente atenuadas fueran
utilizadas en el pasado como cepas vacunales debido a la gran respuesta inmune que
despiertan y en situaciones patológicas generen cuadros de parálisis crónica no fatal que
hasta hace muy poco se relacionó con procesos de disfunción y muerte de las neuronas
motoras periféricas fenómeno in vivo que puede estar relacionado en parte con la
respuesta que se desencadena en las células gliales (astrositos y microglia) de la médula
espinal como resultado de la infección (Coulon et al, 2002). Los trabajos de Jackson
desde el año de 1997 permiten postular que la patogénesis del RABV en el SNC puede
deberse en parte debido a apoptosis en algunas subpoblaciones neuronales o que como
resultado de una disfuncionalidad, estas células inducen su apoptosis. Esta última
hipótesis surge a raíz de la evidencia electrofisiológica y el descubrimiento de diferentes
serotipos de RABV en murciélagos pone en duda esta afirmación. Aunque en algunos
estudios, la infección con cepas f ijas del virus muestran por lo general altas tasas de
fragmentación del ADN como signo inconfundible de apoptosis (Jackson y Rossiter, 1997). Inesperadamente, un estudio de inducción de apoptosis hecho en ratones
inoculados con un serotipo del virus conocido SHBRV (Silver Haired Bat Rabies Virus)
mostró niveles muy bajos de fragmentación a pesar de que los individuos infectados
mostraban signos clínicos de la enfermedad muy similares a los de los ratones inoculados
con virus CVS (Yan et al, 2001). Este último estudio pone en evidencia la hipótesis más
aceptada sobre la neuropatología del virus: daño electrofisiológico que conduce a una
encefalitis fatal. Sin embargo, el fenómeno apoptótico sigue siendo un patrón en los
ratones infectados experimentalmente con la cepa f ija CVS y, al menos en el SNC, es
más fuerte en la medida que se han identif icado más factores apoptóticos entre los que se
encuentran: el producto del gen Nedd-2 que ha sido catalogado como un gen sobre-
regulador de la respuesta apoptótica en procesos de desarrollo neuronal pero que se
reactiva durante infecciones por RABV, la enzima inducible oxido nítrico sintasa (iONS)
110
cuyo producto fue recientemente identif icado como un promotor de la muerte celular y el
complejo Fas/FasL que media la ruta extrínseca de la apoptosis clásica. En el primer
reporte sobre apoptosis y neuroinvasión por RABV, células de adenocarcinoma prostático
de rata (AT3) fueron infectadas con la cepa CVS. Las características morfológicas de la
infección mostraron condensación citoplasmática y de la cromatina al igual que
fragmentación del ADN mediante la prueba de TUNEL y sobreexpresión de la proteína
pro-apoptótica Bax. En el mismo estudio ratones ICR inoculados intracerebralmente con
esta misma cepa compartían estas características de apoptosis especialmente en la
región del hipocampo y la corteza cerebral (Jackson y Rossiter 1997). A partir de este
punto, Jackson y colaboradores han explorado diferentes cepas y mutantes de diferentes
cepas del RABV con el f in de describir las diferentes bases moleculares de la propagación
y patogénesis viral. Así, esta evidencia podría signif icar que la MCP está relacionada con
la patogénesis de la enfermedad rábica en estadíos f inales de la disfuncionalidad
neuronal, proponiendo la apoptosis como resultado de la disfunción y no como causa. Sin
embargo, estudios más profundos se necesitan para comprobar esta hipótesis.
Como lo demostró el estudio realizado por Faber y colaboradores en 2002, la activación
de caspasa 3 está mediada por la proteína G, al menos en virus recombinantes vacunales
no neuroadaptados. Esta misma clase de cepas virales atenuadas, como la cepa Pasteur
(PV) o la cepa Evelyn Rotkitniki Abelset (ERA) han mostrado la capacidad de activar
factores proapoptóticos como las AIF, mientras que las cepas altamenta patogénicas
como la CVS fomentan la sobreexpresión de la proteína Bcl-2 como se muestra en la Figura 26, diagrama perteneciente al trabajo realizado por Thoulouze y colaboradores en
el 2003. Sorprendentemente, el mecanismo de sobreexpresión de Bcl-2 parece ser
utilizado por el virus para controlar la supervivencia de las células que infecta. En este
estudio reportaron por primera vez a las cepas neurotrópicas del RABV como entidades
subversivas que regulaban de forma natural la expresión de esta proteína anti-apoptótica,
al menos en cultivos celulares de células de origen linfoide (Jurkat T) transfectadas con
una copia del gen humano bcl-2. Eventualmente este mecanismo de evasión de
respuesta apoptótica debe estar controlado directa o indirectamente por alguna proteína
viral para el establecimiento de una infección a largo término como lo propone Thoulouze
en este trabajo. Sin embargo, hasta el momento los estudios no han establecido la
naturaleza de dicha relación.
111
Figura 26. Modelo propuesto por Thoulouze et al, 2003 para la inducción de apoptosis en cepas no neurovirulentas de RABV. La infección por RABV no patogénico activa dos rutas apoptóticas secuenciales: la translocación de la proteína independiente de caspasas AIF (24H p.i) seguida por la activación de las vías dependientes de caspasa (72H p.i). Ambas rutas son inhibidas por la sobreregulación de Bcl-2 en infecciones con cepas RABV neuroadaptadas. Figura tomada de Thoulouze et al, 2003. Debido a la gran dif icultad que conlleva la obtención de cultivos primarios de neuronas
sensoriales y la interpretación de los resultados debido a las múltiples subpoblaciones
presentes en estos (como es el caso de los cultivos de GRD), las técnicas de genética
reversa y de proteínas virales f luoro-marcadas han permitido dar un paso importante en la descripción de la biología molecular de la infección por RABV. De momento se cree que
este Rabdovirus previene la muerte celular en el SNP mediante una interferencia directa
con factores apoptóticos, mediante la sobreregulación de moléculas antiapoptóticas y
f inalmente bajo una estrategia de subversión basada en mantener los niveles de
expresión de los genes virales por debajo de los estándares óptimos con lo que
garantizaría pasar desapercibo ante moléculas de respuesta a infecciones como Nf-kB.
Trabajos de trazado neuronal de la infección llevados a cabo hace más de 10 años
encontraron que el movimiento del RABV está acompañado por una asombrosa
preservación de las funciones neuronales que va acompañada por hallazgos de ARNm
muy limitados de proteínas. Desde hace varios años, y basados generalmente en el VSV
112
como modelo, se ha visto que la atenuación en la expresión de los genes virales está
relacionada directamente con la posición que cada uno de ellos ocupa dentro del genoma
y las regiones adyacentes –conocidas como regiones intergénicas (RIG) o gene borders-
que poseen secuencias específ icas como se observa en la Figura 27 y por ende
estructuras de ARN secundario especiales que promueven una mayor o menor afinidad
por la polimerasa viral L y posteriormente por los ribosomas (Rose et al, 1981). Este
concepto se relaciona directamente con la teoría de la infección viral críptica, donde
muchos virus evitan la respuesta de defensa apoptótica mediante la regulación de sus
replicación y transcripción (ver capítulo 2.6).
Figura 27. Secuencia de las IGR o señales de transcripción en el RABV. Estas son secuencias consenso para el codon de parada y poliadenilación y el codon de inicio indicados en un orientación positiva. Figura tomada de Finke y Conzelman, 2000. Trabajos en genética molecular realizados por Finke y Conzelman en el año 2000
encontraron que el remplazo de tan solo 2 nucleótidos en la RIG que separa N y P y de 5
nucleótidos en la RIG P/M o M/G generaba cambios en la expresión que comprendían el
78% y 81% de subregulación genética, indicando que la atenuación está relacionada con
la longitud de la RIG. Adicionalmente encontraron que en cepas atenuadas como la SAD
(L16, TigGL, T y T2) las regiones intergénicas estaban involucradas en la mayor
expresión de proteínas virales, mayores títulos virales e inducción de efectos citopáticos.
En este estudio se hace énfasis en la regulación de la polimerasa viral L que ofrece
ventajas tanto a las cepas silvestre y cepas de laboratorio neuroadaptadas mediante su
113
subregulación, controlando la tasa de transcripción y replicación viral como un
mecanismo para evadir respuesta inmune y apoptótica (Finke y Conzelman, 2000).
Además de la glicoproteína G, que ya fue descrita como una fuerte inductora de
apoptosis, los virus recombinantes obtenidos a partir de ADNc desde 1995 han permitido
demostrar la importancia de otras proteínas virales en la inducción de apoptosis. La
primera en ser descubierta fue la proteína de matriz M. En 2004 se descubrió que un
mecanismo de inducción de apoptosis en neuroblastoma estaba dado por una ruta
extrínseca dependiente de TRAIL y caspasa 8. Se demostró que la decapsidación
(pérdida de G) y la presencia de proteína M en el citoplasma durante fenómenos de
replicación son factores determinantes para la inducción de la apoptosis vía TRAIL.
Aunque antes se había descrito a la proteína M como un factor regulador del switch entre
la transcripción y la replicación, este estudio postuló por primera vez a la proteína de
matriz como la responsable de activar una vía apoptótica en las células infectadas a
través de la deregulación del transporte citoplasmático y de la expresión celular al unirse a
la nucleoporina Nup98 (Kassis et al, 2004). Sin embargo hasta el momento no se ha
establecido con claridad la función de la proteína M dentro del programa de evasión de la
MCP y solo se puede afirmar que en concentraciones bajas evitan la activación
apoptótica, al igual que para la proteína G. No existen datos experimentales que prueben
mecanismos de interferencia de las proteínas virales con las cascadas apoptóticas, así
que el fenómeno de subregulación de la transcripción y la replicación, o infección críptica,
puede ser considerado como la esencia misma de la evasión de la apoptosis. En un contexto general, la proteína M es un factor viral encargado de regular la síntesis del ARN
evitando así respuestas inmunes basadas en el reconocimiento de epítopes de ARN o
mecanismos como el ARN de interferencia. La proteína M interactúa con el complejo
RNP disminuyendo la actividad de transcripción al tiempo que promueve la replicación
viral. Específ icamente, la capacidad de balancear estos dos procesos parece encontrarse
en la presencia de un solo aminoácido: la arginina en la posición 58 de M (Finke and
Conzelman, 2003). El mecanismo por el cual esta proteína promueve el cambio de
transcripción a replicación es motivo de estudio pero se postula que está en íntima
relación con las concentraciones de proteínas virales así como con estructuras
secundarias en el ARNv.
Adicionalmente se ha encontrado que la fosfoproteína viral P también juega un papel
determinante en la supervivencia del virus dentro de las neuronas así como en el
114
mantenimiento de la estructura celular. En el año 2000 Raux y Blondel así como Jacob y
su grupo encontraron independientemente mediante la técnica de interacción proteína-
proteína conocida como Yeast Two-Hybrid, que la fosfoproteína viral posee características
de unión a la Cadena Liviana de la Dineina (LC8), una proteína citoplasmática que forma
un complejo motor involucrado en el transporte retrogrado axonal. El hecho que sea una
proteína del complejo RNP la que está en contacto con este mecanismo de transporte
permitiría plantear que el RABV se transporta intracelularmente desde las neuritas hasta
el soma como un agregado RNP. Adicionalmente, fue propuesto por estos mismos
autores que la unión del RNP a la LC8 podía constituírse como un mecanismo de evasión
de la respuesta apoptótica más que un mecanismo de transporte, pues en 1999 se
estableció que esta molécula motora se unía al factor pro-apoptótico de la familia Bcl-2
conocido como Bim para formar un complejo dentro del citoesqueleto encargado de
monitorear la actividad y el bienestar celular. Bajo algunos tipos de estrés, el
citoesqueleto pierde su integridad y en ese caso el complejo Bim-LC8 es liberado y se
dirige a bloquear la acción antiapoptótica de Bcl-2 (Raux et al., 2000; Jacob et al., 2000).
Adicionalmente, Jackson y colaboradores probaron que la unión P-LC8 no estaba
relacionada exclusivamente con el transporte celular. La exposición a una cepa parental
altamente patogénica –al menos en ratones lactantes- obtenida a partir de ADNc -
conocida como SAD-L16 y derivada de la cepa original SAD-B19 o cepa Street Alabama
Dufferin- y un mutante para el dominio de unión con LC8 presentaba patrones similares
de dispersión y de encefalitis que la cepa parental, donde la única diferencia se constituía en la infección tardía y más sectorizada en el encéfalo (Jackson et al, 2005). Sin
embargo evidencia directa que vincule la unión P-LC8 con un fenómeno de subversión
celular todavía no está disponible y tan solo se pueden plantear hipótesis atractivas que
relacionen el fenómeno de transporte axonal retrogrado con la inhibición de la apoptosis
vía Bim. Recientemente Blondel y colaboradores han presentado más evidencia que
relaciona a la fosfoproteína del RABV con el fenómeno de evasión de la respuesta
antiviral. Dentro de las estrategias más utilizadas por los virus para evadir la respuesta
inmune se encuentra la inhibición del sistema Interferon (IFN). Algunos virus han
desarrollado mecanismos de inhibición física del IFN, de deregulación de los genes
responsables de su síntesis, de inhibición de los factores de transcripción que promueven
su producción o indirectamente mediante el bloque de la transducción de las señales que
los IFN generan. Siguiendo la misma técnica de interacción proteína-proteína este grupo
115
encontró una interacción física con STAT (Signal Transducer and Activator or
Transcription 1), una proteína cascada abajo de la respuesta vía IFN y encargada de
servir como factor de transcripción de genes antivirales como 2´-5´-OAS, PKR o PML.
Esta interacción P-STAT1 efectivamente bloqueó la respuesta IFN mediante la inhibición
de la acumulación de STAT en el núcleo debido a que la fosfoproteína se ubicó sobre el
dominio de unión al ADN de STAT1 (Blondel et al, 2005). Adicionalmente, Blondel
describió en el año 2002 la interacción de algunas de las formas truncadas de P con
proteínas de los cuerpos celulares que han sido identif icadas como factores inductores del
sistema IFN (Blondel et al, 2002). Durante muchos años se ha establecido que uno de los
mecanismos más utilizados por los virus y más eficientes para evitar la respuesta inmune
es mediante la inactivación del JAK/STAT y por ende del componente IFN. Por primera
vez se demuestra que además del mecanismo descrito por Lafon y Baloul en el 2003, el
RABV utiliza estrategias altamente evolucionadas de subversión inmune.
Sorprendentemente, la simplicidad de este virus de ARN de cadena sencilla que solo
codif ica para 3 proteínas estructurales, una polimerasa y un cofactor, contrasta con la
versatilidad molecular que permite sin duda ubicarlo como un modelo más de evasión viral
de la respuesta inmune. Sin embargo, la estrategia esencial de interrupción del programa
apoptótico todavía sigue siendo un misterio, y aunque se tienen descritos los procesos
que el RABV promueve, todavía no se sabe que proteína viral y bajo que condiciones
celulares, se está generando esta respuesta.
4.2. FENÓMENOS DE RESPUESTA INMUNE EN LA INFECCIÓN POR RABV Pasando ahora a un plano más general, los trabajos de Baloul y Lafon en el 2003
probaron de manera cuantitativa los fenómenos de evasión de la apoptosis y su estrecha
relación con la evasión de la respuesta inmune, agrupando y corroborando muchas de las
hipótesis que separadas formaban el rompecabezas de la patogénesis e
inmunopatogénesis del RABV. Mediante el uso de técnicas en inmunohistoquímica y RT-
PCR se logró establecer que las cepas altamente neurotrópicas (como la cepa CVS o las
cepas silvestres) no solo evitan la apoptosis mediante subversión intracelular sino que
también limitan la respuesta inflamatoria característica de la activación inmune mediante
la eliminación vía apoptosis de los linfocitos que migran hacia las células infectadas, al
mismo tiempo que promueven la expresión de moléculas neuroprotectoras como la IL-6.
La estrategia de inmunosubversión está determinada por la expresión irregular del
116
complejo Fas/FasL. Como lo demostró este estudio, las neuronas infectadas disminuyen
notablemente la expresión de Fas en su membrana -lo que las convierte en neuronas
virtualmente inmunes a la ruta extrínseca de la apoptosis- y al mismo tiempo promueven
la expresión de FasL soluble en el medio extracelular. Este ligando genera la eliminación
de los linfocitos T que han sido reclutados al sitio de infección en respuesta a citoquinas
como TNF-a, que son secretadas por las neuronas infectadas. El modelo propuesto por
Lafon se muestra esquemáticamente en la Figura 28 (Lafon M, 2004). Simultáneamente,
y como había sido probado años atrás por Thoulouze en un modelo con células Jurkat T
in vitro, junto con la desregulación del sistema Fas/FasL las neuronas del SNP infectadas
también sobreexpresan la molécula antiapoptótica Bcl-2 (Thoulouze et al, 2003).
Adicionalmente, en el 2001 existían datos que vinculaban el progreso de la enfermedad
rábica con una desregulación por apoptosis de las poblaciones linfocitarias. Sitprija y su
grupo de colaboradores del Centro para la Investigación de la patogénesis por RABV de
Bangkok (Tailandia) reportaron, tras la inoculación de ratones con una cepa silvestre de
RABV, la disminución substancial de las poblaciones de timocitos y linfocitos en paralelo a
la detección del antígeno viral en el cerebro. Adicionalmente estos investigadores
hallaron una severa atrofia del bazo y el timo sin la evidencia de presencia viral. Se
postuló para ese entonces que simplemente las neuronas infectadas promovían la muerte
apoptótica en los linfocitos (Sitprija et al, 2001). Más tarde, los estudios de Lafon
permitieron establecer que esa muerte era dependiente de FasL de origen neuronal.
Aunque el mecanismo molecular no está descrito y no parecen haber indicios del tipo de proteína viral involucrada, este avance es sólida evidencia que el RABV posee estrategias
altamente evolucionadas para infectar y transportarse a través del SNP sin dañar la
estructura neuronal de su hospedero y llegar a su órgano blanco donde se disemina
anterogradamente a prácticamente todos los órganos, incluídas las glándulas salivares
que son el sitio más efectivo de diseminación.
La experiencia a lo largo de dos décadas ha descrito de una manera precisa los
mecanismos que rigen la activación inmune en respuesta a las infecciones virales y a los
mecanismos de apoptosis. La experiencia con el RABV ha mostrado que las cepas poco
neurovirulentas son aquellas inductoras de apoptosis en los estados iniciales de infección
y por ende importantes inductoras de respuesta celular vía macrófagos, CDs y linfocitos T
CD8+ que f inaliza con la generación larga y duradera de anticuerpos neutralizantes
específ icos tanto para la proteína G como para el complejo RNP.
117
Figura 28. Modelo de neuroinvasión e inmunosubversión del RABV. Los linfocitos T activados cruzan la barrera sanguínea hacia el sitio de la infección en respuesta a citoquinas como TNF-a que son secretadas por las neuronas infectadas. Al mismo tiempo, ocurre un fenómeno de desregulación en la relación Fas/FasL donde las neuronas infectadas reducen la presentación en membrana del receptor y promueven la expresión y secreción del l igando. Este patrón de expresión vuelves a las neuronas infectadas inmunes a esta vía de inducción apoptótica al mismo tiempo que elimina a todas las células T que llegan a combatir la infección en la periferia. Figura tomada de Lafon M, 2004.
Sin embargo, y en directa relación con los resultados de inducción de apoptosis, las cepas
neurovirulentas que no inducen apoptosis inducen una baja respuesta inmune. Estos
datos permiten inferir que la respuesta inmune efectiva es una consecuencia natural de la
apoptosis y que como lo demostraran Baloul y Lafon en el 2003, de una correcta
estrategia de subversión apoptótica depende una evasión inmune exitosa.
Al respecto, en el año de 1992 se publicó un estudio donde se comprobó la influencia de
las poblaciones linfocitarias en el desarrollo de la enfermedad rábica paralítica. La
administración de una cepa silvestre del RABV a ratones nulos para la producción de
linfocitos T mostró la ausencia total de parálisis de sus extremidades. En contraste, al
118
reconstituir a estos individuos con células linfocitarias inespecíf icas, el 100% murió
mostrando una parálisis aguda. Sin embargo la administración de células específ icas
anti-RABV a estos ratones inmunosuprimidos provocó una respuesta positiva que se
reflejó en la supervivencia total de la muestra y la ausencia de parálisis, demostrando que
la parálisis inducida por la infección con RABV es un efecto dependiente de la activación
de los linfocitos T. La interpretación de estos resultados permite plantear que una vez las
neuronas son infectadas con cepas virales poco neurovirulentas, liberan citoquinas y otras
moléculas inmunoactivadoras que conducen a la proliferación de linfocitos T y otras
células como macrófagos presentes en la glía que atacan las neuronas, las destruyen y
alteran la integridad de la red neuronal dando como resultado una parálisis crónica no
fatal (Lodmell et al, 1992). Bajo este supuesto, la muerte neuronal es un resultado de la
activación inmune, hipótesis completamente antagonista con los resultados de Lafon y
Baloul del 2003. Sin embargo, estos datos fueron obtenidos hace ya más de diez años y
sin duda constituyen las bases experimentales que dieron pie a la construcción del
panorama de la inmunopatogénesis del RABV. Comparaciones cualitativas de los
genomas virales de cepas inmunosubversivas (como la CVS) y de las inmunoactivas
(como las SAD) han mostrado diferencias apreciables en la cantidad de glicoproteína y
demás productos virales como resultado de variaciones signif icativas en el número y
secuencia de nucleótidos en sus RIG (revisado por Harty y Licata, 2003).
Adicionalmente, la enfermedad ocular causada por el virus después de su acceso al
cerebro es una patología causada exclusivamente por el virus pero que está en estrecha relación con la infiltración de neutrófilos y otras células de sistema inmunes al sitio de la
infección. Mediante la utilización de ratones knock out para el receptor de p55 TNF-a
(p55TNF-aR) este grupo comprobó que la severidad de la enfermedad en la retina está
inversamente relacionada con el patrón de infiltración de neutrófilos y la presencia de
linfocitos T activos. Los ratones nulos para este receptor mostraban un patrón de
infiltración de células inmunes mucho menor que sus contrapartes silvestres y sometidas
a una infección con la cepa viral CVS mostraban un mayor progreso y severidad de la
enfermedad rábica (Camelo et al, 2001).
A diferencia del modelo de infección desde la periferia hasta el SNC donde la respuesta
inmune es un proceso desfavorable para la integridad neuronal, la retinitis muestra los
beneficios en la eliminación del virus mediante respuesta celular inmune. Los resultados
obtenidos en este estudio refuerzan la hipótesis que las neuronas involucradas en el
119
transporte retrógrado del virus desde la periferia hasta el cerebro poseen características
f isiológicas y bioquímicas especiales que facilitan las estrategias inmunosubversivas de
este Rabdovirus.
Así, aunque existe el acuerdo general de que son los mecanismos inmunopatogénicos los
causantes de los resultados clínicos de la presentación paralítica de la rabia y la ausencia
de los mismos de la presentación furiosa de la rabia, tampoco existe duda que esta
respuesta inmune específ ica es el resultado de la cepa viral infectante, la verdadera
causa de la inmunopatogenia de la infección por RABV; y en última instancia y como
causa coyuntural de la enfermedad, las propiedades estructurales de la glicoproteína viral.
Las diferencias en la glicoproteína G alteran de manera signif icativa la unión a los
receptores celulares en el sitio de inoculación (con nAchR) y a través del SNP y SNC
(p75NTR) de ahí la importancia que se le ha dado al residuo de arginina en la posición
333 (Wunner, 2002). La evidencia encontrada y las características de la glicoproteína han
podido construir la teoria que se resume en el artículo que publicaran Morimoto y sus
colaboradores en el año 1999: la patogenicidad de las diferentes cepas del RABV se
relaciona inversamente con la expresión de la glicoproteína y con la inducción de
apoptosis, al menos en cultivos neuronales primarios (Morimoto et al, 1999).
Así, se puede definir a la glicoproteína como la molécula más antigénica del RABV pero
también como la proteína cuya constitución, estructura y nivel de expresión es
determinante en la evasión o activación de la respuesta apoptótica, y como resultado de
esta muerte neuronal sectorizada, en la evasión o activación de la respuesta inmune. Sin embargo, los estudios de interacción de P con LC8 realizados por Jackson en el 2005
poseen un historial contradictorio en los estudios de Mebatsion en el 2001, donde
modif icando el dominio de unión con LC8 y/o la posición 333 de la glicoproteína en la
cepa vacunal SAD-L16 se redujo de una manera signif icativa la dispersión del virus en el
SNP. Aunque las cepas mutantes para Arg333 o LC8/Arg33 se replicaron forma similar
que sus parentales en cultivos celulares, la cepa mutante para Arg333 mostró ser igual de
patogénica -en ratones lactantes, pues en adultos SAD-L16 es utilizada como vacuna-
que la cepa parental vía inoculación intramuscular; mientras que la cepa mutante
LC8/Arg333 inoculada intramuscularmente redujo su patogenicidad 30 veces, pero se
mantuvo enteramente patogénica si se inoculaba intracerebralmente (Mebatsion, 2001).
Estos resultados, junto con la distribución de antígeno viral en CNS encontrada por
Jackson cuatro años después, aunque no explican totalmente las diferencias básicas de
120
la rabia paralítica con la furiosa, permiten plantear, aunque sea parcialmente que no
exclusivamente la variante viral, sino también los patrones de expresión diferencial del
hospedero, son determinantes en la presentación de la enfermedad y el tipo de respuesta
generada. Durante episodios de rabia en humanos, algunas citoquinas pro-inflamatorias
podrían afectar indirectamente los niveles de neurotrofinas, factores de crecimiento o
neurotransmisores en el cerebro mediante la activación de la glia, del sistema inmune o
del tejido vascular, como lo mostraron estudios de expresión genética específ ica llevados
a cabo en el 2003 (Prosniak et al, 2001 y 2003) e indirectamente esta perturbación, ser la
responsable de la disfunción neuronal.
Queda claramente establecido que las característica neutrotrópicas de la cepa viral
infectante son determinantes para el curso de la enfermedad, su presentación clínica y el
tipo de respuesta a nivel celular e inmunológico que se lleva a cabo. Cepas altamente
neurotrópicas y patogénicas desencadenan una respuesta apoptótica e inmune casi
inexistente, mientras que las cepas atenuadas generan la producción de altos títulos de
anticuerpos neutralizantes como resultado, en parte, de fenómenos de MCP que permiten
la presentaciónd de antígenos a las poblaciones gliales e inmunes circundantes. Sin
embargo, en las infecciones por RABV la respuesta inmune adecuada no puede
considerarse la más adecuada pues generalmente está acompañada de muerte celular
anticipada en el SNP que conlleva a presentaciones paralíticas crónicas de la
enfermedad, estableciendo un delicado balance entre lo que se puede considerar como
inmunidad protectiva e inmunopatogénesis (Hooper C, 1995).
121
5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS Como lo observamos a través de toda esta revisión, la biología celular y molecular concerniente a los fenómenos transcripcionales y replicativos del RABV, así como a la activación de la MCP o al desarrollo y características de las neuronas sensoriales, es el resultado de un delicado balance que ha tomado millones de años en establecerse. Se puede concluir que:
El RABV es un virus con genoma ARN de sentido negativo altamente neurotrópico. Las características moleculares de las cepas del RABV neurotrópicas y altamente patogénicas para el SNC le han permitido desarrollar estrategias de evasión de la apoptosis y de la respuesta inmune mediante un conjunto diverso de estrategias individuales. La compresión total del mecanismo molecular, genético y bioquímica de diseminación de las cepas del RABV neuotrópicas y patogénicas en el SNC y de la evasión de la MCP y de la respuesta inmune hasta ahora se ha comenzado a vislumbrar. Nuestro sistema nervioso e inmune son sin duda dos de los logros más maravillosos de la evolución, más sin embargo, las entidades más antiguas en el planeta, los virus ARN como el
RABV, han aprendido a utilizar y alterar la exquisita perfección de sus componentes con resultados tan fatídicos como 50000 muertes humanas al año por una mieloencefalítis de rápido y agudo progreso a la cual no hemos podido combatir. Desde que se describió al fenómeno de MCP como el causante de esta patología y se contó con las herramientas moleculares adecuadas, ha comenzado una carrera que a la fecha arroja muchos resultados de los cuales solo unos cuantos son concluyentes. La ausencia de resultados concluyentes y que expliquen a cabalidad los fenómenos de diseminación y evasión a través del SNP se deben en gran medida a la ausencia de un modelo in vitro que simule el comportamiento del RABV dentro de las neuronas por donde se
transporta desde la periferia y en las cuales lleva a cabo el fenómeno de evasión de la apoptosis y de la respuesta inmune. El establecimiento de un modelo de cultivo primario del GRD de ratones adultos para la infección por RABV ha sido un gran paso para el descubrimiento de las bases moleculares que gobiernan la patogénesis viral. Conociendo quien es el agente etiológico de la enfermedad rábica, los principios del fenómeno de muerte celular que está alterando, las características de la célula blanco de replicación, transcripción y perpetuamiento, en conjunto con un modelo adecuado de análisis in vitro, el mecanismo de patogénesis, evasión de la apoptosis y el fenómeno de inmunoevasión del RABV puede llegar a ser descrito totalmente.
122
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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