Post on 19-Apr-2020
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA
DE MÉXICO
FACULTAD DE QUÍMICA
La elutriación centrífuga como un método de sincronización de
células animales en las diferentes fases del
ciclo celular
TESIS
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO
PRESENTA
Rodrigo Rosas Becerril
MÉXICO, D.F. 2013
UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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JURADO ASIGNADO
PRESIDENTE: Profesor: Euclides Ávila Chávez
VOCAL: Profesor: José Ignacio Páramo Ramírez
Secretario: Profesor: José Antonio Serrato Pérez
1er. Suplente: Profesor: Perla Deyanira Maldonado Jiménez
2ndo. Suplente: Profesor: Laura Carmona Salazar
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA:
Departamento de Bioquímica del
Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias “Ismael Cosío Villegas”
y Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina UNAM
Asesor
Dr. José Antonio Serrato Pérez
Sustentante
Rodrigo Rosas Becerril
AGRADECIMIENTOS
A la maestra Isaura Carrera por enseñarme que cuando creemos que todo lo
sabemos es justo cuando más podemos cometer errores.
A los maestros Alain Quere y José de Jesús García Valdez por mostrarme que
cuando un hombre se concentra en un solo objetivo se vuelve igual de
poderoso que el láser, de modo que la respuesta obvia es el cumplimiento de
su meta.
Al Dr. José Antonio Serrato Pérez por darme la oportunidad de trabajar en un
proyecto de vanguardia, de carácter aplicativo y que pone en alto la ciencia que
se desarrolla en México.
A los miembros del jurado Euclides Ávila Chávez y José Ignacio Páramo
Ramírez, por la revisión de los manuscritos de tesis.
Agradezco al proyecto Conacyt CB-2010-155653 por el financiamiento para la
realización del proyecto, la asistencia técnica de la M. en C. Vanessa
Hernández del IBT-UNAM, a los Doctores Tonatiuh Ramirez del IBT-UNAM por
el uso del Coulter-Multisizer, Lourival Possani del IBT-UNAM por donar la línea
celular BCF2, Enrique Piña, Magdalena Vilchis, Raquel Guinzberg y Antonio
Díaz Cruz por las facilidades otorgadas para el uso del equipo de elutriación en
el departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina-UNAM.
A mis hermanos y amigos de la Facultad de Química, así como de la Escuela
Nacional Preparatoria No.1, Miguel, Jimena, Sandra, Martin Corona, Adrian
Jaen, Griselda, Irving, Wily, Marlene, Alejandro y por supuesto a la MVZ
Guadalupe Velasco con quien he crecido y madurado en los últimos años de mi
vida, gracias por compartir conmigo, gracias por enseñarme, gracias por formar
parte de mi vida, siempre te llevo en mi corazón.
A la Familia Velasco Arguijo que siempre me ha hecho sentir como un
integrante mas de su familia, gracias por todas las atenciones y cálidos
recibimientos que siempre han tendió para conmigo.
A Ricardo Gracia y a Manuel Pascual por ser unas magníficas personas llenas
de luz que han iluminado mi camino y el de las personas que me rodean,
gracias por mostrarme el verdadero propósito de la vida.
Dedicatorias
A mi padre Ricardo Rosas Cedillo con quien en los últimos años me he
reinventado; realmente ha sido una aventura el poder reencontrarnos y de paso
contagiar a la familia de este nuevo estilo de vida, gracias padre por todo tu
apoyo en esta etapa, quiero que sepas que te admiro por todo lo que haz
logrado y te respeto por todo lo que representas para mí.
A mi madre Elvia Becerril Hernández por todo su amor y afecto incondicional,
gracias por siempre confiar en mí y apoyarme en todos mis proyectos. Me
siento muy orgulloso de ti madre, eres un ejemplo para mi y mis hermanos.
Gracias por toda la paciencia y el apoyo que me haz brindado en esta etapa.
No son suficientes las palabras cuando uno quiere decir gracias desde el
corazón.
A mi hermano Hugo Alberto Rosas Becerril con quien he pasado muy buenos
momentos, gracias por mostrarme que ante la vida hay que tener carácter y
mantener el temple en los peores momentos. Gracias por mostrarme los
valores de la responsabilidad y la constancia.
A mi hermano Ricardo Israel Rosas Becerril por ser un gran maestro de la vida,
no sabes cuánto he aprendido de ti. En la vida no hay casualidades ni “por
ques” si no lo que hay son causalidades y “para ques”. Gracias familia los amo.
INDICE GENERAL
1. Indice de Figuras 1
2. Indice de Tablas 2
3. Abreviaturas 3
4. Resumen 5
5. Introducción 6
6. Antecedentes 7
6.1. Ciclo celular 7
6.2. Sincronización célular 7
6.2.1. Métodos químicos de arresto celular 8
6.2.2. Métodos físicos de sincronización celular 10
6.3. Elutriación centrifuga y sincronización 12
6.3.1. Principio de operación del método de elutriación centrífuga 12
6.4. La ingeniería de cultivo de células animales y el ciclo celular 15
7. Justificación 18
8. Objetivos 19
9. Hipótesis 20
10. Materiales y métodos 21
10.1. Modelo biológico 21
10.2. Medios de cultivo utilizados 21
10.3. Mantenimiento de células 22
10.3.1. Congelación 22
10.3.2. Descongelación 22
10.3.3. Condiciones de cultivo 23
10.3.4. Cuantificación de la concentración y la viabilidad celular 23
10.4. Determinación del tamaño celular 24
10.5. Sistema de elutriación 24
10.5.1. Procedimiento de elutriación 25
10.5.2. Preparación de muestra para inyección 28
10.6. Determinación del contenido ADN mediante citometría de flujo 29
10.6.1. Fijación celular 29
10.6.2. Tinción del ADN con colorante fluorescente 30
10.6.3. Lectura en citómetro Facs Calibur (Becton Dickinson) 30
10.7. Consideraciones Matemáticas 31
10.7.1. Velocidad especifica de crecimiento 31
10.7.2. Análisis estadístico de los datos 31
11. Resultados y discusión 33
11.1. Caracterización del sistema de elutriación 33
11.1.1. Caracterización del sistema de circulación del fluido 33
11.2. Caracterización del sistema biológico 36
11.2.1. Evaluación del crecimiento del hibridoma BCF2 36
11.2.2. Determinación del diámetro celular 38
11.2.3. Cálculo del flujo de elución empleando la ley de Stokes
simplificada 39
11.2.4. Determinación del contenido de ADN mediante citometría de
flujo para una población no sincronizada 40
11.3. Evaluación de la sincronía obtenida por el método de elutriación
centrifuga 42
11.3.1. Evaluación de contenido de ADN de las fracciones
celulares obtenidas a los flujos determinados por la
Ley de Stokes simplificada 42
11.3.2. Medición del contenido de ADN en la región con mayor
presencia de células en fase G1 44
11.3.3. Cinéticas de crecimiento de células sincronizadas, en
frascos de cultivo de 25 cm2 49
12. Conclusiones 52
13. Perspectivas 53
14. Anexo I 54
14.1. Principios matemático de la elutriación centrifuga 54
15. Referencia 58
1
1. INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Esquema general del procedimiento de elutriación centrífuga.
Figura 2. Esquema de la separación celular por elutriación centrífuga.
Figura 3. Sistema de Elutriación Beckman Modelo JE-6B.
Figura 4. Esquema de preparación de muestra.
Figura 5. Calibración de la bomba Minipuls 3.
Figura 6. Calibración de la bomba Masterflex.
Figura 7. Cinética de crecimiento de la línea celular BCF2.
Figura 8. Histograma de la distribución de diámetros del hibridoma BCF2.
Figura 9. Distribución de tamaño relativo, complejidad celular y contenido de
ADN de una población BCF2 no sincronizada.
Figura 10. Distribución de tamaño relativo, complejidad celular y variación del
contenido de ADN para una población BCF2 sincronizada.
Figura 11. Análisis de contenido de ADN para las elutriación 1, 2 y 3, a flujos de
24, 25, 26 y 27 mL/min.
Figura 12. Cinéticas de crecimiento de células sincronizadas.
Figura A1. Diagrama de la cámara de elutriación.
2
2. INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Principales agentes químicos de arresto celular para células
animales.
Tabla 2. Métodos físicos de sincronización celular.
Tabla 3. Características de la cámara de elutriación Standard usada en el
proyecto.
Tabla 4. Coeficientes de variación para las ecuaciones provenientes de las
curvas de calibración.
Tabla 5. Caracterización del sistema biológico.
Tabla 6. Flujos de colecta teóricos obtenidos a partir de los datos del
contador electrónico de partículas (Coulter Multisizer) y de la ley de
Stokes.
Tabla 7. Porcentaje de células en cada fase del ciclo celular de una cinética
de crecimiento típica de BCF2 usando el modelo matemático
Dean/Jett/Fox.
Tabla 8. Evaluación del contenido de ADN para las fracciones obtenidas en
el intervalo 24-27mL/min.
3
3. ABREVIATURAS
A Área de la sección transversal
AcM Anticuerpo Monoclonal
ADN Acido Desoxirribonucleico
AraCTP Citosin trifosfato
ARN Acido Ribonucleico
Cdks Cinasas dependientes de ciclinas
CDM Medio químicamente definido
Cel Célula
Ckis Inhibidores de cdk
CO2 Dióxido de Carbono
Ctrl Control
C.V Coeficiente de variación
dCTPs Trifosfatos de desoxicitidina
DMEM Medio de cultivo Eagle modificado por Dulbecco
DMSO Dimetil sulfóxido
dTMP Desoxiadenosina 5'-monofosfato
EC Elutriación Centrífuga
ECC Elutriación Centrífuga a Contracorriente
F Fuerza de arrastre
F Flujo
FACS Clasificación de células activadas por fluorescencia
FSC Dispersión de luz frontal
g Gramo
Glut Glutamina
h Horas
IgG Inmunoglobulina o Anticuerpo de clase G
L Litro
m Metro
MACS Clasificación magnética de células.
min Minuto
4
µ Velocidad especifica de crecimiento
mL Mililitro
mM Milimolar
mOsm Miliosmolar
mPa Milipascal
PBS Solución amortiguadora de fosfatos
r Radio
r coeficiente de correlación lineal
RNR Ribonucleótido reductasa
rpm Revoluciones por minuto
σ Desviación estándar
s Segundo
SFB Suero fetal Bovino
SSC Dispersión de luz lateral
t Tiempo
td Tiempo de duplicación
T.A. Temperatura ambiente
V Velocidad del fluido
Vs Velocidad de sedimentación
X Concentración de células viables al tiempo t
X0 Concentración de células viables inicial
Xtot Células totales
%Xv Porcentaje de viabilidad
X max Concentración celular máxima
η Viscosidad del fluido
μ Velocidad específica de crecimiento aparente
µm Micra
ρm Densidad del fluido
ρp Densidad de la partícula
ω Velocidad angular
5
4. RESUMEN
La mayoría de las investigaciones que realizan experimentación con líneas
celulares para optimizar los procesos de producción de proteínas recombinantes
no toman en cuenta que la población es heterogénea con respecto al ciclo
celular, es decir, se tienen subpoblaciones celulares de un mismo linaje en sus
diferentes fases, bajo condiciones metabólicas y fisiológicas muy diferentes.
Para poder estudiar detalladamente los múltiples procesos celulares y
metabólicos implicados en la producción de proteínas recombinantes a lo largo
de las diferentes fases de un ciclo de división celular es necesario utilizar células
sincronizadas.
En el presente trabajo se implementó y evaluó a la Elutriación Centrífuga (EC)
como método de sincronización de subpoblaciones celulares en las diferentes
fases del ciclo celular. La EC es un método físico de separación de poblaciones
celulares que consigue separarlas en base a su tamaño, densidad y velocidad
de sedimentación. En virtud de que existe una relación directa entre el tamaño y
la fase del ciclo celular, es posible separar mediante EC a las diferentes
poblaciones del ciclo celular (S, G1 y G2) de un mismo linaje. Los resultados
obtenidos en el presente proyecto abarcan la caracterización del procedimiento
de EC y del crecimiento no sincronizado del hibridoma murino BCF2 como
modelo biológico, así como la evaluación de la sincronía en la subpoblación en
fase G1 del ciclo celular separada mediante EC y colocada nuevamente en
cultivo.
Se demostró que la EC fue capaz de separar a las subpoblaciones G1, S y G2.
Las subpoblaciónes en G1 separdas a 25 y 26 mL/min tuvieron el 79.4±3.3% y el
78.4±6.3% de pureza respectivamente. Cinéticas de crecimiento de células
sincronizadas mostraron un perfil de crecimiento escalonado indicativo de la
sincronía existente. Dicho comportamiento se mantuvo durante el tiempo que se
realizaron los cultivos (aproximadamente 60 h) mostrando divisiones celulares
sincrónicas comparables al tiempo de duplicación determinado en cinéticas de
crecimiento no sincronizadas.
6
5. INTRODUCCIÓN
Para finales del siglo XX el cultivo de líneas celulares animales como sistema
biológico productor de proteínas recombinantes terapéuticas se consolidó como
el preferido por la industria farmacéutica biotecnológica debido a las ventajas
que ofrece (plegamiento proteico correcto, glicosilación compleja y secreción del
biofármaco) sobre sistemas como el bacteriano, vegetal o de levaduras. La
ingeniería de cultivo celular en la actualidad se centra en optimizar la capacidad
productiva de este sistema, lo cual requiere una experimentación más detallada
para el entendimiento de los eventos celulares (metabólicos y fisiológicos) que
determinan en última instancia la cantidad o calidad de las proteínas que se
desea producir.
Por la naturaleza de los cultivos celulares (células creciendo y duplicándose
ininterrumpidamente), la mayoría de las investigaciones que realizan
experimentación para optimizar la producción de proteínas recombinantes no
toman en cuenta que la población celular es heterogénea con respecto al ciclo
celular, es decir, se tienen subpoblaciones de un mismo linaje en las diferentes
fases del ciclo celular en condiciones metabólicas y fisiológicas diferentes, de
modo que, en tales circunstancias los resultados obtenidos de los diferentes
procesos en evaluación son aparentes.
Para poder estudiar dichos procesos detalladamente a lo largo de las diferentes
fases de un ciclo de división celular es necesario entonces sincronizar las
células. Entre los múltiples y muy diversos métodos de sincronización celular, en
el presente trabajo se implementó y evaluó al método físico de separación de
poblaciones celulares denominado Elutriación Centrífuga (EC), como
herramienta para sincronizar en las diferentes fases del ciclo celular a las células
animales BCF2 productoras de anticuerpo monoclonal (AcM). Lo anterior con la
perspectiva de que en estudios posteriores se evalúe de manera detallada
aspectos metabólicos, tales como, la síntesis y glicosilación de proteínas o el
consumo y producción de metabolitos en las diferentes fases del ciclo celular, lo
cual permitirá entender su contribución sobre la calidad o cantidad de las
proteínas recombinantes producidas.
7
6. ANTECEDENTES
6.1. CICLO CELULAR
Se denomina ciclo celular a la serie de eventos que ocurren durante la
proliferación celular para que una célula se duplique. Lo anterior implica que
cada célula progrese exitosamente a través de las fases discretas del ciclo
celular denominadas G1 (del inglés Gap 1), fase de síntesis (S), G2 (del inglés
Gap 2) y mitosis (M). Las células viables y funcionales que no están en proceso
de proliferación se les considera en fase de arresto celular (G0). Durante G1 las
células incrementan su tamaño y biomasa hasta que entran a fase S donde los
organelos celulares y el genoma son replicados preparándose para la división
celular. Para el final de la fase S, una célula diploide (2n) se ha convertido en
tetraploide (4n), conteniendo suficiente ADN y componentes celulares para
generar dos células. Después de la fase S la célula entra a G2. Durante esta
fase las células sintetizan las proteínas requeridas para dirigir la segregación
cromosómica y la división celular que se llevará a cabo en la mitosis. La
progresión de las células a través de dichas fases constituye una vuelta del ciclo
celular. Para células de mamífero en cultivo la fase G1 dura entre 1 y 8 h, la
fase S dura de 6 a 8 h, la fase G2 de 2 a 4 h y finalmente la mitosis dura menos
de una hora (Vella, 1994).
6.2. SINCRONIZACIÓN CELULAR
La sincronización celular es una herramienta metodológica para estudiar los
procesos celulares que ocurren durante las fases del ciclo celular (Cooper, 2002;
Pfosser et al., 2007; Gordon y Eliott, 1977). Los métodos de sincronización
celular permiten obtener poblaciones homogéneas de células en una fase
determinada del ciclo celular.
De acuerdo a su principio de operación hay dos grupos principales de métodos
de sincronización: aquellos que detienen la progresión del ciclo celular mediante
la exposición de las células a agentes químicos (arresto celular) y aquellos que
8
emplean procedimientos de separación de poblaciones basándose en las
propiedades físicas de las células. Estrictamente, en un cultivo sincronizado,
todas las células deberían transitar a través de las diferentes fases del ciclo
celular y dividirse al mismo tiempo (Sharma, 1999; Planchais et al., 2000).
Investigaciones realizadas por Cooper (2003) muestran que el uso de métodos
químicos tales como la privación de nutrimentos esenciales, timidina y nocodazol
generan lotes celulares con una escasa sincronía (un segundo ciclo es
raramente observado) atribuyendo esto a la alteración de los procesos
metabólicos y fisiológicos por parte de los agentes químicos (Cowan y Milstein,
1972; Pardee y Keyomarsi, 1992). Con base en lo anterior, el mismo
investigador redefine cultivo sincronizado como aquel en el que la mayoría de las
células progresan de manera normal o no alterada (por ejemplo, sin alteraciones
de contenido de ADN, biomasa y tamaño) a través de las fases del ciclo celular
como un cohorte relativamente uniforme.
6.2.1. MÉTODOS QUÍMICOS DE ARRESTO CELULAR
Los métodos químicos de arresto celular son privación de nutrimentos
esenciales y uso de sustancias químicas. La técnica de privación de nutrimentos
esenciales (Griffin, 1976) arresta a las células en G0/G1 mientras que el uso de
sustancias químicas, es ampliamente usado, para arrestar células en las
diferentes fases. Este tipo de métodos son caracterizados por su fácil uso, bajo
costo y debido que se basan en la inhibición reversible de procesos específicos
para una fase del ciclo celular.Las sustancias químicas detienen el ciclo celular a
diferentes niveles: mediante su interacción a nivel de Cdk´s (cinasas
dependientes de ciclinas), por la unión o inhibición a enzimas relacionadas con
la síntesis de ADN, a través de proteólisis de los reguladores del ciclo celular o
bien a nivel estructural mediante la inhibición de la síntesis del huso mitótico.
Usando sustancias químicas como agentes de arresto se pueden obtener un
número considerable de células sincronizadas (técnica preparativa); sin
embargo, el grado de sincronía a menudo no es alto, además de que el
9
metabolismo celular es modificado, produciendo un crecimiento no balanceado
que ya no corresponde al de una célula no inhibida (Cooper, 2003).
A partir del uso de los métodos químicos se han obtenido cultivos parcialmente
sincronizados (Bootsma et al., 1964; Tobey et al., 1967) que han permitido
obtener datos valiosos en áreas como: síntesis de inmunoglobulinas, donde se
descubrió que para células linfoides humanas esta se lleva a cabo
principalmente durante la etapa tardía de la fase G1 y en la etapa temprana de la
fase S (Fahey et al., 1971). También se conoce su éxito en los procesos
citológicos y moleculares del ciclo celular en plantas, ya que gran parte de este
conocimiento se debe al desarrollo de técnicas de sincronización mediante el
uso de sustancias químicas (Ruiz et al., 2010).
Entre los agentes químicos comúnmente usados para arrestar el ciclo celular de
células animales se encuentran la hidroxiurea, afidicolina, metrotexato, timidina y
nocodazol. A continuación se presenta una tabla donde se explica su
mecanismo de acción.
Tabla 1. Principales agentes químicos de arresto celular para células animales. Se muestran los principales métodos químicos, mecanismo de acción y fase del ciclo celular en el que se produce el arresto.
Técnica Mecanismo de acción Bloqueo a
nivel de: Referencias
Ausencia de
suero y
calcio
La ausencia de factores de
crecimiento evita que ocurran
las diversas señales de
transducción que regulan el
ciclo celular.
G0, G1 y
Mitosis
(dependiendo
del tipo de
célula)
Sherr, 1993;
Griffin, 1976
Hidroxiurea
Inhibición de la subunidad R2
de la enzima Ribonucleótido
reductasa.
G1/S
Tobey et al.,
1990; Young y
Hodas, 1964;
Gao et al., 1998;
Koç et al. 2004
10
Afidicolina
Inhibe la DNA polimerasa α y
δ al competir con los dCTPs
(trifosfatos de desoxicitidina)
por el sitio de unión a la
enzima.
G1/S
Waters, 1981;
Kumagai-Sano
et al., 2006
Metrotexato
Es un inhibidor de la
tetrahidrofolato
deshidrogenasa que evita la
formación de tetrahidrofolato
necesario para la síntesis de
timidilato, componente
esencial del ADN.
S Fox et al., 1987
Timidina
Inhibición de la síntesis de
ADN que se atribuye a la
inhibición de la síntesis de
nucleótidos.
G1/S Harper, 2004
Nocodazol
Inhibe la polimerización de
tubulina In vitro e In vivo. G2/M
De Brabander et
al., 1976;
Hoebeke et al.,
1976
6.2.2. MÉTODOS FÍSICOS DE SINCRONIZACIÓN CELULAR
A diferencia de los métodos químicos la mayoría de los métodos físicos de
sincronización celular ofrecen un alto grado de sincronía, esto en virtud de que
son métodos de separación. Los métodos físicos de sincronización se basan en
la separación de poblaciones en base a las propiedades físicas de la misma. Por
ejemplo: tamaño, densidad o dispersión de luz. Las células sincronizadas por
estos métodos tienen la característica de que no son alteradas en su
metabolismo permitiendo estudios subsecuentes de fisiología y metabolismo
celular. La mayoría de los métodos físicos tienen la desventaja de que no son
preparativos (limitando su uso para un análisis metabólico poblacional) con
excepción de la elutriación centrífuga. Sin embargo, este último requiere de un
11
equipo costoso además de que su operación es un tanto compleja. A
continuación (Tabla 2) se presenta un resumen de los principales métodos
físicos de sincronización.
Tabla 2. Métodos físicos de sincronización celular. Se mencionan a los principales métodos físicos de sincronización, el principio mediante el cual se lleva a cabo la separación celular y un comentario acerca de la misma.
Método
Principio de la
sincronización
Ventajas /
Desventajas
Referencias
Inhibición por
contacto
Tras la confluencia
proteínas como la
P27 inactivan
complejos CDK-
ciclina y cinasas,
dando lugar
al arresto celular
Simple, sin
embargo, de
baja resolución
Polyak et al.,
1994; Harper et
al., 1995; Xiong
et al., 1993;
Holley y
Kiernan, 1968.
Disminución de
la temperatura
de cultivo
Inhibición de Aurora
y Polo cinasas
Simple y
preparativa
Rieder y Cole,
2002; Kaufmann
et al., 1999
Velocidad de
sedimentación Tamaño celular
Técnica simple y
rápida, sin
embargo,
de baja resolución
y rendimiento
Miller y Phillips,
1969
Elución por
membrana
Una célula es fijada
a una membrana de
nitrocelulosa. Tras la
división celular la
nueva célula es
eluida.
Simple y
rápida
Cooper, 2002
Sedimentación
isopícnica
Tamaño celular
Simple y rápida
Morganthaler y
Price, 1976
12
Clasificación de
células
activadas por
fluorescencia
Área de la superficie
celular
tamaño
rugosidad celular
Tecnología cara y
compleja pero
muy efectiva, alta
resolución pero
poco rendimiento
Vaughan y
Milner, 1989
Elutriación
Centrífuga
Tamaño celular,
densidad y
configuración de la
superficie celular
Rápida,
preparativa,
procedimiento un
poco complejo y
tecnología cara
Barford, 1986;
Feder et al.,
1989; Lutz et al.,
1992; Bauer,
1999; Lloyd et
al., 2000;
Banfalvi, 2008
6.3. ELUTRIACIÓN CENTRÍFUGA Y SINCRONIZACIÓN
6.3.1. PRINCIPIO DE OPERACIÓN DEL MÉTODO DE ELUTRIACIÓN
CENTRÍFUGA.
La elutriación centrífuga a contracorriente fue implementada como método de
separación por el científico estadounidense P.E Lindhal (Lindhal, 1948; Bachere
et al.,1988) y posteriormente desarrollada por la compañía Beckman Instruments
Inc. (Lindahl, 1948; Lindahl, 1956; McEwen et al., 1968; Sanderson et al., 1976).
La elutriación centrífuga es utilizada mayoritariamente para la separación de
mezclas de linajes celulares (Yoshioka et al.,1997): por ejemplo para la
separación de los diferentes tipos celulares presentes en el tejido sanguíneo
(Coulais et al., 2012). Sin embargo, por su principio de operación es posible
conseguir la separación de las diferentes poblaciones de ciclo celular de un
mismo linaje.
13
Figura 1. Esquema general del procedimiento de elutriación centrífuga. Para iniciar el procedimiento de elutriación centrífuga se debe contar con un cultivo de células en crecimiento exponencial y viabilidad mayor al 90% (1), posteriormente este cultivo se prepara e inyecta al sistema (2) el cual separará a las subpoblaciones (3), finalmente las células de interés se colectan y según los fines del experimento, son fijadas ó colocadas nuevamente en cultivo (4).
Para obtener una población homogénea de células mediante elutriación
centrífuga en el equipo de Beckman (véase figura 1) se inyecta una suspensión
celular heterogénea que será transportada hasta la cámara de separación
mediante una fase líquida (por ejemplo: amortiguador PBS o medio de cultivo).
La corriente de este medio entra a la cámara en sentido opuesto al campo de
fuerza centrífuga que existe cuando el rotor está funcionando (véase figura 2).
Dentro de la cámara diversas variables como: densidad de la partícula (g/mL),
tamaño de partícula (μm), densidad del fluido (g/mL), fuerza centrífuga (rpm),
viscosidad del fluido (mPa/s), flujo a contracorriente (mL/min) y velocidad del
fluido (m/s) establecen un equilibrio permitiendo el mantenimiento de las células
en una posición espacial determinada dentro de la cámara de acuerdo a su
velocidad de sedimentación (m/s). Las células serán secuencialmente
expulsadas del rotor basándose principalmente en su tamaño (las más pequeñas
eluirán primero y las grandes eluiran al final cuando el equilibrio dentro de la
cámara sea alterado mediante el incremento del flujo de volumen o la
1
2
4
3
14
disminución de la velocidad de centrífugación o fuerza centrífuga (Lindhal,
1948).
Figura 2. Esquema de la separación celular por elutriación centrífuga. A) Muestra suspendida en medio, el cual entra a la cámara. B) Tendencia a la sedimentación de partículas en función de sus tamaños. En rojo se observa la frontera de elutriación. C) Al alterar el equilibrio las partículas más pequeñas eluyen primero. Tomadó de Developing Elutriation Protocols, Technical information, Beckman Instruments Inc. 1994.
De esta forma células de determinado tamaño pueden ser selectivamente
removidas de la cámara (para una descripción detallada del procedimiento de
Elutriación centrífuga en el equipo Beckman véase el apartado 10.5.1 de la
sección Materiales y Métodos).
El uso de la elutriación centrífuga ofrece ventajas sobre los métodos químicos
tradicionales de arresto celular en virtud de que no alteran el metabolismo y/o la
fisiología celular, por lo tanto, los resultados obtenidos son representativos de lo
que ocurre en las células en las diferentes fases del ciclo celular y no del efecto
del agente químico de arresto celular (Cooper, 2003). En comparación con los
demás métodos físicos de separación, la elutriación centrífuga es el método
ideal de sincronización cuando se requieren concentraciones de células en el
orden de 108 además de que se cuenta con la posibilidad de utilizar el sistema
de manera aséptica.
Diferentes grupos de investigación han aprovechado las ventajas que ofrece la
elutriación centrífuga para el estudio de multiples aspectos del ciclo celular, tales
como: el rol de las ciclinas y cinasas en la regulación del ciclo celular (Borycki et
Fuerza centrífuga Contra corriente
A B C
15
al.,1995; Lukas et al.,1995; Ezhevsky et al.,1996; Pusch et al., 1996; Mikulits et
al., 1997), la síntesis de novo de proteínas como chaperonas (Mikulits et al.,
1996; Vaughn et al., 1996; Dittmar et al., 1997), la sensibilidad celular a
radiaciones y sustancias químicas (Buchholz et al., 1995; Davis et al., 1995;
Keng et al 1995; Mitchell et al., 1995; Ramachandran et al., 1996; Terui et al.,
1995; Evans et al., 1996; Gupta et al., 1996), la identificación de enzimas de
importancia para la división celular (Marshak y Russo, 1994; Tsai et al., 1996;
Bianchi et al., 1997), la sensibilidad del ciclo celular debida a señales
transmitidas por citocinas (Breder et al., 1996; Spivak et al., 1996) entre muchas
otras. Algunos autores se han encargado de fundamentar la técnica de
elutriación centrífuga. Barford (1986), describe un modelo matemático que
permite realizar predicciones acerca de la velocidad de flujo necesaria para
separar una población celular. Bauer (1999) por su parte desarrolló un rotor y
cámara de centrífugación con capacidad de 0.5 mL cuya funcionalidad fue
comprobada al trabajar con células linfoides. Recientemente Banfalvi (2008)
reportó un procedimiento para la separación de un cultivo de células CHO
(células ováricas de hámster chino) en las diferentes fases del ciclo celular. La
separación fue evaluada mediante mediciones fluorométricas de contenido de
ADN, mostrando que la técnica permite separar de manera eficiente las
diferentes poblaciones de ciclo celular. Sin embargo, no evaluó la viabilidad
celular tras la elutriación y tampoco muestra una visión cuantitativa de la calidad
de la separación. Estas ultimas investigaciones dan una base teórico - práctica
que fundamentan la factibilidad de la técnica. Exceptuando la investigación de
Bauer (1999) todos los resultados fueron obtenidos con el sistema de elutriación
de la compañía Beckman Instruments.
6.4. LA INGENIERÍA DE CULTIVO DE CÉLULAS ANIMALES Y EL CICLO
CELULAR.
En general una célula somática después de dividirse entra en G0 donde puede
permanecer viable por periodos de tiempo indefinidos (según el tipo de célula)
ejerciendo sus funciones hasta morir, pero conservando su potencial para
16
dividirse si se presenta el estímulo necesario. En contraste, las células animales
utilizadas en biotecnología para la producción de proteínas de interés
terapéutico, son líneas celulares transformadas que proliferan indefinidamente y
no entran a G0 después de su ciclo de división celular en tanto no existan
factores de cultivo (limitación de nutrimentos, acumulación de metabolitos
tóxicos, etc.) que comprometan su viabilidad (Flickinger y Drew, 1999).
Desde el punto de vista de la ingeniería de cultivo de células animales para la
producción de proteínas recombinantes, las implicaciones del ciclo celular en el
desempeño de los cultivos y sobre la cantidad y calidad de las proteínas
recombinantes producidas no ha sido ampliamente estudiado.
Existe evidencia de que el control de la división celular mediante técnicas
moleculares puede mejorar la productividad de los cultivos, representando una
estrategia para optimizar la producción de proteínas recombinantes a partir de
líneas celulares de importancia económica (Fussenegger et al., 1997). Se han
realizado algunos estudios para entender la relación entre el ciclo celular y la
producción de proteínas recombinantes, por ejemplo: estudios sobre la
expresión de genes anti-apoptóticos (Figueroa et al., 2007), la expresión de
genes relacionados con la regulación de ciclo celular (Fussenegger et al., 1998;
Bi et al., 2004), el plegado y ensamblaje en el retículo endoplasmático (Hayes et
al., 2010), la traducción (Underhill et al., 2005) y la secreción de proteínas
(Dinnis et al., 2006; Peng et al., 2010). Sin embargo, la naturaleza heterogénea
de las poblaciones celulares utilizadas en los estudios anteriores genera
resultados aparentes que realmente no permiten evaluar el impacto de los
procesos que ocurren en cada una de las fases del ciclo celular. Muy pocos
estudios se han realizado utilizando poblaciones celulares sincronizadas en las
diferentes fases del ciclo celular.
Al-Rubeai y Emery (1990) usaron métodos de sincronización química para
estudiar el metabolismo en hibridomas. La sincronización de los cultivos fue
lograda a partir de la adición de timidina la cual arrestó a las células en G1
provocando el aumento en la velocidad específica de producción máxima de
anticuerpo monoclonal (al-Rubeai y Emery, 1990); este tipo de evaluación
presenta un problema ya que como se mencionó anteriormente el uso de
17
agentes químicos de arresto altera el metabolismo celular (Cowan y Milstein,
1972).
Feder et al., (1989) mediante elutriación centrífuga obtuvieron poblaciones
homogéneas de células CHO con el objetivo de evaluar el patrón de expresión
de la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR) y sus niveles de ARNm en las
diferentes fases del ciclo celular. Esta investigación concluyó que la actividad y
expresión de la enzima DHFR no cambian a través de las diferentes fases del
ciclo celular por lo cual ésta no puede ser considerada una enzima regulada por
el ciclo.
18
7. JUSTIFICACIÓN
Los cultivos de células animales para la producción de proteínas recombinantes
de interés terapéutico se desarrollan con líneas celulares proliferando de manera
heterogénea, es decir, con células transitando en las diferentes fases del ciclo
celular de manera no sincronizada durante todo el tiempo de cultivo. Como
resultado solo se puede evaluar el metabolismo y los procesos celulares de
forma aparente.
De tal forma que, si se desea estudiar dichos procesos detalladamente a lo largo
de las diferentes fases de un ciclo de división celular es necesario entonces
sincronizar las células. Entre los diversos métodos de sincronización celular en
el presente trabajo se evaluó a la elutriación centrífuga que es un método
preparativo de separación de células con base en su tamaño, que por su
principio de operación no altera la fisiología y el metabolismo celular, lo cual es
una ventaja sobre los métodos químicos de sincronización que ofrecen una
escasa sincronía además de alterar dichos procesos.
19
8. OBJETIVOS
Objetivo general:
Implementar un procedimiento preparativo para la obtención de hibridomas
BCF2 sincronizados en las diferentes fases del ciclo celular en condiciones
asépticas.
Objetivos particulares:
Evaluar a la elutriación centrífuga como método de sincronización de
hibridomas BCF2 en las diferentes fases del ciclo celular.
Determinar las condiciones óptimas para la obtención de células BCF2
sincronizadas en la fase G1 del ciclo celular.
Obtener células sincronizadas en la fase G1 del ciclo celular con alto
grado de sincronización y en condiciones asépticas.
Cultivar In vitro las células sincronizadas en la fase G1 del ciclo celular
para comprobar la sincronía.
20
9. HIPÓTESIS
- En virtud de que existe una relación directa entre el tamaño y la fase de
ciclo celular, el método de elutriación centrífuga por su principio de
operación separará eficientemente a las subpoblaciones G1, S y G2 de un
cultivo no sincronizado de células BCF2.
- Si la elutriación centrífuga es capaz de separar las subpoblaciones
celulares G1, S y G2 de un cultivo de hibridomas BCF2 no sincronizado,
el análisis de contenido de ADN revelará el grado de sincronía de dichas
subpoblaciones, y su comportamiento en cultivo mostrará un perfil de
crecimiento sincrónico escalonado.
21
10. MATERIALES Y MÉTODOS
10.1. MODELO BIOLÓGICO
El hibridoma murino BCF2 utilizado en este proyecto se derivó de una línea de
ratones Balb/c. El AcM que produce dicho hibridoma es de clase G (IgG1),
neutralizante y específico contra la toxina 2 del veneno del alacrán Centruroides
noxius Hoffmann. Dicha toxina es el péptido más tóxico del conjunto de toxinas
presentes en el veneno. Este AcM inhibe la unión de la toxina con las
membranas sinaptosomales del cerebro de ratón, mostrando así una actividad
neutralizante in vivo (Zamudio et al., 1992). La línea celular fue proporcionada
por el Dr. Lourival Possani del Instituto de Biotecnología de la U.N.A.M.
10.2. MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS
Medio de Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium)
El medio DMEM Gibco® sin SFB No. de catálogo 12430-120; fue usado como
medio de elución (en lugar de amortiguador) para las elutriaciones donde se
requirió colocar en cultivo a las células sincronizadas.
Chemically Defined Hybridoma Medium (CDM)
El medio CDM Gibco® No. de catálogo 11279-023 fue usado como medio de
cultivo para la línea celular BCF2. Dicho medio es específico para hibridomas
murinos productores de anticuerpos monoclonales. Se suplementó con
L-glutamina 8 mM (Sigma, 3126, St. Louis, MO) para su uso.
22
10.3. MANTENIMIENTO DE CÉLULAS
10.3.1. CONGELACIÓN
Preparación de banco celular; procedimiento general.
1.- Contar con un cultivo creciendo en fase exponencial y con una viabilidad
≥ 90%.
2.- Determinar la concentración celular y calcular el volumen a usar de medio de
criopreservación considerando que al fin del proceso cada criovial debe contar
con una concentración de entre 5 – 10x106 células viables por mL.
3.- Preparar el volumen requerido de medio de criopreservación mezclando
medio fresco (suplementado con Glutamina 8mM) con DMSO, 45% y 10%
respectivamente del volumen final considerado para el banco celular.
4.- Centrifugar el volumen de medio de cultivo celular en tubos cónicos por 10
min a 100 g para formar el botón celular.
5.- Posterior a la centrifugación eliminar medio en un tubo cónico estéril para su
posterior utilización (medio acondicionado).
6.- Con el otro 45% del volumen final -utilizando medio acondicionado-
resuspender células. Una vez resuspendidas mezclar los volúmenes de los
puntos 3 y 5 en frío.
7.- Dispensar 1 mL por criovial.
8.- Iniciar la congelación pasando consecutivamente de la temperatura ambiente
a -20 °C, -70 °C y finalmente a N2 líquido.
10.3.2. DESCONGELACIÓN
1.- Verter 4 mL de medio CD Hybridoma suplementado con glutamina a un tubo
cónico de 15 mL.
2.- Pasar 5 mL de medio CD Hybridoma suplementado con glutamina a un
frasco T de 25 cm2.
3.- Descongelar un vial de la línea celular BCF2 pasando a 37°C lo más rápido
posible.
23
4.- Traspasar el volumen del criovial (1 mL) al tubo del paso 1.
5.- Centrífugar a 800 rpm por 10 min.
6.- Eliminar el sobrenadante del tubo cónico con pipeta de 5.0 mL, teniendo
cuidado de no aspirar el pellet celular.
7.- Tomar el volumen del paso 2 y resuspender el pellet celular en el tubo cónico.
8.- Tomar el volumen con células suspendidas y verterlo en el mismo frasco T de
25 cm2.
9.- Colocar en incubadora a 37°C, 5% CO2 y humedad a saturación.
10.3.3. CONDICIONES DE CULTIVO
Los cultivos para caracterización cinética de la línea celular se realizaron por
triplicado, iniciando con un inóculo de 0.1x106 cel mL-1 en frascos de cultivo 25
cm2 con 5 mL de medio de cultivo. Se tomó muestra cada 24 horas.
Las elutriaciones se llevaron a cabo con células en crecimiento exponencial, en
un intervalo de concentración entre 1.5 y 2.0x106 cel mL-1 y con una viabilidad
mayor al 90%. Los cultivos ocupados para llevar a cabo cinéticas de
sincronización, se iniciaron con un inóculo ≤ 0.2x106 cel mL-1 en frascos de
cultivo de 25 cm2, conteniendo 5 mL de medio de cultivo. Se tomó muestra
aproximadamente cada 3 h.
Todos los cultivos celulares se incubaron a 37°C en un ambiente con 5% de CO2
y humedad a saturación.
10.3.4. CUANTIFICACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN Y LA VIABILIDAD
CELULAR
La concentración y viabilidad celular se determinó mediante la técnica de
exclusión usando la cámara de Neubauer y el colorante azul de tripano (Sigma
T8154). El colorante es un indicador de la integridad de la membrana
citoplasmática. Mediante esta tinción, las células muertas son permeables al
colorante y se tiñen de azul, mientras que las vivas permanecen refringentes.
24
10.4. DETERMINACIÓN DEL TAMAÑO CELULAR
Para determinar el diámetro celular relativo se usó el contador electrónico de
partículas Beckman Coulter Multisizer™ 3 (con una tubo de apertura de 70 μm)
con solución salina 0.9 % como electrolito. Para calibrar el equipo se usaron
esferas de látex de diámetro conocido. El principio de operación del equipo es
denominado “Electrozone sensing” y se basa en el paso de una solución
adecuada de células a través de un orificio al cual se le aplica un voltaje. Al fluir
las partículas a través del orificio se genera un pequeño pulso de voltaje o pico,
la altura del pico es medida y comparada con los datos obtenidos de una
muestra de látex estándar.
10.5. SISTEMA DE ELUTRIACIÓN
El sistema de elutriación consiste en un sistema de circulación de fluido
acoplado a un rotor para ultracentrífuga ensamblable el cual contiene una
cámara de separación de células.
El rotor está diseñado para usarse a una velocidad máxima de 6000 rpm y para
separar células de 5 µm a 50 µm de diámetro. En la Tabla 3 se muestran las
características de la cámara de separación Standard que es la que se utilizó en
el presente trabajo.
Tabla 3. Características de la cámara de elutriación Standard usada en el proyecto.
Cámara
de
separación
Tamaño de partícula
(μm) valor mínimo y
máximo
Variación del
diámetro de partícula
en una población
eluida (μm)
Capacidad de la
cámara valor
mínimo y valor
máximo
(millones de
células)
Volumen de
la cámara
(mL)
Standard 5 – 50 2.5 – 5.0 107 – 109 4.2
25
El sistema de circulación de fluido está constituido por:
Una jeringa y un “By pass” específicos para la inyección de la muestra
Bomba peristáltica de velocidad variable. En el proyecto se usaron 2, la
bomba Masterflex (Cole Parmer) y la Minipuls 3 (Gilson).
Manómetro.
Una cámara para disminuir turbulencias después de la inyección
Una manguera para transportar el medio liquido de elección y la muestra.
Un reservorio para el medio liquido de elutriación.
Tubos para colectar muestra.
En la figura 3 se esquematiza el sistema de elutriación y sus partes.
Figura 3. Sistema de elutriación JE-6B. Dentro de un marco amarillo se muestra el sistema de circulación de fluido y dentro de un marco rojo se muestra el rotor. También se observan los elementos esenciales del sistema de elutriación: reservorio de buffer, bomba peristáltica, cámara de mezclado, manómetro, inyector de muestra, centrífuga y rotor. Tomado de Developing Elutriation Protocols, Technical information, Beckman Instruments Inc. 1994.
10.5.1. PROCEDIMIENTO DE ELUTRIACIÓN
En la figura 1 se presenta un esquema general del procedimiento de elutriación.
El procedimiento detallado se presenta a continuación.
26
1.- Abrir la tapa de la ultracentrífuga J2-21, colocar el rotor de elutriación y
verificar su correcta colocación.
2.- Enroscar las mangueras de entrada y salida a las conexiones hembra del
rotor y colocar el seguro.
3.- Conectar la sección de manguera de la bomba peristáltica al resto del
sistema de elutriación.
4.- Encender la bomba peristáltica y la ultracentrífuga.
a) Circular en todo el sistema de elutriación etanol al 70% durante
aproximadamente 15 min para sanitizar ó desinfectar.
b) Ajustar velocidad de centrífugación y temperatura según convenga.
Ambos incisos dependerán del tipo de experimento que se desee realizar. Ver
punto número 6. Finalidades del experimento.
5.- Realizar calibración inicial del flujo de la bomba:
a) Tomar mediciones dentro del intervalo de estudio. Por ejemplo, en el intervalo
35-44 rpm para la bomba Gilson y 0.8-1 para la bomba Masterflex se esperarían
flujos entre 22-27 mL/min y 22-31.5 mL/min respectivamente. Si no se registran
estos flujos, tomar en cuenta para corrección.
b) Una vez que los flujos reales muestran una tendencia lineal, calcular el
coeficiente de correlación (valor esperado ≥ 0.99) y obtener la ecuación de la
recta.
c) A partir de la ecuación de la recta obtener las rpm de trabajo que se usaran
durante la elutriación.
6.- Una vez obtenida la calibración inicial de la bomba, el procedimiento de
elutriación puede realizarse de manera aséptica o no, según sea la finalidad del
experimento.
Si la finalidad del experimento es realizar análisis de ciclo celular, continuar el
procedimiento de manera no aséptica y considerar lo siguiente:
a) Condiciones de uso del elutriador: 4.0°C y 2000 rpm.
b) Circular dentro del sistema etanol al 70% para eliminar residuos de otros
experimentos y para obtener la calibración inicial.
c) Circular buffer PBS no estéril para eliminar presencia de etanol y como
medio de elutriación. Contar aproximadamente con 2 L del buffer.
27
Si el experimento se lleva a cabo para colectar células sincronizadas e iniciar
cinéticas de sincronización continuar el procedimiento de manera aséptica y
considerar lo siguiente:
a) Condiciones de uso del elutriador: T.A. y 2000 rpm.
b) Circular dentro del sistema etanol al 70% para sanitizar.
c) Circular PBS estéril para obtener la calibración inicial y eliminar toda
presencia de etanol. Contar aproximadamente con 2 L del buffer estéril.
d) Encender un mechero cerca del área de trabajo. ATENCIÓN: Alejar el
contenedor de etanol y asegurarse de eliminar cualquier presencia de
esta sustancia antes de encender el mechero.
e) Circular medio de cultivo DMEM (sin SFB) como medio de elutriación para
colectar fracciones celulares. Contar aproximadamente con 1 L de medio.
7.- Rotular un par de tubos cónicos por muestra (para los controles solo se
evalúa un tubo) y colocarlos en una gradilla de la siguiente manera: 23-24
mL/min, Ctrl 1, 24-25 mL/min; Ctrl 2, 25-26 mL/min; Ctrl 3, 26-27 mL/min y Ctrl 4.
En los tubos control se colectara un minuto del fluido para pesarlo y obtener el
flujo (mL/min) real. En los tubos correspondientes a fracciones elutriadas se
colectarán 100 mL por fracción (en 2 tubos cónicos de 50 mL). Se podrá
etiquetar más tubos según los requerimientos del experimento.
8.- Circular dentro del sistema el medio de elutriación y asegurarse de eliminar
toda presencia de burbujas en el sistema.
9.- Inyectar la muestra a un flujo de 22mL/min (Véase: Preparación de muestra
para inyección). Una vez que el lote celular está dentro de la cámara del
elutriador aumentar el flujo lentamente hasta 23 mL/min y dejar pasar 2-3 min
para eliminar restos celulares (lavado). Con la finalidad de no alterar el equilibrio
del sistema aumentar una décima de rpm cada cuatro segundos durante el uso
de la bomba Minipuls 3.
10.- Posterior al lavado, comenzar a colectar fracciones en el orden indicado en
el punto 7 al mismo tiempo que se aumenta paulatinamente el flujo de 23 a 24
mL/min.
11.- Continuar colectando las demás fracciones y controles.
28
12.- Graficar los controles para corregir o corroborar flujos de bomba.
13.- Si se desea realizar análisis de ciclo celular; seguir procedimiento:
10.6 Determinación del contenido de ADN mediante citometría de flujo.
14.- Si se desea realizar cinéticas de sincronización continuar con este
procedimiento:
a) Centrífugar las fracciones colectadas a 800rpm por 10 min.
b) Decantar sobrenadante en la campana de flujo laminar.
c) Resuspender células de cada fracción en 5 mL de medio CD-Hybridoma.
d) Colocar el contenido celular de cada fracción en frascos T de 25 cm2.
e) Incubar los frascos de cultivo de 25 cm2 a 37°C, 5% de CO2 y humedad a
saturación.
f) Realizar conteo celular. Si se obtiene una concentración menor a 0.2x106
células viables/mL calcular el tiempo necesario para que se alcance esta
concentración e iniciar cinética de sincronización.
g) Los conteos celulares deberán realizarse con la frecuencia requerida,
considerando que solo se puede tomar el 5% del volumen de un frasco.
10.5.2. PREPARACIÓN DE MUESTRA PARA INYECCIÓN.
1.- Dentro de la campana de flujo laminar, pasar el volumen de los diferentes
frascos de cultivo de 175 cm2 a un solo frasco T de 175 cm2 y colocarlo
verticalmente.
2.- Colocar el volumen total en tubos de 50 mL de fondo cónico y centrifugarlos a
800 rpm durante 10 min.
3.- Eliminar el sobrenadante, juntar y resuspender todos los pellets celulares en
un volumen total de 5 mL.
4.- Verter el volumen en un recipiente estéril adecuado para poder introducirlo en
una jeringa estéril de 10 mL, tapar la punta con la aguja y su capuchón.
5.- Enroscar la jeringa en la válvula de inyección de 3 vías del elutriador,
destinada para la inyección de muestra.
29
6.- Accionar el “By pass” e inyectar lentamente el total de la muestra a un flujo
menor de 1 mL/min. Durante la inyección la muestra pasa a la cámara de
mezclado.
7.- Una vez inyectada la muestra, cerrar el ¨By pass¨ para anular la valvula de
inyección y que la muestra pase a la cámara de elutriación.
8.- Continuar con el procedimiento de elutriación, apartado 10.5.1.
En la figura 4 se presenta un esquema general del proceso de preparación de la
muestra.
Figura 4. Esquema general de preparación de muestra. Una vez que se cuenta con un cultivo celular de características adecuadas (1), es vertido en tubos cónicos (2) para su centrífugación (3). Posteriormente el botón celular es resuspendido en 5 mL (4) y colectado para su inyección (5).
10.6. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ADN MEDIANTE
CITOMETRÍA DE FLUJO.
10.6.1. FIJACIÓN CELULAR
1.- Previamente preparar suficientes tubos para citómetro con 2 mL de etanol al
70%. Colocarlos en hielo para evitar que el ADN se dañe ya que la mezcla de
etanol al 70% con el buffer de elutriación es exotérmica.
2.- Centrífugar las muestras provenientes de elutriación a 1200 rpm.
1 2 3
4 5
30
3.- Eliminar el sobrenadante de las muestras dejando aproximadamente 0.5 mL
en cada uno de los tubos que forman una fracción (2 tubos), de modo que el
volumen total por fracción será de 1 mL.
4.- Resuspender las células y verter dicho volumen en los tubos para citómetro
con etanol. Mantener los 3 mL en hielo hasta su lectura. (Nota importante: Las
células deben ser vertidas mediante goteo en el tubo con etanol, el cual se
encuentra en agitación; esto asegura que las células se dispersen y no se
agreguen durante la fijación con etanol).
10.6.2. TINCIÓN DEL ADN CON COLORANTE FLUORESCENTE
1.- Centrífugar a 1200 rpm los tubos provenientes de fijación con etanol.
2.- Decantar etanol
3.- Agregar los siguientes reactivos en el orden mencionado:
950 μL de amortiguador buffer PBS 1X
10 μL de RNAasa A 10 mg/mL
40 μL de Ioduro de propidio 1 mg/mL
4.- Incubar 30 min en obscuridad previo a la lectura.
10.6.3. LECTURA EN CITÓMETRO FACS CALIBUR (BECTON DICKINSON)
Las lecturas de contenido de ADN se llevaron a cabo en el citómetro Facs
Calibur (Becton Dickinson) el cual cuenta con el software de análisis “Cell quest”.
Las muestras se leyeron a un velocidad media de 35 µL/min. Los gráficos
mostrados fueron generados a partir del análisis de 10 000 eventos usando los
detectores FSC (dispersión de luz frontal), SSC (dispersión de luz lateral), FL2-
Area y FL2-ancho con un umbral lectura S2. Se realizó discriminación de
dobletes, tripletes y “debris” celular.
31
10.7. CONSIDERACIONES MATEMÁTICAS
10.7.1. VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CRECIMIENTO
La velocidad específica de crecimiento es una propiedad de los cultivos
celulares; dicho valor es reproducible bajo condiciones de crecimiento
específicas. La μ se calculó a través de la regresión lineal obtenida de la gráfica
de Ln (X/X0) contra tiempo. Donde X y X0 son la concentración de las células
viables al tiempo t y al inicio del cultivo, respectivamente.
dx/dt = μX (1)
Integrando:
Ln (X/X0)=μt (2)
El cálculo de la velocidad específica de crecimiento (µ) se realizó como parte de
la caracterización del sistema biológico, además de que su valor fue empleado
en los cálculos de predicción de concentración celular para los subcultivos.
10.7.2. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS DATOS
Para el análisis estadístico de las curvas de calibración, cinéticas de crecimiento
y contenido de ADN en el intervalo 24-27 mL/min se usaron los siguientes
parámetros de estadística descriptiva:
- Desviación estándar (σ) como medida de centralización o dispersión de
los datos.
- Coeficiente de variación (c.v): Su fórmula expresa la desviación estándar
como porcentaje de la media aritmética, mostrando una mejor
interpretación porcentual del grado de variabilidad que la desviación típica
o estándar. A mayor valor del coeficiente de variación mayor
32
heterogeneidad de los valores y a menor c.v mayor homogeneidad en los
valores de la variable.
- Coeficiente de correlación (r): el coeficiente de correlación lineal mide el
grado de relación entre las variables cuando dicha relación es lineal. La
correlación es tanto más fuerte cuanto más se aproxime a 1.
Para la obtención de los porcentajes de las poblaciones en las diferentes fases
del ciclo celular a partir de los resultados de contenido de ADN, se usó el modelo
matemático Dean/Jett/Fox del software de análisis FlowJo.
El software FlowJo ajusta los datos obtenidos del análisis de ciclo celular usando
el modelo pragmático de Watson o el modelo Dean-Jett-Fox. Estos modelos son
usados para definir a las poblaciones en G1, S y G2 del ciclo celular. Ambos
modelos ajustan a dichas poblaciones a una curva Gaussiana. El modelo de
Watson no hace suposiciones acerca de la distribución de la fase S si no que del
total de la población resta los datos pertenecientes a las poblaciones G1 y G2 y
posteriormente se construye una función que se adapte a los datos restantes. El
modelo de Dean/Jett/Fox ajusta la fase S a un polinomio de segundo grado.
33
11. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Para mostrar los resultados obtenidos, el presente apartado se dividió en tres
secciones:
11.1. Caracterización del sistema de elutriación.
11.2. Caracterización del sistema biológico.
11.3. Evaluación de la sincronía obtenida.
Las primeras dos secciones permitieron determinar las condiciones de trabajo
ideales para la realización de los experimentos de separación de células BCF2
en las diferentes fases del ciclo celular; la tercera sección se enfocó en
determinar la sincronía existente en las fracciones obtenidas.
11.1. CARACTERIZACIÓN DEL SISTEMA DE ELUTRIACIÓN
Para caracterizar al sistema de elutriación nos basamos en la “Ley de Stokes” la
cual describe matemáticamente el proceso de elutriación. En el Anexo I se
desarrolla el principio matemático que rige el proceso de elutriación centrifuga.
11.1.1. CARACTERIZACIÓN DEL SISTEMA DE CIRCULACIÓN DE FLUIDO
Se caracterizó el perfil de flujos de las bombas peristálticas Masterflex y Minipuls
3. Debido al tipo de control y escala “analógica” que tiene la bomba Masterflex el
error que el experimentador comete al manipular el equipo se incrementa, sin
embargo, con la ventaja de que el intervalo de operación es amplio, de 0 a 80
rpm, permitiendo flujos altos. La bomba Minipuls 3 es de fácil manipulación
debido a su control digital, el cual permite realizar cambios de incluso décimas
de rpm. La desventaja es que la bomba presenta un intervalo de operación
menor, de 0 rpm a 48 rpm.
34
La calibración de las bombas peristálticas se llevó a cabo colectando el volumen
de agua destilada bombeado en un minuto, el cual posteriormente fue pesado
para determinar el volumen exacto. Los volúmenes colectados pertenecen a
flujos en el intervalo 19-28 mL/min para la bomba Minipuls y 9-49 mL/min para la
bomba Masterflex. A continuación se muestran los perfiles de flujo obtenidos de
un triplicado experimental tanto para la bomba peristáltica Minipuls 3 (Véase
Figura 5) como para la bomba peristáltica Masterflex (Véase Figura 6). En cada
uno de ellos podemos observar una relación lineal entre el flujo de salida del
sistema de elutriación en funcionamiento (a 2000 rpm) y las RPM dadas por
cada una de las bombas peristálticas.
Figura 5. Calibración de la bomba Minipuls 3. Se muestran los valores promedio de un triplicado experimental, las barras de error (que representan la desviación estándar de cada punto), la ecuación de la recta junto con los valores de desviación estándar de la pendiente y ordenada y finalmente el coeficiente de correlación lineal.
y = 0.661(±0.0121)x - 1.53 (±0.481) r = 1
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
25 30 35 40 45 50
Flu
jo
(mL
/m
in)
RPM
35
Figura 6. Calibración de la bomba Masterflex. Se muestran los valores promedio de un triplicado experimental, las barras de error (que representan la desviación estándar de cada punto), la ecuación de la recta junto con los valores de desviación estándar de la pendiente y ordenada y finalmente el coeficiente de correlación lineal.
La ecuación de la recta para cada una de las bombas indican que para realizar
cambios de 1 mL/min se deben realizar cambios de 0.02 (en la escala) para la
bomba Masterflex y 1.51 rpm para la bomba Minipuls 3.
El coeficiente de correlación calculado indicó prácticamente nula la variabilidad
en la respuesta obtenida. También se calculó el coeficiente de variación (CV)
para los valores de pendiente y ordenada de cada una de las ecuaciones. Los
valores se muestran a continuación:
y = 48.751(±0.423)x - 16.504(±2.14) r = 0.999
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0.45 0.65 0.85 1.05 1.25 1.45
Flu
jo
(mL
/m
in)
Valor de escala
36
Tabla 4. Coeficiente de variación para las ecuaciones provenientes de las curvas de calibración. Se presentan los C.V para las pendientes y ordenadas obtenidas de un triplicado experimental.
Bomba peristáltica CV de la pendiente (%) CV de la ordenada (%)
Minipuls 3 3.3 3.4
Masterflex 3.5 12.08
El CV expresa la desviación estándar como porcentaje de la media aritmética,
mostrando una mejor interpretación porcentual del grado de variabilidad que la
desviación típica o estándar. A mayor valor del CV mayor heterogeneidad de los
valores y a menor CV, mayor homogeneidad en los valores de las pendientes y
ordenadas. Como se puede observar en la Tabla 4 la bomba Minipuls presentó
un alto grado de reproducibilidad en sus flujos mientras que la bomba Masterflex
presentó menor reproducibilidad debido a su valor de C.V= 12.08%.
11.2. CARACTERIZACIÓN DEL SISTEMA BIOLÓGICO.
El modelo biológico fue caracterizado de tres formas:
Mediante la evaluación del crecimiento de BCF2 en las condiciones de
cultivo adecuadas.
Determinación de la distribución de tamaño de una población no
sincronizada en crecimiento exponencial.
Y mediante el análisis de contenido de ADN por citometría de flujo de una
población no sincronizada.
11.2.1. EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO DEL HIBRIDOMA BCF2
Se realizaron 3 cinéticas de crecimiento en frascos de cultivo de 25 cm2 (cultivo
estático) con el objetivo de conocer el comportamiento de la línea celular con
respecto al tiempo en medio de cultivo específico para hibridoma. Para obtener
el perfil mostrado en la Figura 7, a los frascos se les tomó una muestra cada 24
h teniendo en cuenta que el volumen total extraído de cada frasco no
37
sobrepasara el 10% del volumen inicial. A cada una de las muestras se les
evaluó la concentración de células viables (Xv/mL), concentración celular total
(Xtot/mL) y viabilidad celular (%Xv). Con los datos de la concentración celular
viable se determinó la velocidad específica de crecimiento aparente (µ) y a su
vez el tiempo de duplicación celular (td). Véase Tabla 5.
Figura 7. Cinética de crecimiento de la línea celular BCF2. En esta gráfica se muestran los promedios de tres cinéticas junto con las barras de error que representan la desviación estándar de cada punto. , células viables (Xv/mL); , células totales( Xtot/mL) y , viabilidad celular (%Xv). Tabla 5. Caracterización del sistema biológico. Se muestran los valores promedio de los parámetros obtenidos a partir de tres cinéticas de crecimiento de la línea celular BCF2 * Valor a las 120 h / ** Valor a las 96 h.
Células totales (Xtot/mL)* (2.5x106 ± 0.3) cel mL-1
Viabilidad máxima (Xv max)** (90.3 ± 2.4) %
Concentración máxima (X max)** (2.1 x106 ± 0.2) cel mL-1
Velocidad especifica de crecimiento (µ) (0.033±0.001) h-1
Tiempo de duplicación 20.90 h
A partir del análisis de estos resultados se determinó el intervalo de tiempo ideal
para subcultivar, cosechar y realizar elutriaciónes con una viabilidad ≥90% lo
0
20
40
60
80
100
120
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0 50 100
Co
nce
ntr
aci
ón
ce
lula
r
(mil
lon
es
de
cé
lula
s/m
L)
Tiempo (h)
Via
bilid
ad
celu
lar (%
Xv
)
38
cual asegura que las células no han entrado en ningún proceso apoptótico. Este
intervalo corresponde a 84 h (1.5 x106 cel mL-1) – 96 h (2.1 x106 cel mL-1).
11.2.2. DETERMINACIÓN DEL DIÁMETRO CELULAR
De la ecuación derivada de la ley de Stokes (ecuación 5 del Anexo I) la única
variable a determinar para conocer el flujo de elución es el diámetro celular; de
modo que este se determinó experimentalmente usando el contador electrónico
de partículas Beckman Coulter Multisizer™ 3. Al analizar una muestra de cultivo
creciendo en fase exponencial, el equipo determina la distribución de tamaños y
lo representa mediante un histograma donde la altura de cada barra es el
número de las células con determinado diámetro (Véase Figura 8). Se determinó
que el rango de diámetros de una población no sincronizada se encuentra
mayoritariamente entre 12 y 18 micras.
Figura 8. Histograma de la distribución de diámetros del hibridoma BCF2. Se muestra un histograma obtenido al graficar número de células vs tamaño celular. Los datos fueron obtenidos en el Coulter Multisizer 3.
39
11.2.3. CÁLCULO DEL FLUJO DE ELUCIÓN EMPLEANDO LA LEY DE
STOKES SIMPLIFICADA
Sustituyendo los valores de diámetro de la población BCF2 en la ecuación
simplificada de la Ley de Stokes (ecuación 5) se determinaron los flujos a los
cuales las poblaciones con determinado valor de diámetro serían eluidas de la
cámara de elutriación (Tabla 6).
Tabla 6. Flujos de colecta teóricos obtenidos a partir de los datos del contador electrónico de partículas (Coulter Multisizer) y de la ley de Stokes.
DIAMETRO
(μm)
FLUJOS
CALCULADOS
(mL/min)
11.6 20.5
12.3 23
12.9 25.5
13.5 28
14.1 30.5
14.7 33
15.2 35.5
15.8 38
16.3 40.5
16.8 43
17.2 45.5
Como se observa en la Tabla 6, células con diámetros menores a 11.6 µm
eluyen a 20.5 mL/min de modo que flujos menores a este no permiten la salida
de alguna subpoblación celular de la cámara de separación. Lo anterior permitió
eliminar restos celulares evitando la salida de las células.
40
11.2.4. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ADN MEDIANTE
CITOMETRÍA DE FLUJO PARA UNA POBLACIÓN NO
SINCRONIZADA
Para determinar la distribución del contenido de ADN de un cultivo no
sincronizado de BCF2 en medio para hibridomas suplementado se tomó muestra
a las 0, 24, 48, 72 y 96 horas. Cada muestra fue fijada y teñida con ioduro de
propidio según el apartado 10.6. Los resultados de dicha determinación, la
distribución de tamaño relativo de la población y el aumento de la granularidad
con respecto al tiempo se muestran en la Figura 9.
Figura 9. De izquierda a derecha. Distribución de tamaño relativo, complejidad celular (medición relativa de la cantidad de organelos) y contenido de ADN de una población BCF2 no sincronizada.
41
Mediante el software FlowJo se cuantificó el porcentaje relativo de las
subpoblaciones G1, S y G2 en un cultivo no sincronizado de la línea celular
BCF2 según el modelo matemático Dean/Jett/Fox. Los resultados se muestran
en la Tabla 7. Se determinó que en todo el tiempo la distribución de ADN es
heterogénea y que la población predominante en un cultivo de BCF2 no
sincronizado desde las cero hasta las 96 horas siempre fue la población en fase
S, seguida de la población en fase G1 y finalmente la población en fase G2. Sin
embargo, cabe señalar que del análisis de contenido de ADN mostrado la Figura
9 observamos que el mayor número de células con el mismo contenido de ADN
se encuentran en fase G1, esto debido a que el ancho del pico es menor y la
altura máxima, lo cual a su vez indica una menor variación del contenido de
ADN. Por lo tanto, si se desea obtener la mayor cantidad de células con un alto
grado de sincronización, se deberá de colectar a las células en fase G1.
Tabla 7. Porcentaje de células en cada fase del ciclo celular de una cinética de crecimiento típica de BCF2 no sincronizada usando el modelo matemático Dean/Jett/Fox a partir de la determinación contenido de ADN.
Tiempo
(h)
Fase del ciclo celular
G1 (%) S (%) G2 (%)
0 24.7 57.8 16.9
24 31.3 46.4 21.8
48 31.8 42.4 26.1
72 24.6 57.8 16.2
96 23.8 53.9 18.2
A partir de los resultados de la determinación de contenido de ADN y los
resultados de determinación de tamaño, se infirió el diámetro de las poblaciones
celulares en G1 y G2. Puesto que el contenido de ADN en G2 es del doble que
en G1 y esto a su vez es directamente proporcional al tamaño de la célula; los
diámetros más chicos de la distribución (véase Figura 8) corresponderían a la
población en fase G1 y los diámetros más grandes corresponderían a la
población en fase G2.
42
11.3. EVALUACIÓN DE LA SINCRONÍA OBTENIDA POR EL MÉTODO DE
ELUTRIACIÓN CENTRÍFUGA
11.3.1. EVALUACIÓN DE CONTENIDO DE ADN DE LAS FRACCIONES
CELULARES OBTENIDAS A LOS FLUJOS DETERMINADOS POR
LA LEY DE STOKES SIMPLIFICADA
Una vez realizadas las caracterizaciones del sistema biológico y de elutriación se
llevaron a cabo diversas elutriaciones. La obtención de fracciones celulares de la
línea celular BCF2 en las diferentes fases del ciclo celular fue el objetivo. Se usó
el sistema de elutriación a 2000 rpm variando los flujos de la bomba peristáltica
Masterflex entre 10 y 50 mL/min. El medio de elutriación utilizado fue el
amortiguador isotónico PBS (330 mOsm) y la carga de células a separar fue de
107 células en 5 mL de inyección.
Se realizó un barrido del contenido de ADN de las diferentes poblaciones
presentes en un cultivo de BCF2 obtenidas a partir de los flujos determinados
previamente por la ley de Stokes, (Véase Tabla 6). La Figura 10 muestra los
resultados, donde se observa la variación del contenido de ADN para las
fracciones colectadas a los diferentes flujos, aumentando 2.5 mL/min, partiendo
de 20.5 mL/min y hasta 45.5 mL/min. En las dos primeras series de gráficos se
observó un aumento de tamaño y granularidad celular mientras que en la tercera
serie se observó la variación del contenido de ADN conforme se colectaron
fracciones a flujos cada vez más altos.
43
Figura 10. De izquierda a derecha. Distribución de tamaño relativo, complejidad celular y variación del contenido de ADN para una población fraccionada de BCF2. Fracciones obtenidas con bomba peristáltica MasterFlex.
INER
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o o .- --.~ -- -o o .- ---.~ -- -o o .- --.~ -- -o o .- --.~ -- -o o .- --.~ -- -o o Taonafto T~""" Conteroido de ADN
44
Comparando el control con las fracciones obtenidas; se identificaron las
diferentes poblaciones celulares por su contenido de ADN; de modo que entre
20.5 y 28 mL/min se logró separar una población enriquecida en G1, de 28 a
35.5 mL/min una población enriquecida en S y finalmente de 35.5 a 45.5mL/min
una población enriquecida en G2.
Se determinó que en el intervalo de flujo de 23 –27 mL/min se podría colectar de
manera particular a la población G1 con un alto grado de sincronización.
Posteriores elutriaciones se enfocaron a colectar fracciones en esta región con
poblaciones mayoritariamente en fase G1, lo cual también nos permitió evaluar
el comportamiento del sistema de elutriación en un intervalo de flujos más corto.
11.3.2. MEDICIÓN DEL CONTENIDO DE ADN EN LA REGIÓN CON MAYOR
PRESENCIA DE CÉLULAS EN FASE G1
A partir de la información obtenida de la Figura 10 se realizaron elutriaciones en
la región de 23-27mL/min; con la particularidad del uso de la bomba peristáltica
Minipuls, que es una bomba que permite hacer cambios de flujos más precisos
debido a su control digital electrónicol. Esta característica la hizo ideal para
colectar (en un intervalo de flujo más estrecho) poblaciones mayoritariamente en
fase G1. La Figura 11 muestra la evaluación por triplicado del perfil de contenido
de ADN para poblaciones eluidas a flujos dentro del intervalo 24-27mL/min. El
análisis de datos del perfil de contenido de ADN es resumido y mostrado en la
Tabla 8, en el cual se observa que las fracciones colectada a 25 mL/min y a 26
mL/min fueron las fracciones con mayor porcentaje de células en fase G1,
79.4±3.3% y 78.4±6.3% respectivamente.
45
Elutriación 1
Control G1= 34.8%; S=56.9%; G2=7.84%
Fracción 24 mL/min G1= 75.2%; S=18.1%; G2= 2.73%
Fracción 25 mL/min G1= 82.5%; S= 10.6%; G2=4.39%
Fracción 26 mL/min G1= 85.7%; S= 9.12%; G2= 4.14%
Fracción 27 mL/min G1= 58.6%; S=28.0%; G2=11.2%
Núm
ero
de c
élu
las
Unidades relativas de fluorescencia
Núm
ero
de c
élu
las
Unidades relativas de fluorescencia
Núm
ero
de c
élu
las
Núm
ero
de c
élu
las
Núm
ero
de c
élu
las
Unidades relativas de fluorescencia Unidades relativas de fluorescencia
Unidades relativas de fluorescencia
46
Elutriación 2
Control
G1= 33.7%; S=55.5%; G2= 9.29%
Fracción 24 mL/min
G1=69.1%; S= 28.9%; G2= 3.1%
Fracción 25 mL/min
G1= 79.9%; S=10.9%; G2= 6.9%
Fracción 26 mL/min
G1= 74.1%; S= 12.2%; G2= 12.6% Fracción 27 mL/min
G1=58.9%; S=29.2%; G2=10.6%
Núm
ero
de c
élu
las
Núm
ero
de c
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las
Núm
ero
de c
élu
las
Núm
ero
de c
élu
las
Núm
ero
de c
élu
las
47
Figura 8. Análisis de contenido de ADN para Elutriacion 1, Elutriacion 2 y Elutriacion 3, a flujos
24, 25, 26 y 27 mL/min. Este análisis se llevó a cabo mediante el uso del Software
Figura 8. Análisis de contenido de ADN para Elutriacion 1, Elutriacion 2 y Elutriacion 3,
a
Elutriación 3
Control
G1= 28.3%; S=38.6%; G2=22.4%
6%
Fracción 24mL/min
G1= 52.0%; S = 32.5%; G2 = 9.34% Fracción 25mL/min
G1= 75.9%; S = 13.9%; G2 = 8.55%
Fracción 26mL/min
G1= 59.6%; S = 26.1%; G2 = 10.3%
Fracción 27 mL/min
G1= 50.6 %; S= 47.4%; G2= 6%
Núm
ero
de c
élu
las
Núm
ero
de c
élu
las
Núm
ero
de c
élu
las
Núm
ero
de c
élu
las
Núm
ero
de c
élu
las
48
Figura 11. Análisis de contenido de ADN para las elutriaciónes 1, 2 y 3, a flujos de 24, 25, 26 y 27 mL/min. Dicho análisis se llevó a cabo mediante el Software para Citometría de flujo Flow Jo, donde los porcentajes de contenido de ADN fueron calculados utilizando el modelo Dean/Jett/Fox. URF, Unidades relativas de fluoresencia.
Tabla 8. Evaluación del contenido de ADN para las fracciones obtenidas en el intervalo 24-27mL/min. En esta tabla se muestran los promedios ± la desviación standard de los porcentajes de contenido de ADN del triplicado experimental, el diámetro y el flujo al cual la población fue colectada. Datos obtenidos con la bomba peristáltica Minipuls.
Como se muestra en la Tabla 8, a flujos de 25 mL/min y 26 mL/min se obtuvo
una población predominante en fase G1, las cuales contaron con
aproximadamente el 80% de las células en dicha fase, a diferencia de los
controles de este mismo cuadro y los valores obtenidos en la Tabla 7, donde se
observa que el contenido de ADN de una población no sincronizada se
encuentra principalmente en fase S. Lo anterior demuestra la capacidad que el
sistema posee para obtener fracciones sincronizadas en fase G1. Cabe señalar
que la Tabla 8 también muestra que a pesar de trabajar en el intervalo de alta
pureza (24-27 mL/min), existe presencia de poblaciones en fase S y en fase G2.
Esto puede ser explicado por:
- La existencia de perturbaciones en el equilibrio del sistema de elutriación.
- Generación de dobletes (agregado de dos células) durante el proceso
detección en el citómetro.
- La poliploidia -común en hibridomas- generaría que células del mismo
tamaño no posean el mismo contenido de ADN, esto generaría que
células con el diámetro de la población en G1 posean el contenido de
ADN propio de la población en G2.
DIAMETRO (μm)
12.6 12.9 13.1 13.36 Control
FLUJO
(mL/min) 24 25 26 27 --
G1 65.4±12% 79.4±3.3% 78.4±6.3% 56.0±0.5% 32.3±3.5%
S 26.5±7.5% 11.8±1.8% 15.4±8.3% 34.9±1.6% 50.3±10.2%
G2 5.1±3.7% 6.6±2.1% 6±5.9% 9.3±0.5% 13.2±8.0%
49
11.3.3. CINÉTICAS DE CRECIMIENTO DE CÉLULAS SINCRONIZADAS, EN
FRASCOS DE CULTIVO DE 25 cm2
Las cinéticas de sincronización se realizaron con el objetivo de determinar de
forma directa (diferente al contenido de ADN) la sincronía en las fracciones
colectadas por parte del método de elutriación centrífuga. Para llevar a cabo las
cinéticas de sincronización se cosecharon células en crecimiento exponencial
con una viabilidad ≥ 90%; como medio de elutriación se usó medio DMEM del
cual se colectaron de forma aséptica 50 mL de la fracción a 25 mL/min, dicho
volumen fue centrífugado, posteriormente se resuspendió el pellet celular en un
frasco T de 25 cm2 con 5 mL de medio para hibridomas y se colocó en
incubación. La utilización del medio DMEM (medio rico en aminoácidos,
vitaminas y sales minerales necesarias para el cultivo de hibridomas) como
medio de elutriación evita un cambio drástico en el ambiente que podría alterar
la viabilidad y el metabolismo celular, además de promover el arresto celular
transitorio (sin comprometer la viabilidad) en G0/G1 al no estar suplementado
con SFB. La figura 12 muestra un triplicado de cinéticas de sincronización. La
obtención de cada punto en los gráficos representa un conteo celular, el cual se
llevó a cabo cada 3 horas en la mayoría de los casos. Dichas cinéticas
mostraron el esperado perfil escalonado que representa el momento en que
ocurre la mitosis; duplicándose así la concentración celular.
50
Figura 12. Cinéticas de crecimiento de células sincronizadas A), B) y C). En las tres cinéticas se puede observar el perfil escalonado propio de un cultivo sincronizado. ● Células viables (Xv/mL), ● Viabilidad celular (%Xv).
A
B
C
51
La comparación de estos perfiles escalonados con el típico crecimiento
exponencial de la línea celular BCF2 mostrado en la Figura 7 ratifica la sincronía
de la fracción colectada a 25 mL/min.
INER
52
12. CONCLUSIONES
• La elutriación centrífuga es un método que permitió separar al hibridoma
murino BCF2 en las diferentes fases del ciclo celular.
• Se aisló a la subpoblación G1 de la línea celular BCF2 de manera
sincronizada.
• A 25 mL/min y 26 mL/min se logró obtener una subpoblación enriquecida
con el 79.4±3.3% y 78.4±6.3% respectivamente de células en fase G1.
• Se operó el sistema de elutriación centrífuga en condiciones asépticas.
• Se logró cultivar las fracciones colectadas a 25mL/min provenientes de
elutriaciónes asépticas y observar un crecimiento sincrónico (perfil
escalonado).
53
13. PERSPECTIVAS
Incrementar la concentración celular de los cultivos a elutriar y evaluar el
rendimiento de células viables en fase G1.
Mejoramiento del sistema de elutriación mediante la incorporación de una
bomba libre de pulsaciones.
Análisis de los principales parámetros cinéticos del crecimiento y
metabolismo del hibrdoma BCF2 sincronizado en las diferentes fases del
ciclo celular.
54
14. ANEXO I
14.1. PRINCIPIOS MATEMÁTICO DE LA ELUTRIACIÓN
CENTRÍFUGA
La ley de Stokes es el principio matemático que define la fuerza de arrastre (F)
necesaria para mover una esfera pequeña a través de un fluido continuo a cierta
velocidad (Vs) basándose en el radio (r) de la esfera y en la viscosidad del fluido
(μ) (Banfalvi, 2008).
(1)
De la ley de Stokes se deduce la ecuación para el cálculo de la velocidad de
sedimentación de una partícula esférica en un campo de fuerza centrífuga.
(2)
Donde SV es la velocidad de sedimentación, (r) es la posición radial, (d) es el
diámetro de la partícula, (ρp) es la densidad de la partícula, (ρm) es la densidad
del fluido, (η) es la viscosidad del fluido y (ω) es la velocidad angular.
La ley de Stokes fue diseñada para partículas esféricas sólidas, sin embargo, se
puede usar para células tomando en cuenta las siguientes consideraciones para
el sistema:
- Se asume forma esférica.
- Se asume que no hay interacción entre células.
- Se asume flujo laminar.
55
- Densidad celular y tamaño constante durante el estado de suspensión
dentro de la cámara.
De la ecuación 2 se observa que la velocidad de sedimentación SV es afectada
de manera directamente proporcional por el tamaño y la densidad de las células;
pero debido a que las subpoblaciones celulares no varían mucho en el valor de
su densidad y a que el diámetro esta elevado a la segunda potencia; la
separación por elutriación centrífuga se lleva acabo principalmente por las
diferencias de tamaño entre subpoblaciones, es decir, que el tamaño define la
posición radial dentro de la cámara.
En el procedimiento de elutriación la fuerza centrífuga y las demás propiedades
que producen la sedimentación celular (Vs) en una posición radial son
equilibradas por el flujo y la velocidad del fluido (V) en sentido contrario.
De modo que se puede incorporar a la ecuación (2) la velocidad de flujo (m/s)
que equivale al flujo F (mL/min) dividido entre el área de la sección transversal
(A) de la cámara de separación en el punto de estudio.
(3)
La velocidad del fluido (V) en una tubería es también descrita por V1 A1 = V2 A2
que nos habla del cambio de la velocidad cuando cambia el diámetro de la
tubería, esto es importante por que nuestra cámara de separación tiene una
forma cónica de modo que cambia el área de la sección transversal.
De esta forma se generan dos tipos de gradientes dentro de la cámara: uno es el
gradiente de velocidad del fluido, disminuyendo de la entrada de la cámara hacia
la frontera de elutriación (Efecto Venturi), véase Figura A1, y un gradiente de
56
fuerza centrífuga incrementando de la frontera de elutriación hacia la entrada de
la cámara.
Figura A1. Diagrama de la cámara de elutriación. Tomado de Barford, 1986. Para que una población celular se mueva de la entrada de la cámara de elutriación a la frontera de elutriación es necesario aumentar el flujo en sentido contrario a la fuerza centrífuga. El aumento de flujo coloca paulatinamente a la población de interés en regiones de fuerza centrífuga menor hasta llegar a la frontera de elutriación donde la población es expulsada de la cámara.
De modo que en donde la fuerza centrífuga es menor (frontera de elutriación) la
velocidad de flujo (V) es menor y el área de la cámara es mayor.
Y en donde la fuerza centrífuga es mayor (entrada de la cámara) también lo es la
velocidad de flujo pero con una área de menor tamaño.
Por lo tanto las separaciones son el resultado de diferentes velocidades de
sedimentación que están en equilibrio en diferentes posiciones radiales dentro
de la cámara.
Cuando la velocidad de flujo se incrementa, las células que se encontraban en
equilibrio cerca de la frontera de la cámara de elutriación (de menor tamaño) son
expulsadas, mientras que las células que aun están dentro se recorren hacia el
centro de rotación siendo la población de mayor tamaño la última en ser
expulsada. Si la ecuación (3) se despeja para F obtenemos la ecuación 4.
(4)
Fuerza centrífuga
Flujo
Frontera de elutriación
57
Considerando r como el radio de la frontera de elutriación (86 mm para una
cámara de elutriación estándar), la conversión de ω a rpm, asumiendo que la
diferencia entre la densidad de la partícula y la densidad del medio es de ρp- ρm
=0.05g/mL y que la viscosidad del medio de elutriación es de η=1.002 mPa/s
obtenemos una constante X para nuestro sistema en específico; que tiene un
valor de 0.0378. Al considerar este valor en la ecuación (5) se determina el flujo
(mL/min) necesario para que una población de determinado diámetro sea
expulsada de la cámara de elutriación.
(5)
58
15. REFERENCIAS
Al-Rubeai, M. and A. N. Emery (1990). "Mechanisms and kinetics of monoclonal
antibody synthesis and secretion in synchronous and asynchronous hybridoma
cell cultures." Journal of biotechnology 16(1-2): 67-85.
Bi, J. X., J. Shuttleworth, et al. (2004). "Uncoupling of cell growth and proliferation
results in enhancement of productivity in p21CIP1-arrested CHO cells."
Biotechnology and Bioengineering 85(7): 741-749.
Bachère E, D. Chagot, H. Grizel. (1988). "Separation of Crassostrea gigas hemocytes
by density gradient centrífugation and counterflow centrífugal elutriation."
Developmental and Comparative Immunology. 12(3):549-59.
Banfalvi, G. (2008). "Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrífugal
elutriation." Nature protocols 3(4): 663-673.
Barford, J. P. (1986). "A mathematical model for cell separation technique of centrífugal
elutriation." Biotechnology and bioengineering 28(4): 570-577.
Bauer, J. (1999). "Advances in cell separation: recent developments in counterflow
centrífugal elutriation and continuous flow cell separation." Journal of
Chromatography 722: 55–69.
Bianchi, V., S. Borella, et al. (1997). "Cell cycle-dependent metabolism of pyrimidine
deoxynucleoside triphosphates in CEM cells." The journal of biological chemistry
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