Post on 02-Oct-2018
Universidad de Colima
Facultad de Medicina
Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas
EFECTOS FARMACOLOGICOS Y TOXICOLOGICOS DE EXTRACTOS HIDRO-ALCOHOLICOS DE ZOAPATLE (Montanoa tomentosa) EN RATA.
BIODISPONIBILIDAD DESPUES DE ADMINISTRACIÓN INTRAVAGINAL.
TESIS Que para obtener el grado de
Maestría en Ciencias Fisiológicas con especialidad en Farmacología
presenta
Q.F.B. NORMA ANGELICA MOY LOPEZ
ASESORA
D. en C. LISBETH ENITH GOMEZ MARTINEZ.
COLIMA, COL., MAYO DE 1998.
LA FASE EXPERIMENTAL DE ESTE TRABAJO DE TESIS FUE REALIZADA EN EL CENTRO DE INVESTIGACIONES EN REPRODUCCIÓN ANIMAL (CIRA), CINVESTAV-IPN-UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE TLAXCALA. LA FASE ANALÍTICA SE REALIZO EN EL LABORATORIO DE QUÍMICA AVANZADA DEL CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS BIOLÓGICAS (CICB) DE LA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE TLAXCALA. LOS RESULTADOS OBTENIDOS DURANTE EL DESARROLLO EXPERIMENTAL DE ESTA INVESTIGACIÓN HAN SIDO PRESENTADOS EN CONGRESOS CIENTÍFICOSY SEMINARIOS DE INVESTIGACIÓN, LOS CUALES SE ENUMERAN A CONTINUACIÓN:
CONGRESOS: 1997 Asociación Mexicana de Farmacología. XX Congreso Nacional de
Farmacología. Oaxaca, Oax. 1997 Sociedad Mexicana de Ciencias Fisiológicas. XL Congreso Nacional de
Ciencias Fisiológicas. Morelia, Mich,
TRABAJOS PRESENTADOS EN CONGRESOS E INSTITUCIONES 1997 Moy, N.A. “Efectos farmacológicos de algunos productos naturales a nivel
de reproducción”. Memorias de Seminarios de Investigación del CICB, UAT. Ixtacuixtla, Tlaxcala.
1997 Moy, N.A., Gómez, L.E. y Angulo, L. “Efectos de extractos hidro-alcohó-licos de zoapatle (Montanoa tomentosa) en ratas en diferentes etapas de gestación”. Memorias del XX Congreso Nacional de Farmacología. Asociación Mexicana de Farmacología. Oaxaca, Oax.
1997 Moy, N.A. “Efecto de extractos hidro-alcohólicos de zoapatle (Montanoa tomentosa) sobre diferentes etapas de la gestación”. Memorias de Seminarios de Investigación del CICB, UAT. Ixtacuixtla, Tlaxcala.
1997 Moy-López, N., (avalado por Cueva-Rolón, R.) Gómez-Martínez, L. y Angulo, L.A. “Efectos anovulatorio y luteolítico de extractos de zoapatle (Montanoa tomentosa) en ratas”. XL Congreso Nacional de Ciencias Fisiológicas. Sociedad Mexicana de Ciencias Fisiológicas. Morelia, Mich.
RESUMEN
EFECTOS FARMACOLÓGICOS Y TOXICOLÓGICOS D E EXTRACTOS HIDRO- ALCOHÓLICOS DE ZOAPATLE(Montanoa Tomentosa)EN RATAS EN DIFERENTES ESTADOS REPRODUCTIVOS
Los extractos de zoapatle (EZ) son usados en la medicina tradicional mexicana para el tratamiento de diferentes padecimientos reproductivos. Se usan con fines abortivos, anti- implantorios, control de natalidad, inductor del sangrado menstrual y oxitócico. La actividad oxitócica ha sido objeto de la mayoría de los estudios sobre esta planta. Sin embargo, este efecto presenta diferencias inter- especies, lo que genera mucha controversia en la literatura. Además del efecto oxitócico, el zoapatle tiene un efecto luteolítico que ha sido poco estudiado. Al respecto solo existen dos estudios en humanos que presentan resultados contradictorios.
Con respecto a la toxicidad de estos extractos, se ha determinado que carecen de efectos toxicológicos. Para algunos autores, el uso indiscriminado de estos extractos puede producir graves accidentes en la madre y mortalidad fetal. A pesar de estas consideraciones, no existen estudios sistemáticos sobre toxicidad del EHAZ en diferentes etapas reproductivas (ciclo reproductivo normal, gestación y pseudo gestación).
La disposición de un xenobiótico tanto en madre como en feto puede ser determinante .de toxicidad. En la gestación .se producen cambios fisiológicos que pueden alterar la absorción, distribución, enlace a proteínas, biotransformación y excreción de una sustancia. igualmente el feto va cambiando sus patrones de disposición de acuerdo al grado de desarrollo, en consecuencia, cuando se administra un xenobiótico durante la gestación es necesario consi derar que los efectos no solo son
dependientes de dosis, sino también del período en que se administra.
Dado el amplio uso de zoapatle, el objetivo de este trabajo fue el de evaluar sistemáticamente los efectos de extractos hidro-alcohólicos de zoapatle (EHAZ administrados por vía intravaginal a ratas en diferentes estados reproductivos y determinar la toxicidad de diferentes dosis del extracto en diferentes etapas de la gestación.
La recolección de la planta y la preparación de los extractos se realizaron tanto en época de floración como de no floración. El extracto hidro- etanólico se preparó por maceración (10 g de peso seco de la hoja en 100 ml de una mezcla alcohol: agua 70:30).
Se utilizaron ratas Wistar hembras de 200 a 300 g de peso. Los animales fueron mantenidos en ciclo luz-obscuridad normal 14: 10 h, con agua y alimentación ad libitum, Sólo se utilizaron ratas que presentaran tres ciclos estrales consecutivos de 4 ó 5 días de duración. También se emplearon ratas Wistar hembras prepúberes de 27 días de edad.
Se emplearon diferentes protocolos experimentales para evaluar los efectos del EHAZ en: 1. E/ ciclo estral normal de la rata. 2. El desarrollo folicular. 3. La ovulación inducida en ratas prépuberes. 4. La pseudo gestación y 5. La gestación.
El ciclo estral de las ratas tratadas con los EHAZ presentó un acortamiento dependiente del día del ciclo estral en que se inicie el
tratamiento, el cual fue siempre seguido de proestro y estro persistente.
También se observó acortamiento del ciclo en los animales tratados para observar el desarrollo folicular, presentándose una mayor proporción de folículos maduros y menor cantidad de cuerpos lúteos. La etapa del metaestro, es donde el cuerpo lúteo empieza a ser funcional, secreta progesterona solamente en esta etapa, declinando la concentración de progesterona al día siguiente, por lo tanto, dicho efecto podría ser debido a la inducción de luteólisis por el EHAZ.
En los animales tratados en los que se indujo la ovulación se encontró una disminución significativa (P<0.05, prueba t-student) en el numero de cuerpos lúteos y un aumento significativo en los folículos maduros dependiente de dosis. Se ha establecido que en ratas cíclicas de 4 días la secreción de P en el diestro aumenta la retroalimentación negativa del estradiol sobre la secreción de LH y cuando los niveles de P caen, aumentan los de E y LH facilitando la ovulación. Por lo tanto, el efecto de los EHAZ de inhibición de la ovulación, podría ser comparado con el que producen los fármacos antiprogestágenos.
La pseudo gestación fue interrumpida por el tratamiento con el EHAZ. Nuestros resultados indican que ta administración del EHAZ produce interrupción de la psg dependiente de dosis, lo cual nos habla de una involución del cuerpo lúteo (luteólisis), indicando que el modelo de psg en la rata es adecuado para demostrar el efecto Meolítico de los EHAZ.
El efecto de los extractos de zoapatle sobre la gestación (G) es dependiente de la’ etapa de la gestación en la cual se inicie el tratamiento. En animales tratados del día 1-21 de G se observó una
disminución significativa en la ganancia de peso de la madre entre los días 6 y 14 con respecto al control (Prueba de Duncan P<0.05). En los animales tratados del 14 al 21, la ganancia de peso fue significativamente superior al control y fue dependiente de dosis. La administración de los EHAZ durante este período produce mortalidad fetal y morbilidad materna dependiente de dosis. Con la dosis de 25 mg se presentó un 20% de mortalidad fetal, 20% de mortalidad y 60% de morbilidad materna. Las ratas tratadas con la dosis de 50 mg presentaron hemorragias al día 19 de gestación, dando como resultado un 100% de mortalidad fetal y materna.
Al administrarse los EHAZ en la última etapa del embarazo, los efectos toxicológicos en los fetos pueden ser producidos Por una fuerte vasoconstricción, lo cual disminuye el aporte sanguíneo y de nutrientes, generando isquemia, la cual podría ser la causa de la muerte fetal. En el caso de la madre, el estado de descomposición de los productos podría haberle generado una septisemia ó al no haber la señal embrionaria para que se desencadene el proceso de parto, las ratas presentan retardo y dilatación cervical inadecuada con la consecuente mortalidad. La muerte fetal que se presentó en nuestros resultados también podría ser explicada por un potente efecto oxitócico, y este podría dar lugar a una fuerte contracción uterina y por lo tanto promover la asfixia fetal con la consecuente mortalidad fetal.
Nuestros resultados muestran que el zoapatle tiene un efecto anovulatorio y confirman el efecto luteolítico, así como la toxicidad del extracto al ser administrado en diferentes etapas de la gestación.
INDICE GENERAL CONTENIDO
PAGINA
CAPITULO I: INTRODUCCIÓN 1
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN. 2
2. OBJETIVOS. 4
3. ANTECEDENTES Y MARCO TEÓRICO. 5
3.1. INVESTIGAClÓN FARMACOLÓGICA DE UNA PLANTA. 5
3.2. ZOAPATLE (Montanoa tomentosa). 8
3.2.1. CONSIDERACIONES BOTANICAS. 8
3.2.2. ANTECEDENTES FARMACOLOGICOS. 9
3.2.3. PRINCIPIOS ACTIVOS DEL ZOAPATLE. 11
32.4. EFECTOS FARMACOLOGICOS DEL ZOAPATLE. 13
3.3. FISIOLOGÍA REPRODUCTIVA. 16
3.3.1. INTRODUCCIÓN. 16
3.3.2. CICLO REPRODUCTIVO DE LA MUJER. 17
3.3.3. CICLO ESTRAL DE LA RATA. 21
3.3.3.1. CICLOS ESTRALES DE 4 Y 5 DÍAS DE DURACIÓN, 22
3.3.4. HORMONAS EN EL CICLO REPRODUCTIVO, 24
3.3.5. CUERPO LÚTEO Y LUTEÓLISIS. 26
3.3.6. GESTAClÓN. 28
3.3.6.1. FISIOLOGÍA DE LA GESTACIÓN. 28
3.3.6.2. HOMEOSTASIS EN LA GESTAClÓN. 29
3.3.6.3. CAMBIOS EN EL SISTEMA RESPIRATORIO. 29
3.3.6.4. IMPORTANCIA DE LA OXITOCINA EN LA
GESTAClÓN
30
3.3.6.5. ADMINISTRAClÓN DE XENOBlÓTlCOS EN LA
GESTACIÓN.
30
3.3.7. PSEUDOGESTACIÓN.
31
CAPITULO II : METODOLOGÍA 33
1. SUJETOS EXPERIMENTALES. 34
2 . EXTRACTO DE ZOAPATLE (Montanoa tomentosa). 34
2.1. OBTENCIÓN DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DE
ZOAPATLE (EHAZ).
34
CONTENIDO
PAGINA
3. MATERIAL Y SOLVENTES. 35
3.1. SOLVENTES. 35
3.2. REACTIVOS. 35
3.3. EQUIPO. 35
4. PROTOCOLOS EXPERIMENTALES. 35
4.1. EFECTOS DE LOS EHAZ SOBRE DIFERENTES ETAPAS DE LA
GESTACIÓN.
35
4.2. EFECTOS DEL EHAZ SOBRE EL CICLO ESTRAL DE IA RATA. 36
4.3. DESARROLLO FOLlCULAR. 36
4.4. INDUCCIÓN DE LA OVULACIÓN. 36
4.5. EFECTOS DEL EHAZ EN RATAS EN PSEUDOGESTAClÓN. 37
4.6. ANALISIS ESTADISTlCO. 37
CAPÍTULO III: RESULTADOS
38
1. EFECTOS DEL ZOAPATLE EN DIFERENTES ETAPAS DE GESTACIÓN. 39
1.1. EFECTOS DEL EHAZ SOBRE PARAMETROS MATERNO-FETALES. 39
1.1.1, Administración del EHAZ del día l-21. 39
1.1.2. Administración del EHAZ del día 7-21, 39
1.1.3. Administración del EHAZ del día 14-21. 39
1.1.4. Efecto del EHAZ sobre hipófisis, ovario y glándulas adrenales. 41
1.1.5. El EHAZ produce resorciones y cambios en el tamaño y peso
de los fetos.
41
1.2. EFECTOS TOXlCOLOGlCOS DE DIFERENTES DOSIS DEL EHAZ
EN DIFERENTES ETAPAS DE LA GESTACIÓN.
42
2. EFECTOS DEL EHAZ SOBRE EL CICLO ESTRAL DE LA RATA. 43
3. EFECTOS DEL EHAZ EN EL DESARROLLO FOLICULAR. 43
4. EFECTO DE DIFERENTES DOSIS DEL EHAZ DESPUÉS DE
ADMINISTRACIÓN A RATAS PREPÚBERES CON INDUCCIÓN
DE LA OVULAClÓN.
45
5. EFECTOS DEL EHAZ RATAS EN PSEUDOGESTACION. 45
CONTENIDO
PAGINA
CAPITULO IV: DlSCUSlÓN 50
1. EFECTOS FARMACOLÓGICOS Y TOXlCOLÓGlCOS DEL ZOAPATLE
EN LA GESTACIÓN.
52
1.1. Efecto anti-implantatorio. 52
1.2. Efecto del EHAZ en diferentes etapas de gestación. 53
2. EFECTO LUTEOLITICO. 55
3. EFECTO DEL EHAZ EN RATAS PREPÚBERES A LAS QUE SE HA
INDUCIDO OWLACIÓN.
57
4. VIABILIDAD DE LA VÍA INTRAVAGINAL PARA LA ADMINISTRACI6N
DEL EHAZ.
58
CAPÍTULO V: CONCLUSIONES
60
BIBLIOGRAFIA
62
INDICE DE CUADROS.
NÚMERO CONTENIDO
PAGINA
1 Consideraciones botánicas del zoapatle: Montanoa tomentosa, subs. tomentosa.
8
2 Primeras aportaciones científicas en el estudio del zoapatle. 10 3 Contenido de Ácido grandiflorénico (AG) en extractos de
Montanoa tomentosa.
11 4 Ciclos y fases del ciclo reproductivo de la mujer. 17-19 5 Duración del ciclo reproductivo y sus etapas folicular y luteal en
diferentes mamíferos estrales
20 6 Características fisiol6gicas, morfológicas y citológicas del ciclo estral de
la rata.
21 7 Pérdida de fetos post-implantación con la administraci6n del EHAZ en
diferentes periodos de gestación.
42 8 Datos de mortalidad y morbilidad fetal y materna cuando se
administra el EHAZ en diferentes etapas de gestación.
43
INDICE DE FIGURAS
NÚMERO CONTENIDO PAGINA
1 Interrelación de productos metabólicos primarios y secundarios. 6 2 zoapatle (Montanoa tomentosa, Subs. tomentosa). 9 3 Algunos de Los compuestos aislados de Montanoa tomentosa y
especies afines.
12 4 Diferentes etapas del ciclo ovárico de la rata: desarrollo folicular,
ovulación, formación y regresión del cuerpo lúteo.
19 5 Ciclo uterino b menstrual humano. 20 6 Tipos de células que aparecen en el exudado vaginal de rata
durante las diferentes etapas del ciclo estral.
22 7 Cambios cíclicos observados en la concentración de hormonas
durante el ciclo reproductor de la mujer.
26 8 Efecto del EHAZ sobre la ganancia de peso de las ratas gestantes, 40 9 Efectos del EHAZ sobre la implantación y tamaño de los fetos más
cercanos a la vagina
41 10 Efectos de la administración i.vag. del EHAZ en diferentes etapas
del ciclo estral.
44 11 Efectos del EHAZ (25 mg de peso seco de la hoja de zoapatle) ,
sobre el desarrollo folicular en ratas con ciclo estral normal, cuando la administración (vía i.vag.) inicia en la etapa de metaestro
46
12 Efectos del EHAZ (50 mg de peso seco de la hoja de zoapatle) sobre el desarrollo folicular en ratas con ciclo estral normal, cuando la administración (vía i.vag.) inicia en la etapa de metaestro.
47
13 Efecto anovulatorio de los EHAZ (administración vía subcutánea) en ratas prepúberes a las cuales se les indujo la ovulación con la administración de gonadotropinas coriónicas equina y humana.
48
14 Interrupción de la pseudogestación producida por la administración i.vag. de diferentes dosis del EHAZ.
49
CAPITULO 1
INTRODUCCIÓN
2
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN.
En la medicina tradicional mexicana, existen gran variedad de plantas de gran
utilidad en el tratamiento de diferentes padecimientos de la mujer, en aspectos
relacionados con el sistema reproductivo. Los agentes reguladores de la fertilidad
obtenidos de plantas utilizadas por los indígenas, han sido de gran beneficio tanto para
nuestros antepasados, como para aquellas comunidades alejadas de la civilización, en
donde el acceso a fármacos anticonceptivos esta fuera de sus posibilidades
(Goonasekera y cols., 1995). Es igualmente reconocido el uso de plantas medicinales
como abortivos, inductores del parto y del sangrado menstrual.
Desde hace más de 400 años, los extractos de zoapatle (EZ) han sido utilizados
en la medicina tradicional por sus propiedades interceptivas* y como agente oxitócico
(Ponce-Monter y cols., 1983).
Aunque se han realizado un gran número de investigaciones sobre la actividad
farmacológica de los EZ, en muchos casos la información resulta contradictoria, ya que
se ha comprobado que el tipo de extracto, tiempo de recolección de la planta, especies y
estado hormonal, son algunas de las variables que condicionan los efectos de esta
planta a nivel reproductivo.
La actividad oxitócica ha sido objelo de la mayoría de los estudios realizados
sobre esta planta. El efecto uterotónico del zoapatle ha sido comprobado en cobayos
(Waller y cols., 1987), pero se han observado efectos útero-relajantes en ratas, conejos y
humanos (Losoya y cols., 1983).
Aunque se ha sugerido en algunos estudios, el efecto luteolítico no ha sido
sistemáticamente estudiado. Dos estudios realizados en humanos muestran resultados
contradictorios (Gallegos y cols., 1977; Landgren y cols., 1979).
*Término utilizado para describir agentes abortifacientes, inductores del sangrado menstrual, anticonceptivos, útero-evacuantes y antiímpantatorios (Phillipson, 1979).
3
Recientemente Ortiz y cols., (1995) administraron un extracto hidro-alcohólico de
zoapatle (EHAZ) a vacas con retención del loquios postparto e infección uterina. Esto es
un problema muy común en la ganadería de nuestro país. La administración intrauterina
del EHAZ produjo involución uterina y recuperación del cuadro infeccioso.
Adicionalmente, encontró que las vacas tratadas con zoapatle entran en “calor“ corto
tiempo después del tratamiento, lo cual es ventajoso para la inseminación artificial, ya
que es posible sincronizarlas sin necesidad del uso de prostaglandina (PGF 2α y
antibióticos y en menor tiempo después del parto. El examen clínico de estos animales
reveló que el zoapatle produce involución del cuerpo lúteo, lo cual sugiere que el efecto
de sincronización puede ser debido a luteólísis.
Considerando que en rata existen muchos reportes contradictorios sobre los
efectos de zoapatle y no se ha comprobado en forma fehaciente el efecto luteolítico del
mismo, el propósito de este trabajo fue el de estudiar sistemáticamente los efectos del
EHAZ en diferentes estados reproductivos.
Con respecto a la toxicidad de los EZ, también existe controversia en la literatura.
Aunque se ha promulgado carencia de toxicidad (Landgren y cols., 1979; Gallegos y
cols., 1983; Southam y cols., 1983), algunos autores también consideran que el uso
indiscriminado de esta planta puede producir graves accidentes a la madre y mortalidad
infantil (Nieto, 1953; Cervantes, 1790). A pesar de estas consideraciones, no existen
estudios sistemáticos sobre la toxicidad del EZ en diferentes etapas de la gestación.
Cuando se administra un xenobiótico al organismo durante la gestación es
necesario considerar que los efectos no sólo son dependientes de dosis, sino también
del período en que se administra. Igualmente, la disposición de un xenobíótico tanto en
madre como en feto puede ser determinante de toxicidad, ya que en la gestación se
producen cambios fisiológicos que pueden alterar la absorción, distribución, enlace a
proteínas, biotransformación y excreción de esa sustancia.
Por lo tanto, considerando el amplio uso del zoapatle en la medicina tradicional,
es importante evaluar el efecto toxicológico del EHAZ en las diferentes etapas de la
gestación, lo cual es el segundo propósito de este trabajo..
4
2. OBJETIVOS 2.1. Evaluar en forma sistemática los efectos de Extractos Hidro-alcohólicos de
Zoapatle (EHAZ) en ratas en diferentes estados reproductivos:
a). Ciclo estral normal.
b). Embarazo.
c). Pseudoembarazo.
2.2. Determinar si la administración intravaginal (i.vag.) de los EHAZ produce efectos
sistémicos.
2.3. Determinar la toxicidad de diferentes dosis del EHAZ en diferentes etapas de la
gestación.
5
3. ANTECEDENTES Y MARCO TEÓRICO.
3.1. INVESTIGACIÓN FARMACOLÓGICA DE UNA PLANTA.
La vida del hombre está íntimamente unida a su medio ambiente, en particular a
las plantas, ya que de ellas obtiene compuestos químicos necesarios para sus funciones
vitales, materiales que le protegen de las adversidades del medio y que hacen su
estancia en el planeta más recomfortable.
Todos los pueblos primitivos han adquirido información sobre las propiedades
medicinales de un gran número de plantas propias de su medio ambiente. Estos
conocimientos, generalmente los han acumulado determinados individuos, sacerdotes,
hechiceros, curanderos, etc., quienes los han transmitido de generación en generación, a
determinados aprendices y a sus descendientes (Domínguez, 1988).
No todos los componentes químicos elaborados por las plantas poseen igual
interés para el farmacólogo. En este caso, los principios activos aislados de las plantas
que puedan ser usados para la prevención, el diagnóstico y tratamiento de enfermedades
son a los que se les da mayor importancia (Fig. 1).
Existen otros compuestos químicos como los glúcidos, grasas y proteínas, los
cuales tienen importancia dietética y muchos, como los almidones y las gomas, se
emplean en técnica farmacéutica. Otras sustancias, como el oxalato cálcico, sílice,
lignina y materias colorantes, pueden ser coadyuvantes en la identificación de fármacos
y detección de adulteraciones (Evans y cols. 1991).
Toda la materia prima utilizada, procedente de una planta, ha de ser
adecuadamente identificada, ya que puede desperdiciarse mucho tiempo y dinero en el
examen de material de origen dudoso. La elección depende de la naturaleza de la
materia prima vegetal y de los componentes que han de ser aislados de ella. Las
plantas desecadas suelen pulverizarse antes de la extracción, mientras que las plantas
frescas (hojas, flores, etc.), pueden ser homogeneizadas o bien, maceradas con un
disolvente como el alcohol.
6
BIOSÍNTESIS DE MELABOLITOS VEGELALES
Figura No. 1. Interrelación de productos metabólicos primarios y secundarios (Domínguez, 1988).
7
En la investigación de plantas utilizadas en la medicina tradicional, escoger el
solvente adecuado para la extracción es muy importante. Generalmente son usados
solventes orgánicos polares o moderadamente polares (Samuelsson y cols, 1985).
Para propósitos de investigación los extractos acuosos generalmente son poco
utilizados debido a la complejidad y dificultad que se tiene al usarlos, aunque debe
considerarse que los curanderos tradicionales siempre preparan sus remedios en agua,
ya sea en forma de té, o impregnando de agua fría por un determinado período de
tiempo, las partes de la planta a utilizar (Samuelsson y cols., 1985). En algunos otros
casos se adiciona la planta molida a los alimentos (Hedberg y cols, 1982, 1983a,b).
Por lo tanto, debe asumirse que si la planta contiene compuestos
farmacológicamente activos, estos deben ser extraídos por el agua y que el uso de otro
tipo de solventes podría disminuir su actividad farmacológica (Samuelsson y cols., 1985).
8
3.2. ZOAPATLE (Montanoa tomentosa).
3.2.1, CONSIDERACIONES BOTÁNICAS.
Zoapatle es el nombre común de la Montanoa tomentosa, la cual es una planta
originaria de México. Vicente Cervantes le dió este nombre en honor al eminente médico
mexicano Luis Montaña (Gallegos, 1983).
En la antigüedad, se le conocía como “cihuapatli” en lengua náhuatl (término que
refleja el sistema de clasificación botánica usado por los mexicas), ya que sintetiza dos
vocablos: cihuatl-mujer y patli-medicina. Se vende en los mercados de la Ciudad de
México y zonas aledañas con otros nombres tales como: Achina, cihuapatli, guapiojo,
hierba de la parida, hierba de la mujer, too y zoapatle (Bejar, 1985).
En el cuadro 1 se presenta la clasificación botánica y características biológicas y
físicas del zoapatle (fig. 2).
Cuadro No. 1. Consideraciones botánicas del zoapatle: Montanoa tomentosa, subs. tomentosa
*Subsp. en donde se han encontrado mas propiedades medicinales (Estrada y cols., 1983).
9
3.2.2. ANTECEDENTES GENERALES.
El zoapatle o cihuapatli es una planta utilizada en forma de extracto acuoso (en
forma de té, hirviendo las hojas de la planta de 10-20 minutos) desde hace más de 500
años con fines curativos (Gallegos, 1983).
El uso medicinal que daban a esta planta los mexica era para aliviar los
padecimientos de la mujer al término del embarazo, induciendo la labor de parto al
incrementar las contracciones uterinas y también para disminuir el tiempo de
“cuarentena” postparto (Del Pozo, 1966; Ortiz de Monte Llano, 1975). El uso del
zoapatle para inducir el sangrado menstrual fue descrito por Alfaro en 1866.
Figura No. 2. Zoapatle (Montanoa tomentosa, Subs.. tomentosa).
La primera clasificación taxonómíca sistemática fue realizada por Cervantes en
1790 en su obra: “Ensayo a la Materia Médica del Reino Vegetal de la Nueva España”.
en la cual se describe por primera vez, tanto el efecto terapéutico como el efecto
10
toxicológico del zoapatle, ya que advierte que la planta solo debe usarse en los “partos
perezosos” cuando estos no dependen de una mala posición de la criatura (Bejar, 1985).
El siguiente cuadro se presenta una síntesis de las primeros estudios realizados
con la planta del zoapatle en diferentes estados reproductivos.
Cuadro No. 2. Primeras aportaciones científicas en el estudio del zoapatle (1866-1979).
INVESTIGADOR(ES)
APORTACIONES
Alfaro, R. (1866) Usó el extracto acuoso de zoapatle (EAcZ) para inducir el sangrado menstrual.
Cota, F (1883) Utilizó por primera vez animales de laboratorio para investigar el efecto del zoapatle (dosis: 1-2 g) en perras preñadas de dos y medio meses de gestación, observando un efecto similar al de la ergotina ,(aumento de la contractilidad uterina).
Reza, A. (1887) Observó tetanización del músculo uterino al administrar oralmente el extracto acuoso de zoapatle a mujeres embarazadas, concluyendo que el uso de la planta es beneficioso sólo después del parto, ya que se impide la hemorragia evitando complicaciones funestas.
Rodríguez, J. M (1869) Después de 15 minutos de haber administrado un extracto hidro-alcohólico de zoapatle (EHAZ) a sus pacientes, se presentaron fuertes contracciones en l a matriz.
Derbez y cols. (1945) Aumento en la contractilidad uterina de animales gestantes y no gestantes (cobayos y gatos) después de la administración de un EAcZ
De Alvarez, R. (1960) Proclamó un rechazo general hacia la planta, debido a que la tetanización del músculo uterino podría tener como consecuencia la muerte materna ó fetal.
Gallegos y cols. (1974) La administración oral de zoapatle (15 g) en los días 18-20 del ciclo menstrual en mujeres con menstruación normal, produce una rápida y transitoria reducción de los niveles de progesterona circulante (posible efecto luteolítico). 2. La administración frecuente del extracto (9 días), dio como resultado un ligero acortamiento del ciclo menstrual y en algunos casos, sangrado intermenstrual a los 30-45 minutos después de la administración oral del EAcZ. 3. Observaciones toxicológicas preclínicas (aguda y subaguda) en ratas y perros, los EAcZ no presentaron toxicidad. 4. La evaluación del efecto anti-implantatorio de la decocción de zoapatle en ratas preñadas (50 mg/día por 8 días) dio como resultado una inhibición del 70% en el número de implantes en ratas tratadas con el preparado fresco, observándose disminución de la potencia farmacológica cuando el preparado tenía más de 10 días.
Landgren y cols. (1979) La administración del EAcZ en la primera etapa del embarazo en mujeres (1.1 g/kg.), provocó fuertes contracciones del útero con presencia de dilatación cervical sin alterar los niveles plasmáticos de progesterona y estradiol. Sin embargo, no lograron demostrar los efectos anti-implantatorio y luteolítico en mujeres y roedores.
11
3.2.3. PRINCIPIOS ACTIVOS DEL ZOAPATLE.
Se han aislado más de 40 compuestos químicos de la Montanoa tomentosa y
especies afines. De todos estos compuestos químicos, solamente se ha probado la
acción farmacológica de algunos, entre los cuales se encuentran: el Montanol (M),
Zoapatanol (Z), tomentol (T), tomexantina (TX), Ácido kauradíenoíco o grandiflorénico
(AG), Ácido monoginoíco (AM) y Ácido kaurenoíco (AK) (fig. 3).
En estudios en animales in vivo e in vitro se ha determinado que el extracto
hexánico de las hojas del zoapatle, posee efectos uterotónicos. En éste tipo de extracto
se encuentran el AG, AM y el AK, los cuales después de ser aislados han mostrado que
poseen efectos uterotrópícos (Enríquez y cols., 1983; Lozoya y cols., 1983). De estos
tres compuestos, el que se encuentra en mayor proporción en la planta es el AG (cuadro
3), el cual se extrae tanto en agua como en solventes orgánicos (Enríquez y cols., 1983).
Cuadro No. 3 Contenido de Ácido grandiflorénico (AG) en extractos de Montanoa tomentosa MATERIAL DE LA
PLANTA SOLVENTE CONTENIDO DE AG
Raíces Dielil éter 71.9±3.81 mg/g Tallos Dielil éter 52.1±2.76 mg/g Hojas Dielil éter 43.6±2.31 mgg Hojas Agua 0.19±0.01 mg/g
El Z y M son compuestos biológicamente activos aislados principalmente de las
hojas del zoapatle, y representan un tipo de estructura díterpenoide oxepano inusual
(Cotter, 1981). De la mezcla díterpenoíde se ha encontrado que T y Z se encuentran en
mayor proporción que M (Quijano y cols., 1985a). Otro compuesto con este tipo de
estructura es la TX (Seaman y cols., 1984) que junto con el T han sido evaluados en
ensayos biológicos por su actividad uterotónica (Quijano y cols., 1985a y b).
El extracto acuoso de la planta presentó mayor potencia farmacológica para
producir actividad uterotóníca que los extractos orgánicos (extractos en cloroformo,
alcohol, éter, etc.) (Gallegos, 1983).
La Montanoa frutescens presenta efectos similares a los producidos por
Montanoa tomentosa, y el aislamiento de las fracciones solubles en agua es vanas veces
más potente que el extracto crudo acuoso de zoapatle. El Z, M y los compuestos
kaurenicos son compuestos de bajo peso molecular e insolubles en agua, por lo tanto,
estos compuestos podrían ser originados por la hidrólisis de compuestos de mayor peso
molecular solubles en agua (Guzmán y cols., 1988).
12
Figura No. 3. Algunos de los compuestos aislados de Montanoa tomentosa y especies afines seleccionados del cuadro publicado por Bejar (1985).
13
3.2.4. EFECTOS FARMACOLÓGICOS DEL ZOAPATLE.
Los extractos de zoapatle (EZ) han sido utilizados en la medicina tradicional por
sus propiedades interceptivas (término utilizado para describir agentes abortifacientes,
inductores del sangrado menstrual, anticonceptivos, útero-evacuantes y
antiímplantatorios. Phillipson, 1979) y como agente oxitócico (Ponce-Monter y cols.,
1983).
Los efectos del zoapatle son dependientes de: estado hormonal del individuo al
que se administre, especie, tipo de extracto, tiempo de recolección de la planta, tipo de
planta y subespecie, entre algunos otros factores.
La administración intrauterina del EAcZ de Montanoa frutescens en el cuarto día
de pseudogestación de la rata (concentraciones equivalentes a 50 mg y 5 mg del peso
seco de la hoja) produce un efecto anti-implantatorio del 100%. Sin embargo, al
administrar el EAcZ de Montanoa tomentosa (dosis equivalentes a 50 y 100 mg en peso
seco de la hoja) no se inhibió el número de implantes hasta el día 11 de gestación,
observándose en la mayoría de los implantes características anormales (coloración azul,
mala orientación de los productos y espaciamiento, etc.), considerando estos cambios
morfológicos como probables sitios de reabsorción (Pedrón y cols., 1985).
Al administrar por vía intrauterina el EAcZ de Montanoa tomentosa en el día 4 de
gestación de la rata, no se altera la morfología uterina en los siguientes días (5-8 de
gestación), pero al administrar el extracto de Montanoa frutescens se presenta una
profunda alteración de las estructuras uterinas (pérdida de epitelio, disminución de la luz
de los vasos sanguíneos y alteración de las células del estroma del endometrio de la
rata). Estas alteraciones morfológicas se correlacionan con el efecto anti-implantatorio
asociado con la vía de administración (Angulo y cols., 1985).
No hay efecto del EAcZ de Montanoa tomentosa sobre la motilidad o viabilidad de
espermatozoides de humano y conejo, en un amplio rango de concentraciones. Sin
embargo el EAcZ de Montanoa frutescens tiene un efecto inmediato e inhibitorio sobre la
motilidad y disminuye la viabilidad de las células, presentando lisis de eritrocitos, lo cual
no sucede con Montanoa tomentosa (Wens y cols., 1985).
14
El zoapatanol obtenido por síntesis fue probado in vitro en diferentes tejidos
animales, observándose los siguientes efectos: constricción aguda de la arteria coronaria
de gato y contracción del íleon de gato. No se observaron efectos sobre el músculo
uterino (Smith y cols. 1981).
Estudios posteriores demostraron que el zoapatanol y el montanol no producen
cambio en la motilidad uterina pero si afectan al músculo liso vascular produciendo
constricción (Wani y cols., 1983).
En estudios realizados in vitro en útero de cobayo, se encontró que los kaurenos
son sustancias útero-activas varias veces más potentes que el Montanoal y Zoapatanol
(Gallegos, 1985).
El AG obtenido de las hojas del zoapatle, produce efectos de relajación del
músculo uterino de rata y perro (inhibe la actividad contractil espontánea del útero)
mimelizando los efectos del EAcZ tanto in vivo como in vitro. Por otro lado, en cobayo se
observaron fuertes contracciones del músculo uterino (Lozoya y cols., 1983; Waller y
cols., 1987), lo cual nos sugiera que este efecto puede ser dependiente de especie.
Además de que se ha observado que dicho efecto inhibitorio sobra las contracciones
espontáneas del miométrio de la rata in vitro, también es ejercido cuando se administra
junto con otras sustancias uteroconstrictoras (oxitocina, prostaglandina Fan y
acelilcolina), lo cual hace suponer que los productos del zoapatle no son antagonistas
específicos de los receptores de estas sustancias, y que actúan por medio de un
mecanismo de acción diferente (Bejar y cols., 1984).
También se ha demostrado la absorción gástrica del AG (Neidlein & Stumpf,
1977a), presentando un 100% de absorción por vía intraperitoneal y 83% por vía oral,
con excreción total por vía biliar. Después de la administración de 20 mg/kg. del 14C-AG
a la rata, se eliminó más del 80’% de la radioactividad por las heces en un periodo de
tiempo de 98 h (Neidlein & Stumpf, 1977b). Y además, se demostró que el AG se
transforma en tres derivados oxidados por medio de enzimas mícrosomales hepáticas in
vitro (Neidlein & Stumpf, 1977c)
Se han observado diferencias en la actividad uterotónica entre las plantas de
zoapatle que crecen en su hábitat natural y ias que son cultivadas en campos agrícolas
experimentales, observándose mayor potencia farmacológica en las plantas silvestres
(Ponce-Monter y cols., 1983).
15
Recientemente fue aislado el ácido 16α-Hidroxi-en-kauren-19-oíco de la Montanoa
hibiscifolia, el cual, al igual que su metil éster, tienen efecto sobre la actividad contráctil
de las astas uterinas de cobayo y rata (inhibiendo la actividad contráctil espontánea, la
inducida por oxitocina y la inducida por potasio). El metil éster fue de 2-5 veces más
potente que el ácido sobre las contracciones espontáneas y las inducidas por potasio, y
de 11-15 veces más potente sobre la actividad contráctil del músculo liso uterino inducida
por oxitocina (Ponce-Monter y cols., 1988).
También en 1988, se encontró que la administración oral del EAcZ tanto de
Montanoa tomentosa como de Montanoa frutescens a conejas (5 mg/día del día 3-17 de
gestación), no modifica los niveles plasmáticos normales de progesterona, las
concentraciones de hormona fueron muy similares en las conejas control y las tratadas
con el extracto (Pedrón y cols., 1988).
Un problema muy común en la ganadería bovina de nuestro país, es la retención del
loquios postparto con la consiguiente infección uterina. Ortiz y cols. (1995) en estudios
recientes, han comprobado que la administración intrauterina del EHAZ es eficaz en este
padecimiento. Se logra inducir la involución uterina y la recuperación del cuadro
infeccioso, sin necesidad de usar PGF2α, y antibióticos. También se ha encontrado que
los animales tratados con zoapatle entran en “calor” una semana después del
tratamiento, y pueden ser sincronizadas para la inseminación artificial sin el uso de la
PGF2α,. El examen clínico de estos animales muestra involución del cuerpo lúteo. Esto
sugiere que tanto la involución uterina y la consiguiente presentación del estro podrían
ser explicadas por un efecto luteolítico (Ortíz y cols., 1995).
16
3.3. FISIOLOGíA REPRODUCTIVA.
3.3.1. INTRODUCCIÓN.
Para mejorar su nivel de vida, el hombre puede regular la fertilidad de mamíferos
estrales de los cuales depende para alimentarse y vestirse, o de aquellos que compiten
con él por recursos en común. Muchos de los estudios que se han realizado sobre el
control del ciclo ovárico de mamíferos estrales de ovulación espontánea y no
estacionales, están basados en la información obtenida del ciclo estral de la rata
(Freeman, 1994).
El ciclo estral se define como un fenómeno rítmico, con períodos regulares pero
limitados de receptividad sexual, asociado, en la mayoría de los casos, con la liberación
de óvulos capaces de ser fertilizados. De acuerdo con la presentación de ciclos estrales,
las especies se clasifican en:
a).Monoéstricas: presentan un solo ciclo estral al año, ejemplo; algunas razas de perros.
b).Poliéstricas continuas: presentan ciclos estrales durante todo el año, ejemplo;
humano, vaca, cerda, etc.
c).Poliéstrìcas estacionales: presentan muchos ciclos estrales durante el año pero
confinados a una estación, ejemplo; oveja, yegua, etc.
De acuerdo con la espontaneidad de la ovulación, las especies se clasifican en :
1. Especies de ovulación espontánea con formación de cuerpo lúteo (CL): humano, vaca,
yegua, oveja, perra, cerda.
2. Especies de ovulación espontánea sin actividad reproductiva del CL cuando no hay
estimulación cervical (estímulo de coito o algo semejante que estimule el cervix): rata,
ratona.
3. Ovulación inducida (requieren estimulación cervical para ovular): coneja, gata (Tortora
y cols.,1984).
No obstante, a diferencia del ciclo ovárico de otros mamíferos de ovulación
espontánea (oveja y mono), la rata es la única en la que el ciclo está caracterizado por
una breve fase luteal. Sin embargo, los eventos del ciclo son más largos bajo control
fotoperiódico. Esto es, que la periodicidad de iluminación juega un papel delerminante
en la incidencia y duración del ciclo ovárico (Freeman, 1994).
17
3.3.2. CICLO REPRODUCTIVO DE LA MUJER.
Normalmente, desde el inicio de la pubertad y a través del período reproductivo
de la mujer, se presentan con una regularidad de 28 a 30 días ciclos reproductivos o
sexuales en los cuales se capacita al sistema reproductor femenino para recibir el
producto de la concepción y mantenerlo en condiciones óptimas durante el tiempo que
dura la gestación. El ciclo reproductivo comprende básicamente un ciclo ovárico y un
ciclo uterino o menstrual (cuadro No. 4), (Tortora y cols.,1984).
Cuadro No. 4. Ciclos y fases del ciclo reproductivo de la mujer (Fuentes: Tortora y cols.,1984; Espey, 1975; Freeman, 1994).
CICLO REPRODUCTIVO DE LA MUJER
CICLO OVÁRICO ( fig. 4 ) .
CICLO UTERINO O MENSTRUAL ( fig. 5 )
Fase folicular
1.Crecimiento y diferen-ciación del ovocito prima- rio. Folículo primario. 2.Proliferación de las células foliculares. 3.Formación de la zona pelúcida. 4.Desarrollo de la teca folicular (cápsula de tejido conectivo originada del estroma y secreción del licor folicular en los espacios intersticiales. 5. Formación del antro folicular (cavidad en medio de las células foliculares. 6. Folículo secundario: El ovocito primario se en-cuentra desplazado hacia uno de los lados del folículo, rodeado por una acumulación de células foliculares que toma el nombre de cúmulo oóforo.
Fase menstrual Fase folicular
1. Duración:3-5 días. El 1er Día de la mens- truación, es el inicio del ciclo menstrual. 2. El endometrio se des-prende y se expulsa de la cavidad uterina unto con sangre producida por la ruptura de vasos endometriales. 1.Duración: del día 6-14 del ciclo menstrual. 2.Coincide con el crecimiento y maduración de los folículos del ovario. 3.Aumento en espesor del endometrio en res- puesta a estrógenos pro- ducidos en la teca interna que rodea los folículos. 4.Las glándulas endome- triales aumentan en nú- mero y tamaño y se pro- duce elogenación de las arterias espirales
18
Ovulación
Cuerpo lúteo
7. Las células situadas en contacto con el ovocito, forman una cubierta continua llamada corona radiada 1. El ovocito primario completó su primera divi - sión meiótica y se trans-Forma en ovocito secun- dario. 2. El ovocito secundario Inicia rápidamente su se-gunda meiosis y se detie- ne en metafase. 3. El crecimiento del folí- culo produce presión so- bre el ovario creando una superficie isquémica, la cual facilita la ruptura de la túnica albuginea. 4. El ovocito secundario es expulsado junto con el licor folicular, rodeado por la zona pelúcida y la capa de células foliculares que conforman la corona ra-diada. 1. Después de la ovula- ción se colapsan las pare- des del folículo y la teca folicular que lo rodean. 2. Bajo la influencia de la hormona luteínizante (LH) este tejido se convierte en el cuerpo lúteo ó cuerpo amarillo, el cual secreta progesterona (principal-mente) y estrógenos. 3. Si ocurre fertilización, el CL aumenta su tamaño para constituir el cuerpo lúteo de la gestación.
Fase luteal
Fase isquémica
1, Duración: del día 15 al 26 del ciclo menstrual. 2. Coincide con la forma- ción y crecimiento del cuerpo lúteo. 3. La progesterona secre- tada por el CL produce: a). Cambios en tamaño y forma de las glándulas endometriales. b). Estimula una secre- ción rica en glucógeno. c). Aumenta el espesor del endometrio (gran acu-mulación de líquido en el estroma y crecimiento del mismo). 4. Las arterias espirales alcanzan la capa más su- perficial del endometrio y se hacen más tortuosas. 5. En caso de ocurrir fertilización, el huevo fecundado se implanta en el endometrio hacia el día 20 de esta fase. 1 Si no ocurre fertiliza- ción, el CL degenera y disminuye su secreción hormonal. 2. En consecuencia se produce una isquemia del endometrio que se ex- tiende del día 27 al 28 del ciclo menstrual. 3. El endometrio toma una apariencia pálida, de- bido a la contracción in-termitente de las arterias espirales. 4. Las glándulas endome-
19
continuación… 4.En caso de no ocurrir
fertilización, el CL degenera y toma el nombre de cuerpo lúteo cíclico o de la menstruación 5.El CL se tramsforma finalmente en una ciactriz blanquecina que se deno- mina cuerpo albicans ó blanco
Triales disminuyen su se- creción, presentándose Una notable contracción del endometrio. 5.Al final de la fase isquémica , las arterias es- pirales se contraén por periodos de tiempo mas prolongados.
INICIO DEL CICLO
Figura No. 4. Diferentes etapas del ciclo ovárico de la rata: desarrollo folicular, ovulación,
formación y regresión del cuerpo lúteo (Freeman, 1994).
20
Figura No. 5. Ciclo uterino ó menstrual humano (Tortora y cols.,1984).
Sin embargo, la duración de las diferentes etapas, las características
conductuales y morfológicas de las etapas, podría variar entre mamíferos estrales
(cuadro 5).
CUADRO No. 5. Duración del ciclo reproductivo y sus etapas folicular y luteal en diferentes mamíferos estrales
ESPECIES DURACIÓN TOTAL
( días )
FASE FOLICULAR ( días )
FASE LUTEAL
( días )
Humano Ratón y Rata 1
Ratón y Rata 2 Conejo 3
Cerdo Oveja
24-32 13-14 4-5
14-15 19-21 16-17
10-14 2 2
1-2 5-6 1-2
12-15 11-12 2-3 13
15-17 14-15
1: Pseudogestación (estímulo coítal) 2: Ciclo estral normal 3. Inducción de la ovulación
21
3.3.3. CICLO ESTRAL DE LA RATA.
La palabra estro es una adaptación latina de la palabra griega “oistros” que
significa frenesí o deseo desenfrenado. Este término fue usado por primera vez por
Heape (Heape, 1900) para describir el “período especial de deseo sexual de la hembra”
y distinguirlo del “celo” en el macho (Freeman, 1994).
La rata de laboratorio es un mamífero no estacional, de ovulación espontánea y
poliéstrica, es decir, que el ciclo ovárico se continúa a través de todo el año. La
ovulación no es dependiente de la sobre-estimulación nerviosa y ocurre cada 4 ó 5 días
a través de todo el año. Heape posteriormente describió distintas etapas del ciclo
(cuadro 6, fig. 6), todo esto aplicado a mamíferos durante la época de reproducción.
CUADRO No. 6. Características fisiológicas, morfológicas y citológicas del ciclo estral de la rata
(Heape, 1900; Freeman, 1994).
ETAPA
CARACTERÍSTICAS
FISIOLOGICAS
CITOLOGÍA VAGINAL
Diestro
Las secreciones del ovario preparan al tracto reproductivo para recibir al óvulo fertilizado.
Caracterizada por la presen- cia de una gran cantidad de pequeños leucocitos.
Proestro
Período en el cual la rata está entrando en calor.
Predominan células epite- liales nucleadas. Ocasional-mente aparecen algunas cé- lulas cornificadas.
Estro
Etapa de receptibilidad sexual
Ampliamente caracterizada por un gran número de células epiteliales escamosas cornificadas. No presentan núcleo visible y tienen forma irregular. Ausencia de leuco- citos, algunas células nuclea- das se encuentran presentes.
Metaestro
Corto período de recuperación (si no hay fertilización), durante el cual el tracto reproductivo recupera su morfología
Caracterizada por la presen- cia de pequeños leucocitos y unas pocas células nucleadas o cornificadas.
Anestro
Período del ciclo no reproductivo en la hembra. Los ovarios y órganos reproductivos acceso- rios están relativamente en reposo y no hay receptibilidad sexual.
22
Figura No. 6.Tipos de células que aparecen en el exudado vaginal de rata durante las diferentes etapas del ciclo estral (x100). (A) Proestro: (B) Estro: (C) Metaestro y Diestro (Freeman, 1994). 3.3.3.1. CICLOS ESTRALES DE 4 Y 5 DíAS DE DURACIÓN.
Se ha establecido que durante el ciclo estral de la rata, ya sea de 4 ó 5 días de
duración, se observan dos incrementos transientes en la secreción de progesterona (P);
uno en la tarde del proestro (incremento preovulatorio), y otro denominado incremento
post-ovulatorio ,durante el metaestro (Elo y cols., 1962; Hashimoto y cols., 1968;
Goldman y cols., 1969; Uchida y cols., 1969a; Barraclough y cols., 1971; Piacsek y cols.,
1971; Hashimoto y cols., 1987; Tébar y cols., 1995). El incremento preovulatorio es
consecuencia de la acción de la hormona luteinizante (LH) liberada durante la tarde del
proestro de los folículos maduros (HaNshimoto & Wiest, 1969a; Uchida y cols., 1969a,b;
Barraclough y cols., 1971; Hamberger y cols., 1978; Hashimoto y cols., 1987; Tébar y
23
cols., 1995), mientras que el incremento post-ovulatorio es debido a un incremento en la
secreción de P del grupo de nuevos cuerpos lúteos formados durante el ciclo (Hashimoto
& Wiest, 1969a,b; Furudate y cols., 1975). Las ratas con ciclos de 5 días pueden ser
diferenciadas de las de 4 días determinando la secreción de P post-ovulatoria, la cual
permanece significativamente más alta durante el diestro en las ratas de 5 días que en
las de 4 días (Roser & Block, 1969; Furudate y cols., 1975; van der Schoot & de Greef,
1976; Nequin y cols., 1979; Kaneko y cols., 1986). Por lo tanto, es evidente que la
prolongación en la secreción de P post-ovulatoria (la retención de cuerpos lúteos
prolonga por más tiempo la función progestacional) es responsable de los ciclos de 5
días (Kaneko y cols., 1986). Existe evidencia de que el pico de liberación de LH
ovulatoria es 1 hora más temprano en ratas con ciclos de 5 días que en las de 4
(Hoffman & Schwartz, 1965; Schwartz, 1969; van Rees, 1972) y que hay diferencias
significativas preovulatorias en la cantidad liberada de P, LH y prolactina (Pr) entre las
ratas de ciclos de 5 días y las de 4, en donde las ratas de ciclos de 5 días se diferencian
de las de 4 por sus bajos niveles preovulatorios de P y LH acompañados por altos
niveles de Pr (Hashimoto y cols., 1987). Las ratas con ciclos de 5 días ovulan entre las
1:30 y 9:30 h de la etapa del estro (Hashimoto y cols., 1987; Gay y cols., 1970; Nequin y
cols., 1979). En contraste, las ratas con ciclos de 4 días empiezan a ovular alrededor de
las 1:30 h del estro, pero la incidencia estimada de ovulación en estos animales es más
baja entre las 3:30 y 11:30 h del estro comparado con las ratas de ciclos de 5 días
(Hashimoto y cols., 1987). Los ciclos de 5 días pueden ser convertidos a 4
administrando estrógenos ya sea en el metaestro o en el primer día de diestro (Everett,
1948; Brown-Grant, 1969).
En ratas cíclicas de 4 días se ha establecido que la secreción de P durante el
diestro intensifica la retroalimentación negativa del estradiol sobre la secreción basal de
LH (Beattie y cols., 1975; Kaneko y cols., 1986) y que cuando los niveles de P decaen
(regresión luteal), la secreción de estradiol y LH incrementan y la ovulación ocurre en las
siguientes 6:00-8:00 h (Smith y cols., 1975). Además, la reducción de secreción de P
luteal por la administración de bromocriptina (van der Schoot & Uilenbroek, 1983;
Sánchez-Criado y cols., 1988) o el bloqueo de la acción de la P luteal con un suero
antiprogesterona (Keneko y cols., 1986) o con el antiprogestágeno RU486 (Uilenbroek,
1991) en ratas cíclicas de 5 días, da como resultado acortamiento del ciclo estral en 1 día
(Tébar y cols., 1995).
24
Sin embargo, los mecanismos que regulan la magnitud y el tiempo de liberación
de LH y P en ratas con ciclos de 4 y ratas de 5 días de duración no han sido
complelamente determinados (Hashimoto y cols., 1987).
3.3.4. HORMONAS EN EL CICLO REPRODUCTIVO.
Los estrógenos (E) se mantienen en niveles bajos al inicio de la fase folicular y
van incrementando su concentración paulatinamente hasta alcanzar su pico máximo
justo antes de la ovulación, en donde la alta concentración de E da como resultado el
disparo de los picos de hormonas luteínizante y folículo estimulante (LH y FSH). La
ovulación en mamíferos es un fenómeno biológico distintivo, el cual requiere de la
ruptura de tejido sano de la superficie del ovario. La ovulación se presenta a la mitad del
ciclo reproductor (en el caso de la mujer al día 14), mediante la influencia de las
hormonas gonadotróficas (FSH y LH) producidas por la adenohipófisis (Espey, 1994).
La concentración de E disminuye gradualmente durante la fase luteal. Durante
esta fase los niveles de E se mantienen constantes en los primeros días debido a que el
cuerpo lúteo también produce una cierta concentración de E, y una vez que el CL deja
de ser activo, las concentraciones de E regresan a su nivel basal (fig. 7). El desarrollo
inicial de los folículos es estimulado por la FSH, sin embargo, también se requiere LH
para la maduración final de los mismos. Por otra parte, los folículos en desarrollo
producen E a nivel de la capa interna de la teca folicular (Espey, 1975).
La regulación de la producción de E por lo ovarios es uno de los eventos
fisiológicos más importantes que marcan la espontaneidad e inducción del ciclo estral
(Shoham & Schachter, 1996).
Los E ejercen sus acciones biológicas sobre órganos blanco a través de la unión
a un receptor de E específico (RE), el cual es miembro de la superfamilia de receptores
esteroideos (Beato, 1989; Carson-Jurica y cols., 1990). El equilibrio de los niveles
circulantes de E y la expresión normal en los órganos blanco es de vital importancia para
la homeostasis de varios tejidos; ejemplo: útero (Korach, 1979; Quarmby & Korach,
1984). Así mismo, el desbalance y/o incremento de los niveles circulantes de este
esteroide es crucial en el desarrollo de hiperplasia/hipertrofia de los órganos blanco,
25
como el útero (Herbst, 1981). Los efectos de los E dependen del tiempo de exposición y
de la edad del individuo al que se les administre (McLachlan y cols., 1980).
La hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH), los esteroides gonadales y la
inhibina se encargan de la regulación de la LH y FSH. La inhibina suprime la síntesis y
liberación de FHS, siendo su papel principal el de regulación de secreción de FSH (De
Jong, 1880). La inmunización pasiva contra la inhibina produce un incremento en la
concentración de FSH plasmática (Rivier y cols., 1988; Culler y cols., 1988) y el la
velocidad de ovulación en la rata (Rivier y cols., 1989). Por lo tanto, si se presentan
grandes cambios en la secreción de inhibina durante el periodo preovulatorio se presenta
un pico secundario de FSH, lo cual resulta en diferencias en los patrones de secreción
de LH y FSH en éste periodo. Sin embargo, aún no esta claro cual es la contribución
relativa de E e Inhibina en la regulación de secreción de gonadotrofinas (Arai y cols.,
1996).
La progesterona (P) se mantiene en concentraciones bajas durante la fase
folicular y presenta su pico máximo en la fase luteal, debido a que el CL secreta
principalmente P (fig. 7). La P tiene como función principal estimular la secreción de las
glándulas endometriales, y de esta manera preparar al endometrio para la implantación
del huevo fecundado.. El CL aumenta su secreción hormonal, para continuar con la
estimulación sobre el endometrio y mantener el desarrollo normal del huevo fecundado.
La degeneración del cuerpo amarillo se impide por la gonadotrofina coriónica, una
hormona secretada por el trofoblasto muy tempranamente, después de la implantación
del blastocito (Tortora y cols., 1984).
Además de la acción de la P sobra el tracto genital, también tiene funciones
reguladoras del desarrollo folicular, de la liberación de gonadotrofinas preovulatorias y
sobre la ovulación (Buffler & Roser, 1974; Caligaris y cols., 1971; Mori y cols., 1977).
Dichas acciones son ejercidas a través de su interacción con receptoras de P en el
hipotálamo (Garris y cols., 1981), glándula pituitaria (Kato & Onouchi, 1977) y ovarios
(Schreibar & Hsueh, 1979; Sanchez-Criado y cols., 1990).
26
Figura No. 7. Cambios cíclicos observados en la concentración de hormonas durante el ciclo
reproductor de la mujer.
3.3.5. CUERPO LÚTEO Y LUTEÓLISIS.
El cuerpo lúteo (CL) es la estructura dominante en los primates después de la
ovulación. Secreta hormonas para el control del ciclo estral y promueve la diferenciación
del tracto reproductivo requerido en la gestación intrauterina (Stouffer & Duffy, 1995). El
producto principal del tejido luteal es el esteroide progesterona, pero no es el único,
también secreta E, péptidos derivados de la inhibina y relaxina (Stouffer, 1990).
La esteroidogénesìs en el CL de la rata depende del colesterol exógeno, el cual
es obtenido de lipoproteínas y de la movilización de moléculas lipídicas por la enzima
neutral colesteril éster hidrolasa (Strauss y cols., 1981; Strauss y cols., 1991; Aten y
cols., 1995).
27
Los radicales libres a altas concentraciones producen daño y pérdida de función
celular. El radical superóxido (SOR) induce la formación de peróxidos lipídicos, los
cuales estimulan la actividad de la fosfolipasa A2 (Sevanian y cols., 1988) y ciclo-
oxigenasa (Egan y cols., 1976). La producción y metabolismo de ácido araquidónico
produce una gran cantidad de ácidos grasos oxidados, dentro de los cuales se
encuentran las prostaglandinas (Sawada & Carlson, 1996). En estudios recientes se ha
observado que la producción del SOR está ligada a la regulación y función del CL. El
tratamiento con PGF2α, in vitro, estimula una corta descarga del SOR antes de que
disminuya la secreción de P (Sawada & Carlson, 1991). De igual manera, al inhibir la
esteroidogénesis, también se ha visto que en la estimulación de secreción de P por LH,
hay un pequeño aumento en la producción de SOR (Sawada & Carlson, 1994). Por lo
tanto, se presume que este radical podría estar involucrado en la regulación del CL
(Sawada & Carlson, 1996).
La administración exógena de PGF2α produce luteólisis en vacas y yeguas
(Hansel y cols., 1973; Inskeep, 1973). El aumento en la concentración de 17β-Estradiol
durante la última parte del diestro aparentemente incrementa la síntesis y liberación
uterina de PGF2∝, (Barcikowski y cols., 1974; Fogwell y cols., 1985) contribuyendo a que
se lleve a cabo la luteólisis. Adicionalmente, 17β-Estradiol y PGF2∝, podrían ejercer
efectos sinérgicos sobre la función luteal, independientemente de los efectos de 17β-
Estradiol sobre la secreción uterina de PGF2∝, (Gengenbach y cols., 1977; Hixon y cols.,
1983; Hughes y cols., 1987).
La actividad y permanencia del CL parece estar regulada por factores
luteotróficos y luteolíticos (Bourne y cols., 1996).
28
3.3.6. GESTACIÓN.
La gestación (G) es un proceso integrativo en donde la resultante es el desarrollo
y nacimiento de uno o más miembros de la misma especie (Stock & Metcatfe, 1994).
Para que se lleve a cabo el proceso de gestación deben ocurrir cuatro eventos
esenciales:
1). Ovulación. 2). Introducción del esperma de manera natural o artificial (para ta fertitización de tos
óvulos). 3). Implantación de btastocitos. 4). Formación del CL para mantener el estado progestacional, con lo cual se inicia ta
gestación (Terkel, 1988). 3.3.6.1. FISIOLOGíA DE LA GESTACIÓN.
En el primer tercio de la G en la rata, la activación y el mantenimiento del CL es
regulada por la PRL, denominada como la principal hormona luteotrófica (Aslwood, 1941;
Macdonald & Greep, 1968; Rothchild, 1981; Gunnel & Freeman, 1983). Sin embargo, la
regulación neuroendócitna de la función del CL presenta gran variabilidad en las
diferentes especies de mamíferos, en donde dicha regulación depende de más
sustancias luteotróficas, ejemplo: PRL, LH, E y factores placentarios (Smith, 1980).
En el inicio de ta G y pseudogestación (psg) en la rata, la activación del estado
progestacional es identica, ya que el patrón de secreción de PRL en ta psg (Freeman &
Neill, 1972) es el mismo que ocurre durante la primera mitad de la G (Butcher y cots.,
1972). También se ha reportado que la LH juega un papel luteotrófico importante a la
mitad de la G (Madhwa Raj & Moudgat, 1970) y que tos requerimientos luteotróficos del
CL cambian continuamente durante la G. Por lo tanto, los primeros 7 días son
totalmente dependientes de PRL. Despues el tejido decidual empieza a ser parcialmente
dependiente de LH y dicho cambio esta correlacionado con la perdida relativa de
dependencia de PRL (Lam & Rothchild, 1977). Del día 12 de G en adelante, los
requerimientos luteotróficos cambian debido a que la glándula pituitaria no es capaz de
mantener por mucho tiempo la secreción de P, por lo tanto, el CL comienza a ser
dependiente de lactógenos placentarios de la rata (Lpr) y E (Gibori & Richards, 1978).
29
3.3.6.2. HOMEOSTASIS EN LA GESTACIÓN.
En la mayoría de los mamíferos, es indispensable que la madre proporcione las
sustancias esenciales para el crecimiento del feto y que el medio intrauterino sea el ideal
para el desarrollo y mantenimiento del mismo. Por lo tanto deben establecerse
mecanismos de transferencia de sustancias, tales como nutrientes y oxígeno de la madre
al feto, y la eliminación de productos metabólicos tales como el calor, bióxido de carbono
y sustancias nitrogenadas, para la regulación homeostática de madre y feto (Stock &
Metcalfe, 1994).
Cuando la gestación está a término, la madre requiere mayor consumo de agua
debido a que el feto requiere mayor cantidad de oxígeno (Barcroft, 1947). El volumen
plasmático empieza a incrementar en el primer tercio de la gestación, incrementa más
rápidamente en el segundo tercio y sigue incrementando ligeramente hacia el final de la
G (Chesley, 1972). En la rata, el volumen plasmático incrementa un 4% hasta el sexto
día, 2% hasta el día 12 de 21 días de gestación (Baylis, 1980). Debido a que la
retención de agua es proporcionalmente más grande en magnitud que la de sodio, la
concentración de sodio plasmático disminuye conforme progresa la G (Gray y cols.,
1964; Plentl y cols., 1959). Varios estudios han demostrado disminución significativa en
la osmolaridad plasmática en ratas y humanos (Davison y cols., 1981; Barron y cols.,
1988).
Aunque no está bien determinado el mecanismo homeostático en la gestación,
parece ser que la placenta juega un papel muy importante en la relención de sodio y el
incremento del volumen total de agua (Lindheimer y cols., 1989).
3.3.6.3. CAMBIOS EN EL SISTEMA RESPIRATORIO.
Durante la fase progestacional, ocurre una relativa hìperventílación en cada ciclo
menstrual causando tensión alveolar y arterial de CO2, para después regresar a los
niveles básales observados en la fase preovulatoría (Goodland y cols., 1952). Existe
hiperventilación en vacas preñadas durante la gestación (Gahlenbeck y cols., 1968). La
administración de P exógena produce una disminución de la presión de CO2 arterial en
cobayos y humanos (Hosenpud y cols., 1983;Lyons y cols., 1959). El mecanismo por el
cual la P causa hiperventilación no esta claro todavía(Stock & Metcalfe,1994).Seha
30
encontrado que después de la administración de estradiol, el número de receptores a P
aumenta en el útero de rata, pero no se ve hiperventiiación en ratas no gestantes
(Brodeur y cols, 1986) por lo tanto, esto demuestra que los receptores en el citosol del
útero y los del hipotálamo responden de manera diferente en las ratas gestantes (Al-
Khouri & Greenstein, 1985).
3.3.6.4. IMPORTANCIA DE LA OXITOCINA EN LA GESTACIÓN.
La concentración plasmática de oxitocina (OT) en mujeres embarazadas es
mayor que en mujeres no embarazadas (Kumaresan y cols., 1974; Mizutani y cols.,
1982) dicha concentración es más grande en el cordón arterial sanguíneo que en el
cordón venoso del feto y en la sangre materna (Dawood y cols., 1978), lo cual sugiere
que la OT es generada por el feto perse y es destruida en la placenta y/o suero de la
madre (Naruki y cols., 1996).
Los fetos humanos y animales secretan activamente OT cuando se inicia el
proceso de gestación (Dawood y cols., 1978; Oosterbaan y cols., 1989). La
administración de agonistas de OT es usada para inducir la labor de parto (Bossmar y
cols., 1994). Por lo tanto es muy importante fisiológicamente para el control de la
actividad uterina en la G, ya que se ha encontrado un aumento en el número de
receptores a OT en el útero en el último período de G (Kímura y cols., 1992). También
se ha reportado que los receptores miometriales a OT están presentes en el segundo y
tercer trimestre de G (Fuchs y cols., 1992). En consecuencia, es lógico el aumento de
OT tanto en madre como en feto conforme avanza la G. Esto sugiere que la oxitocinasa
regula la concentración de OT y previene la labor de parto durante la G (Mizutani y cols.,
1988).
3.3.6.6. ADMINISTRACIÓN DE XENOBlÓTlCOS EN LA GESTACIÓN.
La administración de xenobióticos en el período de organogenesis, entre los días
6-15 de G en rata (período más sensible en la G), da lugar a la inducción de
malformaciones estructurales y anatómicas. Dicho efecto no solamente depende del
período de administración, sino también del tipo de xenobiótico administrado (Hansen &
Meyer, 1994).
31
El tiempo de exposición a un fármaco no sólo determina la severidad de la
reaccibn, sino también el tipo de toxicidad a desarrollar, ejemplo: muerte, malformación,
relardo del crecimiento o deficiencia funcional. Durante el período embrionario, en
donde la proliferación y diferenciación de tejidos y órganos es predominante, el efecto
tóxico producido por un xenobiótico está representado con malformaciones o muerte
embrionaria (a dosis adecuadas). En el período fetal, el crecimiento generalizado y la
maduración funcional están en progreso, las influencias adversas dan como resultado
retardo en el crecimiento o deficiencia funcional, aunque altas dosis podrían llegar a
producir histogénesis anormal ó muerte fetal (Wilson, 1974).
El período de tiempo en el cual es administrado el xenobiótico puede influir sobre
la embriotoxicídad bajo dos condiciones:
a). Cuando la sustancia es capaz de inducir o inhibir su propio metabolismo
enzimátíco, y
b). Cuando el uso continuo de la sustancia puede interferir con la función del hígado o
riñon materno o de otros órganos esenciales para la homeostásís, incluyendo la
eliminación de otras sustancias potencialmente embriotóxícas (Wilson, 1974).
3.3.7. PSEUDOOESTACIÓN.
El término pseudogestación (psg) se refiere comúnmente a un estado en el cual
el útero sufre una reacción desídual en respuesta a un trauma uterino (De Feo, 1987).
Esto ocurre cuando los factores luteotróficos activan al cuerpo lúteo, el cual secreta
progesterona (Lu y cols., 1978). La inducción del estado progestacíonal es un requisito
para que se den los cambios estructurales en el útero necesarias para la implantación
del huevo fertilizado (Terkel, 1988).
La inducción de psg en rata ya sea por estimulación eléctrica o mecánica del
cervix uterino da como resultado dos picos diarios de secreción de PRL; uno nocturno
(500 h) y otro diurno (19:00 h) (Butcher y cols., 1972; Smith y cols., 1975; Gunnel y
Freeman, 1983). Como consecuencia de estos picos de PRL semícircadíanos, el cuerpo
lúteo recientemente formado permanece viable y secreta progesterona en los dia 1-8 de
psg. En los días 9-14 de psg se presenta regresión del CL y los niveles de P disminuyen
(Bartosik y cols., 1975); Murakamí y cols., 1979). El ritmo circadiano es mantenido hasta
32
la terminación de la psg por luteólisis (Gorospe y Freeman, í981), mientras que durante
el embarazo, los picos cesan a la mitad de la gestación, al tiempo correspondiente al
desarrollo de la placenta (Yogev y Terkel, 1978; Voogt y cols., 1982).
La psg puede ser inducida coitalmente pero también una gran variedad de
factores no coitales pueden inducir la psg. El estímulo específico copulatorio del macho,
inicia un sistema mnemónico (sistema que asiste en el relenimiento y expresión de la
memoria en algunas ocasiones), el cual es esencial para la secreción circadiana
repetitiva de PRL (Yoshinaga, 1977).
La psg puede ser determinada observando la presencia de diestro permanente
por examìnación del exudado vaginal durante 13-14 días después de la estimulación
cervical, o por la presencia de picos nocturnos de PRL, ya que estos picos parecen ser
esenciales en la iniciación y mantenimiento de la G y psg (Terkel, 1988).
En base a muestreo una vez al día, se encontró que los niveles de PRL eran
bajos durante todo el embarazo con excepción de dos elevaciones significativas. El
primero ocurre al cuarto día de embarazo y esta relacionado con la implantación,
mientras que el segundo ocurre justo antes del parto y esta asociado con la preparación
para la lactación (Amenomori y cols., 1970; Butcher y cols., 1972; Freeman y Nell, 1972).
Las prostaglandinas (PGs) regulan diversas respuestas ováricas asociadas con la
función folicular y luteal (Lindner y cols., 1980; Rothchild, 1981). En rata se ha
observado que el aumento de PGE2 aumenta la secreción de progesterona, cuando es
adicionada la PG a células luteales aisladas al día 6 de psg (Horvath y cols., 1988).
Se ha demostrado que la administración de E durante la psg da como resultado
ovulación,48 h después de la administración, por lo tanto, la ausencia de ovulación en la
psg podría ser debida a la ausencia de altos niveles de E requeridos para la inducción
del pico ovulatorio de LH (Everett, 1947; Welschen y cols., 1975).
33
CAPíTULO II METODOLOGíA.
34
1. SUJELOS EXPERIMENTALES.
Se utilizaron ratas Wìstar hembras de 200 a 300 g de peso.Previo a cualquier estudio,
se determinó mediante una toma diaria de exudado vaginal, a la misma hora (8-9 am), que las
ratas presentaran tres ciclos estrales consecutivos de 465 días de duración.Los animales
fueron mantenidos en ciclo luz-obscuridad normal 14:10 h (luz: 7:00 am-9 pm) en grupos de 4
ratas por jaula, a una temperatura entre 23 y 24°C, con agua y alimentación ad libitum.
Tambien se emplearon ratas Wistar hembras prepúberes de 27 días de edad (45-60 g),
con el orificio vaginal cerrado y mantenidas en las mismas condiciones que las ratas adultas,
para el protocolo de inducción de ovulación.
Las ratas Wistar macho utilizadas presentaron entre 300 y 350 g de peso, con una
conducta sexual normal para inducir el apareamiento con la hembra. Fueron agrupados de la
misma manera que las hembras y bajo las mismas condiciones ambientales y alimenticias. Un
grupo de ratas macho fue castrado y se les administró 5 mg de testosterona en un vehículo
oleoso por vía subcutanea diariamente para mantener la conducta sexual e inducir la
pseudogestación por cópula infertil.
2. EXTRACTO DE ZOAPATLE (Montanoa tomentosa).
2.1. OBTENCIÓN DEL EXTRACTO HIDROALCOLICO DE ZOAPATLE (EHAZ).
La planta de zoapatle fue recolectada en el Estado de Tlaxcala, ya que en estudios
preliminares (Ortiz y cols., 1995) han encontrado que el zoapatle de esta región presenta
adecuada potencia farmacológica. Se recolectó en cantidad suficiente y se cultivó para tener
un solo tipo de planta y un solo lote de extracto en todo el estudio. La recolección de la planta
y la preparación de los extractos se realizaron tanto en época de floración como de no
ftoración, con el fin de comparar la potencia farmacológica.
El extracto de zoapatle (EZ) se obtuvo de las hojas de la planta, las cuales se secaron
a temperatura ambiente. La concentración final del EZ fue de 10 g de peso seco de la hoja en
100 ml de una mezcla alcohol:agua (70:30%), almacenándose en frascos ámbar durante 21
días. Al término de este plazo, se filtró el extracto y se almacenó nuevamente en frascos
ámbar.
35
3. MATERIAL Y SOLVENTES.
3.1. SOLVENTES Alcohol etílico absoluto (Baker) y Agua desmineralizada.
3.2. REACTIVOS. Hormonas, Testosterona (Sigma). Gonadotrofina coriónica humana (hCG), Gonakor. Gonadotrofina
coriónica equina (PMCG), Folligon.
Reactivos químicos. Cloruro de sodio (Baker). Heparina (Sigma). Aceite vegelal comercial.
3.3. EQUIPO Microscopio de contraste de fases.
Microscopio estereoscópico.
4. PROTOCOLOS EXPERIMENTALES.
4.1. EFECTOS DE LOS EHAZ SOBRE DIFERENTES ETAPAS DE LA GESTACIÓN.
Se administraron dos dosis del EHAZ (25 mg, 50 mg de peso seco de la hoja de
zoapatle en solución hidra-alcohólica 30:70) por vía i.vag. a grupos de 5 ratas en tres
diferentes períodos de gestación: 1-21, 7-21 y 14-21. Las ratas fueron sacrificadas al dia 21
por decapitacíón. Para cada grupo se formó un grupo control al cual se le administró el
vehículo.
Se registraron los siguientes parámetros para cada grupo:
a). Ganancia de peso de la madre durante la gestación.
b). Peso de ovarios y características microscópicas.
c). Peso de hipótesis.
d). Peso de adrenal izquierda.
e). Número de implantaciones.
fj. Número de fetos resorbidos.
g). Hemorragias intrauterinas.
h). Número de fetos logrados, peso y características físicas.
i). Peso de placentas y úteros (características macroscópicas).
36
4.2. EFECTOS DEL EHAZ SOBRE EL CICLO ESTRAL DE LA RATA.
Se formaron 3 grupos de 5 ratas a los que se le administró por vía í.vag. entre tas 9-10
am: 1. 0.25 ml del EHAZ equivalente a 25 mg de la hoja seca de zoapatte.
2. 0.25 ml del vehículo (solución alcohol/agua, 70:30).
3. 0.25 ml de solución satina fisíológica (ssf).
La administración fue en diferentes etapas del ciclo estral (Diestro, Proestro y Estro) y
se evaluaron los cambios en el ciclo estral mediante frotis vaginal diario.
4.3. DESARROLLO FOLICULAR.
A dos grupos de ratas en Metaestro se les administró por vía i.vag. 0.25 ml del EHAZ
(25 y 50 mg respectivamente). Se formaron dos grupos control para cada dosis, a los cuales
se les administro el vehículo y ssf. A todos los animales se les determinó la etapa del ciclo
diariamente por frotis vaginal y de cada grupo se satcrificaron 5 animales diariamente por 4
días. Se observaron características macro y microscópicas del tracto genital y mediante
observación estereoscópica se determinó el número de cuerpos lúteos y el grado de
maduración folicular. También se registraron los pesos de: glanduta adrenal izquierda,
ovarios, glándula pituitaria y peso corporal.
4.4. INDUCClÓN DE LA OVULACIÓN.
El día primero de tratamiento se administró a ratas prepúberes (50-60 g) 60 UI de
gonadotrofina equina (PMSG) por vía intramuscular (i.m.), la cual se repitió durante los dos
días subsecuentes.Se administraron a diferentes grupos de ratas(n=7) dos veces al día por
vía subcutánea 5 dosis del EHAZ equivalentes a:25,50,100,200 y 400 mg del polvo seco en
un deposito de aceite (0.25 ml). Al tercer día se administro por vía i.m. 60 U.I. de
gonadotrofina coriónica humana (hCG). Al cuarto día los animales fueron sacrificados
evaluándose la madurez folicular y el número de cuerpos lúteos.
Al grupo control se le indujo la ovulación en la misma forma, pero solo se le aplico el
depósito de aceite vegetal.
37
46. EFECTOS DEL EHAZ EN RATAS EN PSEUDOGESTACIÓN.
La pseudogestación (psg)se indujo por copula infértil de las ratas con machos castrados
(cohabitación con el macho desde la tarde del proestro hasta el día siguiente). La presencia del
tapón vaginal a la mañana siguiente fue considerada como día 1 de psg. A partir de este día se
administro por vía i.vag. a tres grupos de ratas (n=7), 0.25 ml del EHAZ correspondiente a 12.5,
25 y 50 mg de hojas de zoapatle en peso seco. Al grupo control se le administro el vehículo
(Alcohol/Agua 70:30).
El frotis vaginal de ratas en psg se caracteriza por la presencia de leucocitos (diestro).
La interrupción del psg se determinó por la presencia de frotis característicos de proestro yestro
(células nucleadas y cornificadas).
4.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO.
En el protocolo de los efectos de los EHAZ en diferentes etapas de gestacion, las
diferencias en peso de los distintos parámetros reproductivos fueron analizadas mediante la
prueba estadística de Duncan (P<0.05).
Para los demás protocolos, en todos los casos se consideraron las diferencias entre los
animales controles con respecto a los animales tratados utilizando la prueba t de Student a un
nivel de significancia de P<0.05.
38
CAPÍTULO III
RESULTADOS.
39
1. EFECTOS DEL ZOAPATLE EN DIFERENTES ETAPAS DE GESTACIÓN.
1.1. EFECTOS DEL EHAZ SOBRE PARÁMETROS MATERNO-FETALES. 1.1.1. Administración del EHAZ del día 1-21.
En los primeros 5 días de administración del EHAZ (25 y 50 mg) se registra un
aumento significativo (Prueba de Duncan, P<0.05) en la ganancia de peso en las ratas
tratadas con el EHAZ (dependiente de dosis) en comparación con el control (fig. 8, panel
A). Del dia 6 al 14 hay una disminución significativa en la ganancia de peso en los
grupos tratados con el EHAZ, mientras que en el grupo control el aumento de peso es
continuo. En el último tercio del embarazo el grupo tratado con 25 mg gana más peso
que el grupo control. El grupo tratado con 50 mg, tambien gana peso pero por debajo
del control y no hay diferencias significativas.
1.1.2. Administración del EHAZ del día 7-21.
En el primer tercio del embarazo (1-6 días) se registra una ganancia de peso igual
para los tres grupos, La administración de 25 mg del EHAZ al día 7 promueve un
aumento mayor en la ganancia de peso que el grupo control y con 50 mg también
aumenta de peso pero por debajo del control. Al día 19 se invierte la relación, es decir;
al término del embarazo las ratas tratadas con 50 mg quedan por arriba del control y las
tratadas con 25 mg por debajo (fig. 8, panel 8).
1.1.3. Admínístracíón del EHAZ del día 14-21.
La ganancia de peso registrada en los dos primeros tercios de la gestación (1-13)
no presentó diferencias significativas. La administración del EHAZ al día 14 produjo un
aumento en la ganancia de peso dependiente de dosis con respecto al control (fig. 8,
panel C).
40
Figura No. 8. Efecto del EHAZ sobre la ganancia de peso de las ratas gestantes, cuando se administra en diferentes periodos de la gestación (g). (A) Administración aguda de los EHAZ y del vehículo (Acohol/Agua 70:30) en el período 1-21, (B) 7-21 y (C) del 14-21. *Prueba de Duncan P<0.05
41
1.1.4. Efecto del EHAZ sobre hipófisis, ovarios y glandulas adrenales.
La administración del EHAZ no produce cambios significativos en el peso de
hipófisis, ovarios y glándulas adrenales con respecto al control en ninguna etapa de
gestación.
1.1.5. El EHAZ produce resorciones y cambios en el tamaño y peso de los fetos.
La administración del EHAZ en el período del día 1-21 de gestación, produce
pérdida post-implantación de los fetos más proximales a la vagina (fig. 9), esta pérdida
coíncide con una hemorragia densa (presencia de tejido y moco cervical) observada
durante los días 6 y 7 de gestación en todas las ratas tratadas con el extracto. Dichos
efectos son dependientes de dosis como se muestra en el cuadro 7.
Figura No. 9. Efectos del EHAZ sobre la implantación y tamaño de los fetos más cercanos a la vagina.
42
También se presenta una disminución en tamaño y por consiguiente en peso, de
los fetos más cercanos a la vagina.
En el periodo de administración del día 7-21 no se observan cambios
significativos (Prueba de Duncan, P<0.05) en cuanto al tamaño de los fetos más
cercanos a la vagina y no se presentan resorciones. Al administrar el EHAZ en el último
período de gestación no se presentaron resorciones, pero se presentaron problemas
toxicológicos dependientes de dosis, los cuales se resenaran en el siguiente punto.
Cuadro No.7.Pérdida de fetos post-implantación con la administración del EHAZ en diferentes
periodos de gestación.
1.2. EFECTOS TOXICOLÓGICOS DE DIFERENTES DOSIS DEL EHAZ EN DIFERENTES ETAPAS DE LA GESTACIÓN.
La administración del EHAZ en la última fase del embarazo produce mortalidad
fetal y morbilidad materna dependiente de dosis. Las ratas tratadas en éste período
presentan hemorragias al día 19 de gestación, pero su estado de salud en general es
bueno. Al día 21 de gestación se presentan problemas para parir: pelo erizado,
inmovilidad, tremor, hemorragias con presencia de tejido y moco cervical y dificultad para
respirar, muriendo en la noche del día 21. Al realizar la autopsia se encontró a los fetos
en estado de descomposición. El grado de descomposición indica que los fetos
fallecieron entre el día 19 y 20 de gestación. El efecto toxicológico fue dependiente de
dosis y de periodo de administración (cuadro 8)
PERIODO DE ADMINISTRACIÓN ( días )
1-21 7-21 14-21
PORCENTAJE DE PERDIDA
TRATAMIENTO
EHAZ 25 mg 12.50 0 0 EHAZ 50 mg 20.83 0 0
Control Alcohol / agua 70:30
0 0 0
43
.Cuadro No. 8. Datos de mortalidad y morbilidad fetal y materna cuando se administra el EHAZ en
diferentes etapas de gestación.
Porcentaje de Morbilidad y Mortalidad
Tratamiento Control alcohol / agua
EHAZ 25 mg
EHAZ 50 mg
Periodo de admón. 1-21 7-21 14-21 1-21 7-21 14-21 1-21 7-21 14-21
Morbilidad Fetal 0 0 0 0 0 0 0 0 * Mortalidad Fetal 0 0 0 0 0 20 0 0 100 Morbilidad materna 0 0 0 0 0 60 0 0 100 Mortalidad materna 0 0 0 0 0 20 0 0 100
* No se verificó la morbilidad fetal, ya que todos los animales se sacrificaron hasta el dia 21 de G 2. EFECTOS DEL EHAZ SOBRE EL CICLO ESTRAL DE LA RATA.
La administración aguda del EHAZ modifica el ciclo estral normal de la rata
dependiendo de la etapa del ciclo en que el extracto es administrado (estado hormonal).
Cuando se inicia la administración del EZ en la fase del diestro (fig. 10, panel A), se
presentan dos ciclos normales seguidos de un proestro persistente. Al administrar el
extracto en el proestro (fig. 10, panel B), se termina el ciclo en el cual se administró y
después se presenta un proestro persistente al igual que el anterior, pero cuando la
administración se hace en el día del estro, este se mantiene durante 8 días consecutivos
(fig. 10, panel C). En todos los casos, cundo se deja de administrar el extracto, las ratas
regresan a su ciclo estral normal.
3. EFECTOS DEL EHAZ EN EL DESARROLLO FOLICULAR.
El EHAZ fue administrado en la fase de metaestro. La administración de 25 mg
produjo acortamiento del ciclo estral, pasando de metaestro a proestro, manteniéndose
en ésta etapa 2 días para después pasar a estro. Los grupos controles (s.s.f. y de
solución alcohol/agua 70:30) siguieron un ciclo estral normal, sin brincarse etapas del
ciclo como con el EHAZ (fig. 11)
44
Figura No.10.Efectos de la administración í.vag. del EHAZ en diferentes etapas del ciclo estral.
A: Administración del EHAZ en la fase de diestro. B: Administración en proestro C: Administración en el estro.
45
La administración de 50 mg también produjo acortamiento del ciclo estral,
pasando de metaestro a proestro, cambiando al día siguiente a estro y manteniendose
en esta etapa por 3 días. Al igual que con 25 mg no hubo cambios significativos en los
grupos controles (fig. 12).
El efecto fue dependiente de dosis.
4. EFECTO DE DIFERENTES DOSIS DEL EHAZ DESPUÉS DE ADMINISTRACIÓN A RATAS PREPÚBERES CON INDUCCIÓN DE LA OVULACIÓN.
La administración s.c. del EHAZ produce efectos anovulatorios dependientes de
dosis (fig. 13). Conforme se va aumentando la dosis del EHAZ se va disminuyendo
significativamente (Prueba t Students P<0.05) la cantidad de cuerpos Iúteos presentes
en los ovarios de las ratas tratadas y aumentan los folículos maduros. Con las tres
primeras dosis se muestra este patrón de respuesta, pero con la dosis de 200 mg se
observa aumento en el número de folículos maduros, pero el número de cuerpos lúteos
no cambia con respecto a la dosis de 100 mg. Con la dosis de 400 mg todos los
animales mostraron morbilidad a partir del segundo día de administración y murieron
unas horas antes de la hora correspondiente al sacrifício.
El análisis posmorten de los ovarios, mostró un elevado porcentaje de folículos
maduros y una muy pequena proporción de cuerpos lúteos.
Estos datos son indicativos de toxicidad sistémica a altas dosis del extracto.
No se observaron cambios macroscópicos significativos en el tracto reproductivo
con respecto al control.
5. EFECTOS DEL EHAZ RATAS EN PSEUDOGESTACION.
El tiempo normal de pseudogestación en ratas es de aproximadamente 14 días.
La pseudogestación en las ratas tratadas con el vehiculo alcohol/agua 70:30, presentó
una duración normal, mientras que en las ratas tratadas con el EHAZ, la psg se
interrumpió antes de 14 días. La duración de la psg fue dependiente de la dosis
administrada (fig. 14).
46
Figura No. 11. Efectos del EHAZ (25 mg de peso seco de la hoja de zoapatle) , sobre el desarrollo folicular en ratas con ciclo estral normal, cuando la administracibn (vía i.vag.) inicia en la etapa de metaestro. (A) Administración aguda del EHAZ, (B) de solución salina fisiológica (s.s.f.) y (C) del vehiculo (Alcohol/Agua 70:30) .
47
Figura No. 12. Efectos del EHAZ (50 mg de peso seco de la hoja de zoapatle) sobre el desarrollo folicular en ratas con ciclo estral normal, cuando la administración (vía i.vag.) inicia en la etapa de metaestro,. (A) Administración aguda del EHAZ, (B) de solución salina fisiológica (s.s.f.) y (C) del vehiculo (Alcohol/Agua 70:30) .
48
Figura No. 13. Efecto anovulatorio de los EHAZ (administración vía subcutánea) en ratas prepúberes a las cuales se les indujo la ovulación con la administración de gonadotropinas coriónicas equina y humana. Control: administración de aceite vegelal (vehículo). *Prueba t- Student, P<0.05.
49
Figura No. 14. Interrupción de la pseudogestación producida por la administración i.vag. de
diferentes dosis del EHAZ.
50
CAPITULO IV
DISCUSIÓN
51
En la investigación de plantas usadas en la medicina tradicional, la elección del
solvente adecuado para la extracción es muy importante. Usualmente son utilizados
solventes orgánicos, polares o moderadamente polares. Los extractos acuosos ofrecen
mayor dificultad ya que solo se extraen un número limitado de compuestos y es difícil
homogeneizar el procedimiento. Sin embargo, en la medicina tradicional la extracción
acuosa es la más usada, ya sea hirviendo las partes de la planta burdamente
pulverizada o macerándolas con agua fría por corto o largo tiempo. Por lo tanto, si
fueran efectos farmacológicos de interés, los principios activos deberán ser extraídos por
el agua en forma adecuada (Samuelsson y cols., 1985).
Uno de los problemas que presenta el estudio de efectos farmacológicos en
extractos acuosos, es la rápida descomposición y en consecuencia, la pérdida de las
acciones farmacológicas. Una de las alternativas es hacer los extractos en mezclas
hidro-alcohólicas, los cuales preservan por más tiempo el producto y además por poseer
una polaridad intermedia, se garantiza una mayor extracción de los principios activos.
Considerando que el alcohol etílico puede enmascarar los efectos de los
principios activos extraídos, es necesario el uso de controles adecuados. En el caso del
EHAZ empleado en este estudio se utilizó una proporción de alcohol etílico
absoluto/agua 70:30. La administración de éste producto no produjo alteraciones del
tejido vaginal tales como ulceraciones, irritaciones, molestias para el animal, ni se
observaron efectos diferentes a los de los controles acuosos.
En consecuencia, podemos afirmar que todos los efectos observados se
relacionan con los principios activos presentes en los EHAZ administrados.
En este estudio se demuestra que la rata es un modelo animal adecuado para
observar los efectos del EHAZ en diferentes estados hormonales. Se evaluaron también
los efectos del EHAZ en ratas en diferentes condiciones reproductivas, debido a que la
rata es la especie donde se han observado mayores diferencias en cuanto a efectos de
los EZ (Gallegos y cols., 1977; Landgren y cols., 1979). Por ello, en nuestros estudios
con el EHAZ, se utilizó esta especie tratando de eliminar la mayor cantidad de variables
posibles.
Otras variables que se han comprobado que influyen en los efectos de los EHAZ,
es la época del año en la que se colecta la planta (Estrada y cols., 1983) y la subespecie
52
de planta que se utiliza (Estrada y cols, 1983, 1985; Angulo y cols, 1985; Valencia y
cols., 1985).
Para este estudio de utilizaron plantas de zoapatle (Montanoa tomentosa)
colectadas en el Estado de Tlaxcala en los meses de Noviembre-Diciembre en la época
de floración, debido a que se ha comprobado que los efectos del zoapatle a nivel
reproductivo, se observan a su potencia máxima durante esta etapa (Estrada y cols.,
1983).
1. EFECTOS FARMACOLÓGICOS Y TOXICOLÓGICOS DEL ZOAPATLE EN LA GESTACIÓN.
1.1. Efecto anti-implantatorio.
Los resultados de éste trabajo muestran una pérdida post-implantación de los
fetos más proximales a la vagina la cual es dependiente de dosis y de la vía de
administración empleada (i. vag.). Este efecto pudiera considerarse local (difusión del
extracto de la vagina al útero), ya que se afectan en mayor proporción los fetos más
cercanos al sitio de administración. Sin embargo, esta pérdida también coincide con la
hemorragia observada durante los días 6 y 7 de gestación en todas las ratas tratadas
con el EHAZ y con la disminución del peso corporal de la madre entre los días 6-14 de
gestación, por lo que el efecto también puede tener un componente sistémico.
Además del efecto de pérdida postimplantación, también se observa disminución
en tamaño y peso de los fetos más proximales al sitio de la pérdida post-implantación.
Esto también puede estar relacionado con el efecto local, pero el componente sistémìco
también podría estar relacionado con la pérdida de peso de la madre.
En este caso, el efecto del EHAZ podría ser como el de un agente
antiprogestágeno, ya que se sabe que las antiprogestinas interfieren con la
transformación del endometrio en una estructura apta para la implantación del producto
(Spitz y cols., 1996). Las dosis administradas en este estudio, solo produjeron el efecto
anti-implantatorio en los fetos más proximales a la vagina, probablemente porque las
concentraciones que se alcanzaron localmente en estos sitios en esa etapa crítica fué
mayor. A dosis mayores se observan efectos toxicológicos generalizados tanto en
madre como en fetos.
53
La acción de la P antes de la implantación es la de:
1. Facilitar y reforzar la retroalimentación positiva de los E sobre la LH cerca del final de
la fase folicular.
2. Sinergizarse con el E durante la fase luteal para mantener el control de la
retroalimentación negativa sobre la secreción de gonadotrofinas.
3. Transformación del endometrio de un estado proliferativo a uno secretor para el
mantenimiento del producto.
4. Mantenimiento de la integridad miometrial (Spitz y cols., 1996).
Si la P no se mantiene en niveles adecuados para que se lleven a cabo estos 4
pasos, se presenta el efecto de anti-implantación.
Nuestros resultados confirman el efecto anti-implantatorio de las EZ reportado
previamente por Gallegos y Cortes (1974).
1.2. Efecto del EHAZ en diferentes etapas de gestación.
Existen tres períodos críticos en la G:
1). La implantación de los productos (día 7 de gestación).
2). El período embrionario, en donde la proliferación y diferenciación de tejídos y órganos es
predominante.
3). El período fetal: el crecimiento generalizado y la maduración funcional están en
progreso (Wilson, 1974).
Cuando el EHAZ se administró durante todo el período de gestación (1-21) no se
presentaron problemas en ningún período de la gestación. Probablemente algunos de
los principios activos del extracto estén induciendo su propio metabolismo enzimático, ya
que un fármaco es capaz de inducir o inhibir su propio metabolismo enzimático y el uso
contínuo puede interferir con la función del hígado o riñón materno o en otros órganos
esenciales para la homeostásis, incluyendo la eliminación de otras sustancias
potencialmente embriotóxicas (Wilson, 1974).
La administración del EHAZ en el segundo tercio del embarazo no interfiere con
el desarrollo de la gestación.
54
El período de exposición al fármaco en la gestación determina el tipo de efectos
toxicológicos a presentarse, ejemplo: muerte, malformación, retardo del crecimiento o
deficiencia funcional. En el periodo embrionario dichos efectos se manifiestan en
malformaciones o muerte embrionaria. En el periodo fetal dan como resultado retardo en
el crecimiento o deficiencia funcional y altas dosis podrían llegar a producir histogénesis
anormal ó muerte fetal (Wilson, 1974).
Al administrarse los EHAZ en la última etapa del embarazo, los efectos
toxicológicos en los fetos pueden ser producidos por una fuerte vasoconstricción, lo cual
disminuye el aporte sanguíneo y de nutrientes, generando isquemia, la cual podría ser la
causa de la muerte fetal. En el caso de la madre, el estado de descomposición de los
productos podría haberle generado una septisemia ó al no haber la señal embrionaria
para que se desencadene el proceso de parto, las ratas presentan retardo y dilatación
cervical inadecuada con la consecuente mortalidad.
En el último periodo de la G, el feto requiere de un mayor cantidad de oxígeno
para poder subsistir, en consecuencia, la madre aumenta su consumo de agua (Stock &
Metcalfe, 1994). Por lo tanto, si disminuye el aporte de oxígeno en esta etapa, el feto
muere. Un agente antiprogestágeno podría disminuir la hiperventilación que produce la
progesterona per se. La disminución en la concentración de P, puede producir un
aumento en la presión de dióxido de carbono arterial, lo cual podría provocar efectos
toxicológicos a los fetos (Hosenpud y cols., 1983; Lyons y cols., 1959). El mecanismo
por el cual la P produce hiperventilación en la G aún no esta bien determinado (Stock &
Metcalfe, 1994).
Se ha encontrado que en el tercer tercio de la G hay un aumento significativo en
el número de receptores a OT en el útero (Kimura y cols., 1992). Varios investigadores
han encontrado efectos oxitócicos en el zoapatle, aunque este efecto ha sido
cuestionado por otros grupos. La muerte fetal que se presentó en nuestros resultados
también podría ser explicada por un potente efecto oxitócico, y este podría dar lugar a
una fuerte contracción uterina y por lo tanto promover la asfixia fetal con la consecuente
mortalidad fetal (Bejar y cols., 1985).
55
2. EFECTO LUTEOLÍTICO.
En el modelo de pseudogestación, el cuerpo lúteo se mantiene generalmente
durante 11-12 días y el estado de psg tiene una duración de 13-14 días. Nuestros
resultados indican que la administración del EHAZ produce interrupción de la psg
dependiente de dosis, lo cual nos habla de una involución del cuerpo lúteo (luteólisis).
Se ha determinado que la inducción de psg en rata da como resultado dos picos
diarios de secreción de PRL (nocturno y diurno) (Butcher y cols., 1972; Smith y cols.,
1975; Gunnel y Freeman, 1983) y que la secreción de P en el primer tercio de la psg y la
G dependen de la PRL. En los días 9-14 hay regresión del CL y en consecuencia
disminuyen los niveles de P (Bartosik y cols., 1975); Murakami y cols., 1979). Por lo
tanto, si no se mantiene la secreción de PRL en el primer tercio de la psg, el cuerpo lúteo
pierde su actividad secretora, los niveles de P bajan y en consecuencia, el proceso de
psg termina al no haber aporte suficiente de P para que el tracto reproductivo se
mantenga viable, ya que el SNC detecta falta de producto en el útero.
Se ha visto que la administración del antiprogestágeno RU486 en ratas en psg
produce un efecto luteolítico y antiluteolítico, el cual depende del período en que se inicie
la administración del fármaco, ya que si se administra en el segundo periodo de psg
induce luteólisis, y si se administra el la primera etapa no se afecta la actividad luteal
(Uilenbroek y cols., 1995). En nuestros estudios, el extracto fue administrado durante
todo el periodo de psg, observándose acortamiento de la psg dependiente de dosis, lo
cual nos indica que el modelo de psg en la rata es adecuado para demostrar el efecto
luteolítico de los EHAZ.
Al administrar el EHAZ en ratas cíclicas para Determinar los efectos del extracto
sobre el desarrollo folicular, se presentó el mismo efecto que en la psg: luteólisis.
La administración del EHAZ en el metaestro produjo acortamiento del ciclo estral
dependiente de dosis. La etapa del metaestro, es donde el cuerpo lúteo empieza a ser
funcional, es decir, el nuevo cuerpo lúteo formado en las ratas cíclicas, secreta
progesterona solamente en esta etapa, declinando la concentración de progesterona al
día siguiente (Smith y cols., 1976), por lo tanto, dicho efecto podría ser debido a la
inducción de luteólisis por el EHAZ, lo cual se refleja en acortamiento del ciclo estral.
56
Al administrar el EHAZ en la etapa del proestro, no hay cambio a la siguiente
etapa (estro) como en las ratas control. Este efecto podría ser inducido por un agente
antiprogestageno, o del tipo estrogénico, causando un desequilibrio endógeno en la
proporción estrógeno-progesterona, alterando la retroalimentación de esteroides a nivel
de hipotálamo ó hipófisis. Gómez y cols., (comunicación personal), encontraron que la
administración del EHAZ por vía oral en ratas ovariectomizadas, no produce
estrogeniración, por lo tanto se descarta el efecto estrogénico. En la tarde del proestro
el cuerpo lúteo degenera y la secreción de progesterona disminuye (Smith y cols., 1976).
En estudios recientes se ha determinado que el radical superóxido regula la
funcioón del cuerpo lúteo (Sawada & Carson, 1991). Este radical produce una pérdida
inmediata de la producción de AMPc LH-dependíente y de la secreción de P (Gatzuli y
cols., 1991) por lo tanto, si existe un desbalance en la producción del radical superóxido,
se rompe la cadena metabólica, ya que no se forman los peróxidos de lípidos
responsables de la estimulación de fosfolipasa A2 (Sevanian y cols., 1988) y
cicloxigenasa (Egan y cols., 1976) necesarias para la producción de ácido araquidónico y
para la síntesis de prostaglandinas, la cuales desencadenan el proceso de luteolísis
(Sawada & Carson, 1996).
La administración de PGF2α, produce luteólisís en vacas y yeguas (Hansel y cols.,
1973; lnskeep, 1973). Se ha demostrado que un aumento en la concentración de
estradiol en la última etapa del diestro incrementa la síntesis y liberación de PGF2α
uterina induciendo la luteólisis, con el consecuente acortamiento del ciclo reproductivo
(Gengenbach y cols., 1977; Hixon y cols., 1983; Hughes y cols., 1987).
Al ser administrado el EHAZ en vacas por vía intrauterina, se observó el mismo
efecto producido por la administración de las prostaglandinas, por lo cual, no se descarta
que el efecto luteolítico se deba a una estimulación de la sintesís de prostaglandinas, la
cual podría estar ligada a la OT, ya que se ha determinado también que los farmacos
agonístas de OT ejercen parte de sus efectos estimulantes del útero por medio de la
estimulación de PGF2α. Al adicionar OT al útero de rata en el último período de
gestación se observa un marcado incremento en la liberación de prostaglandinas
(Williams & Tahir, 1980).
57
3. EFECTO DEL EHAZ EN RATAS PREPÚBERES A LAS QUE SE HA INDUCIDO OVULAClÓN.
En el protocolo de inducción de ovulación en ratas prepúberes, se observa que el
EHAZ produce efectos anovulatorios (aumento de folículos maduros y disminución de
cuerpos lúteos), los cuales podrían deberse a una inhibición del pico de LH causado ya
sea por una alta concentración de estrógenos persistente o por una baja concentración
de estrógenos, la cual no es suficiente para disparar los picos de LH y FSH. Al igual que
en el efecto luteolítico, esto podría ser debido al desequilibrio esteroidal con la
consecuente anovulación.
Los niveles de estrógenos se mantienen bajos al inicio de la fase folicular,
despues van aumentando hasta alcanzar su pico máximo y decaer paulatinamente justo
antes de la ovulación, este cambio estimula el disparo de los picos de LH y FSH, los
cuales promueven la ovulación (Tortora y cols., 1984).
Se ha establecido que en ratas cíclicas de 4 días la secreción de P en el diestro
aumenta la retroalimentación negativa del estradiol sobre la secreción de LH y cuando
los niveles de P caen, aumentan los de E y LH facilitando la ovulación (Beattie y cols.,
1975; Kaneko y cols., 1988; Smith y cols., 1975).
Aunque parece que el estradiol es el único que inicia la liberación del pico de LH,
también debe ocurrir un incremento en la concentración de P, es cual es esencial para
mantener la duración normal de la liberación de LH (Liu & Yen, 1983).
La P tiene efecto positivo sobre la amplitud del pulso de LH (Hoff y cols., 1983),
pero no tiene efecto significativo sobre la frecuencia del pulso de LH (Couzinet &
Schaison, 1993), lo cual sugiere que la P potencia los efectos del estradiol sobre la
liberación de LH de la glándula pítuitatia (Byme y cols., 1998).
Por lo tanto, el efecto de los EHAZ de inhibición de la ovulación, podría ser
comparado con el que producen los fármacos antiprogestágenos.
Los antíprogestágenos inhiben la ovulación por dos mecanismos:
1. Interfieren con el crecimiento de los folículos dominantes (Efecto antifoliculotrófico ó
folículoestático).
2. Inhibiendo el pico de LH.
58
La administración del antiprogestágeno RU486 (potente antagonista de
progesterona) en ratas cíclicas, mostro una inhibición de la ovulación del 100%. Los
mecanismos de acción de éste fármaco son de carácter dual, es decir; parece estar
actuando como inhibidores del crecimiento folicular y de la liberación de la LH (Sánchez-
Criado y cols, 1990).
Por lo tanto, si existe un desbalance entre estas hormonas, se presentaran
efectos anovulatorios.
4. VIABILlDAD DE LA VÍA INTRAVAGINAL PARA LA ADMINlSTRACIÓN DEL EHAZ.
La vía intravaginal (i. vag.) es utilizada generalmente en el tratamiento de
procesos infecciosos locales, para administrar sustancias o preparados anticonceptivos
(espermatizidas, inhibidores de la motilidad del espermatozoide, etc.) y para tratamientos
del tracto reproductivo.
En este estudio se utilizó la vía i. vag. debido a que los estudios realizados por
Ortiz y cols. (1995) utilizando el EHAZ en vacas, mostraron efectos luteolíticos y que
estos podrían ser debidos a un efecto local sobre el CL de la vaca.
Otra de las razones por la cual se uso esta vía de administración, fue debido a
que en estudios realizados con el extracto acuoso de Montanoa Frutescens sobre la
motilidad y viabilidad de los espermatozoides humanos, se observó una inhibición de la
motilidad espermática dependiente de dosis, Negando hasta un 100% de inhibición. En
cuanto a la viabilidad, con Montanoa tomentosa a las dosis utilizadas no se observó una
inhibición total, pero si se presentó una inhibición significativa dependiente de dosis
(Gúzman-Durán y cols., 1988).
En el miometrio existen una gran densidad de receptores β-adrenérgicos los
cuales podrían ser modulados por hormonas esteroideas, dicho efecto es dependiente
de especie (Maltier y cols., 1989). En ratas cíclicas sin tratamiento hormonal, el
contenido miometrial de receptores β-adrenérgicos ha mostrado ser más elevada durante
el proestro (Krall y cols., 1978), cuando los niveles plasmaticos de P y 17β-Estradiol
están más elevados (Butcher y cols., 1974).
59
Varios autores han encontrado que el efecto relajante de los EHAZ sobre el
músculo uterino, ha sido explicado por acción sobre receptores β2 adrenérgicos y por
accion antagónica a nivel de canales de calcio, tipo verapamil. Recientemente ha sido
encontrado que bloqueadores adrenérgicos β2 poseen efecto antifertilidad, por inhibicion
de la motilidad de espermatozoos y se están realizando estudios sobre formulaciones por
vía vaginal de estos compuestos con el fin de evitar, en parte, los efectos sistémicos.
Considerando que varios de los mecanismos antifertílidad del zoapatle han sido
comprobados y que es una planta que se sigue usando con estos fines, es interesante
conocer los efectos de estos extractos utilizando vías de administración alternativas.
Nuestros estudios nos permiten confirmar que la administración i.vag. es viable para
producir efectos sistémicos de los principios activos de los EHAZ, que se manifiestan
tanto como efectos anovulatorios y luteolíticos, como por efectos toxicos asociados con
la dosis.
Los principios activos son absorbidos, liberados a la circulación sistemica y
alcanzan los sitios activos en concentraciones adecuadas para ejercer esos efectos.
60
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES.
61
1.La administración del EHAZ por vía i.vag. a ratas en diferentes etapas de gestación produce: a). Pérdida post-implantación con reabsorción de los fetos más cercanos
a la vagina cuando se administra desde el día 1 de gestación y disminución de tamaño y peso de los fetos más cercanos a los fetos reabsorbidos.
b) Efectos toxicológicos (Mortalidad y Morbilidad felal y materna)
dependientes de dosis al administrarse en el último período de gestación.
2. Los efectos del EHAZ en el ciclo estral de la rata(vía i.vag.)dependen de
la dosis y de la etapa del ciclo estral de la rata en que es administrado. 3. La administración de diferentes dosis del EHAZ en ratas prepúberes en
las que se ha inducido la ovulación produce efectos anovulatorios dependientes de dosis. La dosis más alta(400 mg)fue letal para el 100% de los animales tratados (vía subcutánea).
4.En el modelo de pseudogestación(psg),el EHAZ produce interrupción del
psg dependiente de dosis (efecto luteolítico). 5. Todos los efectos del EHAZ obtenidos después de la administración
intravaginal confirman que esta vía permite la liberación de los principios activos tanto a nivel local como sistémico, ya que se observan estos dos tipos de efectos.
62
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