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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
Identificación de genes de resistencia a Betalactámicos de cepas (BLEE)
en dos especies de aves silvestres: Cormorán Neotropical (Phalacrocorax
brasilianus) y la Focha Andina (Fulica ardesiaca) en la laguna de
Yahuarcocha- Imbabura
Trabajo de grado presentado como requisito para optar por el Título de
Médico Veterinario y Zootecnista
Autora:
Angélica Nathaly Reyes Calupiña
Tutor:
Nivia Cándida Luzuriaga Neira, Ph.D.
Quito, Junio 2017
II
Dedicatoria
A mi familia, que con su apoyo incondicional durante mi carrera y por la confianza
que han tenido sobre mí.
A Fernando, por ser mi amigo y compañero de vida, ejemplo de vida.
A Nivia, amiga y profesora que todos los días me enseña cómo ser mejor
profesional.
Naty.
III
Agradecimientos
A la Dirección General de Postgrado e Investigación de la UCE, por el
financiamiento parcial del estudio, dentro del programa Proyectos Semilla Etapa
3. Este incentivo fue un factor de motivación para mi trabajo.
Mi agradecimiento al laboratorio de Bacteriología y Micología de la FMVZ, y la
UNIETAR, donde pude poner en marcha los conocimientos teóricos y prácticos
necesarios para el estudio y donde he podido desarrollar mis capacidades y
destrezas en el laboratorio.
Al Cuerpo de Bomberos y a la Empresa Mixta de turismo de Ibarra en
Yahuarcocha, por el apoyo logístico en el sitio. Su gentileza y buena acogida nos
ayudaron a cumplir las metas en el terreno. Así mismo al Ministerio del Ambiente
de Ibarra por el permiso de investigación otorgado en un tiempo eficiente.
A mis profesores de la facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de quienes
he recibido los conocimientos de base de una manera incondicional en todas las
etapas en el transcurso de la carrera.
A mi familia: mis padres, hermano y Pilar que me apoyan a diario con su afecto
y con su trabajo también; a mis y amigos que están y han estado presentes en
esta etapa de mi vida brindándome su apoyo confianza y motivación.
Agradezco a mi tutora de Tesis la doctora Nivia Luzuriaga, por sus orientaciones,
acompañamiento, eficiente supervisión y confianza profesional. Este trabajo ha
sido posible gracias a su oportuna gestión de recursos.
Finalmente, a Dios por las bendiciones que derrama sobre mí todos los días.
IV
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORIA INTELECTUAL
Yo, ANGÉLICA NATHALY REYES CALUPIÑA, en calidad de autora de la tesis
“Identificación de genes de resistencia a Betalactámicos de cepas (BLEE) en
dos especies de aves silvestres: Cormorán Neotropical (Phalacrocorax
brasilianus) y la Focha Andina (Fulica ardesiaca) en la laguna de Yahuarcocha-
Imbabura”, por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL
ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que nos pertenecen o parte de
los que contienen esta obra, con fines estrictamente académicos o de
investigación.
Los derechos que como autora me corresponde, con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con el establecimiento
de los artículos 5, 6,8 y 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual
y su Reglamento.
Quito, 05 de Junio del 2017
Angélica Nathaly Reyes Calupiña
C.C.: 1721548590
E-mail: nathaly9015@hotmail.com
V
INFORME DEL TUTOR
En mi carácter de tutora del trabajo de grado presentado por la señorita: Angélica
Nathaly Reyes Calupiña, para optar por el título o grado de Médico Veterinario y
Zootecnista, cuyo título es “Identificación de genes de resistencia a
Betalactámicos de cepas (BLEE) en dos especies de aves silvestres: Cormorán
Neotropical (Phalacrocorax brasilianus) y la Focha Andina (Fulica ardesiaca) en
la laguna de Yahuarcocha- Imbabura”. Considerando que dicho trabajo reúne los
requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la presentación pública y
evaluación por parte del jurado examinador que se designe.
En la ciudad de Quito, a los 5 días del mes de Junio del 2017
Nivia Luzuriaga, Ph. D.
C.C.:1103364517
nluzuriga@uce.edu.ec
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
Identificación de genes de resistencia a Betalactámicos de cepas (BLEE) en
dos especies de aves silvestres: Cormorán Neotropical (Phalacrocorax
brasilianus) y la Focha Andina (Fulica ardesiaca) en la laguna de Yahuarcocha-
Imbabura.
Resumen
Las aves acuáticas que viven en humedades alto andinos explotan los recursos
de ecosistemas contaminados debido a la cercanía de éstos con zonas
agrícolas, ganaderas y de actividad turística que promueven la contaminación
del agua. Por tanto, las aves acuáticas podrían convertirse en reservorios y
diseminadores de enfermedades bacterianas, parasitarias o víricas que pueden
ser zoonóticas y afectar a la salud pública. El presente estudio se realizó en la
Laguna de Yahuarcocha con el fin de determinar la presencia de genes de
resistencia de cepas de E coli BLEE en dos especies de aves acuáticas: la
Focha Andina (Fulica ardesiaca) y el Cormorán Neotropical (Phalacrocorax
brasislianus), durante el periodo de Octubre del 2016 a Abril del 2017. Las aves
fueron capturadas manualmente. Se colectaron 29 hisopados cloacales, 15 de
la Focha Andina y 14 del Cormorán Neotropical. Los resultados mostraron un
48.2% de cepas BLEE identificadas fenotípicamente. Mediante PCR se identificó
que el gen bla CTX-M estuvo presente en las dos especies, uno en la Focha
Andina y tres en el Cormorán Neotropical. Los resultados negativos fueron
mayoritarios para las dos especies identificándose un 13,8% (4/29). El gen bla
TEM tuvo un 6.90 % de positividad (2/29), uno para la Focha Andina y uno para
el Cormorán Neotropical se obtuvo un 3,45% 1 individuo por especie. Para el
gen bla SHV no se obtuvieron resultados positivos. Adicionalmente se realizó
extracción de ADN total a partir de agua de la laguna para realizar PCR e
identificar genes de resistencia; las muestras fueron negativas (0/4). Las
especies estudiadas podrían presentar un elevado riesgo en la diseminación de
enfermedades bacterianas principalmente las especies migratorias como el
Cormorán Neotropical.
X
Palabras clave: AVES ACUÁTICAS, ENFERMEDADES BACTERIANAS,
E.COLI BLLE, FOCHA ANDINA, CORMORÁN NEOTROPICAL
XI
Abstract
Identification of resistance genes to Betalactamic strains (BLEE) in two species
of wild birds: Neotropical Cormorant (Phalacrocorax brasilianus) and Andean
coot (Fulica ardesiaca) in Yahuarcocha lake.
Waterfowl living in high Andean wetlands share sources of contaminated
ecosystems. Due to the proximity of these with agriculture, livestock and touristic
activities which promotes the water contamination. Therefore waterfowl could
have the potential to disperse certain pathogenic microorganisms and become
as a reservoirs and disseminators of many microorganisms (Bacteria, virus,
parasites) that can be responsible for wide geographic distribution. Our study was
aim to determinate the occurrence of resistance genes producing E. coli BLEE
isolated from feces of two species of waterfowls: Andean coot (Fulica ardesiaca)
and Cormorant Neotropical (Phalacrocorax brasislianus) in Yahuarcocha lake. A
total of 29 fecal samples were collected 14 Focha Andina and 15 Cormorant
Neotropical from October 2016 to April 2017. The results showed that E.coli
BLEE isolates were detected in 48, 2%. Identification of CTX-M was confirmed in
both species one for F. ardesica and three for P. brasilianus.13, 8% (4/29)
respectively. We also detected the gene TEM 6.90% (2/29) one for each specie.
SHV type was negative for all isolates. Additionally we did DNA extraction of
water samples from Yahuarcocha Lake in order to determinate resistance genes.
This study couldn´t detect any gene from the water sediment (0/4). The most
prevalent betalactamase gene detected was bla CTX-M. The species studied
could present a high risk in the dissemination of bacterial diseases mainly
migratory birds such as Phalacrocorax brasilianus.
Key words: AQUATIC BIRDS, BACTERIAL DISEASES, E.COLI BLLE,
ANDEAN COOT, CORMORANT NEOTROPICAL.
I certify that the above and foregoing is a true and correct translation of the
original document in Spanish
Nathaly Reyes
Certified translator I.D 1721548590
XII
Índice General
Resumen ......................................................................................................... IX
Abstract ............................................................................................................ XI
1. INTRODUCCIÓN .................................................................................... 1
2. MARCO TEÓRICO .................................................................................. 5
2.1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ...........................................................................5
2.1.1. Humedales Alto andinos del Ecuador ...........................................................5
2.1.2. Descripción taxonómica y ecología de las especies en estudio ............6
2.1.3. Importancia de la resistencia bacteriana ......................................................7
2.1.4. Antibióticos Betalactámicos .............................................................................8
2.1.5. Mecanismos de Resistencia Bacteriana.......................................................8
2.1.6. Betalactamasas de Tipo BLEE .....................................................................10
2.1.7. Importancia de la transmisión de cepas BLEE en animales hacia
seres humanos ..............................................................................................................10
2.1.8. Reacción en cadena de la polimerasa PCR..............................................12
3. METODOLOGÍA.................................................................................... 15
3.1. Tipo de investigación .......................................................................................15
3.2. Fase de campo.- colecta de muestras ........................................................16
Aves: 16
Agua: 17
3.3. Fase de laboratorio.- cultivo y aislamiento ................................................18
3.4. Fase de laboratorio.- Análisis molecular ...................................................19
3.5. Análisis y cuantificación de los resultados .................................................25
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................. 26
4.1. Aislamiento de E. coli BLEE en heces ........................................................26
4.2. Identificación fenotípica E. coli BLEE, técnica de doble disco. ............28
4.3. Resultados e interpretación genes bla CTM-X, bla TEM y bla SHV .........30
4.4. Cepas del agua ................................................................................................35
5. Conclusiones ......................................................................................... 37
XIII
6. Recomendaciones. ................................................................................ 38
7. Bibliografía ............................................................................................ 39
8. Anexos .................................................................................................. 48
ANEXO 1. Tabla para registro de datos morfométricas e identificación de la
muestra biológica..........................................................................................................48
ANEXO 2. Procedimiento en terreno, captura de Focha Andina en la laguna
de Yahuarcocha para toma de muestra (hisopado cloacal) ...........................49
ANEXO 3. Fotografía tomada para identificación de aves silvestres. ..........50
XIV
Índice de Figuras
Figura 1. Pasos ciclo de PCR (Fuente: Tamay de Dios, 2013) ....................... 13
Figura 2. Laguna Yahuarcocha ...................................................................... 16
Figura 3. Aspecto típico de colonias positivas a E. coli BLEE, donde las enzimas
ß-D-Glucuronidasa se fijan con el sustrato X-Glucuronida, y se presentan de
color azul intenso o violeta en agar Crhomocult + Cefotaxima 1g/lt. ............... 26
Figura 4. Identificación de cepas positivas para E. coli, BLEE y sin crecimiento
(Negativo) ....................................................................................................... 27
Figura 5. Identificación fenotípica de cepa resistente a E. coli BLEE, en muestra
de heces de Cormorán neo tropical de la laguna de Yahuarcocha, donde se
evidencia un aumento de más 5 mm en CTX+C con respecto a CTX30. ........ 28
Figura 6. Porcentaje de E. coli BLEE en dos especies de aves acuáticas de la
laguna Yahuarcocha, Ecuador (n=29) ............................................................. 29
Figura 7. Resultados de PCR del gen CTX-M, en dos especies de aves silvestres
acuáticas, con un tamaño de 600 pb. .............................................................. 31
Figura 8. Resultados de PCR del gen SHV, en dos especies acuáticas silvestres
de la laguna de Yahuarcocha, con un tamaño de 790pb. ................................ 31
Figura 9. Resultados de PCR del gen TEM, en dos especies acuáticas silvestres
de la laguna de Yahuarcocha, con un tamaño de 1000pb. .............................. 32
Figura 10. Resultados de PCR para los genes CTX-M, TEM y SHV de muestras
de agua de la laguna de Yahuarcocha ............................................................ 32
Figura 11. Porcentaje de cepas positivas y negativas del Gen CTX-M, en dos
especies de aves silvestres de la laguna Yahuarcocha, Ecuador (n=29). ....... 33
Figura 12. Porcentaje de cepas positivas al gen TEM, en dos aves acuáticas de
la laguna Yahuarcocha, Ecuador (n= 29). ....................................................... 33
(µl) 22
XV
Índice de tablas
Tabla 1. Betactamasas de importancia clínica, enzimas representativas de los
grupos de genes bla CMY, bla TEM, bla SHV, bla CTX-M, bla PER, bla VEB, bla GES,
bla KPC, bla SME, bla OXA, bla IMP, bla VIM, con sus grupos funcionales y numero
de enzimas ..................................................................................................... 11
Tabla 3. Mezcla maestra para realizar la prueba molecular Reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) de Gen bla CTX-M, con volumen final de 16 ul de
muestras positivas a cepas BLLE, de dos especies de aves silvestres Focha
Andina y Cormorán Neotropical tomadas en la laguna de Yahuarcocha -
Ecuador………………………………………………………………………………..22
Tabla 4. Mezcla maestra para realizar la prueba molecular Reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) de Gen bla TEM, con volumen final de 25 ul de muestras
positivas a cepas BLLE, de dos especies de aves silvestres Focha Andina y
Cormorán Neotropical tomadas en la laguna de Yahuarcocha – Ecuador. ...... 22
Tabla 5. Mezcla maestra para realizar la prueba molecular Reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) de Gen bla SHV, con volumen final de 25 ul de muestras
positivas a cepas BLLE, de dos especies de aves silvestres Focha Andina y
Cormorán Neotropical tomadas en la laguna de Yahuarcocha – Ecuador. ...... 23
Tabla 6. Primers utilizados para realizar la Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) de los genes bla CTX-M, bla TEM, bla SHV de muestras positivas a cepas
BLEE de dos especies de aves silvestres Focha Andina y Cormorán Neotropical
y muestras de agua laguna Yahuarcocha- Ecuador ........................................ 23
Tabla 7. Protocolo de la amplificación en el Termociclador para el gen bla CTX-
M. .................................................................................................................... 24
Tabla 8. Protocolo de la amplificación en el Termociclador para el gen bla TEM
........................................................................................................................ 24
Tabla 9. Protocolo de la amplificación en el Termociclador para el gen bla SHV.
........................................................................................................................ 24
XVI
Tabla de Abreviaturas
UNIETAR: Unidad de investigación de enfermedades transmitidas por alimentos
y resistencia a los antimicrobianos
CNAA: Censo Neotropical de aves acuáticas
E. coli: Escherichia coli
BLEE: Betalactamasas de espectro extendido
PCR: Prueba de Reacción en cadena de la polimerasa
ADN: Ácido desoxirribonucleico
NCCLS: Manual de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana
MRD: Drogas multi-resistentes
1
1. INTRODUCCIÓN
Un importante número de aves silvestres migratorias son responsables de
transmitir, diseminar o mantener enfermedades a nivel mundial (Hubálek, 2004).
Enfermedades que originalmente han sido asociadas a seres humanos desde
hace muchos años; por ejemplo se ha aislado Escherichia coli del tracto
gastrointestinal de algunas aves, mamíferos y el hombre (Silva et al., 2014a).
Además, se ha reportado que aves silvestres son transmisores indirectos de
bacterias a través de agua o alimentos contaminados; por ejemplo, patógenos
como Salmonella spp., Escherichia coli, Chlamydia spp., Mycobacterium spp.,
Cryptococcus spp., y el virus del Nilo en galpones de pollo de engorde y otros
animales domésticos como gatos (S Tsiodras, Kelesidis, Kelesidis, Bauchinger,
& Falagas, 2008).
Las aves silvestres son susceptibles de ser colonizadas por bacterias
ambientales, es así que un estudio en Brasil con patos domésticos identificó que
de 155 animales 77 fueron positivos para E. coli, esto demuestra que aunque E.
coli es habitante normal de la flora gastrointestinal, debe ser considerada como
un riesgo potencial para animales, ya que existen factores como: el incremento
de la temperatura y el contacto frecuente con medios contaminados (alimento,
agua y suelo) que pueden llegar a desencadenar enfermedades entre animales
de diferentes especies que comparten el mismo hábitat o medio de crianza (Silva
et al., 2014a).
La constante interacción entre humanos y aves silvestres incrementa la
posibilidad de que los animales adquieran resistencia a antibióticos, en especial
a Betalactámicos de cepas de E. coli esto ha causado una creciente
preocupación en la salud pública y animal (Shobrak & Abo-Amer, 2014), que
motiva al estudio de los genes de resistencia de éstas cepas; por ejemplo, un
estudio realizado para observar como la materia fecal es trasmisora de E. coli
ESBL y Klebsiella pneumoniae en aves silvestres, aves de engorde y humanos
en Nicaragua, demostró que la prevalencia general de los tres grupos fue de
2
8,2% donde el genotipo común para las tres especies fue bla CTX-M (Hasan et
al., 2016a).
La evidencia científica a nivel mundial muestra que E. coli resistente a BLEE está
presente en diferentes especies de aves silvestres incluidas las aves de presa.
En Merelbeke, Bélgica se realizaron pruebas de Betalactamasas de espectro
extendido en centros de rescate en 112 aves silvestres, donde se aisló 12 cepas
positivas resistentes a enterobacterias productoras de ESBL, estas especies
corresponden a dos especies de aves rapaces: el halcón (Falco tinnunculus) y
aguilucho (Buteo buteo) (Rouffaer, Haesebrouck, & Martel, 2014).
El uso indiscriminado de antibióticos, así como la constante alteración de los
hábitats naturales por el depósito de desechos y descarga de aguas
contaminadas podría ser un foco de contaminación y propagación para los
microorganismos en general, “Desde el punto de vista microbiológico, las aves
silvestres podrían crear una amenaza potencial para la salud humana y animal
transmitiendo bacterias MDR (Multi Drug Resistant) a corrientes de agua y a
otras fuentes ambientales a través de sus residuos fecales y a regiones remotas
mediante migración”, provocando así una contaminación en cadena de los
elementos del hábitat (Shobrak & Abo-Amer, 2014)
Los lagos interandinos de Ecuador poseen una gran variedad de vida acuática
silvestre (Guevara, Santander, & Duivenvoorden, 2012a) la cual se ve
amenazada por factores antropogénicos y medio ambientales. El estrecho
contacto con los humanos aumenta la sensibilidad a enfermedades de posible
transmisión horizontal (Konicek et al., 2016b), esto contribuye a que las
poblaciones de aves declinen de forma drástica. Otro factor es la introducción y
colonización de especies, entre ellas las migratorias como el Cormorán
Neotropical (Phalacrocorax brasilianus), lo que causa que la cadena trófica del
ecosistema Andino se altere e incremente la competencia inter-específica por
recursos. (Guevara, Santander, & Duivenvoorden, 2012b)
Por otro lado, el proceso de eutrofización (incremento de N2 y P) que sufren los
lagos alto andinos crean ambientes adecuados para el desarrollo y reserva de
patógenos que pueden también ser zoonóticos, de los cuales el 78,1% son de
3
origen silvestre (enfermedades infectocontagiosas y enfermedades virales
emergentes) (Cleaveland, Laurenson, & Taylor, 2001; Jones et al., 2008).
En Ecuador no existen estudios precedentes que determinen la presencia de
genes de resistencia a Betalactámicos en aves acuáticas, específicamente no
existen estos datos en la Focha Andina, que es una especie endémica de los
lagos alto andinos, y tampoco establecen como el Cormorán Neotropical puede
ser transmisor efectivo de patógenos de resistencia antimicrobiana. Este estudio
es una primera aproximación científica para determinar relaciones entre la
calidad de los hábitats, la presencia de patógenos y la respuesta de las aves
silvestres, tanto endémicas residentes como migratorias.
4
OBJETIVO GENERAL
Identificar cepas de E. coli BLEE en dos especies de aves silvestres,
Cormorán Neotropical (Phalacrocorax brasilianus) y Focha Andina (Fulica
ardesiaca) en la Laguna de Yahuarcoha- Imbabura.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar la presencia de E. coli BLEE en Cormorán Neotropical
(Phalacrocorax brasilianus) y Focha Andina (Fulica ardesiaca) en la laguna
de Yahuarcocha con respecto a la contaminación del agua.
Identificar genes de resistencia blaCTX-M, blaTEM y blaSHV en muestras
positivas de cepas BLEE de las dos especies de aves estudiadas, Cormorán
Neotropical (Phalacrocorax brasilianus) y Focha Andina (Fulica ardesiaca).
Identificar genes de resistencia BLEE (blaCTX-M, blaTEM, blaSHV) en muestras
de agua de la Laguna de Yahuarcocha- Imbabura.
HIPÓTESIS
H0: Las dos especies de aves, Cormorán Neotropical (Phalacrocorax
brasilianus) y la Focha Andina (Fulica ardesiaca) poseen genes de resistencia
a Betalactámicos
H1: Las dos especies de aves, Cormorán Neotropical (Phalacrocorax
brasilianus) y Focha Andina (Fulica ardesiaca) no poseen genes de resistencia
a Betalactámicos
5
2. MARCO TEÓRICO
2.1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1.1. Humedales Alto andinos del Ecuador
Humedales: Son hábitats continentales de diversas extensiones de pantanales
cubiertos de agua, los cuales pueden ser temporales o permanentes,
superficiales o profundos y albergan gran diversidad de fauna y flora biótica
(López Ayala Zayana, 2012). Se consideran ecosistemas principales, ya que
son fuentes de agua para diversas actividades, así como albergan una elevada
biodiversidad en fauna y flora. Estudios realizados por la Convención Ramsar
han determinado problemas emergentes en los humedades debido a la cercanía
de explotaciones ganaderas y agrícolas que provocan modificaciones en la
calidad del agua y alteran el hábitat de la zona (Ramsar, 2012).
Eutrofización de lagos alto Andinos: Los lagunares de Ecuador son fuente de
producción de O2, ayudan en la regulación de la temperatura y mantenimiento
del medio ambiente, albergan vida silvestre, especies botánicas, se caracterizan
por ser ecosistemas limitados por zonas en los que existen seres bióticos y
abióticos, son atractivos turísticos que despiertan un interés económico y social
(López Ayala Zayana, 2012). Sin embargo, la alteración y acumulación de restos
orgánicos produce un aumento de nutrientes inorgánicos como nitrógeno (N2) y
fósforo (P) en un ecosistema equilibrado, debido a un factor antropogénico que
provoca un deterioro en la calidad de agua y vida de los animales que ahí habitan
(Maridueña & Chalén, 2011).
Vida silvestre en laguna de Yahuarcocha: Según el censo realizado por Censo
Neotropical de Aves Acuáticas (CNNA) en Yahuarcocha se registraron en Julio
del 2012 un total de 1117 individuos de 17 especies. Las poblaciones pueden
variar de acuerdo a la época del año debido a la migración de algunas de ellas.
La laguna alberga importantes colonias de Ardea ibis (675 ind.), además de un
creciente número de Phalacrocorax brasilianus (416 ind).(Sainz-Borgo, 2013).
6
2.1.2. Descripción taxonómica y ecología de las especies en
estudio
Phalacrocorax brasilianus: Nombrado comúnmente como Cormorán
Neotropical, se encuentra distribuido desde EEUU hasta las costas de sur
América, ha sido una especie poco estudiada; sin embargo, se sabe que no
presentan dimorfismo sexual, coexisten junto con otras colonias, son especies
migratorias, son diurnos y su alimentación es piscívora. Su madurez sexual se
alcanza alrededor de los dos años de vida, su plumaje negro brillante los
diferencia de los juveniles que poseen más bien plumas grisáceas y opacas
(Ambiente, Direcci, & Silvestre, n.d.; Kreuder et al., 2002)
Adicionalmente, el Cormorán Neotropical por pertenecer a una especie de vida
silvestre migratoria, puede convertirse en un vector diseminador de un amplio
rango de microorganismos, muchos de los cuales pueden ser enfermedades que
afectan al ser humano y su ecosistema.(Sotirios Tsiodras, Kelesidis, Kelesidis,
Bauchinger, & Falagas, 2017).
Fulica ardesiaca: La Focha Andina es una especie endémica de la región
Andina se encuentra distribuida en lagunas de Chile, Bolivia, Perú y Argentina
(Vizcarra, 2008). Esta especie puede presentar hibridación entre F. ardesiaca y
Gallinula chloropus, una característica que es fundamental para la supervivencia
y mejora la eficiencia reproductiva. La focha andina posee un parche blanco
debajo de las plumas de la cola. (Yury-Yáñez, Torres-Araneda, & Soto-Acuña,
2009)
Escherichia coli: Descrita por primera vez en 1885 por Theodor Escherich es
un hospedero natural del tracto gastrointestinal y heces de humanos, varias
especies de aves y animales de sangre caliente.(Pereira P, Rey P, López R,
Castro O, & Uribe D, 2016).
Morfología: E. coli pertenece a la familia Enterobacteriae, es un bacilo gram
negativo, anaerobio facultativo y termotolerante (Silva et al., 2014a). Es
considerado comensal del sistema digestivo de humanos y otros animales,
aunque algunas cepas pueden ser patógenas y producir principalmente cuadros
de diarrea y enfermedades del tracto urinario.(Rodríguez-Angeles, 2002).
7
Clasificación: Las cepas de E. coli que son capaces de producir enfermedad en
aves son conocidas como E. coli (APEC), estas afectan de manera significativa
al sistema gastrointestinal, respiratorio, urinario, reproductivo o pueden
ocasionar enfermedad sistémica (Braga et al., 2016).
Kauffman et, al (2004) desarrollo un sistema de identificación de grupos
patógenos de E. coli, que en la actualidad contiene 176 antígenos somáticos (O),
112 flagelares (H) y 60 capsulares (K). El antígeno “O” es el responsable del
serogrupo, siendo así han sido clasificadas en seis grupos (Rodríguez-Angeles,
2002) Enterotoxigénica (ETEC) localizadas en la mucosa del intestino delgado
producen diarrea en niños lactantes hasta 6 años de edad. Enterohemorrágica
también conocidas como productoras de toxina Vero o toxina semejante a Shiga
(EHEC o VTEC o STEC), produce diarrea con sangre y dolor abdominal agudo.
Enteroinvasiva (EIEC) y enteropatógena (EPEC) afecta a adultos mayores y
niños lactantes. Enteroagregativa (EAEC) y adherencia difusa (DAEC),”(Pereira
P et al., 2016)
2.1.3. Importancia de la resistencia bacteriana
Cecil George Paine en 1930, trato por primera vez con penicilina a pacientes
con enfermedades cutáneas, sin embargo la penicilina administrada vía
parenteral fue utilizada varios años después.(Suárez & Gudiol, 2009)
Los antibióticos betalactámicos han sido utilizados por más de 70 años; como
consecuencia de su administración continúa y descontrolada ciertos
microorganismos han desarrollado mecanismos de defensa y resistencia hacia
los fármacos (Silva et al., 2014b; Torres et al., 2007). E. coli ha sido considerada
como un microorganismo que puede llegar a ser potencialmente patógeno
debido a la variación de factores como: cambios bruscos de temperatura,
periodos prolongados de estrés, alteraciones genéticas y alimentación
inapropiada;(Silva et al., 2014a) los mismos que constituyen un problema a la
salud pública y animal a nivel mundial, además de pérdidas del rendimiento e
incremento de la mortalidad. (Mosquito, Ruiz, Bauer, & Ochoa, 2011)
Diferentes mecanismos de resistencia antimicrobiana han sido descritos en
animales de vida silvestre que tienen algún tipo de contacto con seres humanos
8
(Middleton & Ambrose, 2005). Las aves acuáticas silvestres pueden ser
reservorios de resistencia bacteriana ya que las especies migratorias vuelan
miles de kilómetros cada año, llegando a ser diseminadores efectivos de diversas
resistencias bacterianas. (Middleton & Ambrose, 2005)
La vida silvestre en estado natural puede ser reservorio de bacterias como E.
coli, que a menudo son microorganismos que poseen genes de resistencia. Los
genes de resistencia podrían ser adquiridos en el momento en que los humanos
invaden hábitats primarios, contaminan medios ambientes acuáticos con restos
de materia fecal, que al parecer, es el principal mecanismo de transmisión de
genes de resistencia hacia la vida silvestre. (Shobrak & Abo-Amer, 2014).
2.1.4. Antibióticos Betalactámicos
En su estructura química poseen un anillo betalactámico, cuyo mecanismo de
acción es la inhibición de la síntesis de la pared celular. Son de espectro
moderado, actúan sobre bacterias Gram negativas y Gram positivas, son de baja
toxicidad, su penetración intracelular es baja y atraviesa con facilidad la barrera
placentaria. (Suárez & Gudiol, 2009).
Mecanismos de resistencia: Los antibióticos pueden desarrollar resistencia
antimicrobiana bajo presión selectiva, o por exposiciones determinantes
indirectas hacia un antibiótico (Middleton & Ambrose, 2005).
2.1.5. Mecanismos de Resistencia Bacteriana
Producción de Enzimas: Las bacterias son capaces de producir enzimas
específicas como las Betalactamasas las cuales están en el espacio extracelular
e hidrolizan el enlace 4 del anillo Betalactámicos, de esta manera las
propiedades de los antibióticos se inhiben. Las Betalactamasas de espectro
extendido son codificadas por genes plasmidicos y otros elementos genéticos
móviles como integrones (Tekiner & Özpınar, 2016).
Impermeabilidad de la Membrana Bacteriana Externa: La permeabilidad de
la membrana se ve alterada por cambios en la estructura de las capa bi- lipídicas,
aquí actúan principalmente las porinas las cuales evitan la entrada del antibiótico
a la célula (Tafur & Villegas, 2008).
9
Alteración de los Blancos: Producen cambios en la estructura de los
antibióticos Betalactámicos, por ejemplo en las proteínas de unión de penicilina
(Balagurusamy & Campus, 2017). La modificación del sitio PBP (penicillin-
binding-protein) producen cambios en la estructura de la célula, formando un
complejo enzimático dado por mutaciones, produciendo resistencia a los
antibióticos (Moreno, González, & Beltrán, 2009)
Bombas de E- flujo: Pueden conferir resistencia antimicrobiana por un flujo
activo mediado proteínas transmembrana, membrana externa y espacio
periplásmico formando canales que envían fuera de la célula al antibiótico
(Cavalieri et al., 2009).
Mecanismos de resistencia adquirida e innata: Es propia de cada bacteria,
familia o género y no es variable, a diferencia de la resistencia adquirida que se
da por presión selectiva, ya que dicho agente está expuesto durante un tiempo
a condiciones que le permiten adquirir resistencia en función de su variabilidad
genética. Las bacterias pueden adquirir resistencia gracias a cambios genéticos
dados por mutación, por transferencia de material genético de otras células
bacterianas (transferencia horizontal) que pueden codificar material genético
cromosómico y extracormosómico (plásmidos) (Mosquito et al., 2011; Vignoli &
Seija, 2000).
Mutación: Debido a la mutación de genes propios de la membrana
externa de la célula (Tafur & Villegas, 2008), por ejemplo la resistencia a
antibióticos Betalactámicos se da por mutaciones continuas donde el
microorganismo sufre cambios morfológicos, baja la velocidad de
crecimiento; lo que le confiere resistencia a cefalosporinas de 3ra
generación (Moreno M, González E, & Beltrán, 2009; Vignoli & Seija,
2000).
Conjugación: Utilizadas por bacterias gram negativas e incluso gram
positivas; una bacteria donadora transfiere su material genético
(plásmidos) a una receptora mediante el pili sexual (Gentilini, 2007; Winn
et al., 2013).
Transformación: Mediado por fragmentos libres de ADN que contienen
genes que codifican para resistencia bacteriana que son introducidos a la
10
célula por transformación; los fragmentos se conjugan con el cromosoma
de la célula y adquiere resistencia. (Cavalieri et al., 2009)
Transducción: Se produce cuando los bacteriófagos se reproducen en
una célula bacteriana. Secuencias de ADN de plásmidos se unen a una
cápsula viral y algunas de estas unidades pueden tener resistencia y
traspasar a la nueva célula huésped (Cavalieri et al., 2009)
Transposición: Los transposones tienen fragmentos de ADN móviles,
que se pueden mover de un sitio del cromosoma bacteriano a otro. “Los
transposones de ADN pueden estar incorporados a plásmidos y de esa
manera transportar genes de resistencia antimicrobiana” (Cavalieri et al.,
2009).
2.1.6. Betalactamasas de Tipo BLEE
Se encuentran con mayor frecuencia en E. coli y Klebsiella spp. Se generan
debido a mutaciones y cambios de los aminoácidos en su sitio activo, esto
aumenta su capacidad hidrolítica. Las cepas BLEE tienen resistencia a
“cefalosporinas de tercera generación, el aztreonam y cefalosporinas de
espectro reducido”(Balagurusamy & Campus, 2017; Casabonne, Pérez,
Balagué, & Fernández, 2012). Las BLEE más prevalentes son de tipo bla CTX-
M, bla SHV, bla TEM, y usualmente las “BLEE tipo TEM y SHV hidrolizan a
ceftazidime con mayor eficiencia que a ceftriaxona o cefotaxime, mientras que
las CTX-M, usualmente, hidrolizan cefotaxime y ceftriaxona más rápidamente
que ceftazidime”(Casabonne et al., 2012; Tafur & Villegas, 2008).
2.1.7. Importancia de la transmisión de cepas BLEE en
animales hacia seres humanos
La importancia de éstas cepas es reciente ya que “en 1998 se aisló la primera
bacteria de origen animal portadora de una betalactamasa de espectro extendido
(BLEE) E. coli (productora de SHV-12)”(Torres et al., 2007). Se ha demostrado
que la transmisión de ESBL ocurre principalmente a través de la cadena
alimentaria, además de la exposición de especies silvestres a aguas residuales
no tratadas que podría ser un vínculo hacia la presencia de genes de resistencia
11
en animales en ambientes naturales (Delport, Harcourt, Beaumont, Webster, &
Power, 2015) y a través del contacto directo con animales domésticos.(Xu, An,
Wang, & Zhang, 2015).
Recientes investigaciones demuestran que los animales silvestres juegan un
papel fundamental en el desarrollo de resistencia antimicrobiana, especialmente
la vida silvestre acuática (Rouffaer et al., 2014).
Clasificación de ESBL:
Tabla 1. Betactamasas de importancia clínica, enzimas representativas de
los grupos de genes bla CMY, bla TEM, bla SHV, bla CTX-M, bla PER, bla VEB, bla
GES, bla KPC, bla SME, bla OXA, bla IMP, bla VIM, con sus grupos funcionales
y numero de enzimas
Familia de Enzimas
Grupo funcional o subgrupo
No. de enzimas
Enzimas representativas
CMY 1, 1e 50 CMY -1 a CMY- 50
TEM
2b, 2be, 2br, 2ber 172
2b 12 TEM -1, TEM – 2, TEM – 13
2be 79 TEM -3. TEM- 10, TEM-26
2br 36 TEM-30 (IRT-2), TEM -31 (IRT-3),TEM – 163
2ber 9 TEM -50 (CMT- 1), TEM -158 (CMT -9)
SHV
2b, 2be, 2br 127
2b 30 SHV -1, SHV – 11, SHV -89
2be 37 SHV – 2, SHV – 3, SHV – 115
2br 5 SHV – 10, SHV – 72
CTX-M 2be 90 CTX –M -1, CTX-M-44, a CTX –M- 92
PER 2be 5 PER -1 a PER – 5
VEB 2be 7 VEB -1 a VEB- 7
GES 2f 15 GES – 2 a GES -7, GES -15
KPC 2f 9 KPC- 2 a KPC-10
SME 2f 3 SME -1, SME- 2, SEM -3
OXA
2d, 2de, 2df 158
2d 5 OXA -1, OXA -2, OXA -10
2de 9 OXA -11, OXA – 14, OXA -15
2df 48 OXA -23, OXA – 51, OXA -58
IMP 3ª 26 IMP -1, IMP -26
VIM 3ª 23 VIM – 1, VIM – 23
IND 3ª 8 IND -1, IND -2, IND -2a, IND -3, a IND -7
Fuente: (Bush & Jacoby, 2010)
CTX- M: Es considerado de mayor prevalencia en todo el mundo, se derivan
cromosómicamente del género Kluyvera (Calvo, Cantón, Fernández-Cuenca,
Mirelis, & Navarro, 2011). Se subdivide en 5 grandes grupos que son: bla CTX-
12
M-1, bla CTX-M-2, bla CTX-M-8, bla CTX-M-9, y bla CTX-M-25 (Xu et al., 2015).
Según estudios realizados en 2007, 79% de los animales observados
presentaron cepas CTX-M (Torres et al., 2007). La mayor parte de estos
hallazgos se encuentran en heces de animales de distintas especies incluyendo
animales silvestres; lo cual determina un problema en la salud y tratamiento de
animales con infecciones bacterianas (Blanco et al., 2013; Tekiner & Özpınar,
2016).
SHV: Con menor capacidad de hidrólisis pertenece al grupo 2b de la clasificación
de (Bush & Jacoby, 2010), se identificó en 1970. Posiblemente su origen es de
una penicilinasa cromosómica de Klebsiella pneumoniae. Las enzimas del gen
SHV son habitualmente codificadas por plásmidos que le confieren resistencia a
penicilinas y cefalosporinas de primera generación e inhibidas por el ácido
clavulánico. (Liakopoulos, Mevius, & Ceccarelli, 2016). Se han identificado 117
variantes de este gen hasta el momento, de las cuales 46 son bla SHV-
ESBL.(Liakopoulos et al., 2016; Thai & Pleiss, 2010).
En 1983 se reportó el primer caso aislado de SHV resistente a cefalosporinas
de tercera generación en un cultivo de Klebsiella ozaenae (Liakopoulos et al.,
2016)
TEM: Deriva su nombre del primer caso encontrado en un paciente con E. coli
en 1965, pertenece al grupo 2b según la clasificación de Bush, et al (2010), son
Betalactamasas de amplio espectro las mismas que son inhibidas por el ácido
clavulánico y se ha descrito 216 variantes. (Casabonne et al., 2012)(Cavalieri et
al., 2009). Un estudio realizado en Suecia determinó que en 128 niños que existe
mayor prevalencia del gen bla TEM 27/32 sobre bla SHV (5/32)(Mosquito et al.,
2011).
2.1.8. Reacción en cadena de la polimerasa PCR
La reacción en cadena de la polimerasa fue desarrollada en 1983 por el Doctor
Kary Mullis quien fue ganador del Premio Nobel de Química (Mas, Poza, Ciriza,
Zaragoza, & Osta, 1993). En los últimos años, las técnicas de biología molecular
han (PCR) permitido a los investigadores y científicos identificar fragmentos de
13
ADN amplificados, generar millones de copias de ADN para caracterizar
genéticamente a los diferentes agentes sean estos virus, bacterias, parásitos, o
cualquier molécula que contenga ADN de interés(Tamay de Dios, Ibarra, &
Velasquillo, 2013). Es una técnica de alta sensibilidad y especificidad, es eficaz
y permite evaluar resultados en poco tiempo. (Tamay de Dios et al.,
2013)(Rodríguez-Angeles, 2002).
Fundamento: Consta de tres fases desnaturalización, hibridación y extensión
(Figura 1.) que constituyen un ciclo, en donde se obtiene un pequeño fragmento
de ADN; este re repetirá de 20 a 40 veces (Konicek et al., 2016a; Tamay de Dios
et al., 2013).
Desnaturalización: Desnaturaliza la cadena de ADN, la separa en dos
fragmentos, debido a que los enlaces de hidrogeno se rompen, este proceso se
realiza aproximadamente por 30 segundos a 94ºC. (Biotecnología & Elsa, 2004).
(Ver tabla 2, 7, 8,9
Hibridación: La hibridación de los primers o cebadores se alinean al extremo
3`del ADN esto proceso se da al bajar la temperatura aproximadamente 60ºC lo
cual facilita la unión con las cadenas de ADN (Biotecnología & Elsa, 2004; Tamay
de Dios et al., 2013). (Ver tabla 2, 7, 8,9)
Elongación o extensión: Permite que la enzima ADN polimerasa inserte
nucleótidos a 72ºC para permitir que una nueva cadena de ADN se sintetice.
“La extensión de las cadenas es en dirección de la síntesis del ADN, es decir, de
5’ a 3’ (Tamay de Dios et al., 2013) (Ver tabla 2, 7, 8,9).
Figura 1. Pasos ciclo de PCR (Fuente: Tamay de Dios, 2013)
14
Tabla 2. Componentes y características esenciales de la Reacción en
cadena de la Polimerasa (PCR)
Fuente: Tamay de Dios, 2013
Interpretación de la PCR:
La lectura de los resultados de los fragmentos amplificados se lleva a cabo a
través de electroforesis en gel agarosa. Es un proceso de separación por difusión
que permite observar y comparar el tamaño de los fragmentos de ácidos
nucleicos por acción de un campo eléctrico (Biotecnología & Elsa, 2004).
Extracción de ADN a partir de muestras de agua: aísla y extrae ADN
genómico total que se encuentra en medios acuáticos. Es posible recuperar
secuencias de ADN que persisten por largos periodos de tiempo en sedimentos
o medios congelados.(Ficetola, Miaud, Pompanon, & Taberlet, 2008). Existen
factores que pueden alterar la cantidad de ADN presente en agua: la cantidad
de agua, el tiempo de permanencia de los fragmentos de ADN, presencia de luz,
temperatura, entre otros. (Ficetola et al., 2008)
Por consiguiente, existe la posibilidad de la presencia de material genético de
bacterias patógenas en medios acuáticos incluso después de haber muerto (Fey
et al., 2004). Ante un esfuerzo desesperado por reducir la presencia de
antibióticos y bacterias resistentes a antimicrobianos de diversos orígenes como
alimentos o agua (natural o residual), se realizan estudios en todo el mundo,
como por ejemplo en China se realizó un estudio en agua potable donde se
encontró ESBL de E. coli (Zhang, Gao, & Chang, 2016). Asimismo, en Australia
existe una prevalencia estimada del 15 % de SHV en estudios realizados en
aguas residuales de un hospital (Liakopoulos et al., 2016; Torres et al., 2007).
Componente Característica
Template (ADN lisado)
Magnesio (Mg) Solución amortiguadora o buffer
H2O Agua ultra pura
dNTPs (Adenina, Guanina, Citosina, Timina)
Oligonucleótidos
Taq polimerasa Enzima
15
3. METODOLOGÍA
3.1. Tipo de investigación
Observacional transversal descriptivo.
Diseño de la investigación: Este tipo de investigación se realiza en un tiempo
determinado y permite estimar la magnitud de la enfermedad en un momento
dado. En el proyecto se capturó aves silvestres de dos especies, el Cormorán
Neotropical y la Focha Andina. No existió manipulación de las variables (Berra,
Elorza-ricart, Estrada, & Sánchez, 2008).
Zona de estudio: El sitio de estudio se ubica en la provincia de Imbabura, Ibarra,
y consiste del ecosistema laguna de Yahuarcocha (Figura 2). Para el muestreo
se establecieron 4 puntos de captura de los animales dentro del perímetro de la
laguna, tomando en cuenta los sitios de mayor incidencia de percha de las
especies estudiadas. A continuación se detallan las coordenadas sexagesimales
tomadas con equipo GPS de captura de animales
1. 20. N: 00º22.735” W: 078º06.456´ ALTURA: 2197 msnm
2. 122. N: 00º22.615” W:078º06.128´ ALTURA: 2194 msnm
3. 123. N: 00º22.500” W: 078º05.394´ ALTURA: 2198 msnm
4. 124. N: 00º22.669” W: 078º06.611´ ALTURA: 2197 msnm
16
Figura 2: Ubicación geográfica de la laguna Yahuarcocha, provincia de Imbabura (Ecuador)
(Fuente, Google Earth, 4 de Junio del 2017).
Las muestras (hisopados cloacales) fueron transportadas al Laboratorio de
Bacteriología y Micología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de
la Universidad Central del Ecuador.
Muestra: Se realizó un muestreo aleatorio probabilístico simple, donde 14
muestras fueron de Cormorán Neotropical y 15 de la Focha Andina. Las
muestras se colectaron para identificar cepas resistentes a Betalactamasas y
genes de resistencia bla CTX-M, bla SHV, bla TEM.
3.2. Fase de campo.- colecta de muestras
Aves:
Para la captura se usó el método manual, que consiste en atrapar el animal en
su dormidero; este método reemplazó al método de trampa múltiple propuesto,
ya que fue evaluado en tres ocasiones sin el éxito esperado. La captura se
realizó durante la noche, en días de luna nueva para evitar el escape de los
17
animales. Para el desplazamiento en la laguna se usó transporte acuático (bote
a motor). El trabajo se realizó en tres sesiones de captura durante los meses de
noviembre 2016 y enero y febrero del 2017 (Anexos 3-5). Los animales
capturados fueron trasportados en bolsas ornitológicas hasta el centro de
manipulación donde fueron colocadas en jaulas tipo Huakal, para ser
posteriormente analizados. Para la colecta de muestras se procedió
primeramente a tomar medidas morfométricas las cuales fueron registradas en
tablas previamente estructuradas (ver Anexo1). Se identificó la especie de cada
individuo. Para la colecta de las muestras biológicas (hisopados cloacales) se
usó medios de transporte Stuart estéril; además, para la identificación se
etiquetaron con códigos alfanuméricos/especie y las muestras fueron
almacenadas a 4ºC para su transporte a Quito. El procedimiento de muestreo se
realizó durante las horas seguidas a la captura para evitar el estrés de los
animales, que luego de ser examinados fueron liberados en mismo sitio de
captura.
Agua:
Para la colecta de muestras de agua de la laguna de Yahuarcocha se estableció
un protocolo de muestreo en los lugares de percha de las especies estudiadas.
Los sitios en detalle están citados en el párrafo anterior.
Se tomó aproximadamente 150 ml de sedimento de la laguna en frascos
estériles; éstas fueron trasportadas en cadena de frío a 4°C; posteriormente,
fueron congeladas durante 12 horas y luego llevadas al laboratorio. Las
muestras fueron procesadas en el CIZ (Instituto de Investigación en Salud
Pública y Zoonosis) de la Universidad Central para la extracción del ADN donde
se utilizó el kit Mo bio,( PowerWater® DNA Isolation Kit Sample)
Recolección de información: En laguna de Yahuarcocha se capturó un total de
29 individuos, 14 de Focha Andina y 15 de Cormorán Neotropical, también se
colectaron 4 muestras de agua que corresponden a los sitios de percha de las
especies estudiadas.
18
3.3. Fase de laboratorio.- cultivo y aislamiento
3.3.1. Cultivo bacteriológico
Aislamiento e identificación de Escherichia coli (BLEE)
A continuación se describe el proceso establecido por UNIETAR (Unidad de
Investigación de Enfermedades Trasmitidas por Alimentos y Resistencias
Antibacterianas) para el aislamiento de cepas BLEE. Se sembró en agar
Crhomocult + Cefotaxima 1g/l. La técnica que se aplica fue el aislamiento por
estriación de los hisopados cloacales, con posterior incubación por 24 horas a
37ºC. El crecimiento de las colonias de color azul oscuro o violeta se identificaron
como positivas para, a continuación, realizar la prueba de detección fenotípica
de BLEE mediante la prueba de doble disco (Konicek et al., 2016b, UNIETAR,
2017).
Detección de BLEE mediante la prueba de sinergia con doble disco
Para la identificación de cepas resistentes a betalactámicos se utilizó la técnica
de la sinergia de doble disco descrita por Legrand et al.1997; la cual está basada
en “la propiedad del ácido clavulánico de inhibir estas enzimas. Esta técnica se
realiza por difusión en agar utilizando una placa de Mueller-Hinton inoculada con
una suspensión bacteriana ajustada al patrón de 0,5 de la escala McFarland;
sobre ella se colocan los discos con carga estándar (30 μg)”. (Casabonne et al.,
2012). Este ensayo, según las normas de la CLSI (Clinical and Laboratory
Standards Institute), es confirmatorio para la presencia de BLEE, porque mide el
aumento del tamaño del halo de inhibición en la combinación del antibiótico más
el inhibidor comparado con el halo generado por el antibiótico sin inhibidor. Para
la ejecución de este ensayo se utilizaron los siguientes monodiscos con
antibióticos: cefotaxima, cefotaxima/ácido clavulánico, ceftazidime,
ceftazidime/ácido clavulánico, cefepime, cefepime/ácido clavulánico, cefoxitin. El
aumento en 5 mm del halo de inhibición en el disco del antibiótico más el
inhibidor, en comparación al del antibiótico sólo, indican que la bacteria es
productora de BLEE (Cavalieri et al., 2009).
19
3.4. Fase de laboratorio.- Análisis molecular
Protocolo de identificación molecular de Genes bla CTX-M, bla SHV, bla TEM:
de cultivos puros positivos a cepas BLEE y muestras de agua laguna
Yahuarcocha.
Obtención de ADN de cepas BLEE positivas: Se seleccionaron dos colonias
puras suspendidas y homogenizadas en 30 ul de agua destilada estéril, se
colocaron en microtubos de 2ml y se sometieron a ebullición por 30 minutos,
para posterior se almacenaron a -20ºC. (Hart, Meyer, Johnson, & Ericsson,
2015),(Hasan et al., 2016a), (Omar, Atif, & Mogahid, 2014).
Obtención de ADN de muestras agua laguna Yahuarcocha: Se utilizó el kit
comercial Mo Bio, (DNeasy PowerWater Kit For the isolation of genomic DNA
from filtered water samples, including turbid water).
Protocolo para extracción de ADN en muestras de agua:
Solución tibia PW1 antes de su uso a 55 ° C durante 5-10 minutos. Utilice la
solución PW1 mientras esté caliente. Compruebe la solución PW3 y caliente a
55 ° C durante 5-10 minutos si es necesario. La solución PW3 puede utilizarse
mientras esté caliente.
1. Filtrar las muestras de agua utilizando un embudo de filtro reutilizable o
desechable unido a una fuente de vacío.
2. Si utiliza un embudo de filtro reutilizable, retire la parte superior del aparato. Si
se utiliza un embudo de filtro MO BIO Laboratories, retire la parte superior de
100 ml de la taza del filtro del depósito de retención desenganchándola.
3. Usando dos juegos de fórceps estériles, tome la membrana blanca del filtro en
bordes opuestos y enrolle el filtro en un cilindro con la cara superior mirando
hacia dentro.
4. Inserte el filtro en el tubo de 5 ml PowerWater® Bead.
5. Agregue 1 ml de Solución PW1 al Tubo de Cordón PowerWater®. Nota: La
solución PW1 debe calentarse para disolver los precipitados antes de su uso. La
solución PW1 debe utilizarse mientras esté caliente. Para las muestras que
contienen organismos que son difíciles de lisar (hongos, algas), se puede incluir
una etapa de calentamiento adicional. Consulte Método de lisis alternativo en la
Guía de sugerencias y solución de problemas.
20
6. Asegure el Tubo de Perforación PowerWater® horizontalmente a un
Adaptador MO BIO Vortex, número de catálogo 13000-V1-15 o 13000-V1-5.
7. Vortex a velocidad máxima durante 5 minutos.
8. Centrifugar los tubos ≤ 4000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente. La
velocidad dependerá de la capacidad de su centrífuga.
9. Transfiera todo el sobrenadante a un tubo de recogida limpio de 2 ml
(suministrado). Dibuje el sobrenadante usando una punta de pipeta de 1 ml
colocándola en las perlas. Nota: Colocar la punta de la pipeta hacia abajo en las
perlas es necesario. Pipetee más de una vez para asegurar la eliminación de
todo el sobrenadante. Cualquier acarreo de perlas no afectará los pasos
subsiguientes. Se espera recuperar entre 600-650 μl de sobrenadante
dependiendo del tipo de membrana de filtro utilizada.
10. Centrifugar a 13.000 x g durante 1 minuto.
11. Evitando el sedimento, transfiera el sobrenadante a un tubo de recogida
limpio de 2 ml (suministrado).
12. Añadir 200 μl de Solución PW2 y agitar vórtice brevemente para mezclar.
Incubar a 4 ° C durante 5 minutos.
13. Centrifugar los tubos a 13.000 x g durante 1 minuto.
14. Evitar el sedimento, transferir el sobrenadante a un tubo de recogida limpio
de 2 ml (suministrado).
15. Añadir 650 μl de Solución PW3 y agitar vórtice brevemente para mezclar.
Nota: Compruebe la solución PW3 para la precipitación antes de usarla. Caliente
si es necesario. La solución PW3 puede utilizarse mientras esté caliente.
16. Cargar 650 μl de sobrenadante en un Filtro de centrifugado y centrifugar a
13.000 x g durante 1 minuto. Deseche el flujo y repita hasta que todo el
sobrenadante se haya cargado en el filtro de centrifugado. Nota: Se requiere un
total de dos cargas para cada muestra procesada.
17. Coloque la cesta del filtro de centrifugado en un tubo de recogida limpio de 2
ml (suministrado).
18. Agitar para mezclar la solución PW4 antes de usar. Añadir 650 μl de Solución
PW4 y centrifugar a 13.000 x g durante 1 minuto.
19. Desechar el flujo y añadir 650 μl de Solución PW5 y centrifugar a 13.000 x g
durante 1 minuto.
20. Desechar el flujo y centrifugar nuevamente a 13.000 x g durante 2 minutos
para eliminar el lavado residual.
21. Coloque la cesta del filtro de centrifugado en un tubo de recogida limpio de 2
ml (suministrado).
22. Añadir 100 μl de Solución PW6 al centro de la membrana filtrante blanca.
21
23. Centrifugar a 13.000 x g durante 1 minuto. 24. Deseche la cesta del filtro de
centrifugado. El ADN está ahora listo para cualquier aplicación aguas abajo. No
se requieren más pasos.
Recomendamos almacenar el ADN congelado (-20 ° C a -80 ° C). La solución
PW6 no contiene EDTA. Para concentrar el ADN, consulte la Guía de
Sugerencias y Solución de Problemas.
Se colectaron 150 ml de agua en 4 sitios de percha de las especies estudiadas
en el sitio de muestre, con puntos referenciales sexagesimales con equipo GPS
(Ficetola et al., 2008), (Birkett et al., 2007).
Preparación del Master Mix: Se trabajó con 7 muestras positivas a BLEE 2
para Focha Andina, 5 para Cormorán Neotropical y 4 muestras de agua de
laguna de Yahuarcocha.
Los controles positivos utilizados fueron: Cepa de E. coli ESBL TIAC 809, para
gen bla CTX-M cepa de E. coli ESBL 361,para el gen bla TEM y cepa de E.coli
ESBL 430 y para el gen bla SHV: cepa 811; control negativo fue agua ultrapura
para el gen SHV se adicionó una cepa TIAC 361 A, como control negativo
(Sánchez U et al., 2006, UNIETAR, 2017).
La mezcla maestra para los genes bla CTX-M, bla TEM y bla SHV se realizó en el
laboratorio de UNIETAR de la Facultad de Medicna Veterinaria de la Universidad
Central (Ver tablas 3, 4, 5). Los primers que se utilizaron para la amplificación de
los genes de resistencia de bla CTX-M, bla TEM y bla SHV se describen en la Tabla
6.
22
Tabla 3. Mezcla maestra para realizar la prueba molecular Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de Gen bla CTX-M, con volumen final de 16 ul de muestras positivas a cepas BLLE, de dos especies de aves silvestres Focha Andina y Cormorán Neotropical tomadas en la laguna de Yahuarcocha - Ecuador.
Reactivo
VF Mastermix
(µl) C. inicial C. final Volumen para una reacción
VOLUMEN TOTAL DE
MASTERMIX (µl)
Nº 9 Nº 6 cantidad unidad cantidad unidad cantidad unidad
Agua 54,4 54.8 - - 7,775 µl 54,425
Template 2,0 2,0 1 µl 7
Buffer 18,2 18,0 5 X 1 X 2,6 µl 18,2
MgCl2 7,3 7,2 25 mM 2 mM 1,04 µl 7,28
dNTP Mix 1,8 1,8 10 mM 0,2 mM 0,26 µl 1,82
CTXM-f 0,9 0,9 100 pmol/µl 1 pmol/µl 0,13 µl 0,91
CTXM-r 0,9 0,9 100 pmol/µl 1 pmol/µl 0,13 µl 0,91
Taq 0,5 0,5 5 U/µl 0,025 U/µl 0,065 µl 0,455
Total 13 µl 91
Fuente: Investigación directa, UNIETAR, 2017
Tabla 4. Mezcla maestra para realizar la prueba molecular Reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) de Gen bla TEM, con volumen final de 25 ul
de muestras positivas a cepas BLLE, de dos especies de aves silvestres
Focha Andina y Cormorán Neotropical tomadas en la laguna de
Yahuarcocha – Ecuador.
Reactivo
VF Mastermix
(µl)
C. inicial C. final Volumen para una reacción VOLUMEN TOTAL DE
MASTERMIX (µl)
cantidad unidad
cantidad unidad
cantidad unidad Nº9 Nº6
Agua 133,9 89,3 - - 14,875 µl 133,875
Template 2,0 2,0 2 µl 18
Buffer 45,0 30,0 5 X 1 X 5 µl 45
MgCl2 18,0 12,0 25 mM 2 mM 2 µl 18
dNTP Mix 4,5 3,0 10 mM 0,2 mM 0,5 µl 4,5
TEM1 2,3 1,5 100 pmol/µl 1 pmol/µl 0,25 µl 2,25
TEM2 2,3 1,5 100 pmol/µl 1 pmol/µl 0,25 µl 2,25
Taq 1,1 0,8 5 U/µl 0,025 U/µl 0,125 µl 1,125
Total 25 µl 225
Fuente: Investigación directa, UNIETAR 2017
23
Tabla 5. Mezcla maestra para realizar la prueba molecular Reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) de Gen bla SHV, con volumen final de 25 ul
de muestras positivas a cepas BLLE, de dos especies de aves silvestres
Focha Andina y Cormorán Neotropical tomadas en la laguna de
Yahuarcocha – Ecuador.
Reactivo
VF Mastermix
(µl)
C. inicial C. final Volumen para una
reacción VOLUMEN TOTAL DE
MASTERMIX (µl) cantid
ad unidad
cantidad unidad
cantidad unidad Nº10 Nº6
Agua 148,8 89,3 - - 14,875 µl 148,75
Template 2,0 2,0 2 µl 20
Buffer 50,0 30,0 5 X 1 X 5 µl 50
MgCl2 20,0 12,0 25 mM 2 mM 2 µl 20
dNTP Mix 5,0 3,0 10 mM 0,2 mM 0,5 µl 5
SHV1 2,5 1,5 100 pmol/µl 1 pmol/µl 0,25 µl 2,5
SHV2 2,5 1,5 100 pmol/µl 1 pmol/µl 0,25 µl 2,5
Taq 1,3 0,8 5 U/µl 0,025 U/µl 0,125 µl 1,25
Total 25 µl 250
Fuente: Investigación directa, UNIETAR 2017
Primers:
Tabla 6. Primers utilizados para realizar la Reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) de los genes bla CTX-M, bla TEM, bla SHV de muestras
positivas a cepas BLEE de dos especies de aves silvestres Focha Andina
y Cormorán Neotropical y muestras de agua laguna Yahuarcocha- Ecuador
CTX : (CTX-MU1 5'-ATGTGCAGYACCAGTAARGTKATGGC-3' y CTX-MU2 5'-
TGGGTRAARTARGTSACCAGAAYCAGCGG-3')
SHV (SHVOS5 5'-TTATCTCCCTGTTAGCCACC-3' y SHVOS6 5'-GATTTGCTGATTTCGCTCGG-3')
TEM (TEM front P1 5'-GCGGAACCCCTATTTG-3' y TEM-C-R-ny 5'-ACC AAT GCT TAA TCA GTG
AG-3')
El kit GoTaq® Flexi DNA Polymerase de Promega: GoTaq® Flexi Buffer 5X, MgCl2 Solution, 25mM1, PCR,
GoTaq® DNA Polymerase (5u/µl)
Nuclease-Free Water® de Promega
Nucleotide Mix®, 10 mM de Promega
Fuente : (Costa et al., 2006), (Xu et al., 2015)(Cantón, González-Alba, & Galán, 2012; Gil, Núñez,
Benevidez, & López, 2014)
24
Protocolo para la realizar la prueba de Reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) de muestras positivas a cepas BLEE para los
genes bla CTX-M, bla TEM y bla SHV y muestras de agua laguna
Yahuarcocha.
Las fases de amplificación de ADN se obtienen de manera exponencial y
logarítmica para obtener un producto de 1000pb se necesita un minuto, el
protocolo para los genes bla CTX-M, bla TEM y bla SHV se describen en las Tablas
7, 8, 9 (Tamay de Dios et al., 2013).
Tabla 7. Protocolo de la amplificación en el Termociclador para el gen bla
CTX-M.
Fuente: (Nazik et al., 2011)(Birkett et al., 2007) Modificado por: UNIETAR, 2017
Tabla 8. Protocolo de la amplificación en el Termociclador para el gen bla
TEM
Fuente: (Nazik et al., 2011) Modificado por: UNIETAR, 2017
Tabla 9. Protocolo de la amplificación en el Termociclador para el gen bla
SHV.
Fuente: (Nazik et al., 2011). Modificado por: UNIETAR, 2017.
Etapa Tº Tiempo Ciclos
Desnaturalización inicial del ADN 94 ° 5 minutos 1
Desnaturalización del ADN 94 ° 40 segundos
35 Hibridación de los Primers 62 ° 40 segundos.
Extensión de la cadena 72 ° 1minuto
Elongación final 72 ° 10minutos 1
Conservación de los amplicones 10 ° Infinito 1
Etapa Tº Tiempo Ciclos
Desnaturalización inicial del ADN 94 ° 5 minutos 1
Desnaturalización del ADN 94 ° 40 segundos
35 Hibridación de los Primers 62 ° 40 segundos.
Extensión de la cadena 72 ° 1minuto
Elongación final 72 ° 10minutos 1
Conservación de los amplicones 10 ° Infinito 1
Etapa Tº Tiempo Ciclos
Desnaturalización inicial del ADN 94 ° 5 minutos 1
Desnaturalización del ADN 94 ° 40 segundos
35 Hibridación de los Primers 62 ° 40 segundos.
Extensión de la cadena 72 ° 1minuto
Elongación final 72 ° 10minutos 1
Conservación de los amplicones 10 ° Infinito 1
25
Electroforesis:
Al concluir las etapas del termociclador, se sometió las muestras a electroforesis,
la cual permite separar las moléculas de ADN por un campo electromagnético.
Una vez realizada la amplificación, las muestras fueron sometidas a migración
por electroforesis, según las siguientes condiciones:
Protocolo electroforesis: Preparación de gel agarosa para electroforesis de
genes: CTX-M, TEM, SHV y muestras agua laguna Yahuarcocha.
Se preparó una solución de 50ml con TBE al 0,5x; se adicionaron 0,5g de
agarosa, 1ul de Syber safe por cada 10ml de TBE al 0,5%, 3,5 ul de muestra +
1ul de ladder y 2 ul de marcador, se homogenizó la muestra y se colocó en el gel
previamente preparado, en cada pocillo se ubicó las muestras identificadas,
control positivo, negativo, y marcador molecular, las muestras fueron sometidas
a 400mAmp y 100mV. por 40 minutos.
3.5. Análisis y cuantificación de los resultados
Los resultados se organizaron en una base de datos en Excel 2013 y fueron
analizados con estadística descriptiva, las variables cualitativas fueron con datos
discretos para lo cual se usó las herramientas de cálculo y gráficas del propio
programa.
26
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. Aislamiento de E. coli BLEE en heces
De las 29 muestras cultivadas, el 14,3% (2) de Focha Andina (F. ardesiaca) y
26,2% (5) de Cormorán Neotropical (P. brasilianus) fueron positivas para E. coli.
BLEE. 48,2 % (15) no tuvo crecimiento. La identificación positiva se muestra en
la Figura 3. La coloración azul muestra la detección positiva a la bacteria en las
heces cultivadas.
Figura 3. Aspecto típico de colonias positivas a E. coli BLEE, donde las enzimas ß-D-
Glucuronidasa se fijan con el sustrato X-Glucuronida, y se presentan de color azul intenso o
violeta en agar Crhomocult + Cefotaxima 1g/l.
27
Figura 4. Identificación de cepas positivas para E. coli, E. coli BLEE y sin crecimiento
(Negativo)
La proporción de muestras positivas determinadas en este estudio fue del 27,5%
(9/29). A pesar que E. coli se encuentra como flora normal en animales de sangre
caliente (Silva et al., 2014a) se evidencia la ausencia de crecimiento en un
48,2%. Esto indica que la Focha Andina y el Cormorán Neotropical no son
portadores efectivos de la bacteria, incluso en situaciones de supervivencia bajo
estrés ambiental. Estudios realizados sobre Gaviotas de la familia Laridae,
Gansos (Anser anser), y la Focha Común (Fulica Ardesiaca) mostraron que el
contenido de E. coli en heces que puede aportar la focha común a un sistema
lacustre es de 1,1 x 1011 igual que los gansos pero en menor cantidad que las
gaviotas (Meerburg, Koene, & Kleijn, 2011). En contraste con otros estudios, se
observa que el porcentaje de aislamiento de E. coli resistente a antimicrobianos
puede ser considerado bajo. Por ejemplo, el estudio de Poirel et, al. (2012)
realizado en las costas de Florida, analizaron heces de Gaviotas de la familia
Laridae y Pelicanos (Pelecanus erythrorhynchos) (53 y 10 muestras
respectivamente) para testear su resistencia a las cefalosporinas, y obtuvieron
14% de muestras positivas (Poirel et al., 2012). Un porcentaje de aislamiento
cercano (16%) fue reportado por Alcalá et, al. (2015) donde se analizó la
resistencia E. coli a las cefalosporinas en 100 muestras de 16 especies de aves
28%
23%
49%E.coli
E. coli BLEE
NegativoNegativo
E.coli
E. coli BLEE
28
silvestres, de las cuales la cigüeña blanca (Ciconia ciconia) tuvo un mayor
porcentaje de muestras positiva (3/9) (Alcalá et al., 2016).
De las 29 muestras colectadas, Focha Andina presentó el 6.9% (n=1) y
Cormorán Neo tropical el 17.2% (n=4) de cepas positivas para E.coli BLEE
(Figura 5). Las muestras negativas fueron mayores en Focha Andina (44.8%)
que en Cormorán Neotropical (31%).
4.2. Identificación fenotípica E. coli BLEE, técnica de doble disco.
Figura 5. Identificación fenotípica de cepa resistente a E. coli BLEE, en muestra de heces de
Focha Andina de la laguna de Yahuarcocha, donde se muestra un aumento de más 5 mm en
CTX+C con respecto a CTX30.
29
Figura 6. Porcentaje de E. coli BLEE en dos especies de aves acuáticas Focha Andina (Fulica
ardesiaca) y Cormorán Neotropical (Phalacrocorax brasilianus) de la laguna Yahuarcocha,
Ecuador (n=29)
El porcentaje obtenido en este estudio se aproxima a los resultados publicados
por Tausova at al. (2012) donde se evaluó la resistencia de E. coli a cefotaxima
en 49 individuos del Cormorán Grande (Phalacrocorax carbo). En el mencionado
estudio se obtuvieron 8 muestras positivas equivalente a 16 %, considerando
que este estudio se desarrolló en una amplia escala temporal (~ 3 años). La
presente investigación demostró que el 17,2% (5) de cepas positivas a BLEE
(Figura 6.) pertenecen al Cormorán Neotropical resultados que sugieren que
esta especie podría ser un agente de trasmisión de bacterias resistentes a
antimicrobianos, como lo indica un estudio realizado en el Cormorán de Doble
Cresta (Phalacrocorax auritus) en Florida, donde se aislaron por primera vez
Salmonella spp. en esta especie (White & Forrester, 1979).
El hábito alimenticio así como el desplazamiento del Cormorán Neotropical, con
respecto a la Focha Andina podría explicar el alto porcentaje de positividad a
cepas BLEE. Es decir, el uso combinado del ambiente acuático natural y urbano
son factores que han sido evidenciados en aves de zonas agrícolas urbanas en
Holanda (Hasman, Mevius, Veldman, Olesen, & Aarestrup, 2005). Dado que el
44,8%
31,0%
6,9%
17,2%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Fulica Ardesiaca Phalacrocorax brasilianus
% c
ep
as p
osi
tiva
s B
LEE
Especies
Negativo
Positivo
30
uso de antibióticos en las aves silvestres no es frecuente, la presencia de
bacterias multi-resistentes en los animales silvestres puede ser atribuida a la
proximidad de la avifauna a las actividades humanas (e.j. agricultura, ganadería,
tratamiento inadecuado de aguas residuales y alta densidad poblacional) a los
ambientes naturales (Pinto et al., 2010).
La aves acuáticas silvestres han sido poco estudiadas; sin embargo, se
considera que las aves migratorias pueden ser un reservorio importante de
bacterias resistentes a antibióticos, especialmente las especies que tienen algún
tipo de contacto con los seres humanos (Middleton & Ambrose, 2005). Estudios
realizados en gaviotas de la Familia Laridae (Larus sp.), han determinado altos
porcentajes de presencia de ESBL (28.7%). El resultado ha sido atribuido a que
éstas especies tienen características tolerantes de reproducción y adaptación en
ambientes urbano perturbados, así mismo su alimentación tiene alto contenido
de desechos de origen animal, por tanto esta sería la fuente transmisora de las
bacterias (Stedt et al., 2015)
La rápida dispersión de bacterias multi-resistentes debido a la contaminación de
ecosistemas demuestra que las aves silvestres pueden ser diseminadoras de
ESBL de enterobacterias como E. coli (Torres et al., 2007). El contacto con
ambientes acuáticos contaminados y la presencia de alimentos que pueden
tener genes de resistencia hacia diferentes antibióticos son los principales
factores de transmisión hacia humanos (Alcalá et al., 2016; Torres et al., 2007)
Por ejemplo, un estudio realizado en Arabia Saudita en 15 diferentes tipos de
aves migratorias y no migratorias, con un total de 45 muestras de hisopados
cloacales, aisló 94% de E. coli de las cuales 62,5% fueron resistentes a ceftiofur
y cefalexina (Shobrak & Abo-Amer, 2014).
4.3. Resultados e interpretación genes bla CTM-X, bla TEM y bla SHV
Los resultados para la identificación de genes de resistencia a Betalactámicos
se presentan en sistema digital de foto documentación de gel en agarosa (1%)
(Figuras7, 8 y 9). El gen bla CTX-M fue identificado en las dos especies
estudiadas; en Focha Andina un individuo y en Cormorán Neotropical 3
individuos13, 8% (4/29). Los resultados negativos fueron mayoritarios para las
31
dos especies. Para el gen bla SHV, no se obtuvieron muestras amplificadas
(Figura 8), el 100% de muestras analizadas de las dos especies fueron negativo.
El gen bla TEM presentó dos muestras amplificadas 6,90 % (2/29) 1 individuo por
especie (Figura 9), Los resultados para el análisis de los tres genes en muestras
de agua fue negativo 0/4 (Figura 10.)
Figura 7. Resultados de PCR del gen bla CTX-M, en dos especies de aves silvestres acuáticas,
Focha Andina (Fulica ardesiaca) y Cormorán Neotropical (Phalacrocorax brasilianus) de la
laguna Yahuarcocha, Ecuador (n=29) con un tamaño de 600pb.
Figura 8. Resultados de PCR del gen bla SHV, en dos especies de aves silvestres acuáticas,
Focha Andina (Fulica ardesiaca) y Cormorán Neotropical (Phalacrocorax brasilianus) de la
laguna Yahuarcocha, Ecuador (n=29) con un tamaño de 790pb.
32
Figura 9. Resultados de PCR del gen bla TEM, en dos especies de aves silvestres acuáticas,
Focha Andina (Fulica ardesiaca) y Cormorán Neotropical (Phalacrocorax brasilianus) de la
laguna Yahuarcocha, Ecuador (n=29) con un tamaño de 1000pb.
Figura 10. Resultados de PCR para los genes bla CTX-M, bla TEM y bla SHV, (n=29) de
muestras de agua tomadas en la laguna de Yahuarcocha- Ecuador
33
Figura 11. Porcentaje de cepas positivas y negativas del Gen CTX-M, en dos especies de aves
silvestres Focha Andina (Fulica ardesiaca) y Cormorán Neotropical (Phalacrocorax brasilianus)
de la laguna Yahuarcocha, Ecuador (n=29).
Figura 12. Porcentaje de cepas positivas al gen TEM, en dos especies aves acuáticas Focha
Andina (Fulica ardesiaca) y Cormorán Neotropical (Phalacrocorax brasilianus) de la laguna
Yahuarcocha, Ecuador (n= 29).
Los resultados obtenidos en este estudio se aproximan a los resultados
publicados por Hasan et al (2016) sobre un grupo de aves silvestres estudiadas
en Nicaragua, donde se estimó una prevalencia de 13,6% para el gen bla CTX-M
(Hasan et al., 2016b). No osbtante, la prevalencia estimada en este estudio
48,28%
34,48%
3,45%
13,79%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Fulica Ardesiaca Phalacrocorax brasilianus
Po
rce
nta
je d
e g
en
CT
X-M
Especie
Negativo
Positivo
48,28%44,83%
3,45% 3,45%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Fulica Ardesiaca Phalacrocorax brasilianus
Po
rce
nta
je d
e g
enTE
M
Especies
Negativo
positivo
34
difiere con aquella reportada por Guenther, et al (2010) en Alemania donde se
realizó un estudio en cuatro especies de aves silvestres, con un total de 172
aislamientos de E. coli identificándose 2,3% de cepas positivas para el gen bla
CTX-M. La determinación del bla CTX-M, en este estudio (Figura 11, 12.), se
relacionan con un estudio realizado en 9 países de Europa donde se colectaron
3158 muestras fecales de 5 especies de gaviotas, considerando en todos los
sitios de muestreo características similares de densidad poblacional y actividad
humana; observandose que el gen bla CTX-M está presente en un 66,4% (n=602)
de las muestras (Stedt et al., 2015).
Los resultados obtenidos podrían ser explicados por el hecho que bla CTX-M es
uno de los más expandidos a nivel mundial, y es aparentemente, endémico de
E. coli, es frecuente en aves silvestres, ya que también ha sido aislado tanto en
aves terrestres como el Mirlo Negro (Turdus merula) y la Paloma de las Rocas
(Columba livia) y aves semi acuáticas como el Ganso careto (Anser albifrons)
(Guenther et al., 2010). Así mismo otros resultados muestran que los animales
en cautiverio también son susceptibles de poseer genes de resistencia; por
ejemplo en un zoológico de Portugal se analizaron 72 hisopados cloacales de
animales silvestres entre ellos 14 aves de presa donde aislaron 9 muestras
positivas para bla CTX-M, las mismas que tuvieron resistencia intermedia a
cefotaxima y ceftazidime; además, en este estudio de las 14 especies de aves
de presa, 5 resultaron positivas para bla CTX-M y bla TEM y una para bla SHV; esto
demuestra que los animales que tienen un contacto estrecho con seres humanos
tienen mayor susceptibilidad a adquirir resistencia a antibióticos (Costa et al.,
2006). Investigaciones realizadas en otros medios con diferentes especies, tanto
domésticas como silvestres, sugieren que la mayor prevalencia de gen bla CTX-
M se encuentra aves silvestres de medios acuáticos o terrestres e incluso en
aves comerciales, resultados confirmados por Costa et al (2006), por Lukman et
al (2016) y Rouffaer 2014 (Costa et al., 2006; Lukman et al., 2016; Rouffaer et
al., 2014).
Con respecto al gen bla SHV en este estudio no se encontraron muestras
positivas (Figura 13.), en contraste con otros estudios de más largo alcance en
cuanto a número de especies y tamaño de muestra. Por ejemplo, en el estudio
de Veldman et al, (2013) se analizaron 55 especies (n=414), solamente en 4
35
especies se aisló este gen (Veldman, van Tulden, Kant, Testerink, & Mevius,
2013). La explicación a este resultado podría estar en el hecho que este gen es
codificado por plásmidos auto-trasmisibles que con frecuencia generan
resistencia a otros grupos de antibióticos (Liakopoulos et al., 2016).
4.4. Cepas del agua
El 100% de las muestra de agua analizadas fueron negativas a la presencia de
E. coli BLEE (n=4). Consideramos que los resultados negativos podrían estar
vinculados a situación de orden ambiental (Han et al., 2017; Stutter & Cains,
2017) y de protocolo de análisis; dado que, estudios realizados en Portugal sobre
río contaminados donde usaron la técnica de cultivo en placa y posterior
genotipificación (PCR) muestran que la ocurrencia de la diversidad de genes de
resistencia bla CTX-M está asociada a ambientes con presiones de selección
antropogénica (Tacão, Correia, & Henriques, 2012). Además, los mismos
autores sugieren que estas cepas que fueron aisladas en los ríos han sido
anteriormente aisladas en muestras clínicas.
En adición, un estudio experimental realizado en estaques para cría de aves
acuáticas en el Sur de China, usando la técnica de cultivo en placa, se utilizó
agar Maconkey para las muestras de agua, donde se identificó posibles colonias
de E. coli., posteriormente se realizó pruebas bioquímicas para confirmar la
presencia de E.coli en las muestras de agua y se hizo antibiogramas para
determinar la presencia de resistencia hacia diferentes antibióticos , a fin de
realizar PCR para genotipificar genes de resistencia antimicrobiana, el estudio
concluyó que en aguas estancadas expuestas a la presencia de las aves la
prevalencia de blaCTX-M fue de 46,7% (7/15)(Ma et al., 2012). En este estudio a
pesar que el ecosistema tiene alta carga de materia orgánica proveniente de
aves acuáticas y residuos de la población (Terneus, 2014) no se logró amplificar
los genes blaCTX-M, TEM aislados de las aves; a pesar que en el caso de agua
lentas se sugiere que existe una transmisión horizontal a la resistencia de
antibióticos provocada por la diseminación de las heces de los animales en el
agua Ma, et al (2012). Se sugiere un ajuste en el protocolo de estudio del agua
para confirmar nuestros resultados, ya que incluso el CTX-M ha sido aislado en
36
agua usada para consumo humano en Tanzania (Lyimo, Buza, Subbiah, Smith,
& Call, 2016)
37
5. Conclusiones
En la presente investigación se detectaron cepas positivas a BLEE en 7
individuos de dos especies de aves acuáticas de la laguna de Yahuarcocha-
Imbabura, de las cuales el Cormorán Neotropical obtuvo 26,2% y la Focha
Andina 14,3% (n=29).
Se determinaron tres genes de resistencia a antibióticos Betalactámicos (blaCTX-
M, blaTEM, blaSHV), identificándose tres individuos positivos para Cormorán
Neotropical y un individuo positivo para Focha Andina.
Los análisis realizados para aislar genes de resistencia a Betalactámicos en el
agua fueron negativos (0/4), a pesar de existir una evidente contaminación del
medio estudiado.
38
6. Recomendaciones.
Los resultados obtenidos en la presente investigación evidencian una cierta
sensibilidad a la dispersión de bacterias resistentes a Betalactámicos desde
hábitats costeros hacia sitios andinos asociadas al Cormorán Neotropical, dado
que, es una especie con migración altitudinal anual. En este contexto, es
necesario alertar los posibles riesgos de salud pública en el sitio estudiado y
extender el alcance del estudio hacia otras especies que cohabitan en el mismo
espacio y en lagunas cercanas.
39
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48
8. Anexos
ANEXO 1. Tabla para registro de datos morfométricas e identificación de
la muestra biológica.
Nº Especie Fecha Peso (g)
Talla total(cm)
Talla ala(cm)
Talla tarso (cm)
Talla pico (cm)
Sexo Edad Ectoparásitos Hisopado cloacal
49
ANEXO 2. Procedimiento en terreno, captura de Focha Andina en la
laguna de Yahuarcocha para toma de muestra (hisopado cloacal)
Figura 13. Focha Andina (Fulica ardesiaca), capturado en la laguna de Yahuarcocha
50
ANEXO 3. Fotografía tomada para identificación de aves silvestres.
Figura 14. Focha Andina (Fulica ardesiaca), capturado en la laguna de Yahuarcocha