Post on 02-Oct-2018
Universidad Autónoma de Ciudad JuárezInstituto de Ciencias BiomédicasDepartamento de Ciencias Básica
Uso de ciclodextrinas como antioxidantes
Ciudad Juárez
CiclodextrinasOligosacáridos cíclicos naturales constituidos por 6, 7 u 8 unidades de glucopiranosa unidas por enlaces glucosídicos α(1,4)
O
H
H
HO
H
O
OHH
H
OH
O
H
H
HO
H
HO
H
H
OH
O
O
H
H OH
HO
HO
H
H
OHO
H
H
OH
H
O
HOH
H
HO
O
H
H
OH
H
OH
H
H
HO
O
O
H
HHO
HO
OH
H
H
HO
O
H
H
HOH
O
OH
H
H
OH
O
HH
OH
H
O
HO
H
H
OH
O
H
H
OH
H
O
HOH
H
HO
O
H
H
OH
H
O
OH
H
H
HO
OH
H
HO
H
OOHH
H
HO
O
H
H OH
H
OHO
H
H
OH
O
H
HHO
H
O
OH
H
H
HO
O
H
H
HO
H
O
OHH
H
OH
O
H
H
HO
H
O
HO
H
H
OH
O
HH
OH
HHO
H
H
OH
O
OH
HOH
H
OHO
H
H OHO
H
H
OH
H
O
HOH
H
HO
O
H
H
OH
H
O
OH
H
H
HO
O
H H
HO
HOH
H
H
HO
O
OH
HHO
H
OOH
H
HHO
4,7 - 5,3 Å 6,0 - 6,5 Å 7,5 -8,3 Å
α β γ
Almidón
Ciclodextrinas
Ciclodextrina GlucosilTransferasa
E.C. 2.4.1.19
Reacción
intramolecular
Obtención de Ciclodextrinas
Cinturón de hidroxilosprimarios
Cinturón de oxígenos
glucosídicos
H(3) H(3)H(3)
H(5) H(5)H(5)
H(6)H(6
Cinturón de hidroxilos
secundarios
Propiedades fisicoquímicas de las Ciclodextrinas
Complejos de inclusión
Supermolécula formada por una molécula huésped (sustrato) que es incluída o encapsulada en el interior de una molécula hospedadora (receptor)
• Equilibrio Químico
• Constante de equilibrio
La formación de agregados supramoleculares está regida por un Proceso de Reconocimiento Molecular
a) Compatibilidad geométrica:
Tamaño
Forma
b) Compatibilidad en la polaridad.
A mayor polaridad del huésped, menor capacidad de formar complejos
Complejos de inclusión
(b) (c)(a)
(d) (e)
Completo Axial
Parcial
De estequiometría superior
Tipos:
(b) (c)(a)
(d) (e)
Completo Axial
Parcial
De estequiometría superior
(b) (c)(a)
(d) (e)
Completo Axial
Parcial
De estequiometría superior
Tipos:
Estequiometría y Fortaleza.
Complejos de inclusión
Modificación de las propiedades fisicoquímicas de la molécula huésped
Solubilidad: Aumento o disminuciónBiodisponibilidad
Estabilidad: TérmicaOxidaciónDegradación fotoinducida
Otros procesos: Enmascarar saborReducir volatilidad
Complejos de inclusión
● β y γ ciclodextrinas son “generalmente reconocidas como seguras” (GRAS de Generally Recognized As Safe) por la FDA.
● El reconocimiento GRAS fue otorgado en el año 2000 para la γ-CD y 2001 para la β-CD, aunque esta última ha sido utilizada desde 1996.
● La Organización Mundial de la Salud aprobó el uso de la β-CD como aditivo alimentario desde 1993.
● Para estas aprobaciones tuvieron que realizarse estudios de: toxicidad aguda y crónica, teratogenicidad y embrio-toxicidad, estimaciones de la máxima dosis consumible (9-12 mg/día.Kg), etc.
Usos de las ciclodextrinas en alimentos: Normativa
80-90%Vehículo de vitaminas y ácidos grasos como suplemento2%Leche de soya (modificación del sabor)
1 %Bebidas e polvo, sopas instantáneas, polvo para salsas, café y té instantáneos, especias, botanas, chicles y dulces
γ-CD0.2%Sopas deshidratadas
1%Gelatinas y pudines, café y té de sabores, productos de queso, polvo para bebidas
2 %Cereales, chicles, dulces
β-CD
Máximo permitido
Tipo de alimento y uso
80-90%Vehículo de vitaminas y ácidos grasos como suplemento2%Leche de soya (modificación del sabor)
1 %Bebidas e polvo, sopas instantáneas, polvo para salsas, café y té instantáneos, especias, botanas, chicles y dulces
γ-CD0.2%Sopas deshidratadas
1%Gelatinas y pudines, café y té de sabores, productos de queso, polvo para bebidas
2 %Cereales, chicles, dulces
β-CD
Máximo permitido
Tipo de alimento y uso
Usos de las ciclodextrinas en alimentos
• Protección frente a la degradación• Eliminación productos indeseables (olores, sabores)• Control de la maduración de frutas (Metileno)
ColesterolHO
C8H17
Complejo con β-CD insoluble
Ejemplos de aplicaciones
Productos lácteos libresde colesterol
Complejación de Vainillina
Prolongar sensación de frescura y liberación controlada del aroma en:
• Shampoo
• Enjuague de boca
• Chicles
Ejemplos de aplicaciones
Ejemplos de aplicaciones
Complejación de ácidos orgánicos usualmente líquidos para formar granulados:
Producción de bebidas en polvo ricas en proteína de soya y de un color rojo brillante
Ejemplos de aplicacionesComplejación de β caroteno:
Producción de sustitutos de grasas (no digeribles) , enriquecidos en vitaminas liposolubles
CH3 CH3
CH3CH3
CH3
CH3CH3
CH3
CH3
CH3
Ejemplos de aplicacionesComplejación de aceite de ajo: Capacidad antifúngica
Capacidad antioxidante complejos β-CD:polifenoles efecto in vitro
•• ¿¿El complejo ciclodextrina: El complejo ciclodextrina: polifenolpolifenoltiene mayor capacidad antioxidante tiene mayor capacidad antioxidante que el compuesto libre?que el compuesto libre?
•• ¿¿El complejo ciclodextrina: El complejo ciclodextrina: polifenolpolifenolse degrada menos que el antioxidante se degrada menos que el antioxidante libre?libre?
•• FormulaciFormulacióón de suplementos n de suplementos alimenticios alimenticios
Antioxidantes Naturales y Capacidad Antioxidante
Los compuestos fenólicos “neutralizan” el exceso de radicales libres que pueden desarrollar enfermedades crónicas de tipo degenerativo tales como el cáncer y cardiovasculares.
Estos radicales libres pueden dañar el ADN y ser potencialmente cancerígenos
Antioxidantes Naturales y Capacidad Antioxidante
Otro efecto protector de estos antioxidantes es a nivel cardiovascular.La LDL-colesterol al ser oxidada por radicales libres es reconocida por los macrófagos muy rápidamente.
Antioxidantes Naturales y Capacidad Antioxidante
Esta respuesta tan agresiva puede crear daños en el endotelio vascular, solución de continuidad en vasos y finalmente trombos.
Antioxidantes Naturales y Capacidad Antioxidante
Un buen aporte de frutas a la dieta puede tener excelentes efectos en nuestra salud
Es importante mantener la capacidad antioxidante de los alimentos
Antioxidantes Naturales y Capacidad Antioxidante
Determinación de la Capacidad Antioxidante
Dos métodos principales:
- Transferencia de átomos de hidrógeno (HAT)
X· + AH → XH + A·
Método ORAC
ROO. + proteína → oxidación
ROO. + AH → ROOH + A.
ROO. + A. → ROOA
Reacción Rápida
Independiente del disolvente
tiempo (min)
0 20 40 60 80 100
Fluo
resc
enci
a (u
a)
0
10
20
30
40
50
60
Dos métodos principales:
- Transferencia individual de electrón (SET)
M(III) + AH → M(II) + AH+
Método FRAP
Determinación de la Capacidad Antioxidante
Fe(TPTZ)2(III) + AntiOH → Fe(TPTZ)2(II) + AntiOH+·
Ambos mecanismos (HAT y SET) ocurren paralelamente
Capacidad Reductora
Reacción Lenta
Dependiente del disolvente y pH
Sensible a la presencia de vit. C
Determinación de la Capacidad Antioxidante
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 500 1000 1500 2000
Tiempo / s
Abs
595
Qc
Rt
CA
CDQC
CDRt
CDCA
y = 0.0005x + 0.1594R2 = 0.9988
00.2
0.40.6
0.81
1.21.4
1.61.8
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
Fe2+ / mM
Abs
Cuantificar la concentración de
Fe2+ reducido
•• ¿¿Forman las ciclodextrinas Forman las ciclodextrinas complejos de inclusicomplejos de inclusióón con los n con los
polifenolespolifenoles??
•• ¿¿Los Los complejoscomplejos mmodificanodifican la la capacidad antioxidante de los capacidad antioxidante de los
polifenolespolifenoles??
Capacidad antioxidante complejos β-CD:polifenoles efecto in vitro
Formación de los complejos de inclusión β-CD:polifenoles
Quercetina
0
5
10
15
20
450 500 550
l / nm
u. a
. f.
Espectro de fluorescencia
Formación de los complejos de inclusión β-CD:polifenoles
Análisis no lineal: ajuste por mínimos cuadrados
[β-CD] / nm
0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010
Fluo
resc
ence
Inte
nsity
/ a.
u.
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
1/[β-CD]
0 1000 2000 3000 4000
1/Δ
F
0 .050 .100.150.200.250.300.350.400.45
[ ][ ]01
011
1 CDKCDKFFF CH
++
=λλ
λ
Datos iniciales:Valores de ajuste lineal:
K1
K1
Guest K1/ M-1
(linear fit)
K1/ M-1
(non-linear fit)
CA 420 ± 50a 465 ± 26
Rt 250 ± 48 224 ± 14
Qc 1284 ± 106 1138 ± 52
Formación de los complejos de inclusión β-CD:polifenoles
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 500 1000 1500 2000
Tiempo / s
Abs
595
Qc
Rt
CA
CDQC
CDRt
CDCA
Transformar a concentración de Fe2+ con la curva de calibración
Capacidad antioxidante complejos β-CD:polifenoles efecto in vitro
Capacidad antioxidante complejos β-CD:polifenoles efecto in vitro
Fe2+ 4 min Fe2+ 30 min
Qc 1424 ± 73 2073 ± 130
Rt 660 ± 58 1454 ± 73
CA 569 ± 23 1063 ± 65
Qc:CD 1515 ± 107 2225 ± 227
Rt:CD 770 ± 23 1608 ± 70 *
CA:CD 673 ± 11 * 1215 ± 27 *
Valores FRAP 4 min
Valores FRAP 4 min y 30 min
0200400600800
10001200140016001800
Qc Qc/CD Rt Rt/CD CA CA/CD
Tratamiento
Fe2+
*
4 grupos: a) control (agua)b) β-CD ( 6 mM)c) Ácido Caféico (6 mM)d) Mezcla (6 mM CD + 6
mM AC)
Duración del experimento: 28 días
Capacidad antioxidante in vivo de complejos de ciclodextrina
Extracción de sangre (2 mL), centrifugar para separar el plasma y medir capacidad antioxidante por la técnica FRAP
Capacidad antioxidante in vivo de complejos de ciclodextrina
0.0
100.0
200.0
300.0
400.0
500.0
600.0
700.0
CD Caf com agua
[Fe2+
] / m
M
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
80.0
90.0
CD Caf com agua
mg
Col
este
rol
Capacidad antioxidante:
Diferencia significativa entre tratamiento con ciclodextrina
Colesterol:
No se presentaron diferencias entre tratamientos
Efecto de la ciclodextrina en la inhibición de la actividad de la PPO
Sustrato + Ciclodextrina Complejo
o-Quinonas
Pardeamiento
PPO
Aminoácidos
K11
Efecto de la β-ciclodextrina sobre la actividad de la PPO
Forma de acción de la PPO
R
OH
R
OH
OH
R
O
O
O2Actividad cresolasa
O2Actividad
catecolasa
R
OH
R
OH
OH
R
O
O
O2Actividad cresolasa
O2Actividad
catecolasa
R
OH
R
OH
OH
R
O
O
O2Actividad cresolasa
O2Actividad cresolasa
O2Actividad
catecolasa
O2Actividad
catecolasa
Enzima responsable del pardeamiento de frutasEnzima responsable del pardeamiento de frutas
[AC] / mM
0 2 4 6 8 10
V o/Uabs
1
0.0000
0.0005
0.0010
0.0015
0.0020
0.0025control 4-HR / 0.5 mM β-CD / 5.0 mMMezcla (CD+ 4-HR)
Vo
/ U
abss
-1
***
§§
Efecto de la β-CD, 4HR y Mezcla sobre la oxidación del AC por PPO de Manzana
Todos los tratamientos produjeron una inhibición de la
actividad de la PPO, siendo esta mayor para el caso de la
mezcla.
Efecto de la ciclodextrina en la inhibición de la actividad de la PPO
Control 4-HR ΜJ* β-CD
Vmax1 2.9 2.8 2.2 2.5
K´M1 3.39 9.86 4.20 8.35
Vmax2 3.0 2.8 2.9 2.1
K´M2 3.68 10.84 6.62 6.4
Ki 0.26 8.38 3.42
Parámetros cinéticos de la PPO de manzana Red Delicious en presencia de los inhibidores.
1Ajuste no-lineal a la ecuación de Michaelis-Menten; 2ajuste lineal a la ecuación Lineweaver-Burk.
Competitivo MixtoMixto
Efecto de la ciclodextrina en la inhibición de la actividad de la PPO
Efecto de la ciclodextrina en la capacidad antioxidante de manzana fresca cortada
Manzana cortada lavada y Manzana cortada lavada y tratada con CD, extracto de la tratada con CD, extracto de la piel, extracto mas CD y aguapiel, extracto mas CD y agua
Tomar muestras liofilizar y Tomar muestras liofilizar y determinar capacidad determinar capacidad antioxidanteantioxidante
Efecto de la ciclodextrina en la capacidad antioxidante de manzana fresca cortada
1500
2000
2500
3000
0 3 5 7
Días
[Fe2+
] / m
M ControlAguaCD
Capacidad antioxidante de manzana fresca cortadaCapacidad antioxidante de manzana fresca cortada
¡¡Gracias!Gracias!