Post on 27-Jan-2016
Tema 29. Ingeniería genética
Definición crear y analizar DNA recombinante
Técnicas y estrategias
1. enzimas de restricción y vectores
2. construcción del DNA recombinante
3. clonación y obtención de un clon
4. caracterización y análisis del fragmento clonado
5. mapas de restricción, Southern (electroforesis e hibridación), PCR, RFLP, VNTR, secuenciación, transgénicos
Aplicaciones de la Ingeniería Genética
1. Estudio del material genético: organización, estructura, expresión y evolución
2. Producción de proteínas humanas/animales en bacterias: insulina, interferón, factores coagulantes, vacunas
3. Organismos transgénicos: levaduras, plantas y vertebrados
4. Humanos: identificación de individuos (genética forense); detección de enfermedades genéticas; terapia génica
5. Medio ambiente: biorremediación (petróleo), metales pesados
enzima de restricción (tipo II)
(sitio de restricción)
palíndromo (4-8 pb)
extremos de secuencias específicas
K12 B
K12 (P1)
100%
100%
100%
0,002%
0,01% 0,01%
Restricción y Modificaciónsistemas de modificación y restricción
enzimas de restricción o endonucleasas de restricción (I)
extremos cohesivos, escalonadosen bisel o pegajosos
enzimas de restricción o endonucleasas de restricción (II)
extremos romos
corte y unión
vectores de clonación
• Moléculas pequeñas y bien caracterizadas
• Contienen:
- un origen de replicación autónomo
- sitios de corte únicos para enzimas de restricción- marcador de selección
• Fácil recuperación de la molécula híbrida
plásmidos20-100 copias/célulafragmento clonado: 5-10 Kpb
fagos
15-20 Kpb
cósmidosHíbrido entre plásmido y fago:‘in vivo’ se mantiene como plásmido; ‘in vitro’ se empaqueta como fago
Fragmento clonado: hasta 45 Kpb
fagos de una cadena
Infección: 1 cadena; replicación: 2 cadenas (≈ plásmidos)
Útiles: secuenciación y mutagénesis
Ej: el más usado M13
BAC: cromosomas artificiales bacterianos
Basados en plásmido F (genes de replicación y control de número de copias)
Vectores de expresión: sitios de restricción flanqueados por promotores
cromosomas artificialesde levadura (YAC)
preparación de fragmentos a clonar
extremos cohesivos
extremos romos: ligasa de T4 puede unir o uso de conectores
adición de colas a extremos romos: desoxinucleotidil transferasa terminal de timo de ternera en extremos 3’ (tras digestión de 5’ con una exonucleasa). Uso de colas poliA/poliG y poliT/poliC (fragmento y vector)
clonación en E. coli
pBR322
pUC18
selección de plásmidos recombinantes
selección del clon deseado (I)
selección del clon deseado (II)
selección del clon deseado (III)
mapa de restricción (I)
caracterización de lassecuencias clonadas
mapa de restricción (II)
model 1 model 2
mapa de restricción: recopilación del número, orden y distancias entre los sitios de corte de enzimas de restricción de una molécula o segmento de DNA
síntesis de cDNAa partir de mRNA
Southern Edward Southern, 70’s
Identificación de lassecuencias clonadas
Southern, Northern y Western
PCR
Polimerasa Taq de Thermus aquaticus
RFLP: polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción
Aplicaciones RFLP:- mapeo cromosómico- diagnóstico de
enfermedades- pruebas de paternidad - genética forense
sospechosos
muestra
VNTR: repeticiones en tándem de número variable
Aplicaciones VNTR: - pruebas de paternidad - genética forense - evolución de poblaciones
VNTR: pruebas de paternidad
secuenciación (método Sanger)
gel de secuenciación
Aplicaciones de la secuenciación: estudio de los genes a nivel de - estructura y función - evolución (bases de datos)
Secuencia obtenida (leída de abajo hacia arriba): CATGTCAGCTGT…
secuenciación automática
secuenciación automática
transgénico vegetal
obtención de un transgénico vegetal (I)
obtención de un transgénico vegetal (II)
maíz resistente a herbicida
arroz blanco y arroz dorado (GM; beta-carotenos)
transgénico animal
terapia génica
tipos de terapia génica en mamíferos
One of the six restriction maps shown here is consistent with the pattern of bands shown in the accompanying figure in the gel after digestion with several restriction endonucleases. The enzymes that were used are shown.
(a) From your analysis of the pattern of bands on the gel, select the correct map and explain your reasoning.
(b) In a Southern blot prepared from this gel, the highlighted bands (pink) hybridized with the gene pep. Where is the pep gene located?
problema