Tema 14. Principios de Genética Bacteriana. Variaciones Bacterianas. Mutaciones.

Tema 15. Recombinación.

Tema 16. Transferencia de material genético en bacterias: Transformación. Conjugación. Transducción.

Tema 17. Ingeniería genética. Técnicas y Aplicaciones.

BLOQUE III. MICROORGANISMOS PROCARIOTICOS

III.C. GENÉTICA BACTERIANA

1. CONCEPTO Y APROXIMACION HISTORICA-Experiencia de Lederberg y Tatum-Experiencia de Davis-Experiencia de Lederberg y Hayes

2. DESCRIPCION DEL PLASMIDO F Y DE SUS FUNCIONES BÁSICASEstructura físicaOrganización genética y funcionalProcesos de integración y escisión del plásmido F

3. FASES DE LA CONJUGACIÓN-Contactos entre las células-Transferencia del DNA

F+ x F- ----- F+, HfrHfr x F- ----- F-F' x F- ----- F', Hfr

-Estado del DNA donador en la célula receptora

4. APLICACIÓN DE LA CONJUGACIÓN EN EL LABORATORIO

Tema 16. Conjugación.

Conjugación: Transferencia de material genético entre dos bacterias vivas, donadora y aceptora, a través de un contacto físico

1. CONCEPTO Y APROXIMACIÓN HISTÓRICA

Transferencia de ADN plasmídico

Transferencia de ADN cromosómico

Donador

Receptor

•Aparición de colonias con frecuencia muy superior a la de doble reversión

- Escherichia coli K12

Prototrofos

RECOMBINACIÓN

A B

Medios mínimos sin metionina, biotina, treonina, leucina

Mutantes auxotrofos1.Experimento de Lederbergy Tatum (1946)

2. Experimento de Davis

Bio- met- thr+ leu+ Bio+ met+ thr- leu-A B

4 h

No crecimiento

E. coli K12

A B

2. Experimento de Davis

Bio- met- thr+ leu+ Bio+ met+ thr- leu-A B

4 h

Prototrofas

E. coli K12

A B

Sin filtro

Las células necesitan contactar físicamente

Bio+ met+ thr+ leu+

3. Experimento de Lederberg y Hages

Célula donadorafértil F+

Célula receptora no fértil F-

La conjugación es un FENÓMENO POLAR

Factor sexual F+

Plásmido F(genes para los pili)

OmpA

Receptores pili

3. Experimento de Lederberg y Hages

Célula donadorafértil F+

Célula receptora no fértil F-

La conjugación es un FENÓMENO POLAR

Factor sexual F+

OmpA

Receptores pili

3. Experimento de Lederberg y Hages

Célula donadorafértil F+

Célula receptora no fértil F-

La conjugación es un FENÓMENO POLAR

Factor sexual F+

F+ F- F+ F+

F+ ~ (100%)Frecuencia recombinación (10-5)

(la auxotrofía desaparecía rara vez)

Estructura física, organización genética y funcional del plásmido F

25 genes(33Kb)

Región tra

Plásmido F100 Kb

-biosíntesis y ensamblaje de pelos sexuales-estabilización de los agregados de conjugación-regulación genética de la transferencia-proteínas que tapan las porinas ompA

(fenómeno de exclusión de superficie)

Región de replicación:ori V y ori T

Región tra

Estructura física, organización genética y funcional del plásmido F

Plásmido F100 Kb

Región de integración del plásmido en el cromosoma y de su escisión.

Organización genética y funcional del plásmido F

Región de replicación:ori V y ori T

Región tra

Integración del plásmido F en el cromosoma

autónomo integradoF+ Hfr

F+ Hfr

Recombinación homóloga(RecA)

Recombinación homóloga(RecA)

Hfr

Gen cromosómico

Plásmido F

Escisión del Plásmido FHfr F’

Separación del plásmido F llevándose parte del cromosoma bacteriano

Posibles situaciones del plásmido F

autónomo integradoAutónomo (con un fragmento cromosoma)

Hfr F’

F+

Célula F+

Célula F-

1. Contactos entre células fértiles y células infértiles

1-10 pelos sexuales

OmpA

HfrF’

F+

3. Fases de la conjugación

1. Contactos entre células fértiles y células infértiles

OmpA

Cromosoma bacteriano Plásmido F

Pili

Puente conjugativo

Genes tra

Célula F+ Célula F-

oriT

El pelo se despolimeriza

El pili se retrae

2.Transferencia y procesamiento del DNA conjugativo

oriT

a) Transferencia entre células F+ y F-

TODA LA POBLACIÓN F+

Inicio síntesis de la cadena complementaria en célula receptora

Final transferencia DNASeparación células

Endonucleasahelicasa

Genes tra

a) Transferencia entre células F+ y F-

F+ F- F+ F+

oriT

b) Transferencia entre células Hfr y F-

Ori THfr F- Hfr F-

tiene un fragmento del DNA plasmídico y cromosómico con el cual puede recombinar o degradar

TODA LA POBLACIÓN F+

c) Transferencia entre células F’ y F-

F’ F- F’ F’

oriT

TODA LA POBLACIÓN F’

Cruces posibles

•F+ X F-→ F+

•Hfr X F-→ Hfr + F-

•F’ X F- → F’

Cruces no viables (exclusión superficial)

F+ X F+ F+ X Hfr F+ X F’

F’ X F’ F’ X Hfr

Hfr X Hfr

1.- Contactos entre las células2.- Transferencia del DNA

FASES DE LA CONJUGACIÓN

4. Aplicación de la conjugación en el laboratorio

Construcción de mapas cromosómicos(actualmente por secuenciación)

Ingeniería genética

1. Concepto y aproximación histórica

2. Tipos de bacteriófagos implicados en la transducción

3. Tipos de transducciónTransducción generalizada

-características-mecanismo

Transducción especializada-características-mecanismo

4. La transducción en la naturaleza y en el laboratorio

Tema 16. Transducción.

Transducción: Transferencia de material genético en la que el DNA exogenote es vehiculizado desde la célula donadora a la aceptora a través de un bacteriófago

1. Concepto y aproximación histórica

Células A ++ -- x Células B -- ++

Medio de cultivo deficiente enbio, met, tre, leu, etc.

En todos los casos hubo crecimiento de colonias recombinantes

Prototrofos

Norton Zinder y Joshua LederbergSalmonella typhimurium

Células A ++ -- x Filtrado del cultivo de las células B -- ++Células A ++ -- separadas por filtro Células B -- ++

+ DNAsas

Medio de cultivo deficiente enbio, met, tre, leu, etc.

+ DNAsas Prototrofos

1. No se requiere contacto célula-célula2. No se afecta por la DNAasa3. Agente de transferencia atraviesa el

material poroso (bacteriófago)4. La recombinación solo ocurre con

células receptoras que tengan sitios receptores para el virus

Transducción Proceso de transferencia genéticamediada por un virus

2. Tipos de bacteriófagos implicados en la transducción

Ciclo lítico Ciclo lisogénico

inducción

Adsorción

Penetración

Síntesis de ácidos nucleicos y proteínas

Ensamblaje

Lisis

2. Tipos de bacteriófagos implicados en la transducción

Fagos virulentos Fagos atemperados o moderados

1.Transducción generalizada

2.Transducción especializada

Fagos virulentos

Fagos atemperados o moderados

Empaquetamiento inespecífico

1.Transducción generalizadaFagos virulentos

Partículas transductantes

Partículas virales

Ciclo lítico

La transducción no siempre va seguida de recombinación del DNA exogenote en la

célula receptora

b)DNA transductante muy diferente(sistemas modificación-restricción)

DNA se recombina

DNA no se recombina

a)Transducción abortiva

Recombinación homóloga o generalizada

Supervivencia DNA donador

Degradación

Transferencia génica estable

Ciclo lisogénico

Adsorción

Penetración

Síntesis de ácidos nucleicos y proteínas

Ensamblaje

Lisis Integración del DNA fago

Profago Bacteria lisogénica

Recombinación específica de sitio

2.Transducción especializada

Fagos atemperados o moderados

Recombinación específica de sitio - Entre secuencias idénticas(sitios de fijación “att”)

- No interviene RecA

Escherichia coli

Fago lambda

Integrasa(int)

2.Transducción especializada

Fagos atemperados o moderados

ATAT

TATA

ATAT

TATA

integrasa

A TATTAT A

A TAT

TAT A

Recombinación específica de sitio

ATAT ATATTATA TATA

λ

E.coli

Recombinación específica de sitio

-proceso reversible el DNA del fago se escinde (escisionasa)

Ciclo lítico

Escisión normal Escisión defectuosa

Transducción generalizada(igual fagos virulentos)

Infección célula receptora

gal+

gal+

gal+

Fagos defectivos

Escisión defectuosa

Infección célula receptora

a) Entrecruzamiento para integrar genes bacterianosCromosoma bacteriano que contiene DNA del dador

b) Integración como profagoCromosoma bacteriano que contiene DNA viral y del dador

gal+

Bacteriofago + gal+

Fagos defectivos

No dan ciclos líticos

2. TRANSDUCCIÓN ESPECIALIZADA

a) Fagos con ciclo lisogénico(atemperados)

b) Se transfieren zonas concretasdel cromosoma

c) Se produce por escisión del profago y consiguiente entrada a fase lítica

d) El DNA genómico de la bacteria va unido al DNA del fago

TIPOS DE TRANSDUCCIÓN

1. TRANSDUCCIÓN GENERALIZADA

a) Fagos con ciclo lítico(virulentos)

b) Se transfiere con igual probabilidad cualquier región del cromosoma

c) La eficiencia de la transducción para cualquier marcador cromosómico es muy baja

d) El DNA transferido puede sufrir recombinación generalizada

Transducción en la naturaleza y en el laboratorioEn la Naturaleza: tiene importancia como mecanismo de intercambio genético

En el Laboratorio: clonaje de genes, construcción de mapas genéticos y librerías genómicas