Actividad de los antimicrobianos frente a las biocapas bacterianas

Isabel García LuqueDepartamento de Microbiología

Universidad de Sevilla

Infecciones asociadas a dispositivos médicos

Aumento considerable de dispositivos médicos. Alta incidencia de infecciones.

Infecciones persistentes que responden poco/mal a tratamientos convencionales.

Resistencia/ tolerancia a los antimicrobianos.

Infecciones asociadas a dispositivos médicos.

Implante nº /año Infecciones Mortalidad

Catéter intravascular 200.000.000 <0,1-7% 15-20%

Sonda uretral 5.000.000 5-10%

Shunts LCR 80.000 10-15%

Marcapasos 60.000 0-3% 2%

Válvulas protésicas 100.000 1-5% 34%

Prótesis articulares 350.000 <1-2% 2,5%

Implantes dentales 436.000 15%

Infecciones asociadas a dispositivos médicos

DevicePrevalent causative pathogens

Principal Secondary

Central venous catheters CoNS S. aureus, enterococci, Candida spp., K. pneumoniae, P. aeruginosa.

Urethral catheters E. coli Candida spp., CoNS, E. faecalis, P. mirabilis.

Mecanical heart valves CoNS S. aureus, Streptococcus spp., GNB, enterococci, diptheroids.

Ventricular assist devices CoNS S. aureus, Candida spp., P. aeruginosa.

Coronary stents S. aureus CoNS, P. aeruginosa, Candida spp.

Neurosurgical ventriclar shunts Staphylococci Streptococcus spp., Corynebacterium, GNB.

Peritoneal dialysis catheters S. aureus P. aeruginosa, other Gram-negative spp., Candida spp.,

Orthopedic prostheses Staphylococci S. pneumoniae, Streptococcus spp., P. acnes.

Fracture-fixation devices CoNS S. aureus, Propionibacterium spp., Corynebacterium,

Endotracheal tubes Enteric GNB P. aeruginosa, Streptococcus spp., Staphylococcus spp.

Inflatable penils implants CoNS S. aureus, enteric GNB, P. aeruginosa, Serratia spp., fungi.

Breast implants Staphylococci E. coli, peptostreptococci, C. perfringens, P. acnes.

Cochlear implants S. aureus P. aeruginosa, Streptococcus spp., N. meningitidis, fungi.

¿Cómo actuar?: Retirada/cambio del dispositivo. Tratamiento antimicrobiano prolongado

a altas dosis.

Reintervención difícil. Única opción: tratamiento

antimicrobiano.

Costes elevados

Actividad antimicrobiana –biocapas bacterianas

Huésped Microorganismo. Antimicrobiano.

DISPOSITIVO MÉDICO

Comunidad de microorganismos, incluidos dentro de una matriz extracelular, que se encuentran adheridos a una superficie o en una interfase y que poseen un estado metabólico diferente del de las bacterias de vida libre.

J.W.Costerton. The Biofilm Primer

Biocapas bacterianas:

Fase inicial: inespecífica, reversible. Interaccionesa larga distancia (>150 nm).

− Fuerzas de Van der Waals− Gravitación− Interacciones electrostáticas− Hidrofobicidad

Formación de las Biocapas. Adherencia

− Enlaces de hidrógeno− Enlaces covalentes− Interacciones iónicas− Hidrofobicidad− Moléculas bacterianas

(adhesinas, GPS) Fase secundaria: específica, irreversible. Interacciones

a corta distancia (<3 nm).

Una vez adheridas, las bacterias comienzan a multiplicarse hasta que se desarrolla la biocapa madura.

Formación de las Biocapas.

“Mecanismo bacteriano de comunicación intercelular controlando la expresión génica en función de la densidad celular”.

En el proceso de desarrollo de la biocapa, se establece una comunicación entre las bacterias (quorum sensing).

La estructura de la biocapa no es homogénea.

Eficacia de los antimicrobianos frente a las biocapas bacterianas.

Penetrar a través de la densa matriz de la biocapa.

Mantener su actividad bactericida: En las diferentes condiciones

microambientales. Frente a bacterias de crecimiento lento.

Presentar baja tasa de desarrollo de resistencias

Resistencia de las biocapas bacterianasa los antimicrobianos

Resistencia innata. Mecanismos adicionales, diferentes a los de las

bacterias planctónicas. CMB biocapas >> CMB planctónicas. Las bacterias recuperan rápidamente su

sensibilidad cuando se liberan de la biocapa.

Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos en las biocapas bacterianas:

Inadecuada exposición al antimicrobiano (permeabilidad reducida).

Alteraciones en el metabolismo bacteriano: Baja tasa de crecimiento Heterogeneidad fenotípica

Resistencia inducida por los biomateriales

Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos en las biocapas bacterianas:

Inadecuada exposición al antimicrobiano (permeabilidad reducida). Pseudomonas aeruginosa: alginato- imipenem y

tobramicina. Staphylococcus aureus: slime - glicopéptidos.

Actividad dependiente de la estructura /composición química de la biocapa y tamaño/composición química del antimicrobiano.

Estudios de Permeabilidad

JM Rodríguez-Martínez et al. 2007 ( modif. Anderl et al. AAC 2000)

1 1 MH agar. 2,4 Membranas de policarbonato. 3 Biocapas. 5 Disco de antimicrobiano

1

5

43 21

5

43 2

Permeabilidad de CIP, AMC, FOS y SXT en biocapas de P. aeruginosa y E. coli

FOSFOMICINA

0,025,050,0

75,0100,0125,0150,0

175,0200,0

1 3 6

Tiempo en horas

µg

de

anti

mic

rob

ian

o

E. coli E. coli BLEE+ P. aeruginosa

50%

AMOXICILINA-CLAVULANICO

0,05,0

10,015,0

20,025,030,0

1 3 6

Tiempo en horas

µg

de

a

nti

mic

rob

ian

o

E. coli E. coli BLEE+ P. aeruginosa

50%

COTRIMOXAZOL

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

1 3 6

Tiempo en horas

µg

de

anti

mic

rob

ian

o E. coli E. coli BLEE+ P. aeruginosa

50%

CIPROFLOXACINO

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

1 3 6

Tiempo en horas

µg

de

anti

mic

rob

ian

o E. coli E. coli BLEE+ P. aeruginosa

50%

Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos en las biocapas bacterianas:

Alteraciones en el metabolismo bacteriano: Tasa de crecimiento reducida:

• Pseudomonas aeruginosa /betalactámicos.

• Staphylococcus epidermidis/ ciprofloxacino.

• Diferentes condiciones microambientales: ácido/básicas, aeróbicas/anaeróbicas• P. aeruginosa / tobramicina.

Mecanismos convencionales de resistencia a los antimicrobianos.

Mecanismo de resistencia Especies bacterianas Antimicrobianos

Impermeabilidad de las biocapas a los agentes antimicrobianos

P. aeruginosaAminoglucósidos,

Betalactámicos

S. epidermidisS. aureus

Vancomicina, Teicoplanina

Tasa alterada de crecimiento

P. aeruginosaE. coli

Betalactámicos

S. epidermidisS. aureus

Fluoroquinolonas

El microambiente de las biocapas afecta a la actividad antibacteriana

Característica general de las biocapas

Aminoglucósidos, Macrolidos, Tetraciclinas

Mecanismos de resistencia expresados en bacterias

planctónicasP. aeruginosa

Azitromicina, Betalactámicos,

Tobramicina

Elementos genéticos de transferencia horizontal

EnterobacteriaceaeBetalactámicos,

Aminoglucósidos

Mecanismos de resistencia de las biocapas bacterianas:

Resistencia inducida por biomateriales:P. aeruginosa y látex siliconizado:

La actividad de las carbapenemas disminuye en presencia de este biomaterial.

(J Med Microbiol 1997).

Relacionado con las OMPs (pérdida de oprD2).(Antimicrob Agents Chemother. 1999)

Inducida por el Zn liberado al medio. (Antimicrob Agents Chemother. 2003)

OMPs de P. aeruginosa: Efecto del zinc

MC. Conejo et al.; Antimicrob Agents Chemother. 2003

CzcCBA: Bomba de expulsión responsable de la co-resistencia a carbapenemas y metales pesados.

Perron K. et al. J Biol Chem 2004; 279: 8761-8768.

“Comparison of biofilm-associated cell survival following in vitro exposure of meticillin-resistant Staphylococcus aureus biofilms to the antibiotics clindamycin, daptomycin, linezolid, tigecycline and vancomycin”. Smith et al. Smith et al. Int J Antimicrob Agents. 2009

Limitaciones estudios in vitro:

Formación proceso complejo: Muchos factores. Difícil reproducir in vitro.

Resultados controvertidos. Cautela a extrapolar in vivo.

Métodos de estudio in vitro

Modelos estáticos: Formación de las biocapas:

Placas de microdilución. Incubación de segmentos.

Exposición de la biocapa al antimicrobiano

Ventajas: Muchos antimicrobianos, diferentes concentraciones.

Inconvenientes: Modelo estático, tiempos cortos, poliestireno

Efecto de daptomicina sobre la formación de biocapas

MRSAMRSA MSSAMSSA

VISAVISA

MSSEMSSEMRSEMRSE

>75%>75%>70%>70%

>90%>90%

70-90%70-90%

80%80%

Roveta et al. Roveta et al. Int J Antimicrob Agents 2008

Adherencia bacteriana a biomateriales plásticos

Catéter S. aureus S. epidermidis E. coli P. aeruginosa

Latex siliconizado

27 ±3 18 ±2 19 ±2 24 ±3

PVC 42 ±5 23 ±3 18 ±2 41 ±4

Teflon 11 ±1 7 ±0,4 3 ±0,1 10 ±1

Poliuretano 15 ±1 4 ±0,6 9 ±0,1 13 ±1

Vialon 7 ±1 5 ±0,3 4 ±0,2 11 ±1

López et al. J. Med Microbiol. 1991.

Bacterias adheridas x 105/cm2

Cultivo continuo. Sistema de flujo laminar.Cultivo continuo. Sistema de flujo laminar.

Dispositivo de Robbins

Métodos de estudio in vitroModelos dinámicos

Modelo dinámico

Sevilla device Cultivo continuo. Sistema de flujo laminar. Utilizar segmentos de catéteres.

Poliuretano. Biocapas de 24 h

Acero inoxidable. Biocapas de 96h.

Actividad de antimicrobianos frente a microorganismos Gram positivos resistentes

Daptomicina / Biometales

Cepas: Staphylococcus epidermidis ATCC 35984 (ica +: productora de

slime). CMI:

Daptomicina 0.5 mg/LVancomicina 2.0 mg/L

Biomateriales: Segmentos de catéteres de poliuretano (3 cm; 7 french). Discos de acero inoxidable 316L (diámetro: 8 mm).

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

0 24 48

Tiempo (h)

ufc

/cm

2

Control 20mg/L Daptomicina 20mg/L Vancomicina

Poliuretano. Biocapas de 24 h

* p<0.05 comparada con vancomicina

*

*

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

0 24 48 72

Tiempo (h)

ufc

/cm

2

Control 20mg/L Daptomicina 20mg/L Vancomicina

Acero inoxidable. Biocapas de 96h.

* p<0.05 comparada con Vancomicina

* *

*

Figura 2. Microscopía electrónica de barrido de las biocapas de 72 horas de S. epidermidis sobre catéteres de poliuretano usando el dispositivo diseñado por nuestro grupo sin antimicrobiano (a) y expuesto a 7.5mg/L de daptomicina (b)

a) b)

Linezolid / Biometales

Actividad comparativa de linezolid y vancomicina frente biocapas bacterianas de 96 horas sobre acero inoxidable a distintos tiempos.

ufc

/cm

2

1,00E+02

1,00E+04

1,00E+06

1,00E+08

1,00E+10

0 1 2 3 7Tiempo (días)

Control Linezolid+Rifampicina Vancomicina+Rifampicina

1,00E+02

1,00E+04

1,00E+06

1,00E+08

1,00E+10

0 1 2 3 7Tiempo (días)

Control Linezolid+Rifampicina Vancomicina+Rifampicina

*

**

*

ufc

/cm

2

1,00E+02

1,00E+04

1,00E+06

1,00E+08

1,00E+10

0 1 2 3 7Tiempo (días)

Control Linezolid+Rifampicina Vancomicina+Rifampicina

1,00E+02

1,00E+04

1,00E+06

1,00E+08

1,00E+10

0 1 2 3 7Tiempo (días)

Control Linezolid+Rifampicina Vancomicina+Rifampicina

*

**

*

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+10

0 1 2 3 7Tiempo (días)

Control Linezolid Vancomicina

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+10

0 1 2 3 7Tiempo (días)

Control Linezolid Vancomicina

ufc

/cm

2

Tiempo (días)

**

***

*

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+10

0 1 2 3 7Tiempo (días)

Control Linezolid Vancomicina

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+10

0 1 2 3 7Tiempo (días)

Control Linezolid Vancomicina

ufc

/cm

2

Tiempo (días)

**

***

*1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+10

0 1 2 3 7Tiempo (días)

Control Linezolid Vancomicina

ufc

/cm

2

Tiempo (días)

**

***

***

***

*

Linezolid / Biometales

Actividad de linezolid y vancomicina asociados a rifampicina frente biocapas bacterianas de 96 horas sobre acero inoxidable a distintos tiempos.

Nuevas estrategias frente a las biocapas bacterianas

Impedir la formación de la biocapa: Bloqueando la adherencia:

Biomateriales impregnados con biocidas o antimicrobianos. Moléculas antisentido que silencien los genes involucrados en la

adherencia Inhibidores del quorum

sensing.

Adhesión inicial Adherencia Colonización

Tra

nsp

ort

e d

e m

asas

Inte

racc

ion

es e

lect

rost

átic

as

Van

der

Waa

ls

Ad

hes

ina-

rece

pto

r

Inte

racc

ion

es

hid

rofó

bic

as

Fo

rmac

ión

d

e B

ioca

pa

BIOMATERIAL

Quorum

Sensing

Nuevas estrategias terapéuticas frente a las biocapas bacterianas

Eliminar la biocapa formada: Métodos físicos: corriente eléctrica de baja intensidad,

ultrasonidos Terapia fotodinámica (PDT)