TECNICATURA EN ANÁLISIS CLÍNICOS

BIOQUÍMICA

CLASE 3

TECNICATURA EN ANÁLISIS CLÍNICOSTECNICATURA EN ANÁLISIS CLÍNICOS

Las enzimas son proteínas, producidas por los seres vivos que tienen capacidad para catalizar con gran eficiencia procesos muy específicos.

Un catalizador es una sustancia que aumenta la velocidad de una reacción, sin verse alterada en el proceso global.

ENZIMAS

Ejemplos de reacciones enzimáticas: glucólisis.

Ejemplos de reacciones enzimáticas: ciclo de la urea (hepatocitos).

1- carbamoil-fosfato-sintetasa I2- ornitina transcarbamoilasa3- argininosuccinato sintetasa 4- arginino succinato liasa5- arginasa

* Las enzimas ejercercen su poder catalítico en condiciones suaves de temperatura, pH, presión, etc., compatibles con la vida. Además, las

enzimas son catalizadores susceptibles de regulación en su actividad, lo que permite armonizar el entramado metabólico de acuerdo con las

necesidades del organismo.

* Aplicaciones de las enzimas:- Análisis clínico- Aplicaciones médicas

- Aplicaciones industriales

* Química orgánica

* Química farmacéutica

* Alimentación

* Detergentes

* Textil

Ausencia de enzimas NO metabolismo celular NO vida

• Coenzimas: Ciertas enzimas requieren de ciertos compuestos para cumplir con su función catalítica; estas moléculas se denominan coenzimas y son generalmente vitaminas o metales.

• Los inhibidores enzimáticos son moléculas que se unen a las enzimas y disminuyen su actividad. Algunos anticoagulantes pueden actuar como inhibidores enzimáticos.

Inhibidor enzimático

Formas multiples de una enzima: Isoenzimas

Definición:

Isoenzimas o Isozimas son “cualquiera de las múltiples formas de una enzima, proveniente de diferencias determinadas genéticamente

en la estructura primaria”.

* El término Isoenzima es un término operacional, que hace referencias a un conjunto de enzimas que catalizan la misma reacción en

la misma célula o en el mismo organismo.

Láctico deshidrogenasa; posee 5 isoenzimas

Creatinafosfokinasa

Posee tres isoenzimas.

– CK-MM o CK 3 (localización muscular)– CK-MB o CK2 (localización cardíaca)– CK-BB o CK 1(localización cerebral)

Clasificación de las enzimas según el tipo de reacción que catalizan

• Oxidorreductasas

• Transferasas

• Hidrolasas

• Liasas

• Isomerasas

• Ligasas

Enzimología Clínica

• Se define a la enzimología clínica como a la aplicación del estudio de las enzimas. La cuantificación de las enzimas se realiza a través de la medida de la velocidad de reacción del sistema que catalizan.

Clasificación clínica de Bücher

1. Enzimas Plasmoespecíficas

2. Enzimas secretadas o exocitoenzimas

3. Enzimas celulares o endocitoenzimas

Clasificación clínica de Bücher

1.Enzimas Plasmoespecíficas:– Enzimas que participan en la coagulación (ej:

plasminógeno, protrombina) pseudocolinesterasa.

– Son sintetizadas fundamentalmente por el hepatocito.

– Interesa fundamentalmente sus valores inferiores. Una disminución de su actividad indica alteración de la síntesis; (alteración de la funcionalidad hepática).

2.Enzimas secretadas o exocitoenzimas.

• Son enzimas secretadas por glándulas o tejidos muy especializados.

• Ejemplo: enzimas digestivas pancreáticas que actúan en el duodeno – amilasa – Lipasa – tripsina

3.Enzimas celulares o endocitoenzimas

• Tienen lugar de acción dentro de la misma célula que las sintetiza, no tienen acción en el plasma.– Ubicuas (LDH, GPT, GOT, CK)– Organoespecíficas. (enzimas del ciclo de la

urea; 5´ nucleotidasa; isoenzimas específicas como CK MB, LDH1)

ENZIMAS PANCREÁTICAS

ENZIMAS PANCREÁTICAS

• Baja actividad en sangre

• Sus niveles aumentan en patologías agudas como pancreatitis aguda.

• En patologías crónicas su actividad está disminuída en su lugar de acción (duodeno).

Determinación de enzimas séricas hepáticas.

Determinación de enzimas séricas hepáticas.

Enzimas de interés clínico (Hepatopatías)

• Transaminasas (GOT/GPT).• Fosfatasa alcalina (FAL)• Gammaglutamiltranspeptidasa (GGT)• 5´ nucleotidasa (5´ND)

Hepatitis: Lesión o necrosis de los hepatocitos Etiología fundamentalmente viral; también puede ser de origen tóxica o autoinmune.

Colestasis: Impedimento total o parcial de la llegada de la bilis al duodeno por incapacidad para su formación o flujo causado por una gran cantidad de enfermedades.Etiología: Intrahepáticas (ej: hepatitis aguda, hepatitis crónica, cirrosis , tumores o quistes hepáticos); Extrahepáticas (ej: Litiasis biliar, tumores).

Perfil hepático- Marcadores de compromiso inflamatorio y/o compromiso necrótico:

•Transaminasas (GPT/GOT) •Glutamato deshidrogenasa (GDH)•sorbitol deshidrogenasa (SDH).

- Marcadores de compromiso colestásico: •Fosfatasa alcalina (FAL)•Gammaglutamiltranspeptidasa(GGT)•5´Nucleotidasa.

Transaminasas (GPT/GOT).

• Realizan reacciones de transaminación (transferencia del grupo amino de un aminoácido dador a un cetoácido aceptor).

• No son específicas del hígado (también se encuentran en músculo, corazón, páncreas y cerebro).

• En todas las enfermedades hepáticas que cursan con necrosis celular existe hipertransaminasemia (en hepatitis víricas y tóxicas aumentan hasta 10 veces el valor normal)

Gammaglutamiltranspeptidasa (GGT)

• Cataliza la transferencia de grupos gammaglutamil de un péptido a otro o de un péptido a un aminoácido.

• Se encuentra en riñón, páncreas, hígado, bazo y el pulmón.

• Aumenta en la mayoría de las enfermedades del hígado.

Fosfatasa alcalina (FAL)

• Se encuentra en hígado, riñón, placenta, intestino, huesos y leucocitos).

• Durante el crecimiento, los niveles séricos son altos debido al aumento de la fracción ósea, lo mismo ocurre durante el embarazo).

• Valores de referencia – Adultos: 15-69 UI/l– Niños: hasta 150 UI/l

Determinación de enzimas séricas en el infarto de miocardio

• Creatinafosfokinasa; Posee tres isoenzimas.– CK-MM o CK 3 (localización muscular)– CK-MB o CK2 (localización cardíaca) (6-8 hs)– CK-BB o CK 1(localización cerebral)

• Lactato deshidrogenasa – LDH1 (24-60 hs)

• GOT (16-48 hs)

Infarto de miocardio

Determinación de enzimas en el laboratorio.

• Métodos de una sola medida o de tiempo de incubación fija: Se determina la actividad de la enzima, después de actuar en el sistema durante un tiempo determinado, midiendo luego, colorimetricamente un producto de reacción, o la disminución de un sustrato.

• Métodos cinéticos o de medidas múltiples o de monitoreo continuo: Se determima la variación de absorción de algún componente del sistema (sustrato o producto de la reacción) a través de varias medidas sucesivas en intervalos cortos de tiempo, que aseguren la linealidad de la reacción (velocidad de reacción constante).

Cinética enzimática

Lactato deshidrogenasa (LDH)EC 1.1.1.27

Método cinético según la Federación Internacional de Química Clínica (IFCC)

• L-lactato + NAD+ Piruvato + NADH + H+→←LDH

Reactivos

NAD+

L(+) – Lactato

Buffer N-metil-D-glucamina

Condiciones

Temperatura 30±0,05 °C

pH 9,4 ± 0,05

Medición de la absorbancia (340 nm) cada 10 segundos durante 2-3 minutos.

UI ∆A

ξ b min ll=

Espectrofotometría• La espectrofotometría es el método de análisis óptico más

usado en las investigaciones biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

• Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe longitud de ondas que pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo.

• La absorción de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química.

• Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida.

Espectrofotómetro UV/visible de doble hazEvolution 600 UV-Vis