TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA

Tema 11

Licenciado en QuímicaCurso 1º

TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN

GENÉTICA

Tema 11

Indice

1. Introducción: la clonación molecular

2. Las enzimas de restricción. Aislamiento de ADN foráneo.

3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN

4. Hospedadores. Introducción del vector/ADN foráneo

5. Métodos de selección

6. Obtención de genotecas

7. Electroforesis en geles de agarosa

8. PCR

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- Amplificación de moléculas de ADN por clonación célular-Amplificación de moléculas de ADN por clonación acelular (PCR)

- Manipulación genética y clonación de organismos pluricelulares (animales y plantas)

La clonación consiste en la obtención de un clon, entendido como un conjunto de elementos genéticamente iguales entre si e iguales a su precursor.

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... ¡¡ Dios mío, me han clonado... !!

Tema 11

Estrategia general del proceso de clonación

Extraer elgen de interés

insulina

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Indice

2. Las enzimas de restricción. Aislamiento de ADN foráneo.

4. Hospedadores. Introducción del vector/ADN foráneo

8. PCR

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.• Stanley Cohen (Universidad de Stanford)

Plásmidos bacterianos

• Herbert Boyer (Unversidad de Columbia)

Enzimas restricción

Aislamiento y digestión del ADN

Inserción en moléculas vectores

con capacidad autónoma de replicación en la célula hospedadora

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Los ácidos nucleicos son hidrolizados por nucleasas

Exonucleasas: atacan por un extremo determinad de la cadena nucleotídica

• exonucleasa a o 3’• exonucleasa b o 5’

Endonucleasas: atacan de forma selectiva una secuencia nucleotídica

Enzimas de restricción

Fosfodiesterasade veneno de

serpiente

2. Las enzimas de restricción

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EcoRI actuando sobre una

secuencia de ADN

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1. Introducción: la clonación molecular1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector

2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector

3.Introducción del vector-ADN foráneo en la célula hospedadora

4. Selección de los transformantes

5. Estabilidad de la información genética

Cortar el ADN foráneo y el vector con las mismas enzimas

de restricción

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Tipo I y Tipo III

Actividad restricción y modificación Precisan Mg 2+, ATP y S-adenosil-metionina Reconocen una secuencia específica Recorren un cierto número de bases y cortan

Tipo II

Rompen por la secuencia de reconocimiento Precisan Mg 2+, pero no ATP

2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas

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Los ácidos nucleicos son hidrolizados por nucleasas Ejemplos de endonucleasa

G↓A A T T CC T T A A↑G

C C G G

G G C Cextremos romos

extremos cohesivos

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EcoR 1 de E.coli

G A A T T C

C T T A A G

Secuencias Palindrómicas

A A G C T T Hind III de

T T C G A A Haemophilus influenza

Acción de endonucleasas de restricción Tipo II: corte ADN

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EcoR 1 de E.coli

G A A T T C

C T T A A G

Secuencias Palindrómicas

Acción de endonucleasas de restricción Tipo II: corte ADN

Extremos cohesivos

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Métodos de aislamiento de ADN foráneo

(a) Cortes:

(b) Síntesis

• Endonucleasas de restricción (Tipos I, II, III)

• Fragmentación mecánica

• Síntesis de DNA a partir de RNAm: Transcriptasa reversa

• Síntesis química directa

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Síntesis de ADN a partir de ARNm Transcriptasa reversa

ADNtranscripción

PROTEÍNAtraducción

La mayoría de las células

Transcriptasa reversa

ARN polimerasa

Retrovirus

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Síntesis de ADN a partir de ARNm Transcriptasa reversa

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Indice

2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas

4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo

6. Genotecas

8. PCR

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Cortar el ADN foráneo y el vector con las mismas enzimas

de restricción

Vector declonación

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Vectores de clonación

Son vehículos de ADN para ADN, capaces de recibir ADN foráneo y replicarlo.

Características principales• Se replican de forma autónoma (origen de replicación)

• Contienen regiones no esenciales para su multiplicación y estabilidad

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Tipos de vectores:Plásmidos• Permiten insertar hasta 20 kb de ADN pero son más eficaces con insertos más pequeños (<10kb).

• Contienen genes de resistencia a antibióticos.

Virus• Permiten insertar 15-20 kb.• El sistema de infección del virus permite la entrada del ADN en E. coli.

• Los virus de cadena sencilla tienen aplicaciones especiales para secuenciar y realizar mutagénesis.

Vectores híbridos: cósmidos. Permiten insertar hasta 40 kb.

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Tipos de vectores de clonación

• Plásmidos (bacterianos)

• Virus

• Cósmidos (laboratorio)

• YACs (levaduras)

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• Plásmidos

pBR322

-Control relajado-Fenotipo seleccionable-Cierto Nº de sitios de restricción -Bajo PM (4 363 bp) (transformación con plásmidos 10000bp es poco eficiente

ADN Plasmídico

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• Virus

• YACs (levaduras)

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• Para bacterias: Fago y derivados, Fago M13• Para plantas: CaMV• Para mamíferos: SV40

Virus: se emplea como vector, junto con la capacidad que poseen para introducir el ADN foráneo en la célula hospedadora

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• Virus

-El corte por los sitios cos y el empaquetamiento en la cápsida puede hacerse in vitro. La cápsida admite entre 38 y 53 Kb (-20% y + 10% del DNA l).

-Se introduce en la bacteria hospedadora por transducción

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Adsorción de particulas virales a una bacteria

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• Virus

Mezcla plásmido y virus

• YACs (levaduras), contienes sitios característicos de la funcionalidad de los cromosomas

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Indice

6. Genotecas

8. PCR

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3. Vectores de clonación y unión del framento de ADN

Enzimas de restricción

Vector ADN

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Indice

6. Genotecas

8. PCR

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3.Introducción del vector-ADN foráneo en la célula

hospedadora

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4. Hospedadores. Introducción del ADN foráneo

• Transformación: ADN plasmídico en célula. CaCl2 (mejora el proceso). Para plásmidos < 20 Kb

• Infección: directa del virus empaquetado in vitro

• Transducción: ADN vírico sin cápsida (menor rendimiento)

• Microinyección: para células grandes (eucariotas) con micromanipulación.

• Pistola o Bombardeo de partículas: para transformar vegetales.

• Conjugación: celular del ADN de dos células

• Fusión de Protoplastos: intercambio ADN, dos células sin pared celular

Métodos de inserción del ADN-vector en célula huesped

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6. Genotecas

8. PCR

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MÉTODOS DE SELECCIÓN

Resistencia a antibióticos

Genes marcadores (gen -galactosidasa)

GFP (green fluorescent protein)

Hibridación de colonias

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Resistencia a antibióticosLa resistencia la confieren genes que porta el vector, en este caso a ampicilina y a tetraciclina

PlásmidopBR322

El ADN foráneo se inserta en el gen de resistencia a Ampicilina

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Sin plásmidoSin inserto

La resistencia la confieren genes que porta el vector

Con ampicilinay tetraciclina

Con plásmidoSin inserto

Con plásmidoCon inserto

Con tetraciclina

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• Genes marcadores (ej: gen -galactosidasa)

5-Br-4-Cl-3-indolil-b-galactósido Br-Cl-indol + galactosa

(X-gal) (Azul)

Inactivación insercional

(introducir el DNA foraneo en el medio del marcador)

Inserción génica positiva

(Unir el gen marcador al DNA foraneo)

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• Genes marcadores (gen -galactosidasa)

Plasmido pUC19

Gal + inserto

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5. Métodos de selección-galactosidasa -galactosidasa

+ ADN foráneopUC19 = plásmido

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510488TubulinaGFP-TUB

530515Retículo endoplásmicoYFP-ER

510488PeroxisomasGFP-PEROXI

530515NúcleoYFP-NUC

475420MitocondriaCFP-MITO

600550MitocondriaRFP-MITO

510488MembranaM-GFP

510488EndosomasGFP-ENDO

475420Ap. De GolgiCFP-GOLGI

510488ActinaGFP-ACTIN

Emisión (nm)

Excitación (nm)LocalizaciónVector

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6. Genotecas

8. PCR

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Genotecas

Genoteca: colección de clones que contiene todo el genoma de un organismo.

Tipos de genotecas:• Genómicas• Parciales• ADNc. Colección de ARNm

Tipos de vectores:• Plásmidos (Genotecas parciales)• Fagos (Genotecas genómicas pequeñas y de ADNc)• Cósmidos, BAC (genotecas genómicas complejas)

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Utilizando un virus

Utilizando un plásmido

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• Hibridación de colonias

Consiste en detectar secuencias de DNA en colonias transformadas mediante hidridación “in situ” con sondas marcadas

• Obtención de la sonda marcada:

• marcaje radioactivo: (32P)

• marcaje desoxinucleótidos fluorescentes

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6. Genotecas

8. PCR

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TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS

Se basan en la migración diferencial de las moléculas a separar en un campo eléctrico.

En la electroforesis en gel la fuerza que provoca la migración de las moléculas es el campo electrico, pero el gel actúa como filtro molecular, relentizando la migración su migración en función de su tamaño

Generalmente se lleva a cabo en un soporte inerte. (AGAROSA)

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ELECTROFORESIS. SOPORTES

CNHCH2NH

CCH2 CH

CH2 CH

Acrilamida N,N`-Metilenbisacrilamida

- Geles de acrilamida (proteínas, geles de secuenciación de ADN)

- Geles de agarosa (los más usuales para ADN)

Gelificación química

Gelificación térmica

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ELECTROFORESIS DE ADN

Disolver la agarosa a la concentración deseada en una solución salina TAE (Tris-acetato-EDTA) o TBS mediante calentamiento

Dejar enfriar hasta unos 50ºC y añadir Bromuro de Etidio

Bromuro de Etidio

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La agarosa es el polímero usado para la separación.

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La agarosa se mezcla con un tampón.

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La agarosa se disuelve en el microondas.

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Se preparan la cubeta y el peine.

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Se añade el polímero disuelto a la cubeta y se espera hasta su gelificación.

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El gel se coloca en una cubeta de electroforesis y se cubre con solución TAE

Se procede a cargar los pocillos con las muestras

Se procede a conectar a una fuente de electroforesis

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Formados los “pocillos”, se coloca en ellos cada muestra, incluidos los patrones.

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Cada muestra forma una banda azul que “correrá” en la agarosa dependiendo de su tamaño.

Tema 11

El gel se coloca en una cubeta de electroforesis y se cubre con solución TAE

Tema 11

El gel se retira y el bromuro de etidio ligado al ADN se visualiza con transiluminador de UV, apareciendo bandas fluorescentes.

Se coloca el gel en un transiluminador de luz UV

Se visualizan las bandas de ADN teñidas con el bromuro de etidio.

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La movilidad electroforética del ADN en los geles de agarosa es inversa a su tamaño

2.02.01.61.6

1Kb1Kb AA

3.03.0

1.01.0

0.50.5

BKTBKT--O de O de H. H. pluvialispluvialis2.02.01.61.6

1Kb1Kb AA

3.03.0

1.01.0

0.50.5

BKTBKT--O de O de H. H. pluvialispluvialis

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Indice

6. Genotecas

8. PCR

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8. PCR (Polymerase Chain Reaction)

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Kary Mullis. Premio Nobel de Química en 1993

Descrubrió la PCR en 1985, cuando trabajaba para Cetus Corp.

”Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an

afternoon”

Tema 11

PCR es básicamente una técnica de amplificación del DNA.

amplificación

(molécula sencilla)

Muchasmoleculasdel mismo

Tema 11

PCR es básicamente una técnica de amplificación del DNA.

(doble hélice)

Controlando la temperatura

• Síntesis por DNA polimerasa