Métodos generales de aislamiento, cuantificación y caracterizaciónde metabolitos secundarios de

interés farmacognóstico

Métodos generales de aislamiento de metabolitos secundarios

• Métodos cromatográficos:

• No instrumentales: C. columna y C. capa fina• Instrumentales: HPLC y C. gases

Cromatografía en columna

• Para fines preparativos (aislar sustancias en una cantidad apreciable, generalmente mas de 10 mg puras)

• Para simplificar mezclas complejas antes de pasar a métodos instrumentales.

https://cellularphysiology.wikispaces.com/Column+Chromatography

Cromatografía en capa fina CCF

• Para fines analíticos (separar sustancias en una cantidad muy baja, generalmente menos de 1 mg)

• Para ayudar en la identificación, cuando se cuenta con sustancias de referencia (marcadores).

http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Chromatography/Thin_Layer

Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC)

• Técnica instrumental que puede ser automatizada.• Para fines analíticos y preparativos.• Mayor capacidad de separación que CC y CCF• Más utilizada en laboratorios de control de calidad

de productos naturales• Sustancias de diferente polaridad y estabilidad

térmica.• Puede combinarse con otras técnicas de

identificación y caracterización como Espectrometría UV-vis, de masas y RMN.

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:HPLC.gif

HPLC-EM

http://www.atheris.ch/mass_sp.php

Cromatografía de Gases (CG)

• Técnica instrumental que puede ser automatizada, bases de datos.

• Para fines analíticos más que preparativos.• Mayor capacidad de separación que CC y CCF.• Sustancias térmicamente estables, p. ej.

Aceites esenciales, perfumes, aromas, etc.• Puede combinarse con técnicas de

identificación como Espectrometría de masas.

CG-EM

http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/analytical-standards/application-area-technique/standards-for-iso-188572.html

Métodos generales de cuantificación de metabolitos secundarios

• Gravimetría• Volumetría (valoraciones ácido-base, oxido-

reducción, formación de complejos coloreados, etc.

• Espectrometría UV-visible (curvas de calibración estándar, Ley de Beer)

• HPLC: áreas de los picos• CG: áreas de los picos

http://www.bmglabtech.com

http://en.wikipedia.org/wiki/Volumetric_flask

http://chemwiki.ucdavis.edu

http://www.phmethods.org

http://www.phmethods.org

Métodos generales de caracterización de metabolitos secundarios

• Espectroscopia UV-visible (UV-vis)• Espectroscopia Infrarrojo (IR)• Espectrometría de masas (EM)• Resonancia Magnética Nuclear (RMN)• Difracción de rayos-X

Espectroscopia UV-vis• Compuestos no conjugados: Incoloros• Compuestos poco conjugados: Amarillentos p.

ej.ergosterol • Compuestos muy conjugados: Amarillos (flavonoides

y carotenoides), Naranja (quinonas, flavonoides y carotenoides), Rojos (quinonas, carotenoides, antocianinas), violeta (antocianinas), azul (antocianinas).

• Todos los compuestos conjugados se pueden observar con una lámpara de luz UV 254 nm. Los más conjugados inclusive se observan a 360 nm.

Espectroscopia UV-vis

• E. Ultravioleta: 200-400 nm, solvente: metanol o etanol, celdas de cuarzo

• E. visible: 400-800 nm, celdas de vidrio

http://www.lpdlabservices.co.uk

Espectroscopia IR

• Celdas de NaCl, KBr, SeS, solución, etc.• Determinación de grupos funcionales, enlaces

C=C, =C-H, C-H, O-H, C-O, C=O, C-N, N-H, etc.• 4000 a 600 cm-1

http://www.chem.ucla.edu/

Espectrometría de masas

• Sustancias térmicamente estables: EM Impacto Electrónico (EM clásica), y EM Ionización Suave (FAB-MS, y otras)

• Sustancias térmicamente inestables: EM Ionización Suave (FAB-MS, y otras)

Glicósidos y agliconas

http://examine.com/supplements/Dioscorea+villosa/

Espectrometría de masas Glicósidos y agliconas aromáticas y no aromáticas• Glicósidos aromáticos y no-aromáticos: FAB-MS, ión

pseudomolecular y fragmentos debidos a pérdidas de una o varias unidades de monosacáridos.

• Agliconas aromáticas: EMIE (ión molecular intenso y fragmentación característica de comp. aromáticos).

• Agliconas no-aromáticas: EMIE (ión molecular poco intenso o no se observa, y fragmentación característica de comp. no-aromáticos).

Espectrometría RMN

• RMN una dimensión (RMN-1H, RMN-13C, etc.)• RMN dos dimensiones (Homonuclear y/o

heteronuclear: Cosy H-H, HMBC, HMQC, etc.)

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Protones aromáticos

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RMN-1H• Rango: 0-14 ppm • Protones alifáticos: Campo alto: 3-1 ppm • Protones olefínicos: 4-6 ppm. Acoplamientos: cis J 10, trans J 14 Hz.

Acoplamiento alílico. • Protones aromáticos: 6-8 ppm. Acoplamientos: orto J 8, meta J 2 Hz, para

es muy pequeño. Acoplamiento “W” • Protones de OH: no se observan en solventes próticos, OH peri 12-14 ppm

bs. • Protones de metoxilos: 4 ppm s, si señal integra para 3 protones es un

grupo metoxilo, si integra para 6 protones se trata de 2 grupos metoxilo y así sucesivamente.

• Protones vecinos a carbonos quirales: señal no es tan simple, no se aplica la regla de n+1 (n= número de protones a 3 enlaces)

• En sistemas alicíclicos los protones presentan otros acoplamientos debido a angulos diedros entre los protones vecinos (acopl. Axial-axial, acopl axial-ecuatorial, etc.)

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• Nota: En equipos de baja resolución los dd J 8 y 2 pueden observarse como d J 8 Hz, ó como bs (debido a la superposición o solapamiento parcial de las señales).

• En equipos de muy alta resolución pueden observarse inclusive acoplamientos para.

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RMN CARBONO-13• Rango: 0-220 ppm • Carbonos alifáticos: Campo alto: 50-5 ppm • Carbonos olefínicos y aromáticos: > 90 ppm. • Carbonos carbonílicos: > 160 ppm • Nomenclatura: p, s, t, c (primario CH3, secundario CH2,

terciario CH, cuaternario C) • Nomenclatura: s, d, t, c (singlete C, doblete CH, triplete CH2,

cuartete CH3) • Exp. RMN C-13 PARCIALMENTE DESACOPLADO: señales s, d, t,

c • Exp. RMN C-13 DESACOPLADO: todas las señales son singlete.

Las señales de C con menos hidrógenos ligados son las más débiles. No aplica la integración como en RMN-1H.

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RMN Bidimensional

• COSY H-H: Vecindad de protones a 3 enlaces• HMQC: Correlaciones entre carbonos y

protones directamente ligados a un enlace C-H

• HMBC: Correlaciones entre carbonos y protones a uno (C-H), dos (C-C-H) y tres enlaces (C-C-C-H).