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Epidemiología Molecular: Genotipificación de Brucella spp., aislada en diferentes reservorios en el Ecuador; resultados preliminares
Elizabeth Minda A. (elizabeth.minda@gmail.com)
Jorge Ron RománPaulina Fernández
Centro Internacional de ZoonosisUNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
Marzo 27, 2013
Brucelosis - Generalidades
La Brucelosis es una enfermedad infecto-contagiosa causada por bacterias del género Brucella spp.
La relación causal entre el organismo y la enfermedad fue establecida por Dr. David Bruce (microbiólogo) en 1887. (Aréstegui et al., 2001)
ESPECIE HEMBRA MACHO
Bovino Aborto en el último tercio de la gestación.
Orquitis uni o bilateral,epididimitis.
Porcino Aborto, esterilidad y aumento de la mortalidad. Parálisis y cojeras.
Ovino Los abortos son raros. Epididimitis uni o bilateral con atrofia testicular.
Canino Los abortos pueden repetirse, metritis.
Orquitis, epididimitis, prostatitis.
Ciclo de TransmisiónANIMALES ENFERMOS CONTACTO
(placenta, abortos, heces, secreciones vaginales)
INGESTIÓN(leche cruda y derivados lácteos)
INOCULACIÓN/INHALACIÓN(vacunas vivas, muestras contaminadas)
Epidemiología - Brucelosis
González (2009) determinó una seroprevalencia de 1.5% en productores pecuarios.
- RB / SAT-EDTA / iELISA
Faz (2011) estableció una seroprevalencia global de 1.2% en trabajadores de catorce camales.
- RB / SAT-EDTA
Fuente: http://www.oie.int
Olmedo (2010) encontró una prevalencia de 11.96% (33/276)- Aislamiento y biotipificación- Brucella abortus
Fuente: Minda-Aluisa, 2010
Mecanismos de transmisión depende de las distintas áreas geográficas, especies de Brucella spp., condiciones climáticas, distribución de la población de riesgo, tipos de producción pecuaria, entre otras.
Cocobacilo Gram negativo
Patógenos intracelulares facultativos
no móviles y no formadores de esporas
Fuente: http://www.cdc.gov/Fuente: http://www.uniprot.org
Clasificación Sistemática
Dominio: Bacteria
Filo: Proteobacteria
Clase: Proteobacteria alfa
Orden: Rhizobiales
Familia: Brucellaceae
Género: Brucella
Fuente: Investigación CIZ
Brucelosis- Agente etiológico
Especies y Biotipos (variedades genéticas)
Especies Biotipos Hospedador natural Referencia
B. mellitensis 1 - 3 Cabra, oveja, bovinos, cánidos, hombre Marston, 1859
B. abortus 1 - 6, 9 Bovinos, cánidos, hombre Bruce, 1866
B. suis 1 - 5 Cerdo, cánidos, hombre Huddleson, 1929
B. ovis Ninguno Ovinos Buddle, 1956
B. canis Ninguno Cánidos, hombre Carmichael & Bruner, 1968
B. neotomae Ninguno Rata del desierto Stoenner & Lackman, 1957
B. pinnipedialis Ninguno Focas, lobos marinos Dawson et al., 2008
B. ceti Ninguno Delfines, ballenas Dawson et al., 2008
B. microti Ninguno Zorros Scholz et al., 2008
B. inopinata Ninguno Humanos Scholz et al., 2010
Brucella spp. – Diagnóstico (identificación)
Indirecto Directo
Rosa de Bengala
SAT-EDTA
ELISA
Skin Test
Anillo Coloreado en leche (MRT)
Fuente: Investigación Directa CIZ, 2012
Microbiología
Procedimientos laboriosos y de alto riesgo
Fuente: Paulsen et al., 2002
Genética - Cromosomas
Figura 1. Circular representation of the two chromosomes of B. suis strain 1330.
Filogenética de Brucella spp.
95% de similitud en el ADN genómico
100% de similitud en fragmentos del gen 16S rRNA
Género Monoespecífico
(Fuente: http://www.wipo.int)
Fuente: Characho et al., 1997
Brucella melitensis biovar abortus 1- Por la relación antigénica- Estudios hibridación ADN-ADN- Secuenciación del genoma y de genes 16S rRNA
Fuente: Orduña, 2001
Epidemiología Molecular: Genotipificación El uso de la biología molecular en el diagnóstico de enfermedades infecciosas es IMPORTANTE para poder establecer patrones epidemiológicos mas precisos.
El hombre es susceptible a la infección B. melitensis, B. suis (excepto por el biovar 2), B. abortus y B. canis
Las diferentes investigaciones y análisis moleculares con los cuales se han estudiado a Brucella spp., sirven para conocer la genética de la especie y biotipos.
Biotipificación: Identificación de biotipos (conjunto de fenotipos que corresponden a un mismo genotipo) de la misma especie (Jones et al., 1982).
Metodología - Generalidades
Suspensiones bacterianas inactivadas
Extracción de ADN(Método fenol/cloroformo)
IS711 PCR
AMOS PCR Convencional
AMOS PCR Modificada
OtrasBrucella spp.
Brucella spp.B. abortus bv 1, 2 o 4 B. melitensis bv 1, 2 o 3 B. suis bv 1
B. ovis
RB51/S19
78
85 3
BovinoCaprinoCaninoHumano
Muestras Biológicas
Especie Muestra Aislados
BovinosLecheÓrganosHemocultivo
37401
Caninos Órganos 5
Caprinos Leche 8
Humanos Hemocultivo 3
TOTAL 94
Método (diagnosis molecular) - PCR IS711
IS Secuencia de Inserción
IS711 o IS6501
El número de copias de IS711 varía en el genoma de las especies de Brucella, van desde las 7 de B. abortus, B. melitensis y B. suis a más de 30 en B. ovis y en las cepas de Brucella aisladas de los mamíferos marinos (Ocampo-Sosa & García Lobo, 2008).
260-bp
MP
MP
Fuente: Investigación Directa CIZ, 2012
Método molecular (diagnosis diferencial): AMOS PCR convencional
Fuente: Bricker et al., 1994
498-bp
731-bp 976-bp
285-bp
Fuente: Bricker et al., 1995
178-bp
364-bp
178-bp
Brucella abortus bv. 1- Cepa Vacunal - Cepa de Campo
498-bp
Método molecular (diagnosis diferencial): AMOS PCR modificada
Resultados
Fuente: Investigación Directa CIZ, 2011
Cepas Vacunales. 9
Cepas de Campo. 31
Otras. 14
Brucella spp., 40
Método Resultado esperado
IS711 PCR Brucella spp.
AMOS PCR Convencional
B. abortus bv 1, 2 o 4B. melitensis bv 1, 2 o 3B. ovisB. suis bv 1
AMOS PCR Modificada
Cepa VacunalCepa de Campo
42.6%Fuente: Bricker et al., 1994; Bricker et al., 1995
MP
MP
498 bp
MP
MP
Especie Muestra IS711 Amos Conv. Amos Mod.
Bovino
Leche35 (+)
B. abortus bv. 1, 2 o 4B. abortus bv 1Brucella spp.
19 (cepa campo)2 (cepa vacunal)14 (n.i.)
2 (-) --- ---
Órganos31 (+)
B. abortus bv. 1, 2 o 4B. abortus bv 1Brucella spp.
3622
9 (-) --- ---
Hemocultivo 1 (+) B. abortus bv. 1, 2 o 4 1
Canino Órganos 5 (+) B. abortus bv. 1, 2 o 4 5
Caprino Leche5 (+)
B. abortus bv. 1, 2 o 4B. abortus bv 1Brucella spp.
014
3 (-) --- ---
Humano Hemocultivo 3 (+) B. abortus bv. 1, 2 o 4 3
TOTAL 94
Conclusiones• El hallazgo de aislados de Brucella spp., en diferentes especies de
hospedadores animales en el Ecuador, demuestra la importancia que esta zoonosis tiene en el Ecuador.
• La utilización conjunta de técnicas microbiológicas y moleculares, aporta información valiosa en el análisis de la Epidemiología Molecular.• Relación Fenotipo-Genotipo
• Al no identificar un gran número de cepas de Brucella spp., es necesario buscar metodologías alternativas que permitan caracterizarlas: VTNR’s (HOOF- Print)
• Debido a un alto porcentaje de cepas vacunales encontradas en el estudio, se concluye que una mala vacunación es una causa probable de brucelosis en el Ecuador.
Agradecimientos• Centro Internacional de Zoonosis
▫ Washington Benítez▫ Jorge Ron▫ Gustavo Echeverría▫ Paulina Fernández▫ Richar Rodríguez▫ Lisbeth Olmedo▫ Daniela Barzallo
• University of Liege, Belgium. UREAR-ULg▫ Claude Saegerman
• Department of Animal Health, Institute of Tropical Medicine. Anveres-Belgica▫ Jeff Brandt▫ Dirk Berkvens
• Department of Bacteriology and Immunology, Veterinary and Agrochemical Research. Centre, Brussels-Belgium.▫ David Fretin