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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
MAESTRIA EN CIENCIAS BIOLOGICAS
EXTRACCION Y CARACTERIZACIÓN DE Kappa CARRAGENINA A PARTIR DE Hypnea musciformis
GLADYS ROZO TORRES
TRABAJO DE TESIS Presentado como requisito parcial
Para optar el título de Maestría en Ciencias Biológicas
MAESTRIA EN CIENCIAS BIOLOGICAS
Bogotá D.C. Noviembre de 2006.-
14
NOTA DE ADVERTENCIA “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.” Artículo 23 de la Resolución No 13 de julio de 1946.
15
EXTRACCION Y CARACTERIZACIÓN DE KAPPA CARRAGENINA OBTENIDAA PARTIR DE Hypnea musciformis
GLADYS ROZO TORRES
APROBADO _____________________ ______________________ Balkys Quevedo Hidalgo. Alvaro Orjuela Ingeniera Química Ingeniero Químico. Directora Universidad . Nacional de Colombia Jurado 1
_____________________ ___________________ Alba Alicia Trespalacios . Enrique Javier Peña S. PhD Profesora Director Programa de Postgrado Departamento de Microbiología Ciencias-Biología Pontificia Universidad Javeriana Universidad del Valle Jurado 2 Jurado 3
16
A mi hija Laura Bibiana:
Porque el tiempo invertido
en esta investigación, era tuyo,
siempre lo entendiste.
Gracias.
17
Agradecimientos A la profesora Balkys Quevedo por su apoyo y acertada dirección
durante todo el tiempo que duró la investigación.
Al Doctor Carlos Cardona director del Departamento de Ciencias
Básicas de la Universidad Jorge Tadeo Lozano por su apoyo
incondicional.
A Fabián Pescador, estudiante de tesis de la carrera de Biología
Marina, de la Universidad Jorge Tadeo Lozano, quien arduamente
colaboró en la recolección e identificación de las muestras de algas
utilizadas en la investigación.
A Mauricio Rozo por la digitalización de mapas y la ubicación en el
Sistema de Información Geográfico SIG.
A Claudia Rozo por su constante ayuda, por sus valiosas críticas y
aportes a la investigación, por el soporte económico del proyecto y el
empeño que siempre mostró para la culminación del trabajo.
A Ligia Rodríguez por su colaboración en el proyecto y aporte de
algunos reactivos, sin los cuales no se habría culminado el trabajo.
A la empresa Química Aromática Andina, quien nos facilitó el
equipo para los análisis de textura.
A la paciencia de Edgar y Bibiana, que estuvieron muchas horas sin
mí, para que pudiera culminar con éxito esta investigación
18
INDICE GENERAL
1. Introducción 13
2. Antecedentes bibliográficos 14
2.1 Definición de carrageninas 14
2.2 Mecanismo de gelificación de la carragenina 15 2.3 Propiedades de la carragenina 17 2.3.1 Solubilidad de la carragenina 17
2.3.2 Viscosidad de la carragenina 18
2.3.3 Temperaturas de Fusión y gelificación 19
2.3.4 Fuerza de gel 19
2.3.5 Perfil de textura 21
2.3.6 pH 22
2.3.7 Reactividad frente a las proteínas 23
2.3.8 Espectro Infrarrojo 23
2.4 Aplicaciones comerciales de kappa carragenina 24
2.5 Fuentes de carrageninas 28
2.6 Fuentes de kappa carragenina 30
2.7 Mercado de la kappa carragenina en el mundo 32
2.8 Hypnea musciformis 33
2.8.1 Clasificación taxonómica de Hypnea musciformis 33
2.8.2 Factores que influyen en el contenido de kappa
Carragenina en Hypnea musciformis 34
2.8.3 Ciclo de vida de Hypnea musciformis 36
2.8.4 Pigmentos celulares de Hypnea musciformis 37
2.8.5 Polisacáridos de reserva en las algas rojas 40
2.9 Extracción de kappa carragenina 42
3 Materiales y métodos 50
3.1 Reactivos y equipos 50
3.2 Muestreo 50
3.2.1 Muestreo en la Bahía de Santa Marta 51
3.2.2 Muestreo en el Cabo de la Vela- Guajira 54
3.3 Ensayos Experimentales 55
3.3.1 Análisis de aguas 55
3.3.2 Muestras de algas 56
3.3.3 Extracción y purificación de carragenina 56
3.3.3.1 Decoloración 56
19
3.3.3.1.1 Método de peróxido de hidrógeno 57
3.3.3.1.2 Método de carbón activado 59
3.3.3.1.3 Decoloración con largos períodos de hidratación 61
3.3.3.1.4 Método del hipoclorito de sodio 63
3.3.3.2 Extracción de carragenina 65
3.3.3.3 Precipitación 65
3.3.3.4 secado 66
3.3.4 Determinación de las propiedades fisicoquímica 66
3.3.4.1 Análisis de elementos pesados por Absorción atómica 67
3.3.4.2 Punto de gelificación 67
3.3.4.3 Punto de Fusión 68
3.3.4.4 Espectro Infrarrojo 68
3.3.4.5 Análisis de textura del gel de carragenina 69
3.3.4.6 Determinación de Humedad 69
3.3.4.7 Determinación de proteína 70
3.3.4.8 Determinación de la presencia de almidón floridean 71
3.4 Diagrama general de procedimientos 72
3.5 Programa estadístico de soporte 72
3.6 Diseño Experimental 72
4 Resultados y análisis de resultados 75
4.1 Análisis de aguas 75
4.2 Decoloración de la muestra de algas 75
4.2.1 Decoloración con peróxido 76
4.2.2 Decoloración con carbón activado 77
4.2.3 Decoloración con largos períodos de hidratación 77
4.2.4 Decoloración por tratamiento con hipoclorito de sodio 77
4.3 Extracción de kappa carragenina 80
4.4 Precipitación 82
4.5 Secado 83
4.6 Rendimiento de kappa carragenina 85
4.7 Caracterización fisicoquímica de la carragenina 88
4.7.1 Espectro Infrarrojo 88
4.7.2 Punto de gelificación 91
4.7.3 Punto de fusión 93
4.7.4 Análisis de textura 97
4.7.5 pH 109
4.7.6 Humedad 111
4.7.7 Cenizas 112
20
4.7.8 Análisis de absorción atómica 113
4.7.8.1 Absorción atómica para la muestra de algas 113
4.7.8.2 Absorción atómica para las muestras de carragenina 113
4.7.8.2.1 Análisis del contenido de sodio en kappa carragenina 114
4.7.8.2.2 Análisis del contenido de potasio en kappa
carragenina 115
4.7.8.2.3 Análisis del contenido de Calcio en
kappa carragenina 117
4.7.8.2.4 Análisis del contenido de Magnesio en
kappa carragenina 118
4.7.8.2.5 Análisis del contenido de Hierro en
kappa carragenina 120
4.7.8.2.6 Análisis del contenido de Manganeso en
kappa carragenina 121
4.7.8.2.7 Análisis del contenido de Cobre en
kappa carragenina 123
4.7.8.2.8 Análisis del contenido de Cinc en
kappa carragenina 125
4.7.9 Almidón Floridean 127
4.7.10 Proteína 127
5 Conclusiones y recomendaciones 129
6 Bibliografía 134
7 Anexos
7.1 Anexo de tablas de Resultados
7.2 Anexos estadísticos
21
INDICE DE TABLAS
Tabla No 1 Cationes inorgánicos determinados en
Kappaphycus alvarezii: 14
Tabla No 2 Absorción en el Infrarrojo de las diferentes carrageninas 23
Tabla No 3 Usos de carragenina en alimentos 25
Tabla No 4 Algunos ejemplos de Carragenophytas 29
Tabla No 5 Fuentes de carragenina por países 31
Tabla No 6 Métodos AOAC utilizados en el análisis de aguas 55
Tabla No7 Diseño experimental de un factorial de dos factores 73
Tabla No 8 Análisis de aguas 75
Tabla No 9 kappa carragenina obtenida en función de
la especie y el pH 85
Tabla No 10 Puntos de gelificación para muestras de carragenina Anexo 7
Tabla No 11 Puntos de Fusión de la carragenina Anexo 7
Tabla No 12 Fuerza de gel de la carragenina
en solución 1,5% de KCl Anexo 7
Tabla No 13 Fuerza de gel de la carragenina
en solución 0,5% de KCl Anexo 7
Tabla No 14 Pendientes de los ensayos de perfil de textura del
gel kappa carragenina preparado en solución al 1,5% de KCl 108
Tabla No 15 Estudio de correlación Fuerza de gel elasticidad Anexo 7
Tabla No 16 pH de la carragenina Anexo 7
Tabla No 17 Humedad en muestras de carragenina Anexo 7
Tabla No 18 Porcentaje de cenizas determinado en dos especies de algas 112
Tabla No 19 Análisis de absorción atómica para dos especies de algas 113
Tabla No 20 Contenido de sodio en kappa carragenina Anexo 7
Tabla No 21 Contenido de Potasio en kappa carragenina Anexo 7
Tabla No 22 Contenido de Calcio en kappa carragenina Anexo 7
Tabla No 23 Contenido de Magnesio en kappa carragenina Anexo 7
Tabla No 24 Contenido de Hierro en kappa carragenina Anexo 7
Tabla No 25 Contenido de Manganeso en kappa carragenina Anexo 7
Tabla No 26 Contenido de Cobre en kappa carragenina Anexo 7
Tabla No 27 Contenido de Cinc en kappa carragenina Anexo 7
Tabla No 28 Contenido de proteína en el alga y en kappa carragenina 128
Tabla No 29 Resumen de las propiedades fisicoquímica de kappa carragenina 129
22
INDICE DE FIGURAS
Figura No 1 Tipos de carrageninas 15
Figura No 2 Mecanismo de gelificación de kappa carragenina 16
Figura No 3 Variación de la fuerza de gel en función de la concentración
de kappa carragenina 20
Figura No 4 Curva obtenida en un perfil de textura de un gel de carragenina 21
Figura No 5 Principales Especies de algas utilizadas en la
producción de carragenina 28
Figura No 6 Estructura de kappa carragenina 30
Figura No 7 Hypnea musciformis 33
Figura No 8 Clorofilas presentes en la pared celular de Hypnea musciformis 38
Figura No 9 Carotenos presentes en la pared celular de Hypnea musciformis 39
Figura No 10 Ficobilinas presentes en la pared celular de Hypnea musciformis 40
Figura No 11 Estructura del almidón Floridean 41
Figura No 12 Métodos para la extracción de carragenina 43
Figura No 13 Método para la obtención de carragenina refinada 45
Figura No 14 Área de muestreo en la playa adyacente al aeropuerto Simón Bolívar 52
Figura No 15 Lugar de muestreo, playa aeropuerto Simón Bolívar 53
Figura No 16 Ubicación de la playa de Muestreo bahía de Santa Marta 53
Figura No 17 Ubicación de la playa de muestreo en el Cabo de la Vela Guajira 55
Figura No 18 Diagrama de flujo que muestra la extracción de carragenina
usando peróxido de hidrógeno para retirar el color 58
Figura No 19 Diagrama de flujo que muestra la extracción de carragenina
usando carbón activado de hidrógeno para retirar
el color después de la extracción 60
Figura No 20 Diagrama de flujo que muestra la extracción de carragenina
usando largos períodos de hidratación para retirar el
color antes de la extracción 62
Figura No 21 Diagrama de flujo que muestra la extracción de
carragenina usando Hipoclorito de sodio para
retirar el color antes y después de la extracción 64
Figura No 22 Diagrama general del procedimiento para la extracción de kappa
Carragenina 74
Figura No 23 Muestras de kappa carragenina obtenidas con diferentes
tratamientos de decoloración 79
Figura No 24 Precipitación de kappa carragenina con etanol al 95% 82
23
Figura No 25 Kappa carragenina purificada y filtrada 83
Figura No 26 Aspecto que adquiere un gel de kappa carragenina de acuerdo
con el método de secado 26
Figura No 27 Resultados obtenidos en la extracción de carragenina por especie 87
Figura No 28 Resultados obtenidos en la extracción de
carragenina por pH 87
Figura No 29 Dímero de la estructura básica de la kappa carragenina 89
Figura No 30 Espectro Infrarrojo de kappa carragenina extraída de
Hypnea musciformis a pH 8,6 90
Figura No 31 Estudio del punto de gelificación en función de la especie 91
Figura No 32 Estudio del punto de gelificación en función del pH 92
Figura No 33 Estudio del punto de fusión de kappa carragenina en función del pH 94
Figura No 34 Estudio del punto de fusión de kappa carragenina en función de la
especie 95
Figura No 35 Estudio de la fuerza de gel de kappa carragenina en función de la
Especie 98
Figura No 36 Estudio la fuerza de gel de kappa carragenina en
KCl al 1,5% en función del pH de tratamiento 100
Figura No 37 Perfil de textura para la muestra de carragenina
obtenida a partir de Hypnea musciformis 101
Figura No 38 Perfil de textura para la muestra de carragenina
obtenida a partir de Hypnea musciformis Santa Marta pH 10 102
Figura No 39 Perfil de textura para la muestra de carragenina
obtenida a partir de Hypnea musciformis Santa Marta pH 9,0 103
Figura No 40 Perfil de textura para la muestra de carragenina
obtenida a partir de Hypnea musciformis Santa Marta pH 8,6 104
Figura No 41 Estudio de la fuerza de gel de kappa carragenina preparado
en soluciones de KCl al 0,5% 105
Figura No 42 Estudio de la fuerza de gel de kappa carragenina preparado
en soluciones de KCl al 0,5% en función del pH de extracción 106
Figura No 43 Perfil de textura para la muestra de kappa carragenina
Obtenida a partir de Hypnea musciformis Santa Marta pH 9,0 107
Figura No 44 Determinación del pH final de kappa carragenina obtenida
de cada especie de alga 110
Figura No 45 Variación del pH final de kappa carragenina obtenida
de cada especie de alga en función del pH de extracción 110
Figura No 46 Determinación de la humedad de kappa carragenina
en función de la especie 111
24
Figura No 47 Análisis de absorción atómica para sodio en las muestras de kappa carragenina obtenida a partir de dos especies de algas 114
Figura No 48 Análisis de absorción atómica para sodio en las muestras de kappa
carragenina obtenida a tratamientos de pH diferentes 115
Figura No 49 Análisis de absorción atómica para potasio en las muestras de kappa
carragenina obtenida a tratamientos de pH diferentes 116
Figura No 50 Análisis de absorción atómica para calcio en las muestras de kappa
carragenina obtenida a partir de algas diferentes 117
Figura No 51 Análisis de absorción atómica para Calcio en las muestras de kappa
carragenina obtenida a tratamientos de pH diferentes 118
Figura No 52 Análisis de absorción atómica para Magnesio en las muestras de kappa
carragenina obtenida a tratamientos de pH diferentes 119
Figura No 53 Análisis de absorción atómica para Magnesio en las muestras de kappa
carragenina obtenida a partir de algas diferentes 119
Figura No 54 Análisis de absorción atómica para Hierro en las muestras de kappa
carragenina obtenida a partir de algas diferentes 120
Figura No 55 Análisis de absorción atómica para Hierro en las muestras de kappa
carragenina obtenida a tratamientos de pH diferentes 121
Figura No 56 Análisis de absorción atómica para Manganeso
en las muestras de kappa carragenina obtenida a partir
de algas diferentes 122
Figura No 57 Análisis de absorción atómica para Manganeso
en las muestras de kappa carragenina obtenida a
tratamientos de pH diferentes 123
Figura No 58 Análisis de absorción atómica para Cobre
en las muestras de kappa carragenina obtenida a
partir de algas diferentes 124
Figura No 59 Análisis de absorción atómica para Hierro en las muestras de kappa
carragenina obtenida a tratamientos de pH diferentes 125
Figura No 60 Análisis de absorción atómica para Cinc
en las muestras de kappa carragenina obtenida a
partir de algas diferentes 126
Figura No 61 Análisis de absorción atómica para Cinc en las muestras de kappa carragenina obtenida a tratamientos de pH diferentes 127
25
1. Introducción Esta investigación está enmarcada en el área de la bioprospección,
e involucra el desarrollo de nuevos productos a partir de los recursos
marinos colombianos, y su potencial explotación comercial o industrial.
Las algas en su metabolismo generan compuestos de estructuras
complejas y novedosas, que pueden ser aprovechados por el hombre, por
ejemplo en la producción de aditivos industriales entre los cuales se
destacan las kappa carrageninas que son agentes gelificantes de amplia
utilización en la industria.
En contraste con los abundantes estudios realizados sobre
taxonomía y distribución geográfica de algas en los mares colombianos,
son muy escasos los estudios realizados sobre usos y aprovechamiento
comercial.
La kappa carragenina forma geles termoreversibles de altas
cualidades espesantes y gelificantes que le confieren un lugar
económicamente importante en el país, por ejemplo muchas
preparaciones en la industria de alimentos dependen únicamente de las
propiedades funcionales de este hidrocoloide, para lograr una buena
calidad y aceptables propiedades organolépticas. De otro lado la alta
capacidad de absorción y la buena fuerza de gel sitúan a la kappa
carragenina como un potencial gel hidroretenedor de agua y nutrientes, con
menos sensibilidad a las soluciones salinas que los geles comerciales y con
grandes ventajas medioambientales en la industria Agrícola ya que su
estructura de polisacárido y su origen vegetal lo hacen un buen sustrato en
procesos de germinación o en cultivos que requieran grandes cantidades de
agua, además este soporte es biodegradable.
26
Kappa carragenina se puede extraer de Hypnea musciformis, un
alga nativa del Caribe colombiano, que ha mostrado altos contenidos del
polisacárido (Berchez et al, 1993) y es la primera vez que se usa en
Colombia para la extracción de un valioso polisacárido
El objetivo del trabajo fue diseñar un método para la extracción de
kappa carragenina partir de Hypnea musciformis y caracterizar el producto
mediante la determinación de las propiedades fisicoquímicas del
polisacárido.
Se estudió la influencia de las condiciones de crecimiento sobre el
contenido y la calidad de carragenina en Hypnea musciformis, para lo cual
se usaron dos muestras provenientes de lugares distantes Santa Marta y el
Cabo de la Vela.
Se compararon los resultados obtenidos con muestras de
Kappaphycus alvarezii, un alga exótica que se caracteriza porque presenta
buenos rendimientos de kappa carragenina
27
1. Antecedentes Bibliográficos 2.1 Definición de las Carrageninas
El término carragenina hace parte de una familia de polisacáridos
lineales formados por unidades de D- galactosa- sulfatada en diferentes
grados y con uniones alterantes α 1→3 D-galactopiranosa-4sulfato y β 1→4
D-galactopiranosa 3-6 anhidro; las unidades de disacárido se encuentran
modificadas formando anhídridos y los hidroxilos de la galactosa pueden
estar sustituidos por otros grupos. (Ver figura No.1). Esta variación
estructural da origen a tres principales tipos de carragenina Kappa (к), iota
(ι) y lambda (λ), se conocen algunas otras fracciones precursoras de las
anteriores, pero de menor importancia comercial, como las Mu (М), Nu(N),
theta (θ), y xi (ζ) (Glicksman, 1982). Químicamente estos polímeros son
galactanos altamente sulfatados y la reactividad es debida a los grupos
éster sulfato, que están asociados a cationes; en la tabla No.1 se muestran
algunos datos obtenidos en un análisis de absorción atómica.
Tabla No 1: Cationes inorgánicos determinados en Kappaphycus alvarezii: Los ensayos fueron hechos con absorción atómica.
Determinaciones en peso seco de Kappaphycus alvarezii K % N% Na% Ca% Mg% P% Zn ppm Cu ppm Fe ppm
9.33 1.19 3.97 0,234 0.619 0.030 16.5 2.5 52
Los pesos moleculares de la carragenina se encuentran generalmente en el
rango de 100.000 a 500.000 Daltons.
El contenido máximo teórico de 3,6 anhidrogalactosa encontrado para la κ
carragenina es del 35% (Glicksman, 1982)
28
Figura No 1 Tipos de carrageninas
Tomado de: Glicksman (1982)
La característica comercial más importante de la carragenina es su
capacidad para formar una gran variedad de geles, así, la kappa
carragenina forma geles fuertes y rígidos en presencia de sales de potasio,
pero produce geles débiles cuando se usan sales de calcio en el proceso de
gelificación, mientras que la iota carragenina forma geles elásticos con sales
de calcio y la lambda carragenina forma soluciones muy viscosas pero no
gelifica.
2.2 Mecanismo de gelificación de la carragenina Los geles de iota y κappa carrageninas son térmicamente
reversibles por calentamiento y enfriamiento de soluciones acuosas, las
bases teóricas de la gelificación de kappa carragenina fueron propuestas
por Rees en 1967 y como lo muestra la Figura No. 2, la carragenina existe en
solución en cadenas desordenadas, al enfriarse se acercan las cadenas y se
organizan tridimensionalmente en estructura de gel, si se adiciona un catión
29
la estructura de doble hélice se polimeriza y se estabiliza formado tiras
helicoidales. (Oakenfull et al, 2000)
Figura No 2: Mecanismo de gelificación de la kappa carragenina
El mecanismo de gelificación está fuertemente influenciado por los
electrolitos que se usan, como consecuencia del hecho que la carragenina es
un polisacárido aniónico. La estabilidad de la doble hélice es sensible al radio
de catión y la agregación de las hélices tiene requerimientos altamente
específicos, por ejemplo la gelificación se puede llevar a cabo con todos los
cationes monovalentes a altas concentraciones, pero el K+ es
particularmente efectivo porque forma uniones específicas entre las hélices.
(Michel y colaboradores, 1997).
La gelificación es sensible, al tipo de anión que acompaña el potasio.
Oakenfull y colaboradores (2000), encontraron pequeñas diferencias en la
30
transición de hélice a enrollamiento de hélices usando, acetato, bromuro,
cloruro, citrato y nitrato de potasio.
La temperatura de gelificación varía sistemáticamente con la naturaleza
del anión e influye en el ordenamiento conformacional, un estudio
calorimétrico mostró que el anión acetato induce mayores puntos de
fusión del gel de carragenina (Oakenfull y colaboradores 2000)
2.3 Propiedades de la carragenina 2.3.1 Solubilidad de la carragenina
Se pueden preparar soluciones al 10% de concentración con iota y
κappa carrageninas en agua por encima de 70oC, pero las sales de potasio
y calcio de kappa y iota carrageninas son insolubles en agua fría. (Mshigeni,
1992)
El propilen glicol, los glicoles y los solventes similares en polaridad
con estos alcoholes, son excelentes dispersantes de las carrageninas, la
cantidad del solvente tolerada depende del peso molecular del polisacárido y
del tipo de carragenina, el alto contenido de sulfatos y la disminución de peso
molecular causada por la hidrólisis hacen más hidrofílica la carragenina.
(Mshigeni, 1992)
Las κappa y lambda carrageninas son solubles en soluciones
azucaradas al 65%.
Iota y lambda carrageninas son solubles en soluciones alcalinas al
25%, mientras que κappa carragenina se precipita en estas condiciones.
Todas las carrageninas son insolubles en solventes orgánicos poco
polares. (Mshigeni, 1992)
31
2.3.2 Viscosidad de la carragenina La viscosidad de la carragenina depende de la concentración, la
temperatura, la presencia de otros solutos, el tipo de carragenina y el peso
molecular, incrementa de manera exponencial con la concentración de la
carragenina en solución iónica de potasio, este comportamiento es típico de
polisacáridos lineales con grupos cargados y los cambios en los valores de la
viscosidad se deben a la interacción entre las cadenas de polímero con las
soluciones salinas, que reducen la repulsión entre los grupos sulfato.
La viscosidad decrece de manera exponencial con la temperatura,
pero los cambios son reversibles, enfriamientos abruptos de la carragenina
incrementan la viscosidad aparente.
La viscosidad incrementa con el peso molecular de acuerdo con la
ecuación de Mark-Houwink. (Ecuación No 1)
V= KMx (1.)
Donde V es la viscosidad, M el peso molecular promedio y x un parámetro
que varía con el solvente y el peso molecular del polisacárido utilizado en la
determinación; a bajas concentraciones de sal el factor x es cercano a 1.
Las medidas se viscosidad se suelen tomar a 75oC y 1,5% de
concentración de carragenina en KCl, las carrageninas comerciales
disponibles presentan viscosidades de 5 mPa-s a 800 mPa-s y son
consideradas como fluidos no Newtonianos. Una carragenina comercial
debe disolverse en agua fría ó en agua caliente formando soluciones
viscosas, pero la viscosidad debe aumentar en presencia de sales de calcio o
potasio.
32
El valor de la viscosidad promedio está directamente relacionado con
el peso molecular, la k carragenina usada en alimentos tiene un peso que
está entre 100.000 y 50.000 Dalton, el mayor peso molecular de una
carragenina se ha estimado en 250.000 Dalton.
2.3.3 Temperaturas de fusión y gelificación Los geles de carragenina, son térmicamente reversibles por
enfriamiento, la temperatura de gelificación de una kappa carragenina tiene
un rango entre 35 y 65oC y el punto de fusión entre 55-85oC, las variaciones
son debidas a la concentración de KCl en la cual se prepara el gel. Los geles
de iota carragenina preparados en soluciones de cloruro de calcio presentan
temperaturas de gelificación más elevadas, entre 39 y 71 oC.
2.3.4 Fuerza del gel Es una medida estándar de la fuerza aplicada para provocar una
deformación en un gel, a una concentración y temperatura determinada, la
fuerza está relacionada con la temperatura de gelificación, los iones
presentes y el contenido de anhidrogalactosa, los valores de fuerza de gel
pueden variar desde 127g/cm2 (Mtolera y Buriyo, 2004), hasta 845 g/cm2
(Briones y colaboradores, 2004), dependiendo de las condiciones de
extracción. El gel formado por kappa carragenina en presencia de iones
potasio es rígido y exhibe un alto contenido de 3,6 anhidrogalactosa y un
bajo contenido de sulfatos. Se encuentran geles más elásticos como los
formados por iota carragenina en presencia de calcio.
Las carrageninas preparadas a concentraciones menores al 1,3% en
presencia de cationes pueden formar geles térmicamente reversibles. La
fuerza de gel de las carrageninas se determina usando concentraciones de
1,5 % del catión. En la figura No 3 se aprecia que la fuerza de gel aumenta
con la concentración de KCl y con el % de kappa carragenina en el gel.
33
Figura No 3. Variación de la fuerza de gel en función de la concentración de k carragenina
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
% KCl
Fuer
za d
e ge
l en
g/cm
2
0,5% en kappa
1,0% en kappa
Datos tomados de Briones y colaboradores (2004).
Los valores de fuerza de gel también dependen de la especies de alga
de donde se extrae, por ejemplo geles extraídos de Eucheuma sp tienen
fuerzas de gel de 500g/cm2, este valor depende además del tratamiento
alcalino al que fue sometida la muestra.
La fuerza de gel de la kappa carragenina extraída de una misma
especie de alga presenta variaciones con la estación de recolección, estudios
realizados sobre Hypnea musciformis mostraron un incremento gradual en
la fuerza de gel de marzo ( 57g/cm2) a Octubre ( 521g/cm2) (Guist, 1984) en
muestras recolectadas en Brasil.
De igual manera en cultivos de kappaphycus alvarezii la fuerza de
gel depende de las condiciones climáticas y de nutrientes en el agua.
(Rincones, 1999), (Muñoz, 2004).
Conocer la fuerza de gel de kappa carragenina es importante, porque
de los valores que tome dependen las aplicaciones finales, por ejemplo se
34
puede usar para fabricar empaques, películas o como gelificante de
alimentos (Briones y colaboradores, 2004).
2.3.5 Perfil de textura El análisis de perfil de textura está establecido sobre el reconocimiento de la
textura como una propiedad multiparamétrica. El ensayo está basado en dos
compresiones uniaxiales sucesivas separadas por un tiempo de relajación, el
resultado es una curva de fuerza aplicada en función del tiempo, se
comprime la muestra hasta un 75% de su altura, se afloja el esfuerzo, se
relaja y luego se vuelve a comprimir la curva obtenida para un gel se aprecia
en la figura No 4. (Rao, 1999) Figura No 4 Curva obtenida en un perfil de textura de un gel carragenina
Fuente: Gladys Rozo, equipo Stable Micro systems TA-XT2i
35
La figura No 4 muestra un perfil de textura tomado en un equipo Stable Micro
systems TA-XT2i, de esta curva se pueden obtener los siguientes
parámetros:
El pico F se denomina fracturabilidad y corresponde a la fuerza
necesaria para que se realice la primera ruptura.
La dureza o fuerza de gel es el punto d1t y corresponde a la fuerza máxima
obtenida en la primera compresión.
La adherencia, que corresponde al área de la curva d situada bajo el eje de
las abscisas, se define como el trabajo necesario para despegar el producto
de la placa de compresión.
El carácter gomoso es el producto de la dureza por la cohesión.
La elasticidad es la pendiente de la línea trazada desde el inicio del ensayo
hasta el punto máximo.
El área a1 representa la velocidad de transferencia de energía de molécula a
molécula.
Existen otras definiciones que se pueden obtener de un perfil de
textura, cuando se realiza sobre alimentos, pero para un gel se usan
generalmente los mencionados anteriormente. ( Roudot, 2004).
2.3.6 pH Las carrageninas son estables a valores de pH altos, pero al disminuir
el pH también decrece su estabilidad especialmente si se eleva la
temperatura, a pH bajo ocurre la hidrólisis de la carragenina dando como
resultado una menor viscosidad y menor capacidad de gelificar. Las
carrageninas se pueden depolimerizar por hidrólisis ácidas o básicas a altas
temperaturas, la velocidad de la hidrólisis depende de las condiciones de
temperatura y pH, es muy lenta cuando está formando gel, pero la velocidad
36
aumenta cuando se presenta el estado sol como en lambda carragenina.
(Stanley, 1987).
2.3.7 Reactividad frente a las proteínas
Todos los polisacáridos sulfatados están cargados negativamente a
cierto rango de pH, es por ello que pueden formar complejos con proteínas
que tienen cargas positivas, estas asociaciones cambian los puntos
isoeléctricos de las proteínas. La kappa carragenina tiene la capacidad de
estabilizar la α y β caseína y por eso es usada para estabilizar leches
evaporadas y fórmulas para lactantes. (Nickerson y Paulson, 2005 ) (Ribeiro,
y colaboradores, 2004),
2.3.8 Espectro Infrarrojo La carragenina presenta bandas de absorción fuertes típicas de los
polisacáridos en la región entre 1000 y 1100 cm-1 con señales de absorción
máxima en 1065 y 1020 cm-1 ( Sekkal, et al, 1994). Para sistemas
gelificados y no gelificados, aparecen otras bandas características como las
reportadas en la tabla No 2. (JECFA, 2001).
Tabla No. 2. Absorción en el I.R. de las diferentes carrageninas (JECFA, 2001)
Absorbancia relativa a 1050 cm-1Longitud de onda
(cm-1)
Asignación
molecular
Kappa
Iota
Lambda
1220-1260 Ester sulfato 0.2-1.2 1.2-1.6 1.4-2.0
928-933 3,6 anhidrogalactosa 0.2-0.6 0.2-0.4 0-0.2
840-850 Galactosa-4sulfato 0.1-0.5 0.2-0.4 -
825-830 Galactosa 2-sulfato - - 0.2-0.4
810-820 Galactosa 6-sulfato - - 0.1-0.3
800-805 3,6anhidrogalactosa
-2- sulfato
0.0-0.2 0.2-0.4 -
37
2.4 Aplicaciones comerciales de kappa carragenina Los residentes del condado de Carraghen en la costa sur de Irlanda,
hace más de 600 años, usaban el “ musgo irlandés”,un alga productora de
gel, en los alimentos y medicinas,. Estas algas marinas eran aprovechadas
debido a su propiedad única de gelificar la leche y crecían a lo largo de las
costas de Francia. Con las algas blanqueadas se preparaba un gel de leche
conocido como “blanc-mange”. Este alimento se obtenía enfriando la leche
en la cual se habían cocido las algas.: En los Estados Unidos se preparaba
un alimento similar. Sin embargo, no fue sino hasta la Segunda Guerra
Mundial, cuando se inició la industrialización de algunas especies de algas
que se denominaron carragenofitas.
Hoy el gel de kappa carragenina se usa en coberturas para
alimentos, las coberturas actúan retardando la pérdida de humedad,
aumentando la estabilidad contra el crecimiento de microorganismos en la
superficie, si se usa el gel como portador de agentes antimicrobiales. Las
carrageninas evitan la oxidación de los alimentos porque son buenas
barreras para el oxígeno. En unión con pectinas de bajo metoxilo, gomas
xantán y goma arábiga, pueden satisfacer los últimos requerimientos
alimentarios. Tienen también multitud de aplicaciones fuera del sector
alimentario, como en pastas de dientes, productos cosméticos o
ambientadores, en los que se utiliza para controlar sus texturas y fluidez,
para alargar su periodo de vida o para reducir los costos de producción.
(Dawes, 1986).
En alimentos son usadas como aditivo natural, sin ningún efecto
tóxico conocido; como agentes gelificantes o estabilizantes; una gran
cantidad de productos acuosos de venta hoy en el mercado contienen
carragenina. Un resumen de los usos en el sector de alimentos se aprecia en la
Tabla No 3. (Dawes, 1986)
38
Tabla No 3. Usos de carragenina en alimentos. Tomado de Clinton Dawes, Botánica Marina, 1986
Uso Función Cantidad utilizada aproximada
Geles para postres acuosos Agente fijador 0.7% Gelatina dietética Agente fijador 0.5% Rellenos para pastel Agente fijador 0.5% Jarabes Da cuerpo suspensión 0.2% Polvos de bebidas de frutas y concentrados congelados
Efectos de dar cuerpo y formar pulpa
0.5%
Sustitutos de crema para el café
Estabilización de emulsiones <0.2%
Condimentos, salsas para pizza y barbacoa
Da cuerpo <0.5%
Salsas de mantequilla para vegetales congelados
Adhesión, color uniforme, sensación bucal
<0.5%
Sopas Da cuerpo formación de geles
0.2-1.0
Crema de dientes, lociones Da cuerpo estabilización de emulsiones
<1.0
Suspensiones Forma suspensiones <1.0% Helados Prevenir la separación del
suero 0.015%
Leches pasteurizadas saborizadas
Da cuerpo y suspensión 0.015%
Leches esterilizadas de chocolate
Estabilización de grasas 300 ppm
Leches evaporadas en lata Estabilización de grasas 25-50 ppm Bebidas dietéticas de 900 calorías
Da cuerpo y suspensión 250 ppm
Leches para bebes Estabilización de grasas y proteínas
300 ppm
Rellenos para pastel fríos sin almidón
Agente fijador 0.5-1.0%
Rellenos para pastel fríos con almidón
Fijación inhibición de la sinéresis
0.1-0.5%
Natilla Agente fijador 0.3% Flan horneado Agente fiador 0.3% Productos batidos Estabilización de grasas y
espuma, fijación 0.05%
Cremas, coberturas, postres Estabilización de grasas y espuma, fijación
0.05-0.5
Bebidas espesas malteadas Da cuerpo y estabiliza el exceso
0.1-0.3
39
Desde 1979 la FDA (Food and Drug Administration, U.S.A.), reconoció
a las carrageninas como compuestos que alteran la viscosidad en productos
acuosos y se pueden consumir sin restricción conocida.
La adición de carragenina a productos lácteos es importante porque se
aprovecha la reactividad de las proteínas con un polisacárido sulfatado,
generalmente previene la separación de la capa acuosa en leches
evaporadas y homogeniza controlando la textura del alimento. La adición de
carragenina evita la separación de la capa grasa en los quesos. (Ribeiro, y
colaboradores, 2004 y Nickerson y Paulson, 2005)
Para alimentos basados en agua como jugos se usan mezclas de
carrageninas para dar cuerpo y textura. (Nickerson y Paulson, 2005). En la
preparación de carnes frías la carragenina aporta textura y homogeniza la
mezcla.
En farmacéutica se utiliza para realizar preparaciones de drogas
insolubles en agua, dando estabilidad a las emulsiones, se utiliza en geles
antiácidos, en drogas para curar ulceras y en suspensiones de sulfato de
bario para radiología. ( Xu y colaboradores, 2003).
Se conocen otros usos industriales como: la preparación de pastas
dentríficas, lociones, cremas, bases para pinturas, purificadores de aire y
como medio para inmovilizar enzimas.
La carragenina se vende en forma de polvo fino, el cual, en presencia
de cationes, requiere calor para una solubilización completa. Para compensar
la solubilidad lenta característica del material, se recomienda dispersar la
carragenina con buena agitación en el medio (agua o leche) y calentar el
sistema hasta aproximadamente 82-85ºC, con lo cual se asegura la
solubilización completa del polisacárido.
40
La universidad de Córdoba, España, patentó un procedimiento para
controlar el pardeamiento de bebidas que se produce con el paso del tiempo,
utilizando para ello geles de carragenina en donde se inmovilizaron levaduras
encargadas de prevenir el desarrollo de color. (PTC WO 03/070930).
La empresa Jonsson, radicada en Estados Unidos, en el año 2000,
estableció un protocolo, que se usa actualmente para la preparación de
masmelos, dulces y gomas usando como base kappa carragenina. (PTC WO
00/69275).
Las investigaciones sobre usos y aplicaciones de kappa carragenina
apuntan hacia la síntesis de nuevos compuestos derivados o copolímeros
que presentan actividades antivirales. (PTC WO 00/77019, PTC WO
037093322).
En el campo de la agricultura, kappa carragenina con altas fuerzas de
gel son potenciales geles hidroretenedor con menos sensibilidad a las
soluciones salinas que los geles comerciales y con grandes ventajas
medioambientales ya que su estructura de polisacárido y su origen vegetal lo
hacen biodegradable.
La carragenina es un polisacárido hidrofílico que puede incrementar
las propiedades de los hidrogeles sintéticos (Zhai et al,2004).
Dentro de las nuevas generaciones de geles hidroretenedores se
encuentran los geles por copolimerización de poliacrilamida con Kappa
carragenina, un polisacárido extraído de algas rojas reconocido por su
capacidad de gelificar y con mejores propiedades fisicoquímicas que los
geles superabsorbentes sintetizados hasta la fecha. (Falshaw et al, 2003).
41
En los últimos años se ha estado evaluando el efecto de la aplicación
de geles superabsorbentes sobre el crecimiento de árboles cultivados en
suelos arenosos. Hütermann y colaboradores (1999), estudiaron el efecto de
la adición de un hidrogel superabsorbente de poliacrilamida-kappa
carragenina en plántulas de Pinus halepensis durante estrés hídrico, el gel
de poliacrilamida que emplearon tenía el 40% de los grupos amida
hidrolizados hasta ácidos carboxílicos, con esta metodología encontraron que
la retención de agua en el suelo aumentó exponencialmente con los
incrementos en las dosis de hidrogel y que durante la desecación las
plántulas tratadas con 0.4 % de hidrogel sobrevivieron el doble del tiempo
que las plántulas control, también observaron que el crecimiento de las
plántulas de Pinus halepensis fue tres veces mayor cuando se adicionó el
hidrogel al suelo.
2.5 Fuentes carrageninas Las carrageninas se extraen de diferentes especies de algas rojas, en la
tabla No 4 se aprecia el tipo de carragenina, la especie de alga y el lugar
del mundo donde se encuentra de manera nativa o se cultiva.
En la figura No.5 se presentan algunas Carragenophytas o algas
productoras de carragenina.
Figura No.5 Principales especies de algas utilizadas en la producción de carragenina
Chondrus Crispus (Kappa/Lambda Carragenato)
Eucheuma Cottonii (Kappa Carragenato)
Gigartina, Varias especies (Lambda/Kappa Carragenato)
Hypnea musciformis (Kappa, Carragenato)
Figuras Tomadas de: www. issg Database Ecology of Hypnea musciformis.htlm, 2005
42
Tabla No 4 Algunos ejemplos de Carragenophytas
Especie carragenina país
Chondrus crispus Mezcla de kappa y lambda Francia y regiones
del Atlántico norte
Kappaphycus alvarezii Mayoritariamente Kappa Cultivada en
Venezuela, y México
y nativa de Filipinas
e Indonesia
Eucheuma spinosum Mayoritariamente iota Indonesia
Gigartina skottsbergii Mayoritariamente kappa y
algo de lambda
Argentina y Chile,
cultivada en
Normandía y Gran
Bretaña
Sarcothalia crispata Mezcla de kappa y lambda Chile
Hypnea musciformis Exclusivamente Kappa Brasil, Colombia,
Senegal
G.chamissoi iota Perú y Chile
Iridea sp lambda Francia
En año 2002, el Council of Scientific and industrial Research (PTC WO
02/17707) patentó los métodos para el cultivo de algas productoras de
carragenina de especies comerciales Eucheuma cottonii, Eucheuma
spinosum, y kappaphycus, estas investigaciones presentan: el proceso de
cultivo, el desarrollo de variedades y las metodologías para la propagación,
también se describe la obtención de variedades con aumentos significativos
de biomasa en períodos cortos de tiempo, la variación de la calidad y
cantidad de kappa carragenina, cuando se realizan los cultivos a partir de
tejidos.
43
2.6 Fuentes de kappa carragenina El polisacárido de interés en esta investigación es kappa carragenina,
cuya estructura se ilustra en la figura No 6
Figura No 6 Estructura de kappa carragenina
Originalmente la kappa carragenina fue obtenida de algas que crecían
en ambientes naturales en indonesia y Filipinas, pero partir de los años 70
se iniciaron los cultivos de Kappaphycus alvarezii y Eucheuma
denticulatum en estos países, para satisfacer la demanda creciente de
kappa carragenina en el mundo, los cultivos se extendieron a otros lugares
del mundo como Tanzania, Vietnam y algunas islas de Pacífico como Kiribati
donde hoy se cultivan especies nativas. En China, Taiwán y Filipinas se
siembra Betaphycus gelatinum; en Canadá, Escocia, Estados Unidos y
Francia se cultiva Chondrus crispus; en Chile y Argentina se cultivan
Gigartina skottsbergii y Sarcothalia crispata y Mazzaella laminaroides,
Gigartina canaliculata se cultivan en México y baja California (Falshaw, 2003).
A lo largo de la costa de Brasil se encuentran grandes extensiones de
Hypnea y en algunos lugares de Brasil se ha incrementado su cultivo para
proteger las poblaciones naturales. ( Faccini and Berchez, 2000).
La especie Chondrus crispus fue cultivada en Canadá desde los
años 20, pero no fue sino hasta la segunda guerra mundial cuando adquirió
gran importancia debido a que los coloides eran inaccesibles para el
44
mercado Americano porque las importaciones japonesas estaban
suspendidas.
En los años 70 Canadá era la principal fuente de carragenina,
Chondrus crispus proveía cerca del 70% de la producción mundial, pero en
1992 con los cultivos de Kappaphycus alvarezii ,120.000 toneladas anuales
en peso seco y Eucheuma denticulatum 30.000 toneladas al año en
Filipinas, Indonesia y Tanzania, la producción de Canadá se redujo al
12%. (McHugh, 2001)
En la tabla No 5 se presenta el comportamiento de las fuentes de
carragenina en toneladas de peso en seco para el año 2001, allí se aprecia el
aporte de países nuevos en mercado como Perú, México , España, Portugal
y Corea. (McHugh, 1991)
Tabla No 5. Fuentes de carragenina por países ( McHung, D.J.,1991) Ton % mundial
Chondrus
Canadá 2.000
Francia, España y Portugal 1.400
República de Korea 500
Subtotal 3.900 2.3%
Eucheuma y Kappaphycus
Filipinas 115.000 Indonesia 25.000 Tanzania 8.000 Otros 1.000 Subtotal 149.000 88.5%
Gigartina Chile 14.000
México y Perú 1.500
Subtotal 15.500 9.2%
Total 168.400 100%
45
2.7 Mercado de kappa carragenina en el mundo Las plantas extractoras de Carragenina están ubicadas en Filipinas,
Europa, Estados Unidos y Canadá, en Filipinas se obtiene carragenina
semirrefinada y en los demás países se obtiene carragenina refinada. (Bixler,
1996), (Lillford, 2000)
La carragenina usada actualmente en el mundo para alimentos,
farmacia y cosméticos es un negocio que supera los 200 millones de
dólares (Radmer, 1996). El consumo total de materias primas asciende a
unas 170.000 toneladas de algas marinas en peso seco de las que se
obtienen 30.000 toneladas de carragenina por un valor de 270 millones de
dólares en Estados Unidos. (Lillford, 2000)
En el mundo hay 24 productores reconocidos de carragenina, sin
embargo el 80% del total procesado, corresponde a la producción de tres
empresas, según la FAO el crecimiento anual de los requerimientos de
carragenina para los próximos cinco años está estimado en un 8%.
Habitualmente la extracción de carragenina se hace en lugares muy
alejados del cultivo de algas, lo que significa que para que sea
comercialmente viable, el volumen de producción de cualquier zona debe
ascender a por lo menos 1000 toneladas de peso al año, para poder hacer
frente a los gastos de funcionamiento, el precio en playa debe ser de 200
dólares por tonelada en peso seco. (Lapointe et al, 1982).
En sur América Cuba y Venezuela lograron exportaciones de
Hypnea, en seco hacia Dinamarca para la extracción de carragenina, pero
la cantidad de alga silvestre en esta región no fue suficiente para mantener la
demanda (Smith, 2003). (Jory et al, 2000).
46
En Colombia en el año 2005 se importaron $US3.262.000 dólares de
carragenina, según Proexport pero el país no participa como productor en el
mercado mundial de la carragenina (Sena, 2006)
2.8 Hypnea musciformis 2.8.1 Clasificación taxonómica de Hypnea musciformis
Es un alga con talo pseudoparenquimático, blando, con ramas cilíndricas dispersas alrededor de los ejes; color rojo con las puntas de los ejes recurvadas en forma de gancho (Figura No 7) Clasificación taxonómica: Genero: Hypnea Especie: musciformis Autoridad: (Wulfen) Lamouroux Nombre común: hooked weed Orden: Gigartinales Familia: Hypneaceae . Figura No 7 Hypnea musciformis
Colector: Gladys Rozo, Agosto de 2005.-
47
2.8.2 Factores que influyen en el contenido de kappa carragenina en
Hypnea musciformis.
Hypnea musciformis es un alga Rhodophyta, de donde se ha logrado
obtener kappa carragenina (Berchez, 1993; Oliveira y Berchez, 2000), con
rendimientos que oscilan entre el 35 y el 43%, el contenido de carragenina
se ve afectado por las condiciones ambientales regionales y por el estado de
desarrollo del alga.
Mtolera y colaboradores (2004), reportaron rendimientos del 35% en
ficocoloide, extraído de Hypnea, recolectada en la bahía de Oyster -
Tanzania- en diferentes estaciones monzónicas.
En la India y Florida se han encontrado especies de Hypnea con
altos contenidos de carragenina en los meses de Enero a Abril (Solimabi et
al, 1980).
Algunos autores sugieren que la variación del contenido de
carragenina en el alga se debe a abruptos cambios en parámetros
ambientales como luz, temperatura y salinidad (Collen y colaboradores,
1995; Mtolera y colaboradores, 2004), otros autores sostienen que la
cantidad de carragenina extraída depende de la rapidez con que crece el
alga y que los mayores valores de к carragenina se encuentran en los
períodos de más rápido crecimiento (Rao, 1970).
Se encuentran algunos estudios comparativos con otras
carragenofitas, donde se ha mostrado que esta especie crece un 20% cada
día, con buena iluminación y aguas calmadas, igualmente en la literatura se
encuentran reportes acerca del crecimiento de Hypnea como epifita de
otras especies (Guist et al, 1984).
48
De otro lado Guist y colaboradores (1984) cultivaron Hypnea
musciformis en la Florida durante 15 meses, encontrando un aumento de
biomasa de un 20% diario, con velocidades de crecimiento altas cuando las
temperaturas estuvieron entre 18 y 24oC y con flujos de agua continuos que
contenían fósforo y nitrógeno, mostrando una tasa de crecimiento
inversamente proporcional al nivel de irradiación solar, contrario a las
publicaciones anteriores el contenido de к carragenina de Hypnea cultivada,
fue inversamente proporcional a la velocidad de crecimiento, solamente,
lograron aumentar el contenido de carragenina manteniendo las plantas por
dos semanas en tanques con nutrientes adicionales.
M. Friedlander en 1984 realizó comparaciones entre especies de
carragenofitas cultivadas y silvestres, en las que incluyó Hypnea
musciformis, midiendo velocidad de crecimiento en función de la
temperatura, la intensidad luminosa y el contenido de carragenina, concluyó
que no había diferencias significativas entre las propiedades físicas y
químicas del coloide obtenido del alga cultivada y del alga silvestre.
(Friedlander, 1984).
En Brasil se realizaron estudios sobre cultivos de Hypnea
musciformis in vitro variando la temperatura, la aireación y los nutrientes,
sus mejores resultados, correspondieron a: crecimiento del alga del 20,79%
diario a temperatura de 25oC y en ausencia de aireación. (Bravin y Yoneshigue, 2002), (De Souza, 1990).
En Colombia los estudios se limitan a la propuesta realizada por Bula
Meyer (1990), con base en las observaciones de campo y en mediciones de
temperatura, salinidad, nutrientes, transparencia y movimiento de agua, Bula
planteó, que el factor clave que regula los aspectos fisiológicos de las macro
algas del Parque Tayrona es el asenso de la temperatura por encima de los
49
26oC, como resultado de los fenómenos oceanográficos, que se observan en
la estación húmeda mayor.
El inventario taxonómico de las macroalgas marinas de las costas
colombianas revela una fuente innumerable de especies de gran interés
comercial en todos los aspectos básicos de aprovechamiento (Bula Meyer,
1988; Bula Meyer, 1989).
Hypnea musciformis es la única especie nativa del Caribe
Colombiano, (Díaz-Pulido et al, 2003), que se ha mostrado como promisoria
para la extracción del ficocoloide, kappa carragenina.
Berchez y colaboradores (1989), (1993) realizaron estudios de cultivos
in vitro, con la finalidad de disminuir la presión sobre poblaciones naturales, y
lograron determinar los factores fundamentales para el control del
crecimiento de Hypnea (Bravin y Yoneshigue, 2002; Perpetuo, 2003).
2.8.3 Ciclo de vida de Hypnea musciformis Como la carragenina forma parte de las paredes celulares del alga,
también se ha estudiado la variación del contenido de ficocoloide,
encontrando diferencias significativas y modificaciones de la estructura del
ficocoloide en función del estado de desarrollo del alga, este fenómeno fue
llamado por Yaphe secundarización de la pared celular. (Lahaye y Yahphe,
1998).
Las carregenofitas tienen diferentes estados de desarrollo, se conoce
que por ejemplo en las plantas gametofitas haploides, predomina la kappa
carragenina y en las tetrasporofitas diploides se encuentra
predominantemente lambda carragenina, comercialmente se pueden cultivar
juntas y se obtiene una mezcla de kappa y lambda carragenina que se usa
para la estabilización de productos lácteos. (Dawes et al, 1977)
50
Como la carragenina Nu es precursora de kappa en el ciclo de vida de
las algas carragenofitas es posible encontrar en alguna época de su
crecimiento Nu carragenina y en su estado desarrollo maduro kappa, para el
caso de Hypnea musciformis se reporta que recolectada en su fase final de
crecimiento se obtiene solamente kappa carragenina. (Berchez y
colaboradores, 1993)
2.8.3 Función de la carragenina en las algas rojas Las paredes celulares de las algas marinas contienen polisacáridos de
cadena larga, como la carragenina, que le dan flexibilidad a las algas y les
permiten adaptarse a la variedad de movimientos de las aguas en las que
crecen. Por ejemplo, algunas algas rojas crecen sujetas a las rocas en aguas
muy turbulentas, por lo que han de tener una gran flexibilidad para sobrevivir;
estas algas contienen una cantidad mayor de ese tipo de polisacáridos que
las algas rojas que crecen en aguas tranquilas, es por esta razón que el
contenido de carragenina en las algas dependerá de las condiciones
climáticas en las que sobrevive. (Watt et al, 2003)
2.8.4 Pigmentos en Hypnea musciformis Se ha estudiado la variación del contenido de carragenina en función
del estado de madurez del alga, encontrando diferencias significativas y
modificaciones de la estructura del ficocoloide en función del estado de
desarrollo del alga, este fenómeno fue llamado por Yaphe secundarización
de la pared celular. (Lahaye y Yahphe, 1998).
En Hypnea musciformis y otras algas rojas, a la carragenina la
acompañan una serie de pigmentos que fueron descritos por Rowan (1989):
Clorofilas, carotenos y ficobilinas
51
Las clorofilas a y d son estructuras de tetrapirroles dispuestos en un
anillo con un átomo central de magnesio como se muestra en la figura No 8
Figura No 8 Clorofilas presentes en Hypnea musciformis
CH3
N
N
N
NMg
CH3
CH3
CH3
CH2
H C3
oH
3 oo oo
H
H HH
H C3
Clorofila R: - ; : -CHclorofila CHO;
ad
1 3 CH R = CHR: - R: -CH CH
2 2
1 2 2
R1
R2
3
Los carotenos que se encuentran comúnmente en el género
Rhodophyceae son α, β carotenos y 3-hidroxiderivados como luteína y
Zeaxantina, en la Figura. No 9 se muestran las estructuras de estos
carotenos.
52
Figura No 9 Carotenos presentes en Hypnea musciformis
CH3CH3
CH3
CH3CH3
CH3
OH
OH
α-caroteno
CH3CH3
CH3
CH3CH3
CH3
β caroteno
CH3CH3
CH3
CH3CH3
CH3
luteína
CH3CH3
CH3
CH3CH3
CH3
OH
OH
Zeaxantina
53
Las ficobilinas son tetrapirroles lineales, están unidas a grandes
moléculas de proteína, son hidrosolubles, existen dos tipos de ficobilinas la
ficocianina (responsable de color azul) y la ficoeritrina (responsable color
rojo), las estructuras se aprecian en la figura No 10
Figura No 10. Ficobilinas presentes en Hypnea musciformis
o
H
CH3 CH
CH3
H
CH3 CH2
CH2
COOH
H H
CH2
CH2
COOH
CH3 CH3
H o
CH3 CH
CH2
H
Ficocianina
o
H
CH3 CH
CH3
H
CH3 CH2
CH2
COOH
H H
CH2
CH2
COOH
CH3 CH3
H o
CH3 CH2
CH3
Ficoeritrina
2.8.5 Polisacáridos de reserva de las algas rojas
En los años 1950 y 1960 se descubrió que las algas rojas almacenan
azucares como fuente de energía, en estructuras parecidas a los almidones
denominadas, desde entonces, almidón floridean. (Meeuse, 1960) Los
gránulos de almidón se localizan en el citosol de las células de las algas
rojas (Bouck, 1965)
El almidón floridean , es un homopolímero de la glucosa formado por
enlaces glucosidicos α-1,4 con ramificaciones α-1,6, tal y como se aprecia
en la Figura No.11, La familia Bangiophyceae, almacena almidón con
estructuras de amilasas y amilopectinas, mientras que las algas de la familia
54
Florideophyceae, especies económicamente importantes en la industria de
los ficocoloides de agar, agarosa y carragenina, que se cultivan ampliamente
en varios países del mundo, poseen como polisacáridos de reserva almidón
floridean, cuya estructura está formada solamente por amilopectinas. (Yu et
al, 2002).
Figura No 11 Estructura del almidón Floridean
H
H
H
H
H
CH2
C C
C
C
OH
OH
OH
O
H
H
H
H
H
CH2
C
C C
C
C
OH
OH
OH
O
H
H
H
H
H
CH2
C
C C
C
C
OH
OH
H
H
H
H
H
CH2
C
C C
C
C
OH
OH
H
H
H
H
H
CH2
C
C C
C
C
OH
OOH
OH
H
H
H
H
H
CH2
C
C C
C
C
OH
OH
OH
O
H
H
H
H
H
CH2
C
C C
C
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CH2
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C C
C
C
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C
C C
C
C
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OH
OH
H
H
H
H
H
CH2
C
C C
C
C
OH
OOH
OH
El almidón floridean es reconocido como una impureza en el agar y la
carragenina, presenta efectos adversos en la fuerza de gel y usualmente
tiene que ser removido por tratamiento enzimático con α-amilasas
tremofilicas. (Yu, S et al, 2002) El almidón floridean presenta bajas temperaturas de gelatinización y
la amilosa libre de lípidos y proteínas le confiere un color claro, los
gránulos de almidón en el citosol llegan a medir entre 1.7 y 3.4 µm y tiene un
promedio de 18 unidades de glucosa en cadenas relativamente cortas, con
un alto grado de ramificaciones (frecuencias de 4,8%).(Yu, S et al , 2002).
55
Cuando se extrae almidón Floridean de algas verdes los ensayos de
coloración con una solución de yodo-yoduro, muestran una formación de
complejos de color oscuro casi negro, mientras que el almidón floridean
obtenido de algas pardas no produce ningún complejo coloreado y las
pruebas de yodo-yoduro dan complejos de colores rojos claros cuando el
almidón proviene de algas rojas. (Fournet et al, 1999).
Actualmente se realizan modificaciones genéticas en las algas, con el
propósito de modificar la síntesis o degradación del polisacárido floridean y
ofrecer una carragenina libre de almidón que proporcione mejores efectos
gelificantes. ( Tucker, 2000)
2.9 Extracción Kappa carragenina Existen dos métodos para producir carragenina basados en principios
diferentes. Hasta los años 70 y 80 la carragenina fue extraída del alga en
solución acuosa, los residuos se removían por filtración y la carragenina se
recuperaba de la solución como un sólido seco, que contenía una buena
proporción del coloide, sin embargo, el método presentaba dificultades de
reproducibilidad y pureza de la carragenina. La carragenina obtenida por
este método recibe el nombre de carragenina filtrada. El método se modificó
utilizando hidróxido de potasio para la extracción con el propósito de reducir
los grupos sulfato y aumentar la 3,6 anhidrogalactosa, algo de proteína,
carbohidratos y sales se solubilizan con este método. La figura No 12
presenta un resumen del método para obtener carragenina semirrefinada. En
este cuadro se aprecian dos métodos que promueven una reacción química
para favorecer la extracción, pero al extracto pulverizado de alga no se le
retiran los componentes coloreados de la pared celular. (McHugh, 2001)
56
Figura No 12 Métodos para la extracción de carragenina
Figura tomada de (McHugh, D.J., 2001)
Actualmente la carragenina refinada se obtiene lavando las algas,
removiendo las sales y calentándolas en una solución alcalina, que puede
ser hidróxido de sodio, por varias horas, el tiempo depende de la especie de
donde se hace la extracción; el álcali es usado para causar un cambio
químico que conduce a un incremento en la fuerza de gel en el producto final,
57
con este proceso la solución de carragenina ahora es muy clara y se
pueden usar dos métodos para recuperar el sólido, ( ver figura No 13), una
precipitación con alcohol o con cloruro de potasio, estos procedimientos
permiten remover algunos grupos sulfato de las moléculas e incrementar la
formación de 3,6 Anhidrogalactosa.
Las algas que no se disuelven se remueven por filtración o
centrifugación; el método descrito puede ser usado para obtener cualquier
tipo de carragenina.
Cuando se adiciona alcohol la carragenina precipita y se separa por
filtración, se lava repetidas veces con alcohol, se seca y se pasa por una
malla de tamaño apropiado, el alcohol puede ser reciclado y el gel obtenido
se purifica por enfriamientos repetidos.
Cuando el gel obtenido se precipita con KCl (ver figura No 13), se presiona
para sacar toda el agua y se obtiene la carragenina en forma de fibras que
se hilan a presión. El método está basado en la habilidad que tiene la kappa
carragenina para formar geles con sales de potasio (McHugh, D.J., 2001)
58
Figura No 13 Método para la obtención de carragenina refinada
Figura tomada de (McHugh, D.J., 2001)
En los últimos años se encuentran patentes que muestran la obtención
de carragenina semirrefinada con los siguientes pasos: decoloración de las
algas, cocción en soluciones de KOH hasta causar la formación de 3,6
anhidrogalactosa, lavado, neutralización, filtrado y secado. Estos
procedimientos se han estudiado siguiendo los procesos de reacción por
medidas de potenciales redox (PTC WO 98/40412).
59
En el año 2003 (PTC WO 03/059957) se reportaron los primeros
ensayos de obtención de carragenina con recuperación de la solución
alcalina, los procesos se realizaron utilizando diferentes tipos de algas en la
extracción de carragenina, el gel se separó por compresión y luego se
realizaron sucesivos lavados con agua destilada hasta neutralizar la
muestra.
A continuación se realizaron estudios para retirar la mayor cantidad
de agua posible de la carragenina utilizando métodos de compresión y
extrusión, al producto obtenido se le retiró el 85% de agua sin calentamiento,
la textura de la carragenina obtenida le permitió a los investigadores de la
compañía Colgate Palmolive fabricar los primeros alimentos para gatos y
perros soportados en geles de kappa carragenina (PTC WO 02/051443).
En este mismo camino la compañía Hill׳s Pet Nutrition (PTC WO
02/051443), publicó un nuevo método de extracción de kappa carragenina
con un porcentaje de humedad final de menos del 15%, apta para la
preparación de comida animal. Sin embrago este método no difiere mucho
del reportado por la empresa Colgate- Palmolive
La compañía Gelymar (PTC WO 02/057477), publicó un proceso de
producción de carragenina que se caracteriza porque presenta solamente el
2% de material insoluble y comprende los siguientes pasos i) preparación
de una suspensión acuosa de algas que contienen carragenina, ii)
tratamiento de la suspensión con álcali o con una mezcla enzimática, iii)
precipitación con alcohol y iv) purificación. Dependiendo de las aplicaciones
comerciales de la carragenina el contenido de material insoluble puede ser
más o menos importante, por ejemplo cuando el contenido de material
insoluble es alto el color se torna amarillo y las aplicaciones son limitadas.
60
La empresa Gelymar (PTC WO 02/057477) realizó ensayos de
extracción de carragenina con diferentes especies de algas entre las cuales
incluyen Hypnea spp, para las cuales aplicaron tratamientos de blanqueo
con soluciones de KCl a 30oC, con hipoclorito de sodio, peróxido de
hidrógeno, hipoclorito de calcio, dicloroisocianato de sodio, ácido bórico,
ozono, oxígeno y carbón activado, encontraron los mejores resultados con
hipoclorito de sodio al 10% y cortando las algas en pedazos de 5 cm2 . La
carragenina obtenida con este proceso tiene pH de 8,0, fuerza de gel 180
gcm-2, cenizas 33,3% y viscosidad de 73cP.
La misma compañía (PTC WO 02/057477), (PTC WO 01/82724)
mostró desarrollos de tratamientos enzimáticos que remueven celulosa y
hemicelulosa usando mezclas de xylanasas/ celulasas logrando
rendimientos del 85% de carragenina en especies como Gigartina
skottsbergii, Eucheuma spinosum, Chondrus crispus, etc. Los
experimentos se realizaron con especies de las cuales se extrae iota
carragenina mostrando también altos rendimientos.
En la patente PTC WO 03/059956, se describen los diferentes
procedimientos para optimizar la extracción de carragenina usando
soluciones alcalinas como: NaOH, KOH, Na2CO3, Fosfatos de sodio, K2CO3
fosfatos de amonio, variando las condiciones de concentración del álcali,
temperatura y tiempo de tratamiento, para obtener la carragenina con los
mayores valores de viscosidad. Los ensayos se realizaron sobre E. Cottonii,
la carragenina con mejor viscosidad (100cp), se obtuvo cuando no se
usaron sales de sodio y para niveles bajos de potasio suministrado como
KOH a temperaturas cercanas a 90oC.
Michel y colaboradores en (1997) estudiaron las propiedades
fisicoquímicas de los geles de carragenina en presencia de varios cationes
61
monovalentes y divalentes a diferentes concentraciones y encontraron que
la kappa carragenina gelifica más rápidamente con KCl que con CaCl2
La carragenina extraída del alga Hypnea musciformis fue analizada
usando carragenasas y espectroscopia RMN de C13, se publicaron los
espectros característicos de la к carragenina (Greer, 1993, Yu, G. y
colaboradores, 2002), de igual manera se reportó el uso de FTIR (infrarrojo
con trasformada de Fourirer), para identificar el hidrocoloide (Sekkal, 1998).
También se han realizado ensayos de cuantificación de kappa carragenina
con espectros de resonancia magnética nuclear. (Tojo.y Prado, 2003).
En Tanzania se realizaron estudios comparativos de la extracción de к
carragenina a partir de Hypnea y K. alvarezii con el método de extracción
desarrollado en la Universidad de Dar es Salaam Tanzania, por Semesi en
1977, los resultados obtenidos son bastantes promisorios para Hypnea, con
fuerzas de gel que pueden llegar hasta 243.06 g/cm2. ( Mtolera, 2004).
En el año 2006 se patentaron los métodos de preparación de
mezclas Kappa carragenina–pectina, se obtuvieron fuerzas de gel entre 1
y 8 Kg/cm2, con bajas viscosidades, cuando está mezcla se adicionó a
productos alimenticios al 10 ó 20% de porcentaje en peso, las condiciones
de textura de los alimentos mejoraron notablemente. ( PTC WO 02/005658).
En el año 2006 se publicó la patente No PTC WO 2006/062792,
donde se describen los nuevos métodos para la obtención de hidrocoloides,
entre los que figuran Kappa carragenina, la innovación permite obtener
carragenina incolora y sin olor, conservando las propiedades de viscosidad y
fuerza de gel.
Los polisacáridos sulfatados se están usando recientemente como
bloqueadores del HIV-1; en la patente PTC WO 037093322 , no solamente
62
se discute el efecto de kappa carragenina y sus derivados en diferentes
infecciones causadas por le HIV-1, sino que muestra un protocolo de
extracción de carragenina grado farmacéutico, que consta de los mismos
pasos estudiados en las patentes anteriores, decoloración, cocción en álcali
por una hora, precipitación con etanol absoluto, purificación por enfriamiento
y secado.
La extracción de kappa carragenina se encuentra descrita en la
patente PTC WO 0182724 , allí se presenta un método para la obtención de
carragenina tipo farmacéutico y su uso como portador de flavonoides y
vitaminas en alimentos, la metodología se divide en clarificación,
tratamiento alcalino, precipitación y purificación por enfriamiento.
63
2. Materiales y métodos 2.1. Reactivos y Equipos Reactivos Carbón activado, marca Merck área BET mínima 80m2/g, densidad
específica: de 1,8 a 2,1, tamaño de poro 150 mµ.
Acido Clorhídrico Merck
Hidróxido de sodio Merck
Cloruro de potasio Merck
Hipoclorito de sodio Merck
Etanol Absoluto Merck
Etanol al 96% Merck
Equipos Absorción atómica: Perkin Elmer modelo 3100
Texturometro: Stable Micro systems TA-XT2i
Potenciómetro: Hanna
Condutivimetro: Hanna
2.2. Muestreo La selección del lugar de muestreo se hizo teniendo en cuenta los
estudios presentados por Márquez ( 1982), quien reportó que para el caso
de Neguanje, Punta la Loma y la playa del Aeropuerto de la Bahía de
Santa Marta las coberturas de Hypnea a lo largo de todo el año, tienen
promedios mensuales entre 5 y 80% de biomasa. De estos lugares se
seleccionó la playa adyacente al Aeropuerto de Santa Marta porque tiene
un fácil acceso, muestra explosiones de abundancia de Hypnea a finales del
año con valores máximos para los meses de agosto, noviembre y diciembre
(Márquez 1982), y no se requieren permisos de las autoridades para tomar
las muestras ya que la zona no está dentro del sistema de Parques
Nacionales.
64
En los meses de Agosto y Septiembre de 2005 hubo afluencia de
Hypnea musciformis sobre las playas del Cabo de la Vela, corregimiento
del departamento de la Guajira, evento que se aprovechó para hacer la
recolección de muestra, con la intención de obtener resultados diferentes
en estas dos áreas del Caribe, que se caracterizan porque están dominadas
por dos fenómenos oceanográficos opuestos de gran importancia sobre la
producción marina, el sector del Cabo de la Vela distinguido por una corriente
de surgencia (upwelling) y el sector de Santa Marta determinado por una
corriente de mar afuera (outwelling), así como por su vecindad con la
desembocadura del río Magdalena, fenómenos que producen efectos sobre
la temperatura, salinidad y concentración de nutrientes en los cuerpos de
agua donde se encuentra el alga de estudio.
Para la recolección de muestras se usó el método de línea de
transectos (Sutherland, 1996), que consiste en muestrear a intervalos
regulares de distancia a lo largo de una línea recta, esta línea puede ser
correlacionada con gradientes de factores ambientales, en la playa del
Aeropuerto al trazar la línea recta se observó que cerca de la rocas había
una mayor concentración de algas por lo tanto se muestrearon todos los
puntos ( Figura No 14).
3.2.1 Muestreo en la bahía de Santa Marta El muestreo se llevó a cabo el 21 de Agosto de 2005 a las 8 A.M., en
la zona costera de la playa adyacente al Aeropuerto Simón Bolívar de la
ciudad de Santa Marta, longitud 74º12״34.15 ׳ W; latitud 11º8״48.3 ׳ N (ver
figuras No 15 y16), en el infralitoral en un hábitat rocoso, en compañía de
un biólogo marino de la Universidad Jorge Tadeo Lozano, sede Santa Marta,
quien identificó el alga, e hizo la recolección buceando desde 50 cm hasta
2 m de profundidad, a lo largo de 500 m de costa, se tomaron cerca de 2 Kg
de Hypnea musciformis removiéndola con la mano y verificando que toda
tenía la misma condición de desarrollo.
65
Se tomaron las unidades experimentales en los sitios
demarcados por una X en al figura No 14, que son todos los lugares de la
playa donde se encontraba creciendo de manera natural Hypnea
musciformis. Figura No 14. Área de muestreo en la playa Adyacente al aeropuerto Simón
Bolívar. Las áreas verdes son zonas sumergidas, sobre las que se encuentran
depósitos algales
66
Figura No 15. Lugar de muestreo, playa Aeropuerto Simón Bolivar
Figura No 16 Ubicación de la Playa de muestreo, bahía de Santa Marta
La muestra de Hypnea se lavó varias veces con agua para limpiarla
de macroinvertebrados, epifitos, sedimentos, se enjuagó brevemente con
agua dulce para remover las sales, después se secó al sol, se empacó
cuidadosamente en bolsas de plástico y luego de papel.
67
Cerca al bentos justo encima de las algas, después de la recolección,
se midió la temperatura, se tomó un litro de agua, se colocó en una nevera
oscura en hielo y se trasladó a la Universidad donde se filtró a través de un
filtro Wathman número 44; las muestras se empacaron en hielo en una
nevera.
Tanto las muestras de Hypnea como el agua recolectada se
trasportaron a Bogotá en avión. Una vez en Bogotá se realizó el análisis de
agua. Las muestras de material vegetal se secaron a 25oC en una corriente
aire, durante 48 horas y luego se almacenaron en un lugar fresco y seco.
A esta muestra se le llamará en el texto: Hypnea Santa Marta
3.2.2 Muestreo en el Cabo de la Vela –Guajira- El muestreo se llevo a cabo el 30 de Agosto de 2005 a las 8 A.M. en
la zona costera del corregimiento del cabo de la Vela, longitud 72º8״54.15 ׳
W y latitud 12º11״36.27׳N (Figura No 17), en el infralitoral en un hábitat
arenoso, en compañía de un biólogo marino, quien identificó el alga, e hizo
la recolección a lo largo de 500 m de costa; se tomaron cerca de 2 Kg de
Hypnea musciformis removiéndola con la mano.
Para tomar una muestra representativa se recolectaron las algas
depositadas sobre la playa en línea recta cada 100 metros, hasta cubrir 500
metros de playa (Sutherland, 1996). A esta muestra se le denominara, en el
texto Hypnea Guajira
68
Figura No 17 Ubicación de la playa de muestreo en el Cabo de la Vela Guajira.
La muestra de la especie Kappaphycus alvarezii, (especie exótica)
fue donada por el señor Raúl Rincones y se utilizó para comparar los
resultados del método empleado para Hypnea. Kappaphycus alvarezii es
una especie reconocida a nivel mundial como productora industrial de Kappa
carragenina (Muñoz et al, 2004, Zuccarello et al, 2006)
2.3. Ensayos Experimentales 3.3.1 Análisis de aguas
El análisis de agua de las muestras recogidas en Santa Marta se
realizó de acuerdo con los métodos reportados la en la tabla No 6
Tabla No 6 Métodos AOAC utilizados en el análisis de aguas.
Determinación Métodos
Conductividad 973.40 A.O.A.C.
pH 973.41. A.O.A.C.
Amonio 973.49 A.O.A.C.
Nitratos 973.50 A.O.A.C.
Nitritos 973.76 A.O.A.C.
Fosfatos 973.55 A.O.A.C.
69
3.3.2 Muestras de algas Las muestras tomadas en Santa Marta se encontraban asociadas con
especies como Chaetomorpha sp, corallina, Caulerpa mexicana y
Dyctiota sp y aunque se limpiaron de estas epifitas en el momento de la
recolección, al llegar a Bogotá se revisaron nuevamente las algas al
estereoscopio para retirar algunos residuos animales y vegetales y así
asegurar la limpieza de la muestra.
La muestra de Hypnea proveniente del cabo de la Vela se sometió a
procesos de lavado hasta retirar el máximo posible de impurezas, utilizando
un estereoscopio para observar el proceso. De igual manera se revisó la
muestra de Kappaphycus alvarezii
A continuación se secaron todas las muestras en un flujo de aire
caliente por 48 horas a 25oC, hasta peso constante y se guardaron en un
desecador.
3.3.3. Extracción y purificación de carragenina El proceso de obtención de carragenina contempla cuatro fases que
son: decoloración, extracción, precipitación y secado. Las figuras No 18, 19
20 y 21 representan los ensayos experimentales completos que se
realizaron para cada proceso.
3.3.3.1 Decoloración Se estudiaron Cuatro métodos para decolorar las muestras de
Hypnea y de Kappaphycus alvarezii: Método de peróxido de hidrógeno al
4% ( PTC WO 02/057477), por absorción de los pigmentos sobre carbón
activado (PTC WO.02/057477), utilizando largos períodos de hidratación y
por acción del hipoclorito de sodio (PTC WO 02/057477, PTC WO
2006/062792)
70
3.3.3.1.1 Método de peroxido de hidrógeno Se pesaron 2,000g de alga seca de las dos especies estudiadas, se
hidrataron durante 12horas con 400ml de agua destilada cada una, luego de
lavarlas cuidadosamente se adicionaron 10 ml peróxido de hidrogeno al 4%
(PTC WO 02/057477), se dejó actuar durante períodos de tiempo de 5, 10,
15 minutos, se lavaron nuevamente con abundante agua destilada, se ajustó
el pH a 8,4 y se realizó la extracción de carragenina, tal y como se muestra
en el diagrama de flujo de la figura No 18, Este ensayo se repitió
aumentando la concentración de peróxido al 8%. Todos los experimentos se
realizaron por triplicado para cada especie.
71
72
E ALCOHOL
PURIFICACION POR CONGELAMIENTO
No3-
No2-
PO4-3
NH4+
pH
ConductividadMUESTREO ANALISIS DE AGUA
LAVADO
SECADO A LA SOMBRA
TRANSPORTE
ALGAS
HIDRATACION
DECOLORACION CON H O (10 ml) 2 2
LAVADO
AJUSTE DE pH (8,4 con NaOH1N)
EXTRACCION A EBULLICION (4HORAS)
MEZCLADO LICUADORA
FILTRADO GRUESO RESIDUO
PRECIPITACIÓN EN ALCOHOL
FILTRACIÓN FINARECUPERACION
PROPIEDADES FISICOQUÍMICA :
Absorción atómicCenizasProteína
S
a
D
AJUSTE DE pH
SECADO EN AIRE CALIENTE (40 C)o
Figura No 18. Diagrama de Flujo que muestra la extracción de carragenina usando peróxido de hidrógeno para retirar el color.
3.3.3.1.2 Método de Carbón activado Una vez extraída la carragenina de las dos especies de algas
ajustando el pH a 8,4 y en el proceso final de separación por filtración al
vacío, el gel se hizo pasar por un filtro que contenía 2g de carbón activado
(PTC WO.02/057477), con el propósito de retirar los pigmentos que dan
color a la carragenina., este procedimiento se encuentra descrito en el
diagrama de flujo de la figura No 19.
El carbón activado seleccionado tenía un área superficial de 80 m2/g
y un tamaño de poro de 150mµ, que se usa para retención de pigmentos
como los carotenos y el azul de metileno.
El procedimiento se realizó por triplicado para las dos muestras de
Hynea y para la muestra de Kappaphycus alvarezii.
73
MUESTREO ANALISIS DE AGUA
LAVADO
SECADO A LA SOMBRA
TRANSPORTE
ALGAS
HIDRATACION
LAVADO
AJUSTE DE pH (8,4 con NaOH1N)
EXTRACCION A EBULLICION (4HORAS)
MEZCLADO LICUADORA
FILTRADO GRUESO RESIDUO
AJUSTE DE pH
PRECIPITACIÓN EN ALCOHOL
FILTRACIÓN FINA CON CARBON ACTIVADORECUPERACION DE ALCOHOL
PURIFICACION POR CONGELAMIENTO
No3-
No2-
PO4-3
NH4+
pH
Conductividad
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS:Absorción atómica
CenizasProteína
SECADO EN AIRE CALIENTE (40 C)o
Figura No 19. Diagrama de Flujo que muestra la extracción de kappa
carragenina usando Carbón activado para retirar el color, después de la extracción.
74
3.3.3.1.3 Decoloración con largos períodos de hidratación En los ensayos preliminares se observó que al aumentar el tiempo de
hidratación de las algas se decoloraban, de acuerdo con este resultado se
estudió la extracción de carragenina hidratando las algas en períodos de 12,
24, 36 y 72 horas, como se indica en el diagrama de flujo de la figura No 20;
al final de la extracción se usó hipoclorito de sodio para aclarar la
carragenina obtenida. Para cada especie se realizaron ensayos por
triplicado.
75
MUESTREO ANALISIS DE AGUA
LAVADO
SECADO A LA SOMBRA
TRANSPORTE
ALGAS
HIDRATACION POR 72 HORAS
LAVADO
AJUSTE DE pH (8,4 con NaOH1N)
EXTRACCION A EBULLICION (4HORAS)
MEZCLADO LICUADORA
FILTRADO GRUESO
DECOLORACION CON NaClO al 5 / (5 ml) oo
RESIDUO
AJUSTE DE pH
PRECIPITACIÓN EN ALCOHOL
FILTRACIÓN FINARECUPERACION DE ALCOHOL
PURIFICACION POR CONGELAMIENTO
No3-
No2-
PO4-3
NH4+
pH
Conductividad
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS:Absorción atómica
CenizasProteína
SECADO EN AIRE CALIENTE (40 C)o
Figura No 20. Diagrama de Flujo que muestra la extracción de kappa
carragenina usando largos períodos de hidratación para retirar el color, antes de la extracción.
76
3.3.3.1.4 Método del Hipoclorito de Sodio Se pesaron 2,000g de algas secas, de cada una de las especies se
adicionaron 400 ml de agua destilada, para hidratarlas durante doce horas,
luego se lavaron y se sumergieron en 400ml de agua que contenía 10 ml
de una solución de hipoclorito de sodio al 5% por periodos de tiempo que
variaron entre cinco y quince minutos, se filtró, y el residuo se lavó con
abundante agua destilada, se ajustó a pH 8,4 con HCl 1N y se dejó lista
para iniciar el proceso de extracción, tal y como se presenta en la figura No
21. Los ensayos se realizaron por triplicado para cada especie.
Teniendo en cuenta las experiencias reportadas por el grupo de
investigación de la Universidad Javeriana en la obtención de agar (Montilla y
colaboradores, 2005) donde se trataba la muestra con hipoclorito antes y
después de la extracción, se hizo un procedimiento de blanqueo al final de
la extracción; la carragenina se trató con solución de hipoclorito de sodio al
5% , durante períodos de tiempo que variaron de cinco a diez minutos En la
figura No 21 se aprecia el procedimiento para la obtención de carragenina
usando hipoclorito de sodio para decolorar las algas antes de la extracción y
tratando la carragenina después de la extracción con hipoclorito de sodio.
77
MUESTREO ANALISIS DE AGUA
LAVADO
SECADO A LA SOMBRA
TRANSPORTE
ALGAS
HIDRATACION
DECOLORACION CON NaClO al 5% (10 ml)
LAVADO
AJUSTE DE pH (8,4 con NaOH1N)
EXTRACCION A EBULLICION (4HORAS)
MEZCLADO LICUADORA
FILTRADO GRUESO
DECOLORACION CON NaClO al 5 / (5 ml) oo
RESIDUO
AJUSTE DE pH
PRECIPITACIÓN EN ALCOHOL
FILTRACIÓN FINARECUPERACION DE ALCOHOL
PURIFICACION POR CONGELAMIENTO
Absorción atómica (metales pesados)Determinación de cenizasPunto de gelificaciónPunto de fusiónEspectro InfrarrojoPerfil de texturaDeterminación de pHDeterminación de humedadProteínaAlmidón
No3-
No2-
PO4-3
NH4+
pH
Conductividad
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS:Absorción atómica
CenizasProteína
SECADO EN AIRE CALIENTE (40 C)o
DETERMINACIÓN DE PROPIEDADES FISICOQUIMICAS
Figura No 21. Diagrama de Flujo que muestra la extracción de carragenina usando hipoclorito de sodio para retirar el color, antes y después de la extracción.
78
3.3.3.2 Extracción de carragenina El Procedimiento elegido para la extracción de carragenina es una
modificación de los métodos reportados por Mtolera and Buriyo (2004),
Muñoz et al (2004), Matsuhiro (1995) y Villanueva (2003), obtenido a raíz de
los ensayos preliminares de decoloración. Se pesaron en una balanza
analítica exactamente dos gramos de alga seca, se adicionaron 300 ml de
agua destilada, se mantuvo húmeda la muestra durante doce horas, a
temperatura ambiente, luego se agregaron 10 ml de hipoclorito de sodio al
5% y se dejó decolorar la muestra por quince minutos, al cabo de los cuales
el alga presentó una coloración amarillo claro, casi blanco, a continuación se
lavó con abundante agua destilada redisolviendo en 300ml de agua
destilada, se ajustó el pH de extracción con unas gotas HCl 1N agitando
fuertemente. Después se calentó a ebullición durante cuatro horas
controlando el pH por adiciones sucesivas de NaOH 1N y agitando
continuamente, posteriormente se licuó en caliente por un minuto, se filtró a
través de una malla de nylon, diseñada especialmente para este
experimento, manteniendo la temperatura por encima de 70oC , se adicionó
una porción de 5ml de hipoclorito de sodio al 5%, se dejó actuar durante
cinco minutos, se ajustó el pH con HCl 1N en caliente.
Los valores de pH se ajustaron a 8,0 , 8.4 , 8.6, 9.0 y 10 en cada uno
de los experimentos, estos valores fueron seleccionados de acuerdo con
los reportados en la literatura (Stanley, 1987; Muñoz et al (2004); Mtolera
and Buriyo (2004); Villanueva et al (2003), PTC (WO 02/057477 ).
3.3.3.3 Precipitación La carragenina se precipitó por adición lenta de 300 ml de alcohol
etílico al 95%, una vez el gel endureció se filtró a través de la malla de nylon
y se recogió en cajas de petri. (Mtolera and Buriyo (2004), Muñoz et al
(2004), Matsuhiro (1995) y Villanueva (2003)) La kappa carragenina
obtenida se purificó utilizando el método de congelación a 4oC,
79
descongelación reportado por (Montilla y colaboradores, 2005), para todos
los procedimientos.
3.3.3.4 Secado
Finalmente algunas muestras fueron liofilizadas y otras se secaron a
30oC en un flujo de aire caliente por 12 horas hasta peso constante,
posteriormente se calculó el rendimiento
Este método se utilizó para la especie Kappaphycus alvarezii y para
las muestras de Hypnea recolectadas en Santa Marta y el Cabo de la Vela
3.3.4. Determinación de las propiedades fisicoquímicas Las propiedades fisicoquímicas para caracterizar el gel fueron
seleccionadas de tal manera que la kappa carragenina pueda ser evaluada
según los criterios de la JECFA para ser usado como aditivo en alimentos y
para que pueda ser usada como gel hidroretenedor en agricultura.
Las propiedades fisicoquímicas, punto de fusión y punto de gelificación
se determinaron para las muestras de κ carragenina obtenidas en cada uno
de los 45 ensayos de pH con las diferentes fracciones de Hypnea y
Kappaphycus alvarezii. Con el propósito de controlar y comparar los
valores obtenidos se uso κ carragenina comercial en cada en ensayo.
Para la determinación de las propiedades que dependen del proceso
de gelificación se ensayaron dos concentraciones de KCl para la
preparación del gel , una al 0.5 %p/v de KCl en agua destilada y otra al 1.5%
p/v de KCl en agua destilada, ( Mtolera 2004, ),( Stanley, 1987),(Barboroux,
1984).
80
Los geles de κ carragenina se prepararon al 1.5 %P/v, pesando en
una balanza analítica exactamente 0,3750 g de carragenina y completando a
volumen de 25 ml. (Mtolera and Buriyo, 2004).
3.3.4.1. Análisis de elementos pesados por Absorción atómica Las muestras de algas se prepararon por digestión vía seca, se
pesaron inicialmente cerca de tres gramos de muestra en una balanza
analítica, se quemaron en la llama directamente y luego se calcinaron a
550oC, durante doce horas, se enfriaron en un desecador, se determinó el
peso final y se calcularon las cenizas.
La muestra calcinada se trató con 10 ml de HCl de concentración 1:1
en agua, se calentó a ebullición con agua bidestilada, se filtro y se completo
a volumen de 50 ml, a continuación se leyeron los metales: sodio, potasio,
calcio, magnesio, hierro, manganeso, cobre y cinc en el equipo de Absorción
atómica Perkin Elmer modelo 3100.
El potasio se determinó porque, el contenido de este metal en el alga
y en la kappa carragenina influyen en la fuerza de gel del polisacárido, el
sodio se cuantificó porque forma parte de los reactivos de síntesis y puede
dar información sobre pureza del gel Los demás metales se cuantifican para
dar información sobre la composición de kappa carragenina que es útil en
caso de ser utilizado como gel hidroretenedor en plántulas (Hüttermann et al,
1999) y para explicar diferencias en el análisis de textura y la fuerza del gel
(Michel et al, 1997)
Para determinar contenido de metales en la carragenina extraída se
pesaron cerca de 0,5g de muestra y se calcinaron a 550oC durante 12 horas,
se enfriaron en un desecador durante doce horas, se determinó el peso final
y se calcularon las cenizas.
81
La muestra calcinada se trató con 10 ml de HCl de concentración 1:1
en agua, se calentó a ebullición con agua bidestilada, se filtro y se completo
a volumen de 50 ml, a continuación se leyeron los metales: Sodio, potasio,
calcio, magnesio, hierro, manganeso, cobre y cinc en el equipo de Absorción
atómica Perkin Elmer modelo 3100
3.3.4.2. Punto de Gelificación La determinación del punto de gelificación se realizó preparando 5ml
de suspensión de las soluciones de κ carragenina al 1.5% en KCl 1,5% en
un tubo de ensayo, luego se calentó en un baño María a 90oC hasta
disolución completa, a continuación se enfrió lentamente en un baño de agua
y con agitación constante, cuando gelificó y fue difícil seguir agitando se
midió la temperatura de gelificación. (Mtolera, 2004), (Baeza, 2003).
3.3.4.3. Punto de Fusión Sobre el gel obtenido en la determinación del punto de gelificación se
suspendió una perla de vidrio y se puso al baño maría, el agua se calentó
lentamente y se midió la temperatura de fusión cuando la perla de vidrio se
desplazo hasta el fondo del tubo. (Freile, 2002)
3.3.4.4. Espectros Infrarrojo Existen tres maneras diferentes de disponer las muestras de
polisacáridos para realizar estudios de espectroscopia I.R.: pastilla, película
o suspensión. Para este ensayo se eligió la técnica de preparación de
pastillas.
La κ carragenina previamente seca por liofilización, extraída a cada
uno de los pH de ensayo, se mezcló en un mortero con KBr en una
proporción cercana al 1% y se colocó en un pastillador donde se comprimió
adecuadamente, el material formó una pastilla del diámetro requerido para
tomar el espectro en el equipo. (Stortz,1995), (Chopin, et al 1999)
82
3.3.4.5. Análisis de textura del gel de carragenina Los ensayos de textura de gel se realizaron para las muestras de
carragenina obtenidas a valores de pH diferentes y provenientes de Hypnea
recolectada en Santa Marta, en el Cabo de la Vela y de la especie
Kappaphycus alvarezii. Adicionalmente el ensayo fue realizado para una
muestra de κ carragenina comercial.
Los geles se prepararon dispersando las muestras de κ carragenina
al 1.5% P/v en KCl de concentración 0.5% p/v. También se realizaron
ensayos dispersando la κ carragenina en KCl de concentración 1.5% p/v.
Las soluciones se llevaron hasta ebullición por algunos minutos, se
colocaron en las celdas de medida , se taparon con papel aluminio y se
dejaron en el refrigerador por 20 horas a 4oC. (Villanueva et al. 2004 ; Michel
et al. 1997 y Nickerson, 2005).
La determinación de la fuerza de gel se realizó de acuerdo con la
norma ISO 9665 /1998, que describe ensayos de fuerza sobre Adhesivos
(Coutr,2000; Baeza, 2003) en el equipo Stable Micro systems TA-XT2i, con
los siguientes parámetros :
Velocidad de pre-ensayo: 0.5 mm/s
Velocidad del ensayo: 0.5 mm/s
Velocidad de post-ensayo: 0.5 mm/s
Distancia: 4mm
Velocidad de adquisición de datos : 100pps
Celda: P/0.5R de 5Kg.
3.3.4.5 Determinación del pH El pH se midió usando un potenciómetro previamente calibrado,
colocando el electrodo en una suspensión 1: 100 en agua, a temperatura de
20oC.
83
3.3.4.6 Determinación de la humedad Se pesaron exactamente 0,50000g de muestra de κ carragenina, se
llevaron a la estufa a 105oC por dos horas, se retiraron, se colocaron en un
desecador, se pesaron y luego se llevaron nuevamente a la estufa hasta
peso constante. (JECFA, 2001)
3.3.4.7 Determinación de proteína La determinación de proteína se realizó por el método Kjeldahl para la
muestra de alga recolectada en Santa Marta y para la muestra de k
carragenina que se obtuvo de Hypnea musciformis a pH 8,6.
El método Kjeldahl se fundamenta en la conversión de nitrógeno total
presente en la muestra a sales de amonio, que se valoran posteriormente
por volumetría ácido-base, consta de de tres etapas, digestión, destilación
por arrastre del amoniaco y valoración.
En la variante Steyemark, (AOAC,973.48) el hidróxido de amonio se
recoge sobre ácido bórico no valorado y se titula directamente el borato de
amonio que se forma, con HCl estandarizado., las reacciones son:
Digestión:
Proteína(s) + H2SO4(l) + catalizador → CO2(g) + H2O(g) + NH4HSO4(ac)
Liberación de amoniaco NH3
NH4HSO4(ac) + 2NaOH(ac) → NH3(g) + Na2SO4(ac) + H2O(g)
Arrastre con vapor
NH3(g) + H2O(g) → NH4OH(ac)
Recolección
NH4OH(ac) + H3BO3(ac) → NH4H2BO3 + H2O
84
Titulación
NH4H2BO3 + HCl(ac) → NH4Cl(ac) + H3BO3
Una vez obtenido el valor de la titulación se calcula el contenido de
nitrógeno proteico. Esta determinación tiene como propósito obtener un valor
de contenido de proteína que está relacionado con el contenido de
carragenina en el alga, en el laboratorio de biotecnología de la Universidad
Javeriana, en ensayos para la extracción de agar se ha encontrado que a
mayores contenidos de proteína hay bajos porcentajes de polisacárido.
3.3.4.8 Determinación de la presencia de almidón Floridean. Para la determinación de almidón Floridean se realizó el siguiente
procedimiento ( Pedroza et al, 2006).
Preparación de la solución A ó solución de sales
Se Pesaron 0.936g de NaCl, 6.99g de KH2PO4 y 0.53g de
Na2HPO4.12H2O, se disolvieron todos los componentes en 50 ml de agua
destilada, se ajustó el pH a 5.2 con un potenciómetro.
Preparación de Solución B ó solución de Yodo
Se pesaron 2.2 g de KI y se disolvieron en 30 ml de agua destilada,
se pesó 1.g de I2 y se adicionó a la anterior solución se aforo a 50 ml de
con agua destilada
Preparación de la solución C
A 2 ml de la solución B se añadieron 20 g de KI, y se aforo a 500 ml
con agua destilada.
Prueba para la solución concentrada de carragenina
Se pesó 0.1 g de carragenina y disolvió en 20 ml de agua destilada,
se agregaron 50 ml de agua, se llevó por 1 minuto al horno microondas, se
adicionaron 10 ml de solución de sales (0.936 g NaCl, 6.99 KH2PO4, 0.56 g
Na2HPO4), finalmente se ajustó el pH a 5.6 y se aforó a 100 ml con agua
destilada .
85
A un mililitro de la solución anterior se le adicionó un mililitro de la
solución C y se esperó el desarrollo de color (rojo para floridean y azul para
almidón).
El almidón Floridean se determina porque es una impureza reconocida
en la carragenina, ya que es posible que sea insoluble en alcohol y precipite
con el polisacárido. (Yu S et al, 2002)
3.4 Diagrama general de los procedimientos En la figura No 22 se presenta un diagrama general del procedimiento
empleado para la extracción de kappa carragenina que contempla los pasos
de decoloración, extracción, purificación, secado y caracterización mediante
propiedades fisicoquímicas realizado a todas las muestras de carragenina,
en todos los tratamientos y para las dos especies de algas
3.5 Programa estadístico de soporte Para todos los ensayos se utilizó el Programa estadístico
Statgraphics Plus 5.1, el análisis ANOVA se corrió previa verificación de
normalidad e independencia.
3.6 Diseño Experimental
Se estudiaron simultáneamente los efectos de los factores pH de
extracción y procedencia de la muestra sobre: el rendimiento de κ
carragenina, el punto de fusión de la κ carragenina, el punto de gelificación
de la κ carragenina y la fuerza de gel, mediante un arreglo factorial con un
modelo de efectos fijos y un diseño completamente aleatorizado.
La variable de interés, pH de extracción tenía cinco niveles: 8.0, 8.4,
8.6, 9.0 y 10.
86
La variable de interés, procedencia de la muestra tenía tres niveles,
Hypnea recogida en la playa adyacente al aeropuerto de Santa Marta,
Hypnea recogida en una afluencia en el Cabo de la Vela y Kappaphycus
alvarezii una especie que se caracteriza por altos contenidos de κ
carragenina.
Cada experimento se realizó por triplicado, de tal manera que se
efectuaron 45 procedimientos de extracción que se pueden describir como
aparece en la tabla No 7.
Tabla No 7. Diseño experimental factorial de dos factores. En cada cuadro aparecerá la variable respuesta (ejemplo: % carragenina) obtenida para la
combinación pH- muestra
Factor: pH de extracción Factor:
muestra 8.0 8.4 8.6 9.0 10
Hypnea
Santa Marta
Hypnea
Guajira
Kappaphycus
alvarezii
Este mismo arreglo se efectúo utilizando como variables de respuesta
punto de fusión, luego punto de gelificación, fuerza de gel y las
determinaciones por absorción atómica.
La muestra fue aleatoria e independiente en cada experimento con
un nivel de confianza del 95%. Los datos fueron analizados mediante de
ensayos de normalidad y homogeneidad de varianza.
87
Figura No 22. Diagrama general del procedimiento para la extracción de kappa carragenina
MUESTREO ANALISIS DE AGUA
LAVADO
SECADO A LA SOMBRA
TRANSPORTE
ALGAS
HIDRATACION
DECOLORACION CON NaClO al 5% (10 ml)
LAVADO
AJUSTE DE pH (8,0/8,4/8,6/9,0/10 con NaOH1N)
EXTRACCION A EBULLICION (4HORAS)
MEZCLADO LICUADORA
FILTRADO GRUESO
DECOLORACION CON NaClO al 5 / (5 ml) oo
RESIDUO
AJUSTE DE pH ( 8,0/8,4/8,6/9,0/10 )
PRECIPITACIÓN EN ALCOHOL
FILTRACIÓN FINARECUPERACION DE ALCOHOL
PURIFICACION POR CONGELAMIENTO
Absorción atómica (metales pesados)Determinación de cenizasPunto de gelificaciónPunto de fusiónEspectro InfrarrojoPerfil de texturaDeterminación de pHDeterminación de humedadProteínaAlmidón
No3-
No2-
PO4-3
NH4+
pH
Conductividad
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS:Absorción atómica
CenizasProteína
SECADO EN AIRE CALIENTE (40 C)o
88
4 Resultados y análisis de resultados 4.1 Análisis de aguas
En Santa Marta se tomaron diez muestras de agua para el análisis, en
cada uno de los puntos señalados en la figura No.14 Los resultados
obtenidos se presentan en la tabla No 8, allí se aprecia que en todos los
puntos de muestreo el agua tiene la misma composición, lo que sugiere que
las algas recolectadas son una muestra representativa de la playa del
aeropuerto Simón Bolivar.
Tabla No 8. Análisis de aguas
Muestra No NO3- mg/L NO2
- mg/L PO4-3 mg/L NH4+ mg/L Conductividad
UPS pH
1 1 0,05 0,3 0,1 11,0 7,8 2 2 0,05 0,3 0,1 10,6 7,8 3 1 0,05 0,3 0,1 10,6 7,8 4 2 0,05 0,3 0,1 11,0 7,8 5 2 0,05 0,3 0,1 11,0 7,8 6 1 0,05 0,3 0,1 11,0 7,8 7 2 0,05 0,3 0,1 11,0 7,8 8 1 0,05 0,3 0,1 11,0 7,8 9 2 0,05 0,3 0,1 11,0 7,8 10 2 0,05 0,3 0,1 11,0 7,8
Promedio 1,6 10,9
Para las muestras tomadas en el Cabo de la Vela Guajira, no se
realizaron análisis de agua porque las algas provienen de lugares que
pueden estar mar adentro y el análisis del agua no correspondería a las
condiciones de crecimiento de la muestra.
4.2 Decoloración de la muestra de algas Las muestras de kappa carragenina de valor comercial deben tener
un color beige, amarillo claro casi blanco, (Villanueva et al, 2003), por esa
razón las algas rojas se deben someter a tratamientos físicos o químicos,
para retirar los pigmentos que naturalmente poseen y que se encuentran
89
descritos en el numeral 2.8.4, a este proceso se le conoce como
decoloración.
4.2.1 Decoloración con peróxido Las algas tratadas con peróxido de hidrógeno al 4% durante cinco
minutos mostraron un color verde claro, pero luego del procedimiento de
extracción, purificación y secado, la carragenina presentaba un color amarillo
verdoso, probablemente debido a residuos de clorofilas y carotenos que no
fueron afectados por el peroxido de hidrogeno, por lo tanto se realizaron
ensayos dejando actuar el peroxido de hidrogeno por períodos de hasta 15
minutos pero no se obtuvieron mejoras notables en el color del producto
final.
Se realizaron algunos ensayos aumentando la concentración de
peróxido de hidrógeno hasta el 8% pero no hubo mejoras significativas en el
color de la carragenina. El método de purificación por congelación,
descongelación no fue suficiente para obtener una carragenina de color
claro.
Este procedimiento presentó además, serios inconvenientes porque
la reacción de oxidación es muy espumosa, formando soluciones que son
difíciles de agitar, homogenizar y filtrar
La extracción de kappa carragenina se realizó a pH 8,4 de acuerdo
con el procedimiento que se muestra en la figura No 18, pero debido a que
el producto no era de un color claro como el esperado, no se le realizaron
ensayos fisicoquímicos de composición y pureza.
Los resultados obtenidos con el peroxido de hidrógeno fueron iguales
para las dos muestras de Hypnea y la muestra de Kappaphycus alvarezii.
90
4.2.2 Decoloración con carbón activado Los resultados obtenidos por la absorción de pigmentos sobre el
carbón activado, no fueron satisfactorios ya que, después de la filtración la
carragenina presentaba un tinte rosado, lo que indica que la adsorción de
ficoeritrinas no fue suficiente, además resultó ser un procedimiento muy
dificultoso porque la carragenina forma un gel que se filtra muy lentamente a
través del carbón.
Las experiencias se realizaron por triplicado para cada especie de
alga, pero no se encontró ninguna diferencia en el color de la carragenina
que pudiera ser atribuida a la especie.
4.2.3 Decoloración con largos períodos de hidratación Ensayos preliminares mostraron que al aumentar el tiempo de
hidratación se retiraban algunos pigmentos de las algas, por lo tanto se
ensayó el procedimiento mostrado en el diagrama de flujo No 20, en este
experimento la muestra se hidrató durante 24, 36, 48 y 72 horas, a
continuación se realizó la extracción de kappa carragenina por triplicado de
las dos especies de algas, a pH 8,4, solamente cuando se hidrató durante 72
horas se logró extraer algunas ficoeritrinas, pero la decoloración no fue
suficiente para obtener una carragenina clara. Por lo tanto a estas muestras
no se les realizaron pruebas fisicoquímicas.
4.2.4 Decoloración por tratamiento con hipoclorito de sodio A continuación se decidió utilizar un procedimiento químico para
decolorar las muestras de algas, el tratamiento con hipoclorito de sodio
como agente oxidante se muestra en la figura No 21, las muestras de
kappa carragenina presentaron un color más claro que el obtenido en todos
los tratamientos anteriores.
91
La reacción que describe el procedimiento de decoloración es:
NaClO + H2O → HClO + NaOH
Cuando el hipoclorito de sodio se coloca en agua se produce el ácido
hipocloroso HClO quien actúa como agente oxidante sobre cada uno de los
pigmentos que hay en las algas rojas, por ejemplo la reacción sobre los
dobles enlaces de las ficoeritrinas sería:
C=C + HClO + 5H2O → Cl- + 5H+ C(OH)-CH
Una vez realizada la extracción y antes de la precipitación se trató el
producto nuevamente con 5ml hipoclorito de sodio al 5% durante cinco
minutos, como se aprecia en el diagrama de flujo de la figura N 21, Los
resultados obtenidos mostraron una carragenina libre de pigmentos.
Los ensayos se realizaron por triplicado, para las dos especies de
algas y se obtuvieron resultados similares, se intentaron tratamientos más
fuertes con hipoclorito de sodio con concentraciones hasta del 8% como se
sugiere en la patente PTC WO 02/057477 ó con tiempos de reacción más
largos, pero no hubo cambios significativos en la apariencia de la kappa
carragenina. Como este polisacárido es sensible a los valores extremos de
pH (Yu, G, et al, 2002), se decidió decolorar a condiciones suaves, tiempos
cortos y concentraciones bajas de hipoclorito.
En la figura No 23 se presenta una comparación de los tratamientos
de decoloración, en la fotografía superior se muestra el color de kappa
carragenina, cuando fue tratada con peróxido, carbón activado o períodos de
hidratación largos, se asemeja a un plástico amarillo, que puede tener tintes
rojizos o verdes, estos colores no aseguran un aspecto agradable de kappa
carragenina para el mercado, aunque se someta a procesos de molienda.
92
Figura No 23. Muestras de kappa carragenina obtenidas con diferentes tratamientos de decoloración
Figura superior: Kappa carragenina tratada con peroxido y carbón activado para
decolorar
Figura inferior: kappa carragenina decolorada con hipoclorito de sodio
La fotografía inferior corresponde a kappa carragenina obtenida
usando hipoclorito de sodio para decolorar antes y después de la extracción.
Allí se aprecia un color más claro con aspecto más atractivo para el
comercio.
El aspecto final no depende de la especie de alga seleccionada para
la extracción, se obtuvo el mismo resultado para Hypnea que para
Kappaphycus.
93
Estos resultados permitieron seleccionar el método de hipoclorito de
sodio, mostrado en la figura No 21, para decolorar e iniciar los estudios de
extracción de kappa carragenina.
4.3 Extracción de kappa carragenina
Debido a que el polisacárido es sulfatado las mejores extracciones se
realizan a valores de pH superiores a 7, en la literatura se reportan
separaciones a valores de pH 8,4 y 9,0 con rendimientos que oscilan entre el
24% y el 37%, (PTC WO 02/057477; Mtolera y Buriyo, 2004).
Con el propósito de establecer el mejor pH para la extracción,
entendido como aquel en donde el rendimiento sea mayor, se seleccionaron
los valores de pH 8,0; 8,4; 8,6; 9,0 y 10, porque presentan niveles
superiores (10) e inferiores (8,0) a los reportados.
Como la decoloración se realizó con una solución hipoclorito de sodio,
el valor de pH de las algas era cercano a 10, así que, para retirar el
exceso de solución, se lavaron las muestras exhaustivamente con agua
destilada, antes iniciar el procedimiento de extracción.
Mtolera y Buyiro ( 2004) sugieren agregar 3g de NaOH sólido por
cada 20g de algas secas, licuar y calentar durante cuatro horas, con este
procedimiento obtienen rendimientos del 25%, pero no controlan el pH
durante la extracción. Yakovleva y colaboradores (2001), hicieron
extracciones a altas concentraciones de KCl en caliente, sin controlar el pH
y reportan rendimientos del 30%, Yu, G. y colaboradores (2002) utilizaron
procedimientos con NaOH y KCl simultáneamente a pH 9,0 con
rendimientos de 30%
94
Conociendo estos resultados y los reportes de Yu, G y colaboradores
(2002), que indican que el polisacárido se hidroliza a valores altos de pH, con
una perdida significativa de viscosidad, generando bajos puntos de
gelificación y bajas fuerzas de gel, se decidió hacer una modificación al
procedimiento, que no se encuentra reportada en la literatura, y que consiste
en realizar la extracción a punto de ebullición ajustando el pH con una
solución diluida de NaOH (1N ) y controlando los valores de pH durante las
cuatro horas de extracción. La figura 22 presenta el procedimiento
desarrollado en esta investigación para determinar la cantidad máxima de
carragenina que se puede obtener a partir de las dos especies de algas
rojas.
El tiempo y la temperatura usados en este procedimiento de extracción
se tomaron del protocolo propuesto por Mtolera y colaboradores (2004) y de
la patente PTC WO 02/057477, luego de cuatro horas de calentamiento se
obtuvo un gel de color amarillo claro, que se licuó y se filtró, el residuo,
generalmente tallos gruesos que no fueron atacados por el álcali, se
separaron. Para decolorar nuevamente el gel obtenido, se adicionó
hipoclorito de sodio, en las condiciones descritas en el procedimiento. Las
soluciones a cualquier pH y provenientes de cualquier especie de alga se
tornaron claras.
En la reacción que ocurre al tratar las algas con una solución alcalina
durante cuatro horas se retiran grupos sulfato y se forman los anillos de 3-6
anhidrogalactosa, que le dan las características fisicoquímicas de viscosidad
y fuerza del gel a la kappa carragenina.
95
4.4 Precipitación Se aprovechó que el polisacárido kappa carragenina es insoluble
en soluciones alcohólicas; para separarlo de la solución madre y debido a
que la propuesta metodológica está orientada a obtener un producto que
pueda ser utilizado en la industria alimenticia, se seleccionó etanol como
agente precipitante. En la literatura se reportan las mejores extracciones con
etanol absoluto, pero este sería un proceso costoso para la industria, por lo
tanto se utilizó etanol al 95%, como agente precipitante (Mtolera y
colaboradores (2004), JECFA (2001)).
Los resultados mostraron un precipitado de color claro, que
difícilmente se separa de la solución. Después de varios ensayos se
encontró que una precipitación en caliente con un enfriamiento lento
produce geles duros fáciles de filtrar, como el que se muestra en las figuras
No 24 y 25
Figura No 24. Precipitación de kappa carragenina con etanol al 95%
El método de purificación utilizado consistió en congelar la muestra a
4OC, durante seis horas y descongelarla, las impurezas solubles en agua
formaron una fase diferente que se separó del gel, después se filtró y se
obtuvo una carragenina como la que se presenta en la figura No 25, la foto
superior presenta un gel fuerte, homogéneo e incoloro y la foto inferior
permite apreciar de cerca la apariencia del gel.
96
Figura No 25. kappa Carragenina purificada y filtrada
Foto superior kappa carragenina recién filtrada. Foto inferior acercamiento para ver detalles
del gel.
4.5 Secado La muestra de kappa carragenina filtrada y purificada, se puede secar
en la estufa 30 o 40 oC, durante doce horas tal y como se reporta en la
literatura.(PTC WO 02/057477), los ensayos preliminares de secado
indicaron que en estas condiciones, se obtiene una carragenina con
97
aspecto plástico, difícil de triturar (figura No 26.b) y la acción del calor puede
oscurecer la muestra (figura No 26.a), aunque se utilice una estufa al vacío,
estos resultados llevaron a proponer dos nuevos métodos de secado para
la carragenina: liofilizado y secado con aíre forzado.
En ambos casos: liofilizado o secado con aire forzado, la carragenina
se obtuvo como un polvo de color claro que se deja moler y tamizar al
tamaño de partícula deseado. En la figura No 26 se aprecia una
comparación del aspecto de una carragenina obtenida utilizando liofilización
o secado con aire (26c), con una carragenina secada en estufa (26a)
Figura No 26. Aspecto que adquiere un gel de kappa carragenina de acuerdo con el método de secado
23.a 23.b 23.c
26a kappa Carragenina seca en estufa a 30oC durante 12 horas
26b. kappa Carragenina seca en estufa al vacío a 30oC durante doce horas
26c. kappa Carragenina liofilizada o seca en estufa de aire forzado.
Observando los resultados anteriores, se decidió utilizar la estufa de
aire forzado para el proceso de secado, ya que el equipo se encuentra
disponible en la Universidad. La liofilización es un procedimiento cotoso y de
difícil acceso, sobre todo en la industria, por esta razón solamente se
liofilizaron las muestras enviadas para realizar análisis infrarrojo.
98
4.6 Rendimiento de kappa carragenina
Una vez seca la carragenina hasta peso constante, se calcularon los
datos de rendimiento con base en el peso seco de alga. Las comparaciones
se realizaron sin olvidar que los orígenes de las muestras son diferentes,
pero se quiere dar un reporte de la cantidad de carragenina que se puede
extraer comercialmente de cada una de las muestras.
Los resultados obtenidos en la extracción de carragenina se muestran
en la tabla No 9, donde se aprecia en la columna 1 el nombre y la
procedencia de la muestra de alga y en el las demás columnas el
rendimiento de carragenina en porcentaje en peso obtenido a cada pH en
ensayos por triplicado. Tabla No 9. Carragenina obtenida en función de la especie y el pH.
% En peso seco de carragenina Muestra pH 8,0 8,4 8,6 9,0 10,0
14,97 20,00 44,97 40,38 23,07 15,18 21,09 47,27 38,75 24,05
Hypnea musciformis Santa Marta
12,00 20,05 47,46 39,05 24,25 11,41 27,68 82,04 72,86 60,00 12,05 29,03 81,94 70,00 61,50
Kappaphycus alvarezii 11,44 28,04 80,00 71,95 60,09
7,09 13,80 21,12 18,00 15,00 9,20 12,90 20,12 17,50 14,00
Hypnea musciformis Guajira
9,19 14,58 18,19 17,80 14,60
Para el análisis de resultados se utilizó una prueba ANOVA corrida al
95% de confianza, los resultados presentados en el Anexo estadístico No
7.2.1 muestran que hay normalidad en los residuales, por lo tanto la
muestra proviene de una población con distribución normal.
En las figuras No 27 y No 28, se aprecia que los factores especie y
pH tienen efectos sobre el rendimiento y que existe además interacción entre
Estos factores a pH 8,0. En el anexo estadístico 7.2.1, se muestra
que los mayores rendimientos promedio (49,23%) se obtuvieron a pH 8,6
99
para las dos especies, en los valores de pH 8,0 y 8,4 los rendimientos son
bajos 11,4 y 20,8% respectivamente, debido a la hidrólisis de polisacárido, a
valores de pH 9,0 y 10 se presentan rendimientos de 42 y 33%
respectivamente, que aunque se pueden considerar buenos, se obtiene
mejores rendimientos a pH 8,6
El análisis estadístico evidencia que las medias de los grupos por
especie y pH son homogéneas (ver intervalos LSD. Anexo 7.2.1) y
presentan diferencias estadísticamente significativas, así obtener
carragenina a partir de Hypnea recolectada en la Guajira da rendimientos
cercanos al 15%, mientras que de Hypnea recogida en Santa Marta da
rendimientos cercanos al 29% y la especie Kappaphycus se muestra
como la que provee mayor cantidad de carragenina a cualquier pH con
valores cercanos al 51%. Sin embrago la especie de interés es Hypnea por
que ella se encuentra de manera natural en las playas del Caribe
Colombiano.
Revisando los valores obtenidos en % de carragenina para Hypnea se
observa que se obtienen mejores resultados con la muestra adquirida en
Santa Marta (29%) que con la muestra recolectada en al Guajira ( 15%) a
cualquier pH, esto puede ser debido a que la muestra tomada en Santa
Marta estaba fresca y creciendo en su habitad natural, mientras que la
recolectada en la Guajira fue llevada a la playa por las corrientes marinas y
se desconoce el tiempo que permaneció sometida a procesos de
degradación natural.
Figura No 27 Resultados obtenidos en la extracción de carragenina por
especie
100
4.2 Purificación 4.3 Caracterización Física
Rendimiento de Carragenina en función de la especie
Especie
rend
imie
nto
pH88,48,6910
0
20
40
60
80
100
HYG HYS KP
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii .
Figura No 28 Resultados obtenidos en la extracción de carragenina por pH
La especie Kappaphycus alvarezii ha sido reconocida en el mundo
Rendimiento de Carragenina en función del pH de extracción
rend
imie
nto
EspecieHYGHYSKP
0
20
40
60
80
100
8 8,4 8,6 9 10
pH
La especie Kappaphycus alvarezii ha sido reconocida en el mundo
por su capacidad de producir carragenina (Yu. S et al ; 2002, Ask et al,
101
2002), por tal razón se usó como patrón de comparación en esta
investigación, sin embargo la figura No 28 muestra que esta especie es más
sensible a los cambios de pH en el procedimiento de extracción, el
porcentaje de carragenina obtenido pasa de 11,6 % a pH 8,0 a 81,3% a pH
8,6., mientras que la especie Hypnea exhibe cambios menos bruscos.
Mtolera y Buriyo (2004) reportan procedimientos de extracción de k
carragenina con rendimientos entre el 20 y el 35%, sin controlar el pH de
extracción, el protocolo aquí reportado da mejores resultados con
porcentajes de extracción hasta del 47% a pH 8,6, para Hypnea
musciformis.
El rendimiento obtenido para Hypnea con este protocolo es mejor
que el presentado por otros investigadores, Yakovleva y colaboradores
(2001) reportan hasta un 35,5% de k carragenina obtenida de Tichocarpus
crinitus.
4.7 Caracterización Fisicoquímica de la carragenina 4.7.1 Espectros Infrarrojo Con el propósito de verificar la calidad de la carragenina obtenida se
tomaron los espectros Infrarrojo de las muestras extraídas a cada uno de los
valores de pH . En la Figura No 30 se presenta el espectro I.R. para una
muestra de carragenina obtenida a pH 8,6 de la especie Hypnea recolectada
en Santa Marta, allí se aprecia una señal en 1267 cm-1 que corresponde a
la tensión de la unión C-O-S indicando la presencia del enlace ester sulfato
( ver figura No 29 ), la señal en 928 cm-1 se asigna a la tensión del enlace
de 3,6 anhidrogalactosa, (figura No 25); la señal en 848 cm-1 indica la
presencia de galactosa 4 – sulfato. ( Sekkal et al 1993). La ausencia de una
banda ancha centrada en 830cm1 que corresponde a la galactosa- 2 sulfato
indica que el polisacárido no es lambda carragenina, de igual manera la
102
ausencia de la señal fuerte en 805cm-1, correspondiente al enlace 3-6
anhidrogalactosa -2 sulfato indicó que la muestra no es iota carragenina.
(Matsuhiro y Miller, 2002), Estos resultados permitieron confirmar que el
producto obtenido era mayoritariamente Kappa carragenina. El análisis
infrarrojo coincide con los estudios reportados por Villanueva y
colaboradores, (2003) , Watt y colaboradores, (2003) y Chopin y
colaboradores (1999)
Figura No 29 Dimero de la estructura básica de la kappa carragenina
103
104
4.7.2 Punto de gelificación Los puntos de gelificación se muestran en la tabla No 10 del Anexo y
en la figura No 31; para el estudio de los datos se realizó un análisis ANOVA
al 95% de confianza que se puede ver en el anexo estadístico (7.2.2).
Los resultados estadísticos muestran que hay incidencia del pH en el
punto de gelificación, así en la figura No 31 se observa que los valores de
punto de gelificación son bajos a pH 8,0, (33,3oC), a pH 9,0 (33,4oC) y a pH
10 (32,5oC) y altos a pH 8,6 (37,6oC) y pH 8,4 (36,1 oC)
Figura No 31 Estudio del punto de gelificación en función de la especie
Figura No 4. Los HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
Punto de gelificación vs Especie
Especie
Pun
to d
e G
elifi
c
35
ació
n (o
C)
pH88,48,6910
31
33
37
39
HyG HyS KP
HyG Muestra de Hypnea recolecta en la Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
El estudio muestra, también, que el punto de gelificación no depende
de la especie y que no hay interacción entre los factores pH y especie .
105
La Figura No 32 ilustra que no hay diferencias en el punto de gelificacción
que estén determinadas por la especie de donde se ha extraído la
carragenina
Un procedimiento de Duncan de comparaciones múltiples, que puede
ser consultado en el anexo estadístico 7.2.2, revela que no hay diferencias
significativas entre los valores de puntos de gelificación para valores de pH
8,0 (33,3oC) y 9,0 ( 33,4 oC), es decir que estos datos forman un grupo
homogéneo, de igual manera no hay diferencias entre valores de pH 8,0
(33,3 oC) y 10,0 (32,5 oC) ni entre valores de pH 9,0 (33,4 oC) y 10,0 (32,5 oC),
esto significa que a valores de pH altos y bajos la carragenina extraída tiene
puntos de gelificación bajos, probablemente debido a la fracción hidrolizada
por el efecto del pH.
Figura No 32. Estudio de los puntos de gelificación en función del pH
En estos datos se aprecia que el pH de extracción de la carragenina no
afecta significativamente el valor del punto de gelificación, pero es este
punto es dependiente de la especie, así Hypnea recolectada en Santa Marta
presenta los mayores puntos de gelificación a 37,9oC mientras que Hypnea
Punto de gelificación vs pH
pH
o
31Pun
t d
e G
elifi
caci
ón (o
C)
ESpecieHyGHySKP
33
35
37
39
8 8.4 8,6 9 10
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
106
Pero es importante recordar que la metodología en la determinación
del punto de gelificación puede estar afectando los resultados, ya que la
técnica presentó muchos inconvenientes cuando se realizaron las lecturas
justamente a los pH bajos (8,0) y altos (9,0 y 10,0), es probable que estos
valores sean menores a los registrados y que se requiera de otro estudio,
para encontrar los puntos de gelificación, con mayor precisión, de las
carrageninas obtenidas a pH altos y bajos. Sin embargo como los mejores
rendimientos se obtuvieron a pH 8,6 sólo se tendrá en cuenta este punto de
gelificación para compararlo con los resultados reportados en la literatura.
Mtolera y Buriyo (2004), reportan puntos de gelificación entre 50,50 oC
y 58,75oC para carrageninas extraídas a partir de Hypnea musciformis
recolectada en la Bahía Oyster, pero no reportan pH de extracción; los
valores de punto de gelificación son muy superiores a los obtenidos en este
ensayo, sin embargo Stanley (1987 ) reporta puntos de gelificación para
carrageninas entre 15 y 65oC, para muestras preparadas en KCl al 1%. La
variación en el punto de gelificación se puede asignar al contenido de 3,6
anhidrogalactosa en la carragenina, así puntos de gelificación bajos se
atribuyen a bajos contenidos de 3-6 anhidrogalactosa, pero, si bien es cierto
que un tratamiento alcalino promueve la formación de este anhídrido,
también se propician reacciones de hidrólisis que disminuyen el punto de
gelificación, para dilucidar mejor este efecto se realizaron ensayos de fuerza
de gel que se explicarán más adelante. 4.7.3 Punto de fusión
En el Anexo de tablas, en la tabla No 11 se describen los puntos de
fusión de la carragenina, en ella se aprecian las casillas correspondientes a
los valores de pH 10 vacías, porque experimentalmente no fue posible
determinar el punto de fusión, ya que estas muestras a pesar de gelificar no
resistían el peso de la esfera de cristal que se usa para determinar el punto
de fusión.
107
El análisis de ANOVA se realizó obviando el pH 10 y los resultados se
presentan en el anexo estadístico 7.2.3, este estudio realizado con el 95%
de confianza manifiesta que el punto de fusión depende del pH al que se
extrae la muestra y depende de la especie seleccionada para el estudio, pero
no se advierte una interacción entre la especie y el pH, lo que significa que
cada factor incide de manera independiente sobre los resultados del punto de
fusión. Los valores medios más altos para el punto de fusión se encuentran
para Hypnea musciformis recolectada en Santa Marta ( 63,16oC) y los más
bajos para Hypnea musciformis recolectada en la Guajira ( 48,33oC). En la
figura No 33 se aprecia además que la especie Kappaphycus alvarezii
tiene valores de punto de fusión superiores ( 57,91oC) a Hypnea Guajira
pero inferiores a Hypnea Santa Marta.
Figura No 33. Estudio de puntos de fusión de kappa carragenina en función del pH.
En la figura No 7 se aprecia que los valores más altos de punto de fusión se
encuentran a pH 8,4 y los valores más bajos se ubican valores de pH 9,0 y
8,0, es decir en los extremos tal y como se registró en los puntos de
gelificación.
Punto de Fusión vs pH
pH
Pun
t
46
o de
Fus
ón o
C
ESPECIEHyGHySKP
50
54
58
62
66
8 8,4 8,6 9
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
108
Figura No 34 Estudio de puntos de fusión de kappa carragenina en función
de la especie.
Punto de Fusión vs Especie
ESPECIE
Pun
to d
e Fu
són
oC
pH88,48,69
46
50
54
58
62
66
HyG HyS KP
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
El contraste múltiple de rangos presentado en el anexo estadístico
7.2.3 manifiesta que los grupos de datos conformados por las especies
Hypnea musciformis Guajira y Kappaphycus alvarezii tienen un grupo de
medias entre las cuales no hay diferencias estadísticamente significativas,
mientras que las parejas de medias de Hypnea musciformis Santa Marta y
Kappaphycus alvarezii e Hypnea musciformis Guajira con Hypnea
musciformis Santa Marta, si tienen diferencias en las medias que son
estadísticamente significativas.
Los valores de punto de fusión para k carragenina, extraída de
Hypnea musciformis, reportados por Mtolera y Buyiro (2004) están entre
los 68 y 69oC, estos resultados son cercanos a los determinados para la
109
muestras obtenidas a pH 8,4 de Hypnea musciformis Santa Marta,
(64,7oC).
Stanley (1987 ) reporta puntos de fusión entre 55 y 85 oC para
muestras de carragenina obtenida a partir de Kappaphycus alvarezii, los
resultados de este ensayo coinciden con la literatura, porque como se
muestra en la figura No 34 a pH 8,4 la carragenina extraída de
Kappaphycus alvarezii tiene punto de fusión de 62.3oC.
La variación en los puntos de fusión se debe a la diferencia en el
contenido de 3-6 anhidrogalactosa, así altos puntos de fusión sugieren
mayores contenidos de 3-6 anhidrogalactosa, que se obtienen gracias a la
extracción alcalina realizada, es por eso que a pH bajos el punto de fusión
es menor.
La influencia del factor especie en el punto de fusión se puede explicar
debido a que el contenido de 3-6 anhidrogalactosa formado en el alga,
depende de las condiciones de crecimiento y de condiciones climáticas.
Según Yaphe (1998) el polisacárido en la pared celular de las algas se forma
en mayor cantidad y con mayor contenido de 3-6 anhidrogalactosa en algas
que crecen en presencia de fuertes corrientes y aguas poco calmadas, de
esta manera el alga se aferra al litoral rocoso impidiendo que las corrientes
la arranquen de su habitad, de acuerdo con Yaphe se debe encontrar
diferente contenido de anhidrogalactosa dependiendo de la especie y del
lugar donde habita. Y como el contenido de anhidrogalactosa está
relacionado con el punto de fusión se esperarían diferentes puntos de fusión
para k carragenina extraída de diferentes especies, en este caso Hypnea y
Kappaphycus . (ver anexo estadístico 7.2 3 , contraste de rangos múltiples).
Cuando se trata de la misma especie, en este caso Hypnea
musciformis, creciendo en condiciones climáticas disímiles, se deben
110
encontrar diferencias en el contenido de 3-6 anhidrogalactosa, con seguridad
las muestras recolectadas en el arribazon del Cabo de la Vela, tenían habitad
diferente a las recogidas en Santa Marta, esta es la razón por la cual en el
contraste múltiple de rangos según especie, que se puede observar en el
anexo estadístico, se establecen diferencias significativas entre Hypnea
Santa Marta e Hypnea Guajira en el punto de fusión.
No obstante los puntos de fusión más altos no corresponden con las
condiciones para obtener mejores rendimientos. Los mejores rendimientos
se obtienen de Kappaphycus alvarezii a pH de extracción de 8,6 y los
mayores puntos de fusión los presenta la k carragenina producida de
Hypnea Santa Marta a pH 8,4.
4.7.4 Análisis de textura El estudio de textura, inicia con la determinación de la fuerza de gel,
que se realizó con los estándares reportados en la literatura para la
determinación de la textura de geles. (Coutr,2000; Baeza, 2003). La Tabla No
13 muestra la respuesta (fuerza de gel), en función del pH y la especie, para
soluciones de carragenina al 1,5%, preparadas en KCl al 1,5%, nuevamente
los datos fueron analizados con test ANOVA con el 95% de confianza.
Los resultados dejan ver que hay una incidencia estadísticamente
significativa del pH y la especie en los valores de fuerza de gel. (ver anexo
estadístico 7.2. 4)
En la figura No 35 se aprecia que las mayores fuerzas de gel se
presentan a pH 8,4 (909g/cm2) y 8,6 (732g/cm2) para la especie Hypnea
Santa Marta. Resultados coincidentes con los puntos de fusión y gelificación,
los valores de pH muy altos o muy bajos dan las menores respuestas,
indicando que hay una hidrólisis del polisacárido.
111
Figura No 35 Estudio de Fuerza de gel de kappa carragenina en función de la especie.
Fuerza de Gel en KCl al 1,5% vs Especie
especie
0
200
400
600
800
1000
fuer
za
HYG HYS K
pH88,48,69
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
Un pH básico durante la extracción forma 3-6anhidro galactosa, unido
a una buena proporción de KCl (1,5%), le confiere a la k carragenina una
mejor estructura generando geles con fuerzas de gel mayores. Estos
resultados concuerdan con los encontrados en el punto de fusión y
gelificación porque allí también a valores de pH altos (9,0 y 10,0) y bajos
(8,0) los resultados son menores.
En la figura No 36 se aprecia la diferencia entre las medias de las
fuerzas de gel de Hypnea Guajira e Hypnea Santa Marta y la diferencia
entre las medias de Hypnea Santa Marta y Kappaphycus (ver anexo
estadístico 7.2.4), sin embargo la especie Hypnea recolectada en Santa
Marta se muestra muy sensible a los cambios de pH.
112
Los valores obtenidos para la fuerza gel de la especie Hypnea Santa
Marta son superiores a los reportados por Mtolera y Buriyo ( 2004), quienes
alcanzan fuerzas de gel máximas de 243g/cm2, talvez, porque ellos no
controlan el pH durante el experimento o por las condiciones climáticas a las
que se encontraban sometidas las algas, antes de su recolección.
Stanley (1987), reporta fuerzas de gel para k carrageninas entre 200 y
1600 g/cm2 para polisacáridos extraídos de Eucheuma sp, las variaciones
son asignadas a la especie y las condiciones de pH de extracción. Lo que
indica que los valores obtenidos en esta investigación están dentro de los
rangos reportados en la literatura, de igual forma k carragenina extraída de
Kappaphycus alvarezii en presencia de NaOH al 2% permite obtener geles
con fuerzas superiores a 521g/cm2 (Andrade, 2000).
Se sugiere que los mayores valores de fuerza de gel para la especie
Hypnea musciformis recolectada en Santa Marta son debidos al mayor
contenido de potasio en el alga; concentraciones altas del ión potasio
favorecen la formación de hélices que se organizan y dan origen a geles
bastante fuertes (Michel y colaboradores, 1997; figura No 2 de este texto). Al
estudiar la proporción de potasio en el alga y en la k carragenina obtenida
de las muestra recogidas en Santa Marta, se observa que contienen cuatro
veces mas potasio que Hypnea recogida en la Guajira y que Kappaphycus
alvarezii. ( ver Figura No 49 y Tabla No 21 de este documento)
113
Figura No 36. Estudio de fuerza de gel de kappa carragenina en KCl al1,5% en función del p H de tratamiento
Fuerza de Gel en KCl al 1,5% vs pH
pH
fuer
zaespecie
HYGHYSK
0
200
400
600
800
1000
8 8,4 8,6 9
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
En la figura No 37 se aprecia un análisis de textura típico obtenido
para Hypnea musciformis a pH 8,4, allí se mide la variación de la fuerza en
función del tiempo y el punto máximo es considerado como el punto de
ruptura del gel marcado a 45,219 N, teniendo en cuenta las condiciones del
ensayo se puede calcular el valor en unidades de fuerza, que para este
experimento es 909,9 g/cm2. Cuando se obtiene un triángulo bastante
simétrico se puede decir que el gel es uniforme .
114
Figura No 37. Perfil de textura para la muestra de carragenina obtenida a partir de Hypnea musciformis Santa Marta a pH 8,4
Si realiza el perfil de textura para muestras con baja fuerza de gel
como aquellas cuyo punto de fusión era bajo, obtenidas a pH 10 o que no
gelificaban bien, se obtienen análisis como los indicados en la figura No 38
115
Figura No 38 Perfil de textura para la muestra de carragenina obtenida a partir de Hypnea musciformis Santa Marta a pH 10,0
En la figura No 38 se observa que al poco tiempo de colocar el peso
sobre la k carragenina, el gel se rompe y por lo tanto es imposible calcular
una fuerza de gel, este fenómeno se presenta en las muestras extraídas a
pH 10.
Otra diferencia encontrada para las muestras de k carragenina en la
determinación de la fuerza de gel se aprecia en la figura No 39, en donde se
distingue una porción del triángulo que queda por debajo de las abscisas.
116
Figura No 39. Perfil de textura para la muestra de carragenina obtenida a partir de Hypnea musciformis Santa Marta a pH 9,0
Esta porción se calcula como el área bajo la curva y se obtiene un
valor que corresponde a la adhesividad del gel, que es 41,55gs, para la
carragenina obtenida a pH 10 a partir de Hypnea musciformis. A mayores
áreas bajo el eje X, el gel es más adhesivo significa que cuando el peso que
registró la fuerza de gel regresa al origen trae consigo restos de gel. En
todos los ensayos realizados para la determinación de la fuerza de gel, se
obtuvieron geles más adhesivos a pH altos.
Tener un gel con distribución triangular uniforme no sugiere que sea o
no adhesivo. Así en la figura No 39 se describe un área bajo la curva de
117
34,65g s, que indica un gel adhesivo , aunque es homogéneo, el triángulo es
semejante al de la figura No 40.
Figura No 40 Perfil de textura para la muestra de carragenina obtenida a partir de Hypnea musciformis Santa Marta a pH 8,6
Se realizó la determinación de los perfiles de textura para las
muestras de k carragenina, en soluciones de KCl al 0,5, los resultados se
muestran en la tabla No 13 . Como era de esperarse y de acuerdo con la
literatura (Ribeiro, 2004), las fuerzas de gel disminuyen drásticamente, por
ejemplo, el gel de Hypnea musciformis Santa Marta con pH de extracción
8,4.pasó de 900 a 337,08g/cm2
118
El análisis ANOVA (Anexo7.2.5), mostró que existen diferencias
significativas entre la respuesta obtenida variando el pH y variando la
especie, de igual manera hay una interacción entre los factores pH y especie.
En las figuras No 41 y 42 es evidente, que los valores más altos en
fuerza de gel se obtienen a pH 8,4 para la especie Hypnea musciformis
Santa Marta, al igual que en la preparación del gel de carragenina de1,5%
en KCl.
Figura No 41. Estudio de la fuerza de gel kappa carragenina preparado en soluciones de KCL al 0,5%
Fuerza de Gel en KCl al 0,5% vs especie
ESPECIE
FUE
RZA
DE
GEL
pH8,48,69
0
100
200
300
400
HYG HYS K
En la figura No 41 se observa que a pH 9,0 en todas las especies el
valor de la fuerza de gel es muy bajo, cercano a 18,9g/cm2 y es imposible
determinarlo a pH 10, probablemente el gel está bastante hidrolizado, su
peso molecular es pequeño y no se formaron las hélices.
119
Figura No 42. Estudio de la variación de fuerza de gel kappa carragenina preparada en soluciones de KCl al 0,5% en función del pH de extracción.
Fuerza de Gel en KCl al 0,5% vs pH
pH
FUE
RZA
DE
GEL
ESPECIEHYGHYSK
0
100
200
300
400
8,4 8,6 9
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
Los perfiles de textura revelan muestras muy frágiles y adhesivas. En
la Figura No 43 se aprecia el perfil de textura para una muestra de k
carragenina extraída a partir de Hypnea de Santa Marta, que tiene 18g/cm2
de fuerza de gel, en ella se observa un rompimiento rápido de gel, con poca
adhesividad
120
Figura No 43 Perfil de textura para la muestra de k carragenina obtenida a partir de Hypnea musciformis Santa Marta a pH 9,0.
El gel está preparado en KCl 0,5%
Luego de este estudio se observa que los mayores rendimientos
(47%) en la extracción de carragenina se logran con protocolos de control
de pH a 8,6 con las algas de la especie Hypnea musciformis recolectada en
Santa Marta, pero si lo que se necesita es una carragenina para un uso
industrial particular que requiera altas fuerzas de gel es mejor usar
protocolos a pH 8,4, el rendimiento es menor (22%), pero la fuerza de gel es
mayor (909g/cm2). Estos resultados coinciden con estudios realizados con
anterioridad en el laboratorio de biotecnología de la Universidad Javeriana en
los procesos de obtención de agar microbiológico. (Montilla, 2005).
121
La elasticidad del gel se estudió midiendo la pendiente de la línea
trazada desde el inicio del ensayo hasta el punto máximo., los datos se
encuentran en la tabla No. 14
Tabla No 14 Pendientes de los ensayos de perfil de textura del Gel de kappa
carragenina preparado en solución 1,5% de KCl
1.5% en KCl
Muestra pH Pendiente en N/s
8,0 8,4 8,6 9,0 3,290 95,96 74,065 9,191 3,301 93,92 82,276 7,141
Hypnea musciformis Santa Marta
3,300 96,03 73,984 10,063 14,011 56,685 33,455 26,218 14,131 53,667 33,766 26,110
Kappaphycus alvarezii 13,810 53,749 39,610 26,100
8,592 50,368 46,625 20,877 8,186 53,809 41,287 20,839
Hypnea musciformis
Guajira 7,810 53,586 49,579 20,714
Se analizaron los valores de fuerza de gel en función de la pendiente
y se encontró que hay una relación lineal y positiva, lo que indica que los
geles con mayor fuerza de gel son más elásticos. En la tabla No 15 y el
anexo No 7.2.6 se presentan los datos que se usaron para determinar la
correlación lineal simple.
Los resultados de la correlación muestran la ecuación:
Elasticidad = -2,854+0,10852*Fuerza de gel
Esta ecuación representa un modelo lineal que describe una relación
entre elasticidad y fuerza de gel, estadísticamente significativa, con un
coeficiente de correlación 0,9988, indicando una relación fuerte entre las
variables.
122
Dado que el valor p del análisis ANOVA es mayor o igual que 0,1 el
modelo seleccionado, es decir, la ecuación lineal, se ajusta a los datos, para
un nivel de confianza del 99%.
4.7.5 pH A todas las muestras de k carragenina se les determinó el pH
después del proceso de purificación, pero como no hay diferencias
significativas entre los valores de cada ensayo, sólo se muestra en cada
casilla de la tabla No 16 (presentada en el anexo de tablas), el valor
promedio.
Las figuras No 44 y No 45 muestran que el valor del pH final
depende de las condiciones de extracción, pero no de la especie de alga de
partida. El Análisis ANOVA que se presenta en el Anexo 7.2.7 expresa que
no hay interacción entre los factores especie y pH.
La carragenina extraída a pH 8,6 de la especie Hypnea recolectada en
Santa Marta, de donde se obtienen los mayores rendimientos en porcentaje
en peso seco, forma geles con pH 8,0, este valor está dentro del rango
aceptado por la JECFA (2001), para que pueda ser utilizada con fines
comerciales en la industria alimentaría.
123
Figura No 44 Determinación del pH final de kappa carragenina obtenida de cada especie de alga.
Variación del pH de la carragenina vs Especie
Especie
pH c
arra
geni
napH de extracc
88,48,6910
7,4
7,7
8
8,3
8,6
8,9
HyG HyS K
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
Figura No 45. Variación del pH final de kappa carragenina obtenida de cada especie de alga en función de pH de extracción
Variación del pH de la carragenina vs pH de extracción
pH de extracción
pH c
arra
geni
na
EspecieHyGHySK
7,4
7,7
8
8,3
8,6
8,9
8 8,4 8,6 9 10
124
La k carragenina extraída a pH 8,4 y que presenta la mayor fuerza de
gel tiene un pH final de 7,8 también, aceptado por la JECFA para productos
alimentarios.
4.7.6 Humedad El porcentaje humedad determinado para las muestras de k
carragenina se presenta en la tabla resumen No 17
Tabla No 17 humedad en muestras de carragenina Muestra pH
% de Humedad
8,0 8,4 8,6 9,0 10,0 Hypnea Guajira 9,8% 9,0% 8,0% 9,4% 6,4%Kappaphycus alvarezii 8,0% 9,4% 9,3% 6,9% 7,5%Hypnea Santa Marta 7,5% 9,0% 9,4% 9,4% 9,3%
Los valores de humedad obtenidos para la muestras de carragenina
están dentro de los estándares solicitados por la JECFA, quien determina
que la humedad medida 105oC y peso constate debe ser máximo el 12%,
(JECFA, 2001); la carragenina extraída en esta investigación tiene
porcentajes de humedad, con cualquier tratamiento de pH, por debajo del
valor solicitado.
Se exige la determinación de humedad de la carragenina por parte de
la JECFA porque es indispensable para establecer las condiciones de
almacenamiento y manejo, de tal manera que se pueda realizar un control
microbiológico apropiado.
125
4.7.7 Cenizas La Tabla No 18 presenta los resultados de los ensayos de cenizas
realizados para las algas, con el propósito de tener una caracterización
primaria de la muestra, estos resultados junto con los de absorción atómica
indican, como era de esperarse, que la muestra de Hypnea proveniente de la
Guajira y la de Kappaphycus alvarezii presentan un mayor contenido de
residuos no orgánicos que pueden ser los causantes de las diferencias en la
fuerza gel y el rendimiento, parámetros fisicoquímicos, que se mostraron
dependientes tanto del pH de extracción como de la especie
simultáneamente.
Tabla No 18. Porcentaje de cenizas determinado en dos especies de algas.
Muestra %Cenizas Varianza Hypnea musciformis Guajira 24,98 0,00425Hypnea musciformis Santa Marta 12,43 0,0002916Kappaphycus alvarezii 23,92 0,001233
Los valores de cenizas en las muestras de algas no se encuentran
reportados en la literatura, porque las condiciones de crecimiento, nutrientes
y recolección no son iguales.
126
4.7.8 Análisis de Absorción atómica 4.7.8.1 Absorción atómica para la muestra de algas
En la tabla No 19 se presenta el análisis de absorción atómica de las
muestras de algas, los elementos en mayor composición aparecen en
porcentaje peso a peso sobre peso seco del alga y los elementos en menor
cantidad se expresan en ppm.
Los resultados permiten apreciar que las muestras recolectadas en la
Guajira son ricas en hierro y cobre comparadas con las recolectadas en
Santa Marta.
Los valores de potasio para Kappaphycus alvarezii son más bajos
que los reportados en la literatura para esta especie (Glicksman, 1982),
posiblemente debido a las condiciones de crecimiento del alga.
Tabla No 19. Análisis de absorción atómica para las dos especies de algas.
Análisis de absorción atómica de muestras de algas %p/p %p/p %p/p %p/p %p/p ppm ppm ppm
Muestra
Na K Ca Mg Fe Mn Cu Zn Hypnea musciformis Guajira 3,59 1,14 1,06 1,01 0,52 260 300 48Kappaphycus alvarezii 12,72 1,18 1,70 0,81 0,76 249 188 31Hypnea musciformis Santa Marta 2,17 4,93 0,44 0,67 0,21 42 10 96 Los datos de absorción atómica para las especies en estudio son, también,
una contribución de la investigación a la caracterización de Hypnea
musciformis en Colombia, ya que no se encuentran reportados en la
literatura.
4.7.8.2 Absorción atómica para las muestras de carragenina En cada muestra de carragenina se determinaron por absorción
atómica los siguientes elementos: Sodio, potasio, calcio, magnesio, hierro,
manganeso, cobre y cinc
127
4.7.8.2.1 Análisis del contenido de sodio en kappa carragenina En la tabla No 20 se aprecian los resultados obtenidos para el sodio
en porcentaje peso a peso, el análisis estadístico (Anexo No 7.2.9) que la
especie tiene un efecto significativo sobre el contenido de sodio.
La figura No 47 muestra que los contenidos más altos de sodio se
presentan en la carragenina extraída de la especie Hypnea recolectada en
la Guajira y los más bajos en la carragenina proveniente de la especie
Hypnea recolectada en Santa Marta, en todos los casos los valores son
superiores a los determinados para las algas, debido a que la extracción se
hace a través de un tratamiento alcalino con hidróxido de sodio. Figura No 47 Análisis de absorción atómica para sodio en las muestras de kappa carragenina obtenida a partir de dos especies de algas.
Contenido de sodio en la carragenina vs Especie
ESPECIE
%p/
p de
sod
io
pH88,48,6910
2,2
4,2
6,2
8,2
10,2
HYG HYS K
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
En la figura No 48 se observa que el contenido de sodio es
independiente del pH al cual se realiza la extracción. La interacción pH-
128
especie que muestran los análisis estadísticos (Anexo 7.2.9) se debe al
método de síntesis en combinación con el contenido inicial de sodio en la
muestra.
Figura No 48. Análisis de absorción atómica para sodio en las muestras de kappa carragenina obtenida a tratamientos de pH diferentes.
Contenido de sodio en la carragenina vs pH
pH
%p/
p de
sod
io
ESPECIEHYGHYSK
2,2
4,2
6,2
8,2
10,2
8 8,4 8,6 9 10
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
La JECFA no tiene requerimientos de sodio máximos o mínimos en
carragenina, por lo tanto la carragenina obtenida por este método puede ser
aceptada como aditivo en preparaciones para consumo humano. (JECFA,
2001).
4.7.8.2.2 Análisis del contenido de potasio en kappa carragenina La tabla No 21 presenta el contenido de potasio encontrado para
todos los ensayos de extracción de carragenina en porcentaje en peso, la
figura No 49 muestra que solamente la especie es el factor determinante
129
en el contenido de potasio, como era de esperarse ya que el tratamiento de
extracción no involucra tratamientos con potasio.
Figura No 49 Análisis de absorción atómica para potasio en las muestras de kappa carragenina obtenida a tratamientos de pH diferentes.
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
Contenido de potasio en la carragenina vs pH
pH
1,1
1,6
2,1PO
2,6
3,1
3,6
4,1
TASI
O
8 8,4 8,6 9 10
ESPECIEHYGHYSK
Los análisis estadísticos (Anexo No 7.2.10) y la figura No 49 indican
que no hay interacción entre los factores especie-pH que influyan en el
contenido de potasio de la carragenina. En la figura No 49 se muestra que el
contenido de potasio para Hypnea Guajira e Hypnea Santa Marta son
significativamente diferentes al igual que para Hypnea Santa Marta y
Kappaphycus mientras que no hay diferencias entre Hypnea Guajira y
Kappaphycus. Estas diferencias inciden en al fuerza de gel del polisacárido,
el alto contenido de potasio inicial en las algas provenientes de la playa
Aeropuerto de Santa Marta, promueve la formación de geles con fuerza de
gel grandes. (908 g/cm2)
130
4.7.8.2.3 Análisis del contenido de Calcio en kappa carragenina En la Tabla No 22 se muestran los resultados obtenidos en la
determinación del calcio para las muestras de carragenina, el test ANOVA
(Anexo No 7.2.11), indica que el contenido de calcio depende de la especie
y no del pH de tratamiento, además evidencia que no hay interacción entre
especie-pH.
Las figuras No 50 y 51 son los resultados del test ANOVA, indican que
hay diferencias significativas en el contenido de calcio para cada especie.
Figura No 50 Análisis de absorción atómica para calcio en las muestras de kappa carragenina obtenida a partir de algas diferentes.
Contendio de calcio en la carragenina vs especie
ESPECIE
CAL
CIO
pH88,48,6910
0
0,2
0,4
0,6
0,8
HYG HYS K
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
131
Figura No 51 Análisis de absorción atómica para calcio en las muestras de kappa carragenina obtenida a tratamientos de pH diferentes
Contendio de Calcio en la carragenina vs pH
pH
% C
alci
oESPECIE
HYGHYSK
0
0,2
0,4
0,6
0,8
8 8,4 8,6 9 10
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
4.7.8.2.4 Análisis del contenido de Magnesio en kappa carragenina
El contenido de magnesio se presenta en la tabla No 23, figuras 52 y
53 los resultados del test ANOVA (Anexo No 7.2.12) muestran que el valor
del contenido de Magnesio depende solamente de la especie y no del
tratamiento de extracción.
132
Figura No 52 Análisis de absorción atómica para magnesio en las muestras de kappa carragenina obtenida a tratamientos de pH diferentes
Contenido de Magnesio en la carragenina vs pH
pH
% M
agne
sio
ESPECIEHYGHYSK
0,24
0,27
0,3
0,33
0,36
0,39
0,42
8 8,4 8,6 9 10
Figura No 53 Análisis de absorción atómica para Magnesio en las muestras de kappa carragenina obtenida a partir de diferentes muestras de algas.
Contenido de Magnesio en la carragenina vs Especie
ESPECIE
% M
agne
sio
pH88,48,6910
0,24
0,27
0,3
0,33
0,36
0,39
0,42
HYG HYS K
133
Las figuras No 52 y 53 muestran que la especie con mayor contenido
de Magnesio es Hypnea recolectada en Santa Marta y que la especie
Hypnea recolectada en la Guajira es quien presenta el menor contenido de
magnesio, los resultados están determinados solamente por el lugar de
muestreo.
4.7.8.2.5 Análisis del contenido de Hierro en kappa carragenina Los contenidos de hierro en las muestras de carragenina se presentan
en la tabla No 24 y los resultados del test ANOVA se encuentran el en
Anexo No 7.2.13.
En las Figuras No 54 y 55 se aprecia que la especie Hypnea
recolectada en la Guajira presenta altos contenidos de hierro 0,30%
comparados con la especie Hypnea recolectada en Santa Marta 0,14%, lo
que sugiere diferentes fuentes de nutrientes.
Figura No 54 Análisis de absorción atómica para hierro en las muestras de kappa carragenina obtenida a partir de diferentes especies de algas.
ESPECIE
% H
IER
RO
pH1088,48,69
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
HYG HYS K
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
134
El test ANOVA, muestra que el único factor estadísticamente significativo en
el contenido de hierro es la especie, lo que indica que la procedencia de la
muestra es el factor que determina el contenido de hierro.
Figura No 55 Análisis de absorción atómica para hierro en las muestras de kappa carragenina obtenida a tratamientos de pH diferentes 4.7.8.3 Análisis del contenido de Manganeso en kappa carragenina
pH
% H
IER
RO
ESPECIEHYGHYSK
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
10 8 8,4 8,6 9
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
El análisis ANOVA mostró que no hay diferencias estadísticamente
significativas, cuando se considera la variable pH, entre ningún par de
medias a un nivel del 95% de confianza.
4.3.8.2.6 Análisis del contenido de Manganeso en kappa carragenina
En la tabla No 25 se presenta el estudio realizado para el contenido de
Manganeso en kappa carragenina, el test ANOVA se muestra en el Anexo
No 7.2.14.
135
Los valores p del test ANOVA muestran que el factor significativo en
el contenido de manganeso es la especie y no el pH tal y como se ve en las
gráficas No 56 y 57. Esto indica que la procedencia de las algas es
predominante en el contenido de Manganeso, de hecho su origen en
diferentes zonas del territorio Colombiano y las condiciones de crecimiento
son las que regulan los contenidos Manganeso en la carragenina.
Figura No 56 Análisis de absorción atómica para Manganeso en las muestras de kappa carragenina obtenida a partir de algas diferentes
Contendio de Manganeso en la Carragenina vs Especie
ESPECIE
ppm
Man
gane
so
pH88,48,6910
0
40
80
120
160
200
HYG HYS K
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
136
Figura No 57 Análisis de absorción atómica para Manganeso en las muestras de kappa carragenina obtenida a con tratamientos de pH diferentes.
Contendio de Manganeso en la Carragenina vs Especie
ESPECIE
ppm
Man
gane
so
pH88,48,6910
0
40
80
120
160
200
HYG HYS K
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
4.3.8.2.7 Análisis del contenido de Cobre en kappa carragenina
El contenido de cobre en kappa carragenina determinado por
absorción atómica se muestra en la tabal No 26 en el Anexo No 7.2.15 se
presenta el test ANOVA.
El test ANOVA muestra que le contenido de cobre depende de
la especie y no del tratamiento de pH al cual fue sometida la muestra de alga
para obtener la carragenina.
137
En la figura No 58 se aprecia que los mayores contenidos de cobre se
presentan en la especie Hypnea recolectada en la Guajira ( 273.33 ppm ), y
los menores valores en la especie Hypnea recolectada en Santa Marta (10
ppm), estas diferencias se deben a las condiciones climáticas y geográficas
de donde se obtuvieron las muestras. Figura No 58 Análisis de absorción atómica para Cobre en las muestras de kappa carragenina obtenida a partir de algas diferentes
Contenido de cobre en la carragenina vs Especie
ESPECIE
ppm
Cob
re
pH88,48,6910
0
50
100
150
200
250
300
HYG HYS K
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
En la figura No 59 se aprecia que los tratamientos de extracción a
diferentes valores de pH no inciden el contenido de cobre, como era de
esperarse, ya que el método no contempla el uso cobre ni en la precipitación
ni en la extracción.
138
Figura No 59 Análisis de absorción atómica para Cobre en las muestras de kappa carragenina obtenida con tratamientos de pH diferentes. Figura No 27
Contenido de cobre en la carragenina vs pH
pH
ppm
Cob
re
ESPECIEHYGHYSK
0
50
100
150
200
250
300
8 8,4 8,6 9 10
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
4.3.8.2.8 Análisis del contenido de Cinc en kappa carragenina
Por último se realizó un estudio del contenido de cinc en kappa
carragenina, los resultados se muestran en la tabla No 27 y el análisis
ANOVA en el ANEXO No 7.2.16.
Los valores p del análisis estadístico sugieren que el contenido de cinc
depende solamente de la especie, como lo muestra la figura 60, la especie
Hypnea recolectada en Santa Marta es más rica en cinc (88,33 ppm), que la
especie Hypnea recolectada en la Guajira (43,33 ppm), debido a las
diferencias en las zonas de ubicación y crecimiento de las dos algas.
139
Figura No 60 Análisis de absorción atómica para Cinc en las muestras de kappa carragenina obtenida a partir de diferentes algas. 5 Conclusiones 6 Recomendaciones
Contenido de Cinc en la carragenina vs Especie
ESPECIE
ppm 50
de
Cin
c
pH88,48,6910
30
60
70
80
90
HYG HYS K
40
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
En la Figura 61 se aprecia que el contenido de cinc es independiente
del tratamiento de pH seleccionado para extraer la carragenina, y los
resultados del test ANOVA muestran que no hay interacción especie –pH que
determine el contenido de cinc en kappa carragenina
140
Figura No 61 Análisis de absorción atómica para Cinc en las muestras de kappa carragenina obtenida con tratamientos de pH diferentes.
Contenido de Cinc en la carragenina vs pH
pH
ppm
de
Cin
cESPECIE
HYGHYSK
30
40
50
60
70
80
90
8 8,4 8,6 9 10
HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira
HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta
KP muestra de Kappaphycus alvarezii
4.3.9 Almidón Floridean
Para todas las muestras de kappa carragenina se ensayó el
procedimiento de coloración con la solución de yodo-yoduro sin resultados
positivos de coloración, lo que permitió concluir que no hay en la
carragenina obtenida suficiente almidón para que la prueba de positiva, o
que se está trabajando en los límites de sensibilidad del ensayo.
4.3.10 Proteína Como parte de la caracterización, se realizaron determinaciones de
proteína únicamente para la muestra de kappa carragenina obtenida a pH
8,6 a partir de Hypnea recolectada en Santa Marta con el diagrama de flujo
mostrado en la figura No 18, porque con él se obtiene el mayor rendimiento.
141
También se determinó proteína en el alga. Los resultados se muestran en la
tabla No 28.
Tabla No 28. Contenido de proteína en el alga y en kappa carragenina
Muestra % de Proteína
Hypnea musciformis 13,8%
Kappa carragenina 0,15%
Los resultados muestran el contenido de proteína en el alga, que debe
estar relacionado con la época de recolección y con el contenido de kappa
carragenina, muestran además que el método de extracción presentado en
la figura No 18 logra separar el 99 % de proteína que contenía inicialmente
Hypnea musciformis., esto le confiere un color más claro a la carragenina.
No se reportan resultados en la literatura para comparar los
contenidos de proteína ni en el alga ni en la carragenina obtenida.
En la tabla resumen No 29 se muestra la caracterización
Fisicoquímica y el rendimiento para la carragenina extraída a partir de
Hypnea musciformis, recolectada en Santa Marta de donde se obtienen los
mejores resultados, comparada con las exigencias de la JECFA
142
Tabla No 29 Resumen de las propiedades fisicoquímicas de kappa carragenina
Característica Procedimiento de extracción JECFA
(2001) pH 8.4 pH 8.6
Espectro Infrarrojo Numeral 2.38 de este documento
El análisis de las señales indicó que se obtuvo Kappa carragenina.
Punto de gelificación (ºC)
N.R 36.0 37.3
Punto de fusión (ºC) N.R 66.0 64.7 Fuerza de gelificación (g/cm2)
N.R 909.48 732.86
Elasticidad (N/s) N.R 95.3 76.8 pH Entre 8,0 y 11 7.8 8.0 Humedad (%) Máxima 12% 7,9 8,53 Sodio (%p/p) N.R 2.22 2.22 Potasio (%p/p) N.R 4.05 4.03 Calcio (%p/p) N.R 0.08 0.08 Magnesio (%p/p) N.R 0.41 0.41 Hierro (%p/p) N.R 0.14 0.14 Manganeso (ppm) N.R 31 30 Cobre (ppm) N.R 10 10 Zinc (ppm) N.R 88.7 88.3 Rendimiento (%p/p) 13.76 46.56 cenizas Entre el 15 y
el 40% N.R N.R
Viscosidad 5cp a 75oC en preparaciones al 1,5%
N.R N.R
Sulfatos Entre el 15 y el 40%
N.R N.R
N.R: No se reporta.
143
5 Conclusiones y Recomendaciones
Se diseñó un método para extraer kappa carragenina a partir de
Hypnea musciformis que comprendió las siguientes etapas: Lavado,
Hidratación, decoloración, extracción, mezclado, filtrado, Decoloración,
precipitación, filtración, congelamiento y descongelamiento y secado.
El método más efectivo para retirar los pigmentos de Hypnea
musciformis y kappaphycus alvarezii fue la adición de hipoclorito de
sodio al 5% antes y después de la extracción de kappa carragenina.
El método diseñado para la extracción de kappa carragenina a partir
de Hypnea, también da buenos resultados usando el alga exótica
Kappaphycus alvarezii. Arrojando mejores rendimientos.
El método diseñado para la extracción de kappa carragenina a partir
de Hypnea musciformis da mejores resultados (47% rendimiento) que los
reportados en la literatura (20-35%) para la misma especie.
El mejor método de secado para conservar las características físicas
de la carragenina fue usando una estufa de aire forzado a 30oC durante
doce horas
Los mejores rendimientos se obtuvieron con tratamientos a pH 8,6
tanto para Hypnea musciformis como para Kappaphycus alvarezii.
Se obtuvieron mejores rendimientos cuando la extracción de
carragenina se realizó con las muestras de Hypnea musciformis
144
recolectadas en Santa Marta que con la muestra de Hypnea recolectada en
la Guajira
El análisis de los espectros I.R permitió demostrar que el polisacárido
obtenido a partir de Hypnea musciformis era kappa carragenina.
La pureza de kappa carragenina se evidenció en las bandas finas
obtenidas en el espectro Infrarrojo, los bajos contenidos de proteína y
almidón Floridean y el aspecto final de la muestra.
Se realizaron los análisis de Absorción atómica y cenizas para las
muestras de Hypnea musciformis y kappaphycus alvarezii.
Los puntos de fusión y gelificación de kappa carragenina están dentro
de los rangos reportados en la literatura.
Los resultados del análisis ANOVA indicaron que las diferencias en
los puntos de gelificación son debidas los tratamientos alcalinos y no a la
especie de alga, mientras que las diferencias en el punto de fusión
dependen del pH de extracción y de la especie.
En las dos especies de algas estudiadas, Hypnea musciformis y
kappaphycus alvarezii se observó que cuando kappa carragenina presenta
mayor Fuerza gel el rendimiento es menor.
En la carragenina extraída de las dos especies de algas estudiadas,
Hypnea musciformis y kappaphycus alvarezii se observó que la fuerza de
gel es mayor a mayores concentraciones de KCl.
Se encontró una correlación positiva entre la fuerza de gel y el módulo
de elasticidad, independiente del pH de tratamiento y de la especie.
145
Los mayores rendimientos de extracción de kappa carragenina se
encontraron con protocolos a pH 8,6 en Hypnea musciformis, recolectada
en Santa Marta, sin embrago, la fuerza de gel es mayor a pH 8,4.
Las características Fisicoquímicas encontradas para kappa
carragenina, la postulan como un gel promisorio para aditivos en
alimentos, o como un sustrato hidrorretenedor en Agricultura
Se recomienda:
Realizar una evaluación del contenido de carragenina en el alga
Hypnea musciformis recolectada en Santa Marta, en función de la
diferentes épocas climáticas del año, para observar si hay correlación entre
estos factores.
Estudiar la relación proteína – kappa carragenina y su variación en las
distintas épocas climáticas, para detectar los meses de mayor productividad.
Evaluar el contenido de 3,6 anhidrogalactosa para correlacionarlo con
la fuerza de gel y los puntos de fusión y gelificación.
Establecer si la época climática o los nutrientes en el agua influyen en
los valores de la fuerza de gel que presenta el hidrocoloide.
Evaluar las propiedades hidroretenedoras de la kappa carragenina,
con agua y con diferentes concentraciones de iones solubles para proponerla
como posible soporte para cultivos o en reemplazo de suelo para
implementar semilleros.
Realizar una evaluación del potencial y la disponibilidad de Hypnea
musciformis en las playas del Caribe colombiano.
146
En el campo de la bioprospección, realizar estudios
tecnicoeconómicos que validen la posibilidad de aprovechar el alga Hypnea
musciformis como fuente de kappa carragenina.
Si la extracción de kappa carragenina a partir de Hypnea
musciformis, resulta ser económicamente viable, se recomienda hacer
estudios de cultivos para no ejercer presiones sobre las praderas naturales
del alga.
Hacer estudios más detallados para determinar el contenido de
almidón floridean y sulfatos en kappa carragenina.
147
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155
7 Anexos 7.1 Anexo: Tablas de Resultados Tabla No 10 Puntos de gelificación para las muestras de carragenina
Punto de gelificación OC Muestra pH 8,0 8,4 8,6 9,0 10,0
34 35 36 32 34 34 37 37 33 32
Hypnea musciformis Santa Marta
34 36 39 34 34 33 35 39 34 33 35 37 39 33 32 Kappaphycus alvarezii
33 37 38 34 32
32 35 37 34 32
33 36 38 34 32 Hypnea musciformis
Guajira 32 37 36 33 32
Tabla No 11 Puntos de fusión de la carragenina
Puntos de fusión 0C
Muestra pH 8,0 8,4 8,6 9,0 10,0
62 66 64 62 45 61 65 65 60
Hypnea musciformis Santa Marta
60 67 65 61 55 60 59 55 45 56 63 58 56 Kappaphycus alvarezii
55 64 59 55
48 50 48 48
47 53 49 49 Hypnea musciformis
Guajira 46 53 48 47
156
Tabla No 12 Fuerza de Gel de la carragenina en solución 1,5% de KCl
1.5% en KCl
Muestra pH Fuerza de gel g/cm2
8,0 8,4 8,6 9,0 10,0
58,72 908,95 708,0 112,77 20,20 58.74 909,99 783,34 112,77 N.G.
Hypnea musciformis
Santa Marta 58.74 909,5 707,26 120,77 N.G.
157,00 520,85 335,4 269,01 12,03 158,10 520,85 338,25 268,01 N.G.
Kappaphycus alvarezii 155,15 521,60 336,45 268,09 N.G.
100,34 519,94 446,16 220,13 N.G. 103,55 522,15 407,26 219,64 N.G.
Hypnea musciformis
Guajira 100,10 520,10 483,34 218,50 N.G. N.G: no gelificó
Tabla No 13 Fuerza de Gel de la carragenina en solución 0,5% de KCl
0.5% en KCl
Muestra pH Fuerza de gel en g/cm2
8,0 8,4 8,6 9,0 10,0
338,12 209,12 18,20 15,47 N.G. 338,12 200,22 18,24 N.G.
Hypnea musciformis Santa Marta
335,00 197.35 18,22 N.G. 158,10 100,00 8,60 N.G.
N.G. 158,10 98,00 7.52 N.G. Kappaphycus alvarezii 158,30 100,00 7,50 N.G.
56,00 50,00 21,20 N.G. N.G. 58,72 51,00 20.20 N.G.
Hypnea musciformis
Guajira 57,10 50,00 15,47 N.G.
157
Tabla No 15. Estudio de la correlación fuerza de gel y elasticidad
Especie pH fuerza gel g/cm2
Elasticidad N/s
8,0 58,72 3,300 8,0 58,74 3,302 8,0 58,74 3,302 8,4 908,95 95,966 8,4 909,99 93,919 8,4 909,5 96,026 8,6 708 74,065 8,6 783,34 82,276 8,6 707,26 73,984 9,0 112,77 9,191 9,0 112,77 7,141
Hypnea musciformis Santa Marta
9,0 120,77 10,063 8,0 157 14,011 8,0 158,1 14,131 8,0 155,15 13,810 8,4 520,85 56,685 8,4 520,85 53,667 8,4 521,6 53,749 8,6 335,4 33,455 8,6 338,25 33,766 8,6 336,45 39,610 9,0 269 26,218 9,0 268,01 26,110
Kappaphycus alvarezii
9,0 268,09 26,100 8,0 100,34 8,592 8,0 103,55 8,186 8,0 100,1 7,810 8,4 519,94 50,368 8,4 522,15 53,809 8,4 520,1 53,586 8,6 446,16 46,625 8,6 407,26 41,287 8,6 483,34 49,579 9,0 220,13 20,877 9,0 219,64 20,839
Hypnea musciformis Guajira
9,0 218,5 20,714
158
Tabla No 16 pH de la carragenina
Muestra pH
pH
8,0 8,4 8,6 9,0 10 Hypnea Guajira 7,5 7,8 8,0 8,5 8,6
Kappaphycus alvarezii 7,4 7,8 8,0 8,5 8,6Hypnea Santa Marta 7,5 7,8 8,0 8,5 8,6
Tabla No 17 humedad en muestras de carragenina Muestra pH
% de Humedad
8,0 8,4 8,6 9,0 10,0 Hypnea Guajira 9,8% 9,0% 8,0% 9,4% 6,4%Kappaphycus alvarezii 8,0% 9,4% 9,3% 6,9% 7,5%Hypnea Santa Marta 7,5% 9,0% 9,4% 9,4% 9,3% Tabla No 20 contenido de sodio en kappa carragenina
Muestra SODIO porcentaje peso a peso
8,0 8,4 8,6 9,0 10,08,22 8,22 8,25 8,25 8,258,22 8,22 8,25 8,22 8,25 Hypnea Guajira
8,22 8,22 8,25 8,24 8,255,38 5,42 5,42 5,38 5,425,41 5,42 5,40 5,40 5,40Kappaphycus alvarezii 5,40 5,40 5,40 5,40 5,382,22 2,22 2,21 2,22 2,212,21 2,22 2,22 2,20 2,20Hypnea Santa Marta 2,22 2,21 2,22 2,20 2,22
159
Tabla No 21. Contenido de potasio en kappa carragenina
Muestra pH
POTASIO porcentaje peso a peso
8,0 8,4 8,6 9,0 10,0 1,13 1,12 1,21 1,18 1,13 1,21 1,12 1,12 1,13 1,12
Hypnea Guajira
1,18 1,21 1,18 1,21 1,21 1,14 1,15 1,17 1,15 1,17 1,15 1,14 1,15 1,15 1,01 Kappaphycus alvarezii 1,15 1,14 1,14 1,14 1,15 4,08 4,03 4,03 4,03 4,08 4,06 4,08 4,03 4,06 4,03 Hypnea Santa Marta 4,03 4,03 4,03 4,08 4,03
Tabla No 22. Contenido Calcio en kappa carragenina
Muestra CALCIO porcentaje peso a peso
8,0 8,4 8,6 9,0 10,0 0,77 0,77 0,75 0,77 0,75 0,75 0,75 0,77 0,77 0,77
Hypnea Guajira
0,75 0,77 0,77 0,77 0,77 0,41 0,40 0,40 0,41 0,40 0,40 0,40 0,41 0,41 0,41 Kappaphycus alvarezii 0,40 0,41 0,41 0,41 0,41 0,08 0,07 0,07 0,07 0,07 0,07 0,08 0,08 0,08 0,08 Hypnea Santa Marta 0,08 0,08 0,08 0,07 0,08
160
Tabla No 23 Contenido de magnesio en kappa carragenina
Muestra
MAGNESIO porcentaje peso a peso
8,0 8,4 8,6 9,0 10,00,25 0,25 0,25 0,25 0,250,25 0,25 0,25 0,25 0,25
Hypnea Guajira
0,25 0,25 0,25 0,25 0,250,36 0,36 0,36 0,36 0,360,36 0,36 0,36 0,36 0,36Kappaphycus alvarezii 0,36 0,36 0,36 0,36 0,360,41 0,41 0,41 0,41 0,410,41 0,41 0,41 0,41 0,41Hypnea Santa Marta 0,41 0,41 0,41 0,41 0,41
Tabla No 24. Contenido de hierro en kappa carragenina
Muestra
HIERRO porcentaje peso a peso
8,0 8,4 8,6 9,0 10,0 0,30 0,30 0,31 0,31 0,31 0,31 0,30 0,31 0,30 0,30
Hypnea Guajira
0,31 0,31 0,30 0,31 0,30 0,55 0,55 0,55 0,55 0,55 0,55 0,55 0,55 0,55 0,55 Kappaphycus alvarezii 0,55 0,55 0,55 0,55 0,55 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 Hypnea Santa Marta 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14
161
Tabla No 25. Contenido de Manganeso en kappa carragenina
Muestra MANGANESO ppm
8,0 8,4 8,6 9,0 10,0 117 117 105 117 117 105 117 105 117 105
Hypnea Guajira
105 117 117 105 105 200 200 200 200 200 200 199 199 199 199 Kappaphycus alvarezii 199 200 200 200 200
30 32 29 29 29 29 29 32 32 30 Hypnea Santa Marta 32 32 29 29 29
Tabla No 26 Contenido de Cobre en kappa carragenina
Muestra COBRE en ppm
8,0 8,4 8,6 9,0 10,0 276 251 293 293 251 251 276 251 293 251
Hypnea Guajira
293 293 276 251 293 182 187 187 187 187 184 184 187 182 187 Kappaphycus alvarezii 187 187 182 187 184
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Hypnea Santa Marta 10 10 10 10 10
162
Tabla No 27 Contenido de cinc en kappa carragenina
Muestra CINC ppm
8 8,4 8,6 9 10 46 46 46 46 46 46 42 42 46 46
Hypnea Guajira
46 42 42 42 42 32 30 30 30 30 30 30 32 32 30 Kappaphycus alvarezii 32 32 32 32 32 88 88 88 88 89 89 89 88 89 88 Hypnea Santa Marta 89 89 89 88 88
163
7.2 Anexos Estadísticos
Modelo estadístico
Como ilustración se desarrollará solamente el modelo estadístico para el
rendimiento de carragenina, pero se usa el mismo modelo para todos los
parámetros estudiados.
En términos estadísticos lo que se afirma es que el comportamiento
del rendimiento de carragenina (Υ) en el experimento con tres réplicas(κ)
se podrá describir mediante el siguiente modelo:
Υijk = µ + αi + βj + αβijk + εijk Ecuación 1
i = 1,2,3....a
J = 1,2,3,...b
K = 1,2,3 n
Donde µ es la media general de rendimiento, αi es el efecto debido a i-ésimo
nivel del factor pH, βijk es el efecto del J-ésimo nivel de la especie y αβijk es
el efecto de interacción dado por la combinación especie-pH y εijk es el error
aleatorio que supone sigue una distribución con media cero y varianza
constante δ2 (N (0,δ2 ) y son independientes entre sí. Para que la
estimación de los parámetros de este modelo sea única, se asume que los
efectos dados en el modelo son desviaciones respecto a la media global. El
factor especie es cualitativo y el factor pH es cuantitativo. Este modelo
permite identificar el punto óptimo de operación para obtener el mayor
rendimiento de carragenina.
Hipótesis a evaluar y análisis de varianza
Ho Hipótesis nula
164
HA Hipótesis alternativa
Evaluación del efecto de la variable pH sobre el rendimiento de carragenina.
Ho : Efecto del pH = 0
HA Efecto del pH ≠ 0
Evaluación del efecto de la variable especie sobre el rendimiento de
carragenina
Ho : Efecto de la especie = 0
HA Efecto de la especie ≠ 0
Evaluación del efecto de interacción de las variables especie y pH sobre el
rendimiento de carragenina
Ho : Efecto Especie*pH = 0
HA Efecto Especie*pH ≠ 0
Las hipótesis planteadas de acuerdo con la ecuación 1 son :
Ho : α1 = α2 = αa = 0
HA αi ≠ 0 para algún i
Ho : β1 = β2 = βb = 0
HA βi ≠ 0 para algún i
Ho : (αβij) = 0 para todo ij
HA : (αβij) ≠ 0 para algún ij
Estas hipótesis se probaron mediante el análisis de varianza ANOVA ,
cuyo modelo está descrito por la ecuación No 2
SCT = SCA + SCB + SCAB + SCE Ecuación 2
165
Si el valor p es menor al nivel de significancia α prefijado ( 95%), se
concluye que la correspondiente hipótesis es significativa, es decir ese efecto
está activo o influye en la variable respuesta, por ejemplo en el análisis
ANOVA para rendimiento de carragenina los dos valores p fueron menores
de 0,05 por lo tanto hay efecto de los factores pH y especie sobre el
rendimiento de carragenina, pero además el valor p responsable del efecto
de interacción pH * especie, también es menor que 0,1 lo que indica que hay
un efecto significativo de la interacción, es decir la respuesta rendimiento de
carragenina esta determinada por la interacción especie* pH.
Para investigar cuales medias causan las diferencias detectadas en el
ANOVA, se usa el modelo LSD ( diferencias mínimas significativas).
Denotando los tres niveles del factor especie como E1 (Hypnea
recolectada en Santa Marta), E2(Hypnea recolectada en la Guajira) y E3
(Kappaphycus alvarezii) y los cinco niveles de factor pH como: pH8,0; pH
8,4; pH8,6; pH 9,0; pH 10,0 Las hipótesis para esta prueba fueron:
Para el factor especie:
Ho µE1 = µE2
HA µE1 ≠ µE2
Ho µE1 = µE3
HA µE1 ≠ µE3
Ho µE2 = µE3
HA µE2 ≠ µE3
Para el factor pH
Ho µpH8 = µpH8,4
HA µpH8 ≠ µpH8,4
Ho µpH8 = µpH8,6
166
HA µpH8 ≠ µpH8,6
Ho µpH8 = µpH9,0
HA µpH8 ≠ µpH9,0
Ho µpH8 = µpH10,0
HA µpH8 ≠ µpH10,0
Ho µpH8,4 = µpH8,6
HA µpH8,4 ≠ µpH8,6
Ho µpH8,4 = µpH9,0
HA µpH8,4 ≠ µpH9,0
Ho µpH8,4 = µpH10,0
HA µpH8,4 ≠ µpH10,0
Ho µpH8,6 = µpH9,0
HA µpH8,6 ≠ µpH9,0
Ho µpH8,6 = µpH10,0
HA µpH8,6 ≠ µpH10,0
Ho µpH9,0 = µpH10,0
HA µpH9,0 ≠ µpH10,0
En el anexo estadístico No 7.2.1 se a aplica un procedimiento de
comparación múltiple para determinar las medias que son significativamente
diferentes unas de otras. Con este método, hay un 5,0% de riesgo de
considerar cada par de medias como significativamente diferentes cuando la
diferencia real es igual a 0.
La gráfica de diagrama de dispersión que se muestra en el análisis
denominado : Scatterploy by level Code, es útil porque permitió observar la
variabilidad de la respuesta en cada punto experimental y concluir que no
hay observaciones atípicas que afecten las conclusiones del estudio.
167
Los supuestos de normalidad, varianza constante e independiente de
los residuos en un diseño factorial se verifican con los métodos gráficos, para
ello se emplea la gráfica que se titula Residual plot for rendimiento, como
todos los puntos caen en una banda horizontal se cumple el supuesto de
varianza constante y el supuesto de normalidad al caer los residuos
alineados en la grafica de probabilidad normal. Las gráficas se presentan
por especie y por pH
Scatterplot by Level Code
rend
imie
nto
Especie
0
20
40
60
80
100
HYG HYS KP
168
Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD
Especie
rend
imie
nto
HYG HYS KP14
24
34
44
54
Residual Plot for rendimientore
sidu
al
predicted rendimiento
-2,1
-1,1
-0,1
0,9
1,9
2,9
0 20 40 60 80 100
Residual Plot for rendimiento
sire
dual
row number
-2,1
-1,1
-0,1
0,9
1,9
2,9
0 10 20 30 40 50
Todos estos análisis se obtienen para cada uno de los parámetros
fisicoquímicos determinados.
169