Post on 10-Jul-2015
Recombinación artificial – ingeniería genética :
- Marcadores Genéticos de tipo “ Moleculares “
- ADN recombinante - enzimas de restricción - Técnicas básicas de
ingeniería genética.- Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) –
Enzima de Restricción : mecanismo de acción
corta
corta
Sitio de restricción
Secuencia palindrómo
Visualización de productos de la restricción:
ADN de virus / endonucleasa de restricción PsiI
M: marcador de peso molecular (fragmentos del DNA de virus lambda /enzima BmeI8I).
1-2-3: ADN de diferentes virus
Importancia :
Enzima de restricción : EcoRI
ADN del organismo 1
ADN del organismo 2
Mutaciones en sitios de restricción
ADN de virus, con la endonucleasa de restricción PsiI
M: marcador de peso molecular (fragmentos del DNA de virus lambda /enzima BmeI8I).
1-2-3: ADN de diferentes virus
Mutación en el sitio de restricción : Marcador genético
Normal
Enfermo
Mutación en el sitio de restricción : Marcador genético
Gen normal
Gen mutado
Huellas…….
Huellitas …….
Marcas ……
Marcadores…..
Gen de interés agronómico
Locus “marcador”
* Marcadores genéticos
Loci heredables asociados (ligados) a un carácter de interés agronómico y se heredan juntos.
Utilidad :
Agronómicamente : asisten al mejorador en el proceso de selección artificial temprana de un fenotipo superior.
* Morfológicos * Isoenzimáticos
2- Secuencias nucleotídicas no codificantes
* Moleculares (ácidos nucleicos)
MARCADORES GENÉTICOS
1- Secuencias nucleotídicas codificantes
En cebada
sex1 1cM ms 9
sex1 1cM ms 9
Y 5 cM ms1
Y 5 cM ms1
Maíz
AndroesterilidadEndosperma blanco
AndroesterilidadEndosperma blanco
Marcadores Morfológicos
*Marcadores isoenzimáticos
- Polimorfismo a nivel del producto génico (polipéptido o proteína)
MARCADORES GENÉTICOS
REPLICACIÓN NATURAL DEL DNA
MARCADORES GENÉTICOS “ MOLECULARES “ BASADOS EN LA PCR (Replicación “in vitro” del DNA )
Replicación del DNA
Replicación “in vivo” del DNA
* Helicasa
* Proteínas de unión a cadena sencilla (SSBP)
* Topoisomerasa ADN girasa
* Iniciación de la síntesis
* ADN polimerasa III
* Primasa, ARN polimerasa
* ADN polimerasa III
* ADN ligasa.
* Corrección : polimerasas I y III
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Los pasos 2 a 4 se repiten 30-35 veces e incrementan más de 106 veces el fragmento de DNA de interés
Etapas para la reacción de PCR
Hibridación de oligonucleótidos (cebadores)
4Reacción de PCR
MARCADORES GENÉTICOS “ MOLECULARES “ BASADOS EN LA PCR (Replicación “in vitro” del DNA )
-Microsatélites ó SSR (Single Sequence Repeat)
-5´- AT AT AT AT AT AT AT – 3´
- 5´- GTC GTC GTC GTC GTC – 3´
- 5´- CGAT CGAT CGAT CGAT – 3´
Marcadores tipo SSR (Microsatélites)
Fingerprinting de la Variedad Arbequina de Olivo
oli 11 oli 12 oli 17 oli 22
1 2 3 4 1 2 3 4 M 1 2 3 4 1 2 3 4
MPM (pb)
500
400
300
200
100
A
MPM (pb)
200
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
B
Figura 3: Electroforesis en gel de agarosa 3%
(A) IAS oli 12
(B) IAS oli 17
1- Empeltre de refer. (CSIC, España);
2- Empeltre LP;
3- Manzanilla de refer. (CSIC, España);
4-Manzanilla EC;
5- Manzanilla 4S;
6- Manzanilla gigante 4S;
7- Picual de refer.
8- Nevadillo EC;
9- Nevadillo 4S;
M: 100 pb. DNA ladder (Sigma).
Microsatélites en Olivo (Diversidad )
Utilidad de los Marcadores genéticos
1- FINGERPRINTING (huella genética)
2- BANCOS DE GERMOPLASMA
3- MAPAS GENÉTICOS
4- LOCI LIGADOS
5- DIVERSIDAD Y ESTRUCTURA GENÉTICA
6- FORMA DE REPRODUCCIÓN
7- EVOLUCIÓN Y FILOGENIA
Selección Asistida por Marcadores (MAS)
Marcadores Genéticos
1- Basados en la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
2- Basados en la digestión con endonucleasas (enzimas de restricción)
a) RFLP: (Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricciòn)
*MARCADORES MOLECULARES: - Polimorfismo genético directamente a nivel del DNA
Enzimas de restricción
Enzimas de tipo II :
- Corte simétrico exacto en secuencias específicas palindrómicas
- Origen : diferentes organismos
-Denominación : sistema alfa numérico, (EcoRI proviene de Escherichia coli
- Generan extremos cohesivos ó romos
Técnica de RFLP
NlaIII
RsaI
Tsp509I
TaqI
MseI
Desnaturalización del DNA
Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR)
Ciclo 3
Marcadores moleculares basados en el: Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP)
Marcadores morfológicos: controlados por un solo loci y presentan expresión temprana
a) En Brassica: primera hoja vellosa
b) En maíz: raíz primaria púrpura ó coleoptilo púrpura
Asociados a la Haploidía
Selección asistida por marcadores (MAS)
Marcadores tipo SSR´s (Microsatélites – STR´s- VNTR´s)
e.g. 5' overhangEcoRI G'AATTC
BamHIG'GATCC
3' overhang PstICTGCA'G
(2) When the ends of the restriction fragments are complementary,
e.g. for EcoRI 5' G‑‑‑AATTC 3'‑‑‑
3' CTTAA‑‑‑ G 5'‑‑‑
Figure 3.3.
b. Blunt ends
ADN del organismo 1
ADN del organismo 2
Marcador Isoenzimático
Enzima monomérica
Enzima dimérica