Post on 17-Feb-2019
Utilización de modelos celulares in vitropara la optimización de sistema de
liberación controlada de antitumorales
María Jesús GarridoDpto. Farmacia y Tecnología Farmacéutica
Universidad de Navarra
¿Por qué sistemas in vitro?l Permiten explorar y cuantificar procesos propiamente
celulares además, de procesos o mecanismos debidos a la acción del agente que se ensaye.
l Es posible medir la evolución temporal de una respuesta concreta.
l Posibilidad de evaluar combinaciones farmacológicas.
Principal Limitaciónl Se ignoran procesos de regulación o feed-back
debidos a la propia fisiología o fisiopatología del individuo.
Antitumorales• Principales Mecanismos:
-Mecanismos Citostáticos-Mecanismos Citotóxicos
Mecanismo de Acción Fármaco
Citostático
Citotóxico
Tiempo de exposición al fármaco antitumoral
Viabilidad celular
Tiempo (h)
Cél
ulas
x 1
000
0 20 40 60
1020
4060
8010
0
> concentración fármaco >Inhibición crecimiento celular
basal> concentración fármaco > muerte celular
Ejemplo de ambos mecanismosCamptothecina
0
20
40
60
80
100
0 12 24 36 48 60 72
Tiempo (h)
Nº
Cél
ulas
*100
0
C
10nM
100nM
400nM
500nM
1000nM
Topotecan
0
20
40
60
80
100
0 12 24 36 48 60 72
Tiempo (h)
Nº
Cél
ulas
*100
0
C
100nM
500nM
1000nM
1500nM
2000nM
Cisplatino
0
20
40
60
80
100
0 12 24 36 48 60 72
Tiempo (h)
NºC
élul
as*1
000
C
2.5mM
10mM
25mM
50mM
100mM
200mM
CISPLATINO (CDDP)
Pt
NH3
Cl
Cl
NH3
• Agente alquilante � uniones de tipo covalente ADN
• Capacidad antitumoral en gran variedad de tumores sólidos (testículo, ovario, vejiga, pulmón …)
• Eficacia limitada en cáncer de colon
• Alta toxicidad y fenómenos de resistencia
Cisplatino
Antecedentes:• Administraciones continuas de niveles subterapéuticos causaban
una activación mayor de apoptosis que una administración de
dosis elevada.
• Nanopartículas de paclitaxel eran capaces de superar los fenómenos
resistencia.
Objetivos
• Desarrollar formulaciones de liberacióncontrolada para disminuir la toxicidad y/oaumentar la eficacia del cisplatino.
• La caracterización in vitro del efectoantiproliferativo de las distintas formas de liberación controlada de cisplatino.
– Combinando sistemas de cultivos celulares y técnicas de modelización matemática
Caracterización de los perfiles de liberación de cisplatino desde las distintas formulaciones
0
0.4
0.8
1.2
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Time (days)
Cu
mu
lati
ve F
ract
ion
al R
elea
se (
Ft)
NP-ANP-BMP
Ecuación
( ) ( ))( 502
1
11 Ttk
tkt
eB
eAMM
−−×−
∞ ++−×=
where, A is the fraction of drug released during the phase I, k1 is the release rate constant during this phase; B is the fraction of total drug released during the phase III, k2 is the release rate constant during this phase and T50 is the time taken to release 50% of entrapped drug
- Fase de difusión: A y k1- Fase de entrada de agua a la matriz: T50- Fase de degradación de la matriz: B y k2
Descripción de los perfiles de liberación de cisplatino
0 5 10 15 20 25 30 35Time (days)
0.1
0.7
0.1
0.7
0.1
0.7
MP
NP-A
NP-B
Ft (
Mt/M
∞)
Aplicación de las diferentes formas farmacéuticas
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Descripción del efecto antiproliferativo
CISPLATINO (CDDP)
PtNH3
Cl
Cl
NH3
•••• Agente alquilante � uniones de tipo covalente ADN
ADUCTOS CDDP-ADNINHIBICIÓN PROCESOS TRANSDUCCIÓN Y REPLICACIÓN
PARO DEL CICLO CELULAR(Sistemas Control Celular: CHECKPOINT)
ACTIVACIÓN CASCADA TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES APOPTÓTICASPROTEASAS FAMILIA CASPASAS � CASPASA-3
MUERTE CELULAR PROGRAMADA � APOPTOSIS / MUERTE MITÓTICA(FRAGMENTACIÓN DEL ADN)
ACUMULACIÓN CÉLULAS FASE G2/M
Cisplatino
Mecanismo de acción
N
Proliferación
Cisplatino
+
Señal
....+ � �+ � �+ � �+ � �
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+
Muerte celular
Mecanismo de acción “in vitro”Modelo de citotoxicidad
ModelizaciónCisplatino Mecanismo de Acción Citotóxico
Time (h)
Cel
ls x
100
0
0 20 40 60
020
4060
80
0 nM2.5 nM10 nM18 nM25 nM50 nM100 nM200 nM
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+
+
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Proliferación
N
Proliferación
Cisplatino
+
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Muerte celular
Mecanismo de acción “in vitro”Modelo de citotoxicidad
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Descripción del efecto antiproliferativo
Mecanismo de acción
0
15
30
45
60
0 10 24 48 72 144 0
15
30
45
60
0 10 24 48 72 144
0
15
30
45
60
0 10 24 48 72 1440
15
30
45
60
0 10 24 48 72 144
0
15
30
45
60
0 10 24 48 72 1440
15
30
45
60
0 10 24 48 72 144
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30
45
60
0 10 24 48 72 144 0
15
30
45
60
0 10 24 48 72 144
0
15
30
45
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0 10 24 48 72 1440
15
30
45
60
0 10 24 48 72 144
0
15
30
45
60
0 10 24 48 72 1440
15
30
45
60
0 10 24 48 72 144
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45
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0 10 24 48 72 144 0
15
30
45
60
0 10 24 48 72 144
0
15
30
45
60
0 10 24 48 72 1440
15
30
45
60
0 10 24 48 72 144
0
15
30
45
60
0 10 24 48 72 1440
15
30
45
60
0 10 24 48 72 144
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Ciclo celularActivación Caspasa-3
0
0.5
1
1.5
0 3 10 24 48 72 144
0
0.5
1
1.5
0 3 10 24 48 72 144
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 3 10 24 48 72 144
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0
0.5
1
1.5
0 3 10 24 48 72 1440
0.5
1
1.5
0 3 10 24 48 72 144
0
0.5
1
1.5
0 3 10 24 48 72 1440
0.5
1
1.5
0 3 10 24 48 72 144
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 3 10 24 48 72 1440
0.5
1
1.5
2
2.5
0 3 10 24 48 72 144
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0 1 2 3 4 5 60
50
100
0
50
100
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k1 = 0.05
k1 = 1
0 1 2 3 4 5 60
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0
40
80
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T50 = 5
T50=25
0 1 2 3 4 5 6
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80
0
40
80
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50
100
0
50
100
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50
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k1 = 1
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0
40
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0
40
80
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T50 = 5
T50=25
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Aplicación in silico para optimizar las formulaciones
Conclusiones• Mediante esta estrategia fue posible identificar y
cuantificar dos mecanismos de acción para el cisplatino:– El primero: “inhibición de la proliferación” apoyado por
el efecto observado en ciclo celular– El segundo muerte celular por activación de la vía
apoptótica debida a la caspasa-3.• El modelo concentración-efecto propuesto tuvo
características semi-mecanicista apoyadas por los resultados observados, y resultó una buenaherramienta para explorar in sílico la optimizaciónde las formulaciones para su posterior uso en sistemas in vivo
Perfiles temporales de las concentraciones plasmáticas de
cisplatino
0.01
0.1
1
10
100
0 5 10 15 20
CDDP IV CDDP IP NP B IP
CD
DP
conc
entr
ació
n (m
g/L
Pt)
Tiempo (días)
Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3
Evolución temporal del efecto antitumoral:cisplatino libre vs. encapsulado
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
0 5 10 15 20 25 30
Time (days)
Tum
or v
olum
e (m
m3 )
Control
NP-empty
Cisplatin iv
Cisplatin ip
NP-B ip
Evolución temporal del efecto tóxico:cisplatino libre vs. encapsulado
0.75
0.90
1.05
1.20
0 5 10 15 20 25 30
Time (days)
Rel
ativ
e cha
nge i
n bo
dyw
eigh
t
Control
Cis I.V.
Cis I.P.
NP-B I.P.
0.75
0.90
1.05
1.20
0 5 10 15 20 25 30
Time (days)
Rel
ativ
e cha
nge i
n bo
dyw
eigh
t
Control
Cis I.V.
Cis I.P.
NP-B I.P.
Biodistribución del cisplatino y actividad apoptótica inducida en tumor
Drug levels (µg cisplatin /g tissue)
Caspase-3 (pg/ g tissue)
Lung Liver Kidneys Spleen Tumor Tumor
Control n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 21.2± 12.3a
Cisplatin 0.4 ± 0.2 3.6 ± 1.3 5.1 ± 1.4 2.3 ± 1.4 1.1± 0.6 46.1± 26.0b
Cisplatin-NP
0.4 ± 0.1 2.1 ± 0.9 5.9 ± 1.9 6.5 ± 1.8* 0.12± 0.06* 98.8±23.8*a,b
NP: presentaron similar eficacia y menor toxicidad