Post on 14-Oct-2019
OBTENCIÓN DE UN HIDROLIZADO ENZIMÁTICO BIOACTIVO DE PROTEÍNA MICROALGAL CON
POTENCIAL ANTIMICROBIANO
Lucia Verdugo González
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Maestría en Ciencias-Biotecnología
Medellín, Colombia
2018
OBTENCIÓN DE UN HIDROLIZADO
ENZIMÁTICO BIOACTIVO DE PROTEINA MICROALGAL CON POTENCIAL
ANTIMICROBIANO
Lucia Verdugo González
Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título
de:
Magister en Ciencias-Biotecnología
Director:
MSc, Alejandro Acosta Cárdenas
Codirectores:
Ph.D., Arley David Zapata Zapata Ph.D., Edith Marleny Cadena Chamorro
Línea de Investigación:
Biotecnología microalgal
Grupo de Investigación:
Grupo de Biotransformación-Universidad de Antioquia
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Maestría en Ciencias-Biotecnología
Medellín, Colombia
2018
“Y si todo esto es un sueño, que importa. Me gusta y quiero seguir soñándolo “
Luis Sepúlveda
Agradecimientos
Al grupo de Procesos Agrícolas de la Universidad Nacional, por su disposición y ayuda
incondicional.
Al acuario del Parque Explora por permitirnos usar sus instalaciones y equipos.
Al PECET por brindarme el espacio y la confianza para desarrollar mi experimentación,
especialmente a Sergio Pulido, María Fernanda Flores y Hoover Pantoja, quienes, gracias
a su paciencia y su valioso esfuerzo, me permitieron incursionar en un área desconocida.
A los profesores Carlos Eduardo Mejía, Luisa Fernanda Rojas y Orlando Ruíz por su aporte
invaluable en este trabajo.
A mi compañero Jeison Guayara por su amistad y respaldo en cada etapa del proceso.
A todos los integrantes del grupo Biotransformación por su apoyo moral y académico
durante estos años.
A mis tutores Alejandro Acosta, Arley Zapata y Edith Cadena por su infinita paciencia, sus
sugerencias y enseñanzas, que me hicieron mejorar profesional y personalmente.
A mis amigos por compartir los buenos y malos momentos.
A mi mamá por ser mi motivación constante, por sus consejos y palabras de aliento y a mi
papá a quien llevo en mi corazón.
Resumen
Las microalgas son microorganismos fotosintéticos, ampliamente utilizados a nivel
industrial por su alto contenido de proteínas, lípidos, carbohidratos, vitaminas, pigmentos
entre otros. Específicamente la proteína microalgal es una fuente prometedora de péptidos
con propiedades bioactivas, entre ellas, antimicrobianas. Los péptidos antimicrobianos
poseen un amplio rango de acción contra bacterias, hongos, virus, parásitos y células
tumorales y no producen la resistencia de los antibióticos convencionales.
En este trabajo, a partir de biomasa de la microalga Nannochloropsis sp. se obtuvo un
extracto de proteínas mediante el desarrollo de un protocolo de disrupción celular
mecánica por homogenización a pH neutro, el cual alcanzó un porcentaje de lisis del 60%.
El extracto y la biomasa intacta fueron sometidos a hidrolisis enzimática con dos proteasas
de manera simultánea, papaína y pancreatina, alcanzando un grado de hidrólisis superior
al 80% y al 20% respectivamente, después de 6 horas de reacción, demostrando la
resistencia que ejerce la pared celular frente la acción enzimática. Se evaluó el efecto
antimicrobiano de diferentes concentraciones del extracto hidrolizado con un tamaño
menor a 3KDa contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans,
obteniendo porcentajes de inhibición de 93,14%, 96,65% y 14,46% respectivamente,
convirtiendo a Nannochloropsis sp, en una microalga con un gran potencial para la
obtención de péptidos bioactivos con actividad antimicrobiana.
Palabras clave: péptidos antimicrobianos, proteína microalgal, hidrolizado enzimático,
Nannochloropsis sp.
8 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
Abstract
Microalgae are photosynthetic organisms, widely used at industrial level for their high
content of proteins, lipids, carbohydrates, vitamins, pigments and others. Specifically, the
microalgal protein is a promising source of peptides with bioactive properties, including
antimicrobial. Antimicrobial peptides have a wide range of action against bacteria, fungi,
viruses, parasites and tumor cells and do not produce the resistance of conventional
antibiotics.
In this work, from Nannochloropsis sp biomass, a protein extract was obtained through the
development of a mechanical cell disruption protocol by homogenization, which reached a
60% lysis percentage. The extract and the intact biomass were subjected to enzymatic
hydrolysis with two proteases simultaneously, papain and pancreatin, reaching a degree of
hydrolysis higher than 80% and 20% respectively, after 6 hours of reaction, demonstrating
the resistance exerted by the cell wall against enzymatic action. The antimicrobial effect of
different concentrations of the fraction less than 3KDa of the hydrolyzed extract against
Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Candida albicans was evaluated, obtaining
average inhibition percentages of 93,14, 96,65% and 14,46% respectively, converting
Nannochloropsis sp, into a microalgae with a great potential for obtaining bioactive peptides
with antimicrobial activity.
Keywords: antimicrobial peptides, microalgal protein, enzymatic hydrolyzate,
Nannochloropsis sp.
Contenido
Pág.
Agradecimientos ............................................................................................................. 6
Resumen .......................................................................................................................... 7
Abstract............................................................................................................................ 8
Contenido ........................................................................................................................ 9
Lista de figuras .............................................................................................................. 11
Lista de tablas ............................................................................................................... 12
Lista de abreviaturas ..................................................................................................... 13
Introducción................................................................................................................... 15
1. Estado del arte ....................................................................................................... 17 1.1 Microalgas .........................................................................................................17 1.2 Extracción de proteína ......................................................................................20 1.3 Hidrolizados proteicos .......................................................................................23
1.3.1 Papaína y Pancreatina .................................................................................... 24 1.4 Antibióticos tradicionales ...................................................................................26 1.5 Péptidos antimicrobianos ..................................................................................28
2. Objetivos ................................................................................................................. 31 2.1 General .............................................................................................................31 2.2 Específicos ........................................................................................................31
3. Metodología ............................................................................................................ 33 3.1 Cultivo y obtención de biomasa .........................................................................33 3.2 Lisis celular y extracción de proteína .................................................................33
3.2.1 Cuantificación de proteína ............................................................................. 36 3.3 Hidrólisis enzimática empleando proteasas .......................................................36
3.3.1 Actividad enzimática de proteasas ................................................................. 36 3.3.2 Determinación de las condiciones de pH y temperatura ................................ 38 3.3.3 Hidrólisis enzimática sobre el extracto proteico.............................................. 39 3.3.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) ..................................... 40 3.3.5 Espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier .................................. 41
3.4 Actividad antimicrobiana....................................................................................41 3.4.1 Porcentaje de inhibición ................................................................................. 43
3.5 Análisis estadísticos ..........................................................................................43
10 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
4. Resultados y discusión ......................................................................................... 45
4.1 Lisis celular y extracción de proteína ................................................................ 45 4.2 Hidrólisis enzimática ......................................................................................... 49
4.2.1 Actividad enzimática de proteasas ................................................................ 49 4.2.2 Determinación de las condiciones de pH y temperatura ................................ 50 4.2.3 Hidrólisis enzimática sobre el extracto proteico ............................................. 53 4.2.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) ..................................... 55 4.2.5 Espectroscopia Infrarroja con transformada de Fourier ................................. 57
4.3 Actividad antimicrobiana ................................................................................... 59
5. Conclusiones y recomendaciones ....................................................................... 63 5.1 Conclusiones .................................................................................................... 63 5.2 Recomendaciones ............................................................................................ 64
6. Bibliografía ............................................................................................................. 65
A. Anexo: Perfil de proteína soluble en el tiempo para papaína y pancreatina. .... 75
B. Anexo: Análisis estadísticos ................................................................................. 77
C. Anexo: Curvas de calibración ............................................................................... 82
D. Anexo: Especificaciones de las enzimas empleadas. ......................................... 84
Lista de figuras
Figura 1. Células de Nannochloropsis sp. .......................................................................18
Figura 2. Modelo de la pared celular de Nannochloropsis (Scholz et al., 2014). .............20
Figura 3. Protocolo de actividad antimicrobiana. ................ ¡Error! Marcador no definido.
Figura 4. Protocolo de lisis celular y extracción de proteínas por homogenización. ........47
Figura 5. Células de Nannochloropsis sp. al inicio y al final del tratamiento de lisis celular.
........................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.
Figura 6. Diagrama de superficie de respuesta estimada en diferentes niveles de pH y
temperatura de la papaína sobre caseína. ......................................................................50
Figura 7. Diagrama de superficie de respuesta estimada en diferentes niveles de pH y
temperatura de la pancreatina sobre caseína. .................................................................51
Figura 8. Gráfico de contornos para ambas enzimas utilizadas a diferentes niveles de
temperatura y pH. ............................................................................................................53
Figura 9. Sustratos sometidos a hidrólisis proteica con el complejo enzimático. .............54
Figura 10. Grado de hidrólisis en el tiempo obtenido después de proteólisis enzimática
de papaína-pancreatina a 44oC y pH 7 sobre caseína, biomasa microalgal sin tratamiento
y extracto de proteínas de Nannochloropsis sp ...............................................................55
Figura 11. Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). M) Marcador molecular
utilizado. 1) Muestra de extracto antes de hidrólisis. 2) Muestra del extracto después de
someterse a hidrólisis enzimática. ...................................................................................56
Figura 12. Espectros FT-IR de biomasa de Nannochloropsis sp. y los diferentes extractos
de proteína obtenidos. .....................................................................................................58
Figura 13. Crecimiento de S. aureus, E. coli y C.albicans con diferentes concentraciones
de extracto hidrolizado (C1:33,35%(v/v); C2: 20%(v/v) y C3:10%(v/v)) ...........................59
Figura 14. Porcentaje de inhibición de E.coli, S.aureus y C.albicans a diferentes
concentraciones de hidrolizado enzimático. ....................................................................60
Figura 15. Perfil de proteína soluble en el tiempo por actividad de la Papaína (E/S 1%
p/p) sobre caseína. ..........................................................................................................75
Figura 16. . Perfil de proteína soluble en el tiempo por actividad de la Pancreatina (E/S
1%p/p) sobre caseína......................................................................................................76
Figura 17. Curva de calibración para actividad enzimática de proteasas. .......................82
Figura 18. Curva de calibración de BSA para el método de Lowry. ................................83
Figura 19. Ficha dada por el fabricante de la enzima Papaína 4000 DB. ........................85
Lista de tablas
Pág.
Tabla 1. Composición bioquímica de algunas especies de Nannochloropsis. ................. 18
Tabla 2. Comparación del perfil de aminoácidos de Nannochloropsis con proteínas de
referencia. (mg/g proteína) .............................................................................................. 19
Tabla 3. Biofuncionalidades de péptidos y proteínas de microalgas. .............................. 19
Tabla 4. Mecanismos de lisis celular para diferentes especies de Nannochloropsis
mediante tratamientos individuales o consecutivos ......................................................... 22
Tabla 5. Aplicaciones industriales de algunas enzimas (Liu & Kokare, 2016). ................ 23
Tabla 6. Características generales de algunas proteasas. .............................................. 25
Tabla 7. Algunos antibióticos de origen microbiano (Centrón, 2015). ............................. 27
Tabla 8. Antibióticos y antifúngicos convencionales para el tratamiento de infecciones
causadas por E. coli, S.aureus y C. albicans .................................................................. 27
Tabla 9. Métodos secuenciales de extracción de proteína. ............................................. 34
Tabla 10. Volúmenes para la curva de calibración de Tirosina. ...................................... 37
Tabla 11. Condiciones experimentales en el diseño de superficie respuesta para ambas
enzimas. ......................................................................................................................... 38
Tabla 12. Tipos de soluciones buffer empleadas en el experimento de acuerdo al pH del
tratamiento. ..................................................................................................................... 39
Tabla 13. Concentración de Nitrógeno total y proteína cruda en la biomasa inicial de
Nannochloropsis sp......................................................................................................... 45
Tabla 14. Rendimiento de extracción de los métodos de lisis celular. ............................. 46
Tabla 15. Porcentaje de lisis celular bajo diferentes ciclos de homogenización. ............. 47
Tabla 16. Porcentaje de células lisadas en el método de homogenización. .................... 47
Tabla 17. Concentración de proteína y actividad específica de los extractos enzimáticos
empleados de acuerdo a la metodología de Sigma-Aldrich (2014).................................. 49
Tabla 18. Condiciones de temperatura y pH que maximizan el grado de hidrólisis de
acuerdo a las condiciones planteadas para cada enzima. .............................................. 51
Tabla 19. Condiciones de temperatura y pH óptimas reportadas en la literatura para las
enzimas empleadas. ....................................................................................................... 52
Tabla 20. Concentración de proteína en las fracciones obtenidas del extracto hidrolizado.
....................................................................................................................................... 57
Lista de abreviaturas
Abreviaturas Abreviatura Término
ANOVA
BHI
Análisis de varianza
Brain Heart Infusion
BSA Seroalbúmina bovina
CO2 Dióxido de carbon
DBO Demanda biológica de oxígeno
DNA Ácido desoxirribonucléico
DQO Demanda química de oxígeno
EPA
FTIR
Ácido eicosapentaeinoico
Espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier
E/S Relación enzima-sustrato
KDa Kilodalton
mL Mililitro
mm
mM
Milímetro
Milimolar
NaOH Hidróxido de sódio
PAMs Péptidos antimicrobianos
PDA Potato Dextrose Agar
14 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
Abreviatura Término
rpm Revoluciones por minute
TCA Ácido tricloroacético
TSA Trypticase Soy Agar
UFC Unidades formadoras de colonias
V Voltios
µL Microlitro
µm Micrómetro
µmol Micromol
Introducción
Las microalgas son microorganismos unicelulares o pluricelulares, fotosintéticos,
capaces de transformar la luz solar en energía, para cumplir todas sus funciones vitales
(Catalá, 2013). Los usos tradicionales de las microalgas como biomasa obtenida de forma
natural abarcan principalmente campos como la nutrición humana y la alimentación animal
(Casal, 2010). Sin embargo, las microalgas pueden producir una gran cantidad de
productos de interés entre los cuales se encuentran vitaminas (Quintana, Hernández
Nazario, Morris, & Fernandez Gonzalez, 1999), lípidos (Cho, Oh, Park, Lee, & Park, 2013),
proteínas (Ursu et al., 2014), aminoácidos esenciales (Tibbetts, Bjornsson, & McGinn,
2015), carbohidratos (Martín, Lorenzo, Muñoz, Blanco, & Bolado, 2016), compuestos
bioactivos (Santhosh, Dhandapani, & Hemalatha, 2016), pigmentos (Romero et al., 2017),
productos farmacéuticos, entre otros.
Específicamente, las proteínas provenientes de microalgas han recibido especial
interés por sus posibles propiedades bioactivas cumpliendo funciones antioxidantes (I. C.
Sheih, Wu, & Fang, 2009), hepatoprotectoras (Ibañez, Herrero, Mendiola, & Castro-
Puyana, 2012), antihipertensivas (Ejike et al., 2017) y antimicrobianas (Sun, Chang, Li, &
Li, 2016), entre otras. Sin embargo, su interés no reside únicamente en la proteína intacta
como tal, sino también en los péptidos presentes en sus secuencias, responsables de las
funciones nombradas anteriormente, los cuales sólo serán activos después de su
liberación mediante hidrólisis enzimática con proteasas (Fernández, 2015).
En la actualidad, la constante preocupación por la resistencia que han generado los
microorganismos ante el uso excesivo e indebido de los antibióticos convencionales, se ha
incrementado dadas las dificultades en el tratamiento y control de enfermedades
infecciosas. La resistencia que generan los antibióticos es una respuesta natural de
adaptación evolutiva de los microorganismos frente a un estímulo constante (Y. Sánchez,
2015). El mecanismo de acción de estos compuestos permanece estable, perdiendo
comúnmente su eficacia. En este sentido, una buena solución ante este problema es
16 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
encontrar compuestos que presenten mecanismos de acción diferentes como es el caso
de los péptido antimicrobianos (PAMs).
Los PAMs se han encontrado desde la década de los años 20, en diferentes
fuentes, como microorganismos, insectos, anfibios, plantas o mamíferos y su aislamiento
y caracterización empezó a llevarse a cabo en los años 80 (M. L. Sánchez, 2016). Estos
compuestos hacen parte del sistema inmune innato de gran variedad de organismos,
actuando como una barrera natural contra el ataque de patógenos (Y. Sánchez, 2015).
Presentan ciertas ventajas como su amplio espectro de acción antimicrobiana, eficaz
contra bacterias, hongos, virus o parásitos y la vasta diversidad estructural, que le confiere
la posibilidad de poseer varios blancos moleculares en su papel terapéutico, entre los que
se encuentran membranas celulares, DNA/RNA, proteínas, ácidos nucleicos y enzimas
(Jessica Castañeda et al., 2009; M. L. Sánchez, 2016).
Se han reportado investigaciones donde se demuestra el potencial de diferentes
péptidos e hidrolizados proteicos de origen microalgal con actividad antimicrobiana (Sun
et al., 2016), actividad antiviral (El-Baz, El-Senousy, El-Sayed, & Kamel, 2013), actividad
inmunoreguladora (Hirahashi et al., 2002; Humberto J. Morris et al., 2007), las cuales abren
el camino a nuevas propuestas en el campo del desarrollo de productos de origen biológico
a partir de una fuente de proteína no convencional, como la biomasa microalgal, con una
amplia gama de aplicaciones, más allá de la alimentación animal y humana, precisando
las herramientas modernas de la biotecnología para brindar una plataforma a la obtención
y aplicación de nuevos agentes terapéuticos (Samarakoon & Jeon, 2012).
En este trabajo, se desarrolló una estrategia para la lisis celular y
consecuentemente la liberación de proteínas provenientes de la microalga
Nannochloropsis sp., mediante un tratamiento mecánico. Posteriormente, se llevó a cabo
una hidrólisis enzimática con un complejo de proteasas sobre las proteínas vegetales y se
evaluó la actividad antimicrobiana del extracto hidrolizado obtenido contra los
microorganismos Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans, con el fin
de probar su efectividad en diferentes morfologías celulares.
Estado del arte 17
1. Estado del arte
1.1 Microalgas
Existen más de 200.000 especies de microalgas aproximadamente, algunas de las
cuales han jugado un papel importante en el campo biotecnológico por su implementación
en industrias como la de alimentos, cosméticos, fármacos, biocombustibles, fertilizantes,
tratamiento de aguas, entre otros (Bleakley & Hayes, 2017). Adicionalmente, las
microalgas pueden cultivarse en cualquier época del año (Zeriouh, 2013) y juegan un papel
biorremediador eliminando metales pesados, nitrógeno y fósforo de aguas contaminadas,
disminuyendo las cargas de DBO y DQO (Hernández & Labbé, 2014), incorporando en su
ciclo metabólico CO2 atmosférico y produciendo biomasa.
Nannocholoropsis es un género compuesto por 5 especies unicelulares, de forma
redonda, con un diámetro celular que va de 2-5 µm (Rojo, Morales, Ibarra, Martínez, &
Medina, 2016). Esta microalga ha sido ampliamente utilizada en la industria acuícola, por
presentar un elevado valor nutricional y producir compuestos químicos de alto valor
industrial como pigmentos (clorofila a, zeaxantina, cantaxantina y astaxantina) y ácidos
grasos poliinsaturados, especialmente el ácido eicosapentaeinoico (EPA), el cuál ha sido
utilizado para tratamiento de diversas enfermedades (Rocha, Garcia, & Henriques, 2003).
18 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
Figura 1. Células de Nannochloropsis sp.
Si bien la composición bioquímica de las microalgas dependen de muchos factores
como las condiciones de cultivo, disponibilidad de nutrientes, salinidad, temperatura, luz,
pH entre otros, y puede variar inclusive en la misma cepa, el perfil de aminoácidos, se
mantiene relativamente estable frente a estas condiciones (Cañavate, 2011).
Tabla 1. Composición bioquímica de algunas especies de Nannochloropsis.
Microalga Proteína (%) Carbohidratos (%) Lípidos (%) Referencia
Nannochloropsis sp. 60 15 16 Khatoon et al., 2014
Nannochloropsis oculata 19 37 11 Cavonius et al., 2016
Nannochloropsis oceánica 14,46 8,33 30,7 Ashour et al., 2017
La calidad nutricional de las proteínas se puede determinar por el contenido,
proporción y disponibilidad de estos aminoácidos (Ursu et al., 2014). En este sentido, las
bondades nutricionales de la proteína microalgal son comparables con proteínas vegetales
como la soya (Zeriouh, 2013), como se muestra en la tabla 2.
Estado del arte 19
Tabla 2. Comparación del perfil de aminoácidos de Nannochloropsis con proteínas de
referencia. (mg/g proteína)
Aminoácido esenciales
Patrón (1-3 años) a
Soya a Nannochloropsis granulata b Nannochloropsis sp. c
Histidina 18 27 7,5 7,6
Isoleucina 25 48 17,4 11,5
Leucina 55 67 32,4 29,8
Lisina 51 81 24,1 22,9
Metionina y cisteína
25 30 11,4 3,8
Fenilalanina y tirosina
47 65 33,2 34
Treonina 27 43 16,5 17,2
Triptófano 7 15 0,4 N.C
Valina 32 50 21,5 15,1
N.C: No cuantificado a: Tomado de Ridner (2006) b:Tomado de Tibbetts et al. (2015) c: Tomado de James, Al-Hinty, & Salman (1989)
La proteína microalgal como fuente alternativa a la proteína vegetal convencional
presenta importantes ventajas con respecto a su producción y obtención. Mientras que los
cultivos habituales precisan grandes extensiones de tierra fértil y cantidades significativas
de agua potable, las microalgas no las requieren para su crecimiento, lo cual no las
convierte en una competencia para la producción de alimentos y otros cultivos necesarios
(Bleakley & Hayes, 2017), evitando así, impactos ambientales negativos.
De manera general, las proteínas, hidrolizados proteicos y péptidos de una gran
variedad de cepas de microalgas han presentado diferentes funciones biológicas, estos
pueden alterar las funciones fisiológicas, aumentar el impacto positivo mediante la unión a
receptores específicos o inhibición de reacciones enzimáticas (Samarakoon & Jeon, 2012).
En la tabla 3, se muestra un resumen de la variedad de funciones reportadas por diferentes
investigadores.
Tabla 3. Biofuncionalidades de péptidos y proteínas de microalgas.
Microalga Función Referencia
Arthrospira maxima, Spirulina sp., Chlorella vulgaris
Antioxidante (Lisboa, Pereira, Alberto, & Costa, 2016; Martínez, Martínez, & Dávila, 2015; I.-C. Sheih, Wu, & Fang, 2009)
Spirulina platensis Antiviral (El-Baz et al., 2013)
20 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
Spirulina platensis, Chlorella vulgaris
Inmunoestimulante (Hirahashi et al., 2002; Humberto Joaquín Morris et al., 2009; Watanuki, Ota, Tassakka, Kato, & Sakai, 2006)
Arthrospira máxima Quelante (Martínez et al., 2015)
Chlorella vulgaris Emulsificante (Ursu et al., 2014)
Nannochloropsis oculata Antihipertensiva (Wishvajith Samarakoon et al., 2013)
Spirulina platensis, Chlorella vulgaris
Antimicrobiana (El-Baz et al., 2013; Sedighi, Jalili, Ranaei-Siadat, & Amrane, 2016)
Chlorella vulgaris Anticancerígena (Sedighi et al., 2016)
1.2 Extracción de proteína
La pared celular de las microalgas se presenta como una barrera de protección
contra factores ambientales, permite la transferencia de compuestos hacia el exterior, y
adicionalmente, contiene compuestos de interés como proteínas, carbohidratos, lípidos,
carotenoides, taninos e incluso lignina (Scholz et al., 2014). La pared celular de
Nannochoropsis sp. tiene un grosor que va desde 63 a 119 nm, dependiendo de cada cepa
y sus rasgos genéticos (Jeong et al., 2017).
Es importante resaltar que una etapa crítica en la consecución de compuestos
intracelulares es la disrupción celular ya que es necesario la ruptura de la pared celular de
las microalgas para lograr una adecuada liberación de las moléculas de interés (Bernaerts
et al., 2018; Carl Safi et al., 2014). Sin embargo, este paso puede llegar a ser un
inconveniente en el caso de Nannochloropsis sp. debido a la rigidez que presenta su pared
celular, formada por dos capas. Una capa interior compuesta por celulosa (aprox. el 75%
en peso) y una capa exterior hidrofóbica, llamada algaenan (Z. Zhang & Volkman, 2017),
las cuales le confieren una resistencia mecánica importante.
Extensiones
Capa 1 : Base de Algaenan
Capa 2 : Base de Celulosa
Struts
Membrana de plasma
Citoplasma
Figura 2. Modelo de la pared celular de Nannochloropsis (Scholz et al., 2014).
Estado del arte 21
Se han estudiado diversos mecanismos para este fin, utilizando herramientas
químicas, biológicas y mecánicas. Algunas técnicas incluyen molienda (Schwenzfeier,
Wierenga, & Gruppen, 2011), extracción con solventes (Lee, Show, Ling, & Chang, 2017),
congelación/descongelación (Wang & Zhang, 2012), hidrólisis enzimática (R. Zhang, Chen,
& Zhang, 2018), ultrasonido (Gerde et al., 2013), agitación mecánica (Lupatini et al., 2017),
alta presión (Carl Safi et al., 2014), descargas eléctricas de alto voltaje (Grimi et al., 2014).
En este sentido, la composición de la microalga empleada, su morfología y la composición
específica de la pared celular (Ursu et al., 2014), son elementos fundamentales en la
escogencia del método de extracción ya que éste permitirá garantizar su efectividad en
cuanto a la liberación de compuestos y la estabilidad de todos los metabolitos de interés.
En la tabla 4, se resumen algunas investigaciones empleando diferentes técnicas
para lisis y extracción de proteína de diversas especies de la microalga Nannochloropsis.
Estado del arte 22
Tabla 4. Mecanismos de lisis celular para diferentes especies de Nannochloropsis mediante tratamientos individuales o
consecutivos
Microalga Tipo de extracción Características del proceso Concentración Tiempo Rendimiento Referencias
Nannochloropsis granulata
Fluidos supercríticos CO2 supercrítico, 70°C, 35MPa 350 g 4,5 horas - (Tibbetts et al., 2014)
Nannochloropsis spp. Ultrasonido y Solventes
a pH elevado
Pulsos de 30 s on, 2 minutos off / pH 11,
60°C
5%(p/v) 4 minutos 30% (Gerde et al.,
2013)
Nannochloropsis oculata Disrupción celular con alta presión
2700 bar 0,5 g biomasa/25 mL de agua
destilada
2 pasos 52% (Carl Safi et al., 2014)
Tratamiento químico Solvente: Agua destilada, pH 12 (NaOH 2N), 40°C, en agitación
2 horas 31,10%
Ultrasonicación 20 kHz, Ciclo 5 s on, 15 s off. 30 minutos 13,50%
Molienda manual Molienda y suspensión en agua destilada 2 horas 9,70%
Nannochloropsis gaditana
Campo eléctrico pulsado Longitud de pulso:5 mS; intervalo entre pulsos:5s, Campo de fuerza:30 kV cm-1
60 g/L 10 pulsos 5% (C Safi et al., 2017)
Homogenización de alta presión
1500 bar, velocidad de flujo: 9L/h 100g/L 1 paso 50%
Tratamiento enzimático Alcalase, pH 8 y 50°C. E/S:5%(v/p) 4 horas 35%
Molienda Molino de bolas compuestas de óxido de
zirconio 0,5 mm. Velocidad de agitación 8m/s
100 g/L 1 hora 50%
Tratamientos de lisis celular mediante procesos secuenciales y/o consecutivos
Nannochloropsis sp Campo eléctrico pulsado 20 kV/cm, 1–4 ms, 13,3–53,1 kJ/kg 1% (p/p)
NA Cantidad total de
proteína soluble extraída: 0,7%
(Grimi et al.,
2014)
Descarga eléctrica de
alto voltaje
40 kV/cm, 1–4 ms, 13,3–53,1 kJ/kg 2-800
segundos
Ultrasonicación 200 W, 1–8 min, 12–96 kJ/kg 1-8 minutos
Homogenización de alta
presión
150 MPa, 1–10 passes, 150–1500 kJ/kg NA
Estado del arte 23
1.3 Hidrolizados proteicos
Existe un gran número de microorganismos productores de enzimas, ya sean
bacterias, actinomicetos, hongos y levaduras extracelulares o intracelulares, su producción
es tan versátil como atractiva sumado a una amplia variedad de estructuras y aplicaciones.
Muchas de ellas se producen extracelularmente mediante procesos industriales, ejemplo
de ellos son amilasas, proteasas, pectinasas, lipasas, xilanasas, celulasas, y las lacasas
(Liu & Kokare, 2016). Algunas industrias que utilizan enzimas en sus procesos se aprecian
en la tabla 5.
Tabla 5. Aplicaciones industriales de algunas enzimas (Liu & Kokare, 2016).
Industria Tipo de enzima
Alimentos, lácteos y bebidas Proteasas, Lactasas, Lipasas, Pectinasas, Amilasas, Amiloglucosidasas, Glucosidasas
Detergentes Amilasa, Celulasa, Lipasa, Proteasa, Manasa
Textiles Amilasa, Celulasa, Pectinasa, Catalasa, Keratinasa, Peroxidasa, Proteasa.
Alimentación animal Proteasa, Xilanasa
Producción de etanol Celulasa, Lacasa, Mananasa
Papel y pulpa Amilasa, Celulasa, Lacasa, Celulasa,Hemicelulasa, Proteasa, Lipasa, Xilanasa
Cueros Proteasa, Lipasa
Farmaceútica Peroxidasa, Penicilin acilasa
Biología Molecular Enzimas de restricción, Polimerasas, DNA Ligasa
Las proteasas (EC 3: 4, 11-19, 20-24, 99) (peptidasa o proteinasa) constituyen un
grupo grande y complejo de enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces covalentes
peptídicos. Las proteasas se pueden clasificar en función del pH, la especificidad del
sustrato, similitud con enzimas bien caracterizadas, y el sitio activo.
En este sentido, La hidrólisis proteica consiste básicamente en la ruptura del enlace
peptídico presente en la cadena de las proteínas, con la generación de polipéptidos e
incluso aminoácidos libres (Vioque & Millán, 2005).
24 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
k-1 H2O
El proceso de hidrólisis proteolítica está constituido por tres reacciones
consecutivas. Inicialmente se forma un complejo enzima proteína, con la consecuente
liberación de un péptido, por el rompimiento del enlace peptídico. Este péptido se separa
de la enzima y el proceso vuelve a continuar sobre el nuevo péptido o la proteína inicial
(Benitez, Ibarz, & Pagan, 2008).
𝐸 + 𝑆𝑘1⇔𝐸𝑆
𝑘2→ 𝐸𝑃 + 𝐻 − 𝑃´
𝑘3→ 𝐸 + 𝑃 − 𝑂𝐻 + 𝐻 − 𝑃´
Donde:
E: Enzima, S: Sustrato, P,P´: Péptidos resultantes, kx: Constante de velocidad de reacción.
La hidrólisis enzimática de proteínas presenta ciertas características como la
selectividad, dado que las enzimas son específicas para un determinado enlace y la
reacción se lleva cabo a condiciones moderadas de temperatura y pH, generalmente en el
intervalo de 40 a 60°C y un rango de pH entre 4-8 (Guadix, Guadix, Páez, González, &
Camacho, 2000).
La naturaleza de los péptidos formados en la hidrólisis enzimática, dependen en
gran medida de la naturaleza de las proteasas utilizadas. Las enzimas con actividad
endopeptidasa, rompen los enlaces peptídicos ubicados en el interior de la cadena
proteica, generando péptidos de bajo peso molecular. En contraste, las enzimas con
actividad exopeptidasa, rompen los enlaces en los residuos ubicados en los extremos de
la cadena, logrando polipéptidos y aminoácidos libres (Suarez, 2010).
1.3.1 Papaína y Pancreatina
La papaína pertenece a la familia de las cistein proteasas, puede ser estable y
activa en variadas condiciones, incluso a temperaturas elevadas. Esta enzima se obtiene
del látex del fruto de Carica papaya, la cual contiene cuatro endopeptidasas de cisteína,
incluyendo papaína, quimopapaína, glicil endopeptidasa y caricaína. (Worthington
Biochemical Corporation, 2016). Es ampliamente utilizada en una gran variedad de
sectores industriales como la panadera, láctea, cervecera, peletera (cueros) (Garcia &
Roldan, 2005). Esta enzima tiene la capacidad de hidrolizar los enlaces peptídicos donde
Estado del arte 25
los residuos de aminoácidos aromáticos del grupo carbonil son arginina, lisina o glutamina
(Banchon, 2005).
Por su parte, la pancreatina es un extracto obtenido del páncreas porcino. Contiene
un conjunto de enzimas que pueden clasificarse en proteasas, lipasas y amilasas (Enzyme
Educational Institute, 2018). La actividad de dichas enzimas puede variar dependiendo del
origen del páncreas y del tratamiento de las glándulas extraídas. Las enzimas Tripsina,
Quimotripsina y Elastasa son endopeptidasas específicas, las cuales rompen enlaces
peptídicos preferiblemente en el terminal carboxílico de L-aminoácidos básicos, aromáticos
y alifáticos, respectivamente (BIOZYM, 2016). Lo anterior le confiere un amplio rango de
especificidad y una alta eficiencia en el proceso de proteólisis. En la tabla 6, se exponen
algunas características de las estas enzimas.
Tabla 6. Características generales de algunas proteasas.
Nombre común
Familia Número de
residuos
Tipo de reacción
Enlaces de ruptura
PM* (KDa)
Referencias
Papaína Cistein proteasa
212 endopeptidasa Arg, Lys 23,406 ((Bermúdez Molina & Lipe Snabria, 2005;
Murugesh Babu, 2013; Sigma-Aldrich, 2018b)
Tripsina Serin proteasa
223 endopeptidasa Arg, Lys 23,4 (Schmidt, Jelsch, Ostergaard, Rypniewski, & Lamzin, 2003; Sigma-
Aldrich, 2018c)
Elastasa Serin proteasa
240 endopeptidasa Ile, Gly, Ala, Ser, Val y
Leu
25,9 (Glass, 2018; Sigma-Aldrich, 2018b)
Quimotripsina Serin proteasa
245 endopeptidasa Tyr, Trp, Phe, Leu
25 (Kashima et al., 1998; Sigma-Aldrich, 2018a)
*PM: Peso molecular
En cuanto a los estudios referentes a hidrolizados enzimáticos de biomasa
microalgal, Morris et al., (2001), investigaron 5 combinaciones enzimáticas en la hidrólisis
de las proteínas presentes en la biomasa autotrófica de la microalga Chlorella vulgaris
tratada previamente con etanol. Los mejores resultados se obtuvieron con las mezclas
papaína-tripsina y papaína-pancreatina, obteniendo grados de hidrolisis mayores a 55% y
50% respectivamente. Se emplearon 10 unidades proteolíticas de cada enzima por gramo
de biomasa. Se evidenció también, un efecto positivo del empleo de mezclas enzimáticas
en comparación con las enzimas individuales, lo cual está mediado por la superposición
de sus acciones hidrolíticas. Sun et al.( 2016), también comprobó que el efecto combinado
26 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
de enzimas proteolíticas puede incrementar el grado de hidrólisis con respecto a la acción
de enzimas individuales, sobre un extracto proteico de Spirulina platensis. Los resultados
obtenidos por los autores mostraron incrementos en el grado de hidrólisis de hasta 38,6%
cuando se empleó un método secuencial de proteasa alcalina, seguido de papaína, con
respecto al uso de papaína únicamente.
Posteriormente, Morris et al., (2008), quienes estudiaron la hidrólisis enzimática de
la proteína presente en Chlorella vulgaris 87/1 con pancreatina, observaron la influencia
de diferentes parámetros de reacción, destacando que los valores más recomendados
para llevar a cabo el proceso de hidrólisis es una relación enzima-sustrato de 30-40
Unidades/g alga, una concentración de biomasa de 10-15% y un rango de pH de 7,5 a 8.
Por otro lado, Lisboa et al., (2014) estudiaron la reacción de hidrólisis de la biomasa
de Chlorella pyrenoidosa y Spirulina sp. usando proteasas comerciales que actuaban en
diferentes rangos de pH. En los experimentos realizados variaron la concentración de
enzima (5-10 U/mL), la concentración de sustrato (5-10%) y el tiempo de reacción (60-240
min), obteniendo los mayores grados de hidrólisis a las 4 horas para ambas microalgas.
Más adelante, Lisboa et al., (2016), obtuvieron un hidrolizado enzimático a partir de
biomasa de Spirulina sp. con la enzima comercial Protemax 580L y estudiaron las
propiedades funcionales de éste, así como su potencial antioxidante. Los autores
encontraron un incremento en la digestibilidad, la solubilidad, la capacidad de retención de
agua y la actividad antioxidante del hidrolizado al compararla con la biomasa original.
Como muestran las investigaciones previas, es necesario el uso de un complejo
enzimático de proteasas para obtener mayores grados de hidrólisis y en ese sentido,
incrementar las posibilidades de obtener péptidos de bajo peso molecular, con posibles
propiedades antimicrobianas.
1.4 Antibióticos tradicionales
Los antibióticos pueden ser de origen natural o semisintético (Seija & Vignoli, 2006).
Los de origen natural son sintetizados por microorganismos como metabolitos
secundarios, estos productores de antibióticos van desde las bacterias, actinomicetos y
hongos filamentosos, hasta algunas especies de hongos superiores y algas, siendo los
actinomicetos, los responsables de más del 60% de la producción, especialmente el
Estado del arte 27
género Streptomyces (Egas & Tinajero, 2016). En la tabla 7 se muestran algunos
antibióticos de origen natural.
Tabla 7. Algunos antibióticos de origen microbiano (Centrón, 2015).
Antibiótico Microorganismo productor
Penicilina G Penicillium notatum
Estreptomicina Streptomyces griseus
Cefalosporina C Cephalosporium acremonium
Clortetraciclina Streptomyces aerufaciens
Cloranfenicol Streptomyces venezuelae
Vancomicina Nocardia orientalis
Eritromicina Streptomyces erythreus
Kanamicina Streptomyces kanamyceticus
Gentamicina Micromonospora purpurea
Lincomicina Streptomyces lincolnensis
Tobramicina Streptomyces tenebrarius
Tres de los microorganismos más usados para pruebas de evaluación de actividad
antimicrobiana son E. coli, S. aureus y C. abicans, ya que son representantes de las
bacterias Gram negativas, Gram positivas y de levaduras, respectivamente. Comúnmente,
los tratamientos con antibióticos para infecciones causadas por este tipo de
microorganismos, si no presentan una resistencia específica, se muestran en la tabla 8.
Tabla 8. Antibióticos y antifúngicos convencionales para el tratamiento de infecciones causadas por E. coli, S.aureus y C. albicans
Espectro antimicrobiano
Antibiótico Tipo Referencias
Escherichia coli Aminopenicilinas Betalactámico
(Seija & Vignoli, 2006) Cefalosporinas de primera
generación
Staphylococcus aureus
Eritromicina Macrólidos
Estreptomicina, Kanamicina, Gentamicina,
Neomicina
Aminoglucósidos
Moxifloxacina, Trovafloxacina
Quinolonas
Antifúngicos
Candida albicans Fluconazol y Voriconazol Azoles (Aguado et al., 2011; Allevato,
Negroni, & Galimberti,
2007)
Anfotericina B liposomal Polienos
Caspofungina Anidulafungina
Micafungina
Lipopéptidos
28 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
La resistencia bacteriana adquirida a antibióticos se ha presentado desde el inicio
de su uso como tratamientos de enfermedades infecciosas (Pérez & Robles, 2013). Los
mecanismos de acción que ejercen las células patógenas frente a los antibióticos son
modificación o hidrólisis de la estructura química del mismo, disminución de la captación,
inactivación o modificación del sitio blanco o alteración de las barreras de permeabilidad
como mecanismos de eflujo o expulsión (Cabrera Alaix & Mejía Otero, 2008; Pérez &
Robles, 2013). Estás bacterias resistentes a uno o más antibióticos (multiresistentes) son
una preocupación a nivel mundial, pues se han convertido en una amenaza para la salud
pública al ser inmunes a los tratamientos convencionales, provocando que las
enfermedades persistan (Castañeda, Gómez, Corrales, & Cortés, 2016). Adicional al
problema social que esto genera, la carga económica que origina esta situación a los
sistemas de salud de cada país es bastante considerable, debido principalmente al
aumento de los costos de tratamiento y las estancias hospitalarias prolongadas (Cabrera
Alaix & Mejía Otero, 2008).
En vista de esta problemática, existe una necesidad de implementar nuevos
compuestos terapéuticos, entre los cuales los péptidos antimicrobianos han presentado
una clara acogida (Castañeda et al., 2009).
1.5 Péptidos antimicrobianos
Los péptidos antimicrobianos son una herramienta del sistema inmune innato
presente en plantas, insectos y organismos vertebrados, cuyos mecanismos de acción
presentan una extensa variedad que va desde promover procesos antiinflamatorios, activar
procesos de cicatrización, interaccionar con la pared celular, hasta inhibir la síntesis de
proteínas y de ácidos nucleicos (Téllez & Castaño, 2010). Comúnmente, poseen un
tamaño pequeño de entre 12-100 residuos de aminoácido y son de naturaleza catiónica
(Jenssen, Hamill, & Hancock, 2006). Su amplia acción ha demostrado ser rápida y eficaz
contra bacterias, hongos, virus, parásitos e incluso células cancerígenas (Zhu, Liu, & Niu,
2017). Estas moléculas obtienen su clasificación de acuerdo a su estructura secundaria,
que puede ser de hélices-α, láminas-β o en estructura de asa y extendida, siendo las
primeras dos, las más usuales (Zhu et al., 2017).
Estado del arte 29
Algunos investigadores han reportado estudios que demuestran la actividad
antimicrobiana de hidrolizados proteicos y péptidos provenientes de microalgas como en
el caso de Morris et al. (2003), quienes evaluaron el efecto de la administración de un
hidrolizado proteico de Chorella vulgaris a una concentración de 500 mg/Kg, como
complemento nutricional en ratones Balb/c malnutridos. Identificaron una actividad
inmunoreguladora en el preparado, al lograr una restauración total de leucocitos,
acompañada de una mayor proliferación de linfocitos y niveles incrementados de
monocitos circulantes en la sangre periférica de los ratones tratados.
En los animales que recibieron el hidrolizado, se estimuló la proliferación de las
células del sistema fagocítico mononuclear y el metabolismo de los macrófagos, expresado
por una mayor actividad de la enzima fosfatasa ácida lisosomal y se evidenció el aumento
del peso relativo y actividad hematopoyética del bazo.
Investigadores como El-Baz et al.(2013), quienes probaron el efecto antiviral de un
extracto de Spirulina platensis en etanol, contra Adenovirus tipo 7, Coxsackievirus B4,
Astrovirus tipo 1, Rotavirus Wa y Adenovirus tipo 40, lograron demostrar un porcentaje de
reducción del 53,3%, 66,7%, 76,6%, 56,7% y 50% respectivamente. Adicionalmente,
pusieron a prueba el extracto mencionado con Escherichia coli, Salmonella typhi,
Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, y Candida albican. Mostrando halos de
inhibición en los casos de Enterobacter faecalis y Candida albicans.
Por otro lado, Sun et al. (2016), aislaron el péptido SP-1, extraído de la microalga
Spirulina platensis y determinaron sus características más relevantes, su secuencia
compuesta por 18 aminoácidos, un peso molecular de 1,87 KDa, punto isoléctrico de 5,8
entre otros, y comprobaron la actividad antimicrobiana de éste contra Escherichia coli y
Staphylococcus aureus, hallando la concentración mínima inhibitoria de 8 mg/mL y 16
mg/mL respectivamente.
Sedighi et al. (2016), por su parte, señalaron que el extracto proteico hidrolizado
con pepsina de la microalga Chlorella vulgaris, tuvo un efecto inhibidor en la viabilidad de
células cancerígenas, correspondientes a adenocarcinoma MCF-7. Los investigadores
compararon el efecto antitumoral de la biomasa, la proteína antes de hidrólisis y el extracto
hidrolizado. Hallaron que el extracto hidrolizado, con péptidos de peso molecular entre 3-
5 KDa, redujo el crecimiento celular en más del 60%, después de 72 horas de incubación,
con un valor IC50 de 50 μg/μL.
30 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
Las investigaciones anteriores demuestran el potencial existente en la proteína
microalgal como fuente de compuestos biológicamente activos, específicamente de tipo
antimicrobiano, sin embargo, es claro que hace falta incursionar más en el área y explorar
más especies de microalgas, que han presentado buenas características en diferentes
aplicaciones industriales, como el caso de Nannochloropsis sp., que si bien, ha sido
estudiada ampliamente en el campo de los biocombustibles y la alimentación acuícola,
existe un vacío en las investigaciones referentes a su estudio como fuente importante de
proteína con propiedades terapéuticas.
Objetivos 31
2. Objetivos
2.1 General
Obtener un hidrolizado enzimático bioactivo a partir de proteína microalgal de
Nannochloropsis sp. con potencial antimicrobiano.
2.2 Específicos
Desarrollar un protocolo de extracción de proteínas de biomasa microalgal.
Evaluar la acción de dos enzimas proteolíticas, papaína y pancreatina, en el
proceso de hidrólisis sobre proteína microalgal.
Determinar la actividad antimicrobiana del hidrolizado enzimático obtenido en tres
microorganismos diferentes Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Candida
albicans.
Metodología 33
3. Metodología
3.1 Cultivo y obtención de biomasa
La biomasa de Nannochloropsis sp. fue cultivada en las instalaciones del acuario
del Parque Explora, en fotobioreactores de 250 litros de capacidad, como parte del trabajo
de maestría “Producción de biomasa microalgal, en fotobiorreactores al aire libre, en el
Urabá Antioqueño”.
Como medio de cultivo se empleó fertilizante agrícola NPK 13:40:13, con un
fotoperiodo de 24 horas de luz. Después de 11 días, se agregaron 9 mL de NaOH 0,5M
por litro de cultivo a cada reactor, con el fin de flocular la biomasa cultivada y facilitar su
concentración (Rojo et al., 2016). El tiempo de sedimentación fue de 24 horas, después
del cual se recolectó la biomasa. Se hicieron entre 3 y 5 lavados de la misma con agua,
para eliminar el exceso de sales presentes en el cultivo y posteriormente, se secó en un
horno WTC BINDER por 4-5 días a 50°C.
3.2 Lisis celular y extracción de proteína
Para la lisis y extracción de proteínas, se probaron diferentes métodos en
secuencia, comprendiendo tratamientos químico, biológico y físico, como se aprecia en la
tabla 9
Para la evaluación de los tratamientos la biomasa se secó a 50 oC en un horno
WTC BINDER por 4-5 días, posteriormente, ésta se maceró manualmente en un mortero
hasta obtener un polvo fino. Para la extracción con etanol absoluto se tomaron 100 gramos
34 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
de biomasa y se agregaron 400 mL de etanol. Se dejó en agitación suave por 24 horas,
bajo calentamiento controlado, no sobrepasando los 40°C. La biomasa se filtró y se separó
del sobrenadante (Humberto Joaquín Morris et al., 2008; R. Zhang et al., 2018).
Tabla 9. Métodos secuenciales de extracción de proteína.
Tratamiento Método Características Referencias
Químico Extracción con etanol Concentración de biomasa: 250 mg/mL, 40°C, 24 horas en agitación
suave.
(Humberto Joaquín Morris et al., 2008; R.
Zhang et al., 2018)
Biológico /
Enzimático
Hidrólisis enzimática con celulasa
Enzima: Acellerase 1500(Novozyme). E/S: 20 U/g biomasa, pH:4,8, 50°C,
por 4 horas
(C Safi et al., 2017; R. Zhang et al., 2018)
Físico Congelación/descongelación-Ultrasonido
Buffer fosfato 50mM pH 7,7 ciclos de 10 minutos (on: 2 seg, off:5 seg), amplitud de 20%, 1800W, 60KHz,
baño de hielo
(Grimi et al., 2014; Lee et al., 2017; R. Zhang
et al., 2018)
La hidrólisis enzimática con celulasa se hizo a partir de 10 gramos de biomasa
proveniente de la extracción con etanol, en una solución al 10% (p/v) en buffer acetato pH
4,8 con la enzima Acellerase 1500 de Novozyme®. La reacción se llevó a cabo a 50°C
durante 4 horas. Posteriormente, la biomasa se centrifugó a 10.000 rpm por 5 minutos y
se neutralizó el sobrenadante (C Safi et al., 2017; R. Zhang et al., 2018).
Se implementó congelación y descongelación de la biomasa antes de realizar la
etapa de ultrasonido. 10 gramos de biomasa previamente hidrolizada se congelaron a -
20°C, se descongelaron a temperatura ambiente y se sometieron a ultrasonido en un
equipo BIOBASE® Ultrasonicator cell disruptor UCD-650, por 7 ciclos de 10 minutos (on: 2
segundos, off: 5 segundos) a 1800W y una amplitud de 20%, manteniendo la solución en
baño de hielo para evitar sobrecalentamiento.
La biomasa se centrifugó a 10.000 rpm por 10 minutos y se analizó el sobrenadante
de la muestra. Como criterio para determinar la efectividad de los tratamientos se midió la
proteína soluble presente en el sobrenadante de cada muestra y se relacionó con el
porcentaje de proteína crudo presente en la biomasa inicialmente.
Adicionalmente, se evaluó un método mecánico por homogenización con un
equipo ULTRA TURRAX IKA T25 DIGITAL. Inicialmente se evaluó el número de ciclos de
homogenización a una velocidad de 6000 rpm, donde cada ciclo constaba de 5 minutos de
Metodología 35
funcionamiento y 2 minutos de intervalo. Se analizaron los ciclos 2, 4,8,10,12 y 16, para lo
cual se utilizó 1 gramo de biomasa seca en 10 mL de buffer fosfato 50mM pH 7. La biomasa
se dejó incubando en buffer durante 15 minutos en baño de hielo antes de iniciar los ciclos.
Después de cumplir el número de ciclos asignados, se tomó una alícuota de 5 mL
y se centrifugó a 10.000 rpm por 10 minutos. Se separó el sobrenadante del pellet.
A partir del pellet obtenido, se determinó el porcentaje de lisis celular, mediante
recuento de células intactas en cámara de Neubauer (Pan, Huang, Wang, & Wu, 2017).
Se calculó el porcentaje de lisis mediante la ecuación 1:
𝑃𝑜𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑗𝑒 𝑑𝑒 𝐿𝑖𝑠𝑖𝑠 (%) =
𝐶𝑒𝑙𝑚𝐿𝑐𝑖𝑐𝑙𝑜 1
−𝐶𝑒𝑙𝑚𝐿𝑐𝑖𝑐𝑙𝑜 𝑥
𝐶𝑒𝑙𝑚𝐿𝑐𝑖𝑐𝑙𝑜1
∗ 100 (1)
Donde:
𝐶𝑒𝑙/𝑚𝐿𝑐𝑖𝑐𝑙𝑜 1: Número de células intactas por mililitro, al inicio del tratamiento.
𝐶𝑒𝑙/𝑚𝐿𝑐𝑖𝑐𝑙𝑜 𝑥: Número de células intactas por mililitro, al final del tratamiento.
Si bien 1 gramo de biomasa no es suficiente para obtener la cantidad de proteína
necesaria para llevar a cabo los demás objetivos de este trabajo, se decidió aumentar la
cantidad de biomasa, manteniendo la concentración anterior. Para ello se tomaron 60
gramos de biomasa y se mezclaron con 600 mL de buffer fosfato de sodio 50 mM, pH 7.
Se dejó reposar la mezcla durante 15 minutos a 4°C. Posteriormente, se sometió al
homogenizador, a una velocidad de 6000 rpm, durante 20 ciclos de 5 minutos con
intervalos de 2 minutos. La mezcla se mantuvo en baño de hielo, para evitar su
calentamiento.
Una vez transcurrido el tiempo de lisis, se centrifugó la mezcla a 10.000 rpm por 10
minutos y se filtró al vacío con filtro de membrana de celulosa de 0,2 µm de diámetro de
poro. Por último, el sobrenadante obtenido se sometió a diálisis por 24 horas, con una
membrana con tamaño de poro de 3,5 KDa de Spectra/Por de Spectrum laboratories.
En este segundo procedimiento se cuantificó el porcentaje de células lisadas en los
ciclos 10 y 20 del proceso.
36 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
3.2.1 Cuantificación de proteína
Para la determinación de proteína cruda en la biomasa, se midió el porcentaje de
nitrógeno total por el método de Kjendhal, utilizando como factor de conversión a proteína
5,2 (C Safi et al., 2017).
Para la determinación de la proteína soluble se empleó el método de Lowry (Lowry,
Rosebrough, Lewis Farr, & Randall, 1951) en el sobrenadante en los diferentes
tratamientos. Este método consiste en la formación de un complejo de color azul al entrar
en contacto con el enlace peptídico de las proteínas, siendo la intensidad de color,
proporcional a la cantidad de proteína presente en la solución.
Se construyó previamente una curva de calibración, usando sueroalbúmina bovina
(BSA). La absorbancia de la muestra se midió a 750 nm en un espectrofotómetro UV-Vis
Spectronic Genesys 2PC.
3.3 Hidrólisis enzimática empleando proteasas
Para llevar a cabo este procedimiento, se adquirieron dos proteasas comerciales.
La primera es una Papaína grado alimenticio referencia Papaína 4.000 DB, distribuida por
la empresa Proenzimas. La Papaína 4000 DB, es una proteasa (E.C. 3.4.22.2) extraída del
látex de la Papaya Carica, esta enzima posee un amplio espectro de aplicaciones en la
industria alimenticia, como en la producción de hidrolizados de soya, ablandadores para
carne, en el sector cervecero y pesquero. Es un polvo seco, ligero, de color crema con un
rango de temperatura de 10 a 90°C.
La segunda enzima es una Pancreatina porcina, grado farmacéutico, referencia
CREON® 25000, distribuida por la empresa Abbott. Es un complejo enzimático compuesto
por Amilasa (18000 Unidades FIP), Lipasa (25000 Unidades FIP), Proteasas (1000
Unidades FIP) y se formula como minimicroesferas con cubierta esférica (ácido resistente)
en capsulas de gelatina. Las fichas técnicas de las enzimas se presentan en el Anexo D.
3.3.1 Actividad enzimática de proteasas
Para determinar la actividad de la enzima, se elaborará una gráfica sobre el
comportamiento de la enzima en el tiempo, para seleccionar el área donde su
Metodología 37
comportamiento es lineal. Para ello, se empleó como sustrato caseína (Sigma-Aldrich)
0,65% (p/v) sobre buffer fosfato 50 mM a pH 7,5, a una temperatura de 37°C y una relación
E/S de 1% (p/p), previa cuantificación de la cantidad de proteína presente en el extracto
enzimático por el método de Lowry (1956). Se tomaron muestras en los siguientes tiempos
de hidrólisis: 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 y 60 minutos. Para detener la reacción se agregó
900 µL de ácido tricloroacético (TCA) al 6,25% (p/v) a una alícuota de 100 µL de muestra,
(Lisboa et al., 2016) y se dejó reaccionar durante 30 minutos a 4°C.
La muestra se centrifugó a 10.000 rpm por 5 minutos, se retiró el sobrenadante y
se determinó la cantidad de proteína soluble por el método de Lowry (1956). Por último, se
construyó una curva de concentración de proteína liberada vs tiempo y se determinó la
región lineal de la curva, para cada enzima estudiada. Las mediciones se realizaron por
duplicado.
Para determinar la actividad enzimática específica de las dos enzimas se
implementó el protocolo de Sigma-Aldrich (2014) con algunas modificaciones. Se asumió
una unidad proteolítica como la cantidad de enzima necesaria para catalizar la liberación
de 1µmol de tirosina por minuto, a las condiciones del ensayo. Para ello, se construyó una
curva de calibración con diferentes concentraciones de L-tirosina 1,1 mM, como se muestra
en la tabla 10.
Tabla 10. Volúmenes para la curva de calibración de Tirosina.
Volumen de Solución madre de Tirosina (mL)
Volumen de agua destilada (mL) µMoles de Tirosina
0,05 0,95 0,06
0,08 0,92 0,09
0,10 0,90 0,11
0,12 0,88 0,13
0,15 0,85 0,17
0,17 0,82 0,19
0,20 0,80 0,22
0,22 0,78 0,24
0,25 0,75 0,28
0,30 0,70 0,33
De acuerdo al procedimiento anterior se determinó la actividad específica de las
enzimas con la ecuación 2:
38 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
𝑼𝒏𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆𝒔𝒎𝒈 𝒑𝒓𝒐𝒕𝒆í𝒏𝒂⁄ =
(𝜇𝑀𝑜𝑙 𝑡𝑖𝑟𝑜𝑠𝑖𝑛𝑎 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑎𝑑𝑎)
(𝑉𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎) ∗ ( 𝑇) ∗ (𝐶𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎) ∗ (𝐶𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎) (2)
Donde:
𝑉𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 = 𝑉𝑜𝑙ú𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑎( 𝑚𝐿)
𝑇 = 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑛𝑠𝑎𝑦𝑜 ( 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑜𝑠)
𝐶𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 = 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑚𝑎𝑑𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 (𝑚𝑔/𝑚𝐿)
𝐶𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 = 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑜 𝑒𝑛 𝑝𝑜𝑙𝑣𝑜 (𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎
𝑚𝑔 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜)
3.3.2 Determinación de las condiciones de pH y temperatura
Para validar las condiciones óptimas en cuanto a temperatura y pH, se llevó a cabo
un diseño central compuesto de superficie respuesta con tres puntos centrales y dos
puntos estrella, con ayuda del Software estadístico STATGRAPHICS CENTURION XVI,
en el cuál se evaluaron las condiciones que se muestran en la tabla 11. Estas condiciones
se evaluaron para ambas enzimas.
Tabla 11. Condiciones experimentales en el diseño de superficie respuesta para ambas
enzimas.
Experimento Temperatura (°C) pH
1 35 8
2 47,1 7
3 45 8
4 40 8,4
5 40 7
6 32,9 7
7 40 7
8 45 6
9 35 6
10 40 5,6
Para la realización del experimento, se utilizó como sustrato proteico, caseína
(Sigma-Aldrich) 0,65% (p/v), una relación enzima-sustrato de 10 U/g de proteína y 45
minutos de reacción.
Se emplearon 3 buffers para los diferentes pH requeridos, como se indica en la tabla 12.
Metodología 39
Tabla 12. Tipos de soluciones buffer empleadas en el experimento de acuerdo al pH del
tratamiento.
Tipo de solución buffer Concentración (mM) pH
Fosfato 50 6 ; 7; 8
Tris-HCl 50 5,6
Acetato 50 8,4
Para detener la reacción se agregó 900 µL de ácido tricloroacético (TCA) al 6,25%
(p/v) a una alícuota de 100 µL de muestra, (Lisboa et al., 2016) y se dejó reaccionar durante
30 minutos a 4°C. Se centrifugó la muestra a 10.000 rpm por 5 minutos, se retiró el
sobrenadante y se determinó la cantidad de proteína soluble en éste por el método de
Lowry (1956).
Obtención del grado de hidrólisis
Para estimar el grado de hidrólisis de la muestra (Lisboa et al., 2016) como variable
respuesta, se utilizó la ecuación 3:
% 𝐺𝐻 =𝑃𝑆0 − 𝑃𝑆𝑡
𝑃∗ 100 (3)
Donde:
%GH: Grado de hidrólisis de la reacción (Porcentaje).
PSo: Cantidad de proteína soluble en TCA 6.25% (p/v), antes de la adición de
enzima.
PSt: Cantidad de proteína soluble en TCA 6.25% (p/v), después de la adición de
enzima, en un tiempo t.
P: Cantidad total de proteína determinada inicialmente
Dado que el objetivo de este trabajo es implementar las proteasas como un
complejo enzimático, mediante el estudio estadístico de ambas enzimas empleadas, se
definirán las condiciones de operación en las cuales la eficiencia de ambas fuera
significativa.
3.3.3 Hidrólisis enzimática sobre el extracto proteico
Empleando las condiciones de operación del coctel enzimático, de acuerdo con el
numeral anterior, se llevó a cabo la hidrólisis enzimática del extracto de proteínas de
Nannochloropsis sp. Para tal fin, se prepararon soluciones madre de las enzimas a una
concentración de 100 mg/mL para papaína y 10 mg/mL para pancreatina en buffer fosfato
40 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
50 mM, pH 7. La relación enzima-sustrato implementada para cada enzima fue de 10 U/g
proteína (Humberto Joaquín Morris et al., 2001), es decir, que se empleó una cantidad total
de 20 U/g proteína.
Se tuvieron en cuenta dos controles, el primero fue una solución de caseína a la
misma concentración del extracto proteico de microalgas, y el segundo, fue una solución
de biomasa al 10% (p/v) (Humberto Joaquín Morris et al., 2008) de Nannochloropsis sp.
sin tratamiento alguno, ambos sobre buffer fosfato 50mM, pH 7.
La reacción se llevó a cabo durante 6 horas y se tomaron muestras en los siguientes
tiempos para determinar el curso de la reacción: antes de agregar las enzimas, a los 30
minutos, a la 1, 2, 4 y 6 horas.
La reacción se detuvo agregando 900 µL de ácido tricloroacético (TCA) al 6.25%
(p/v) a una alícuota de 100 µL de muestra, (Lisboa et al., 2016) y se dejó reaccionar durante
30 minutos a 4°C.
Se centrifugó la muestra a 10.000 rpm por 5 minutos, se retiró el sobrenadante y
se determinó la cantidad de proteína soluble en éste por el método de Lowry (1956). El
grado de hidrólisis se determinó por la ecuación 3. Las mediciones se realizaron por
triplicado.
Por último, el extracto de proteínas hidrolizado se hizo pasar por un filtro de
centrífuga AMICON de 3 KDa, para probar su efectividad contra los microoganismos
Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Candida albicans.
3.3.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Para determinar el tamaño molecular de las proteínas presentes en el extracto
obtenido antes y después de la hidrólisis enzimática, las muestras debieron ser
concentradas de acuerdo con Gallardo (2006), agregando a 10 mL de éstas, 10 mL de
TCA 20%(p/v) y se dejaron a 4°C durante toda la noche. Posteriormente, se centrifugaron
a 15.000 rpm por 15 minutos a 4°C. Los pellets obtenidos se lavaron con 300 µL de acetona
fría y se dejaron reposar durante 30 minutos en baño de hielo. Se centrifugaron
nuevamente a 15.000 rpm por 15 minutos a 4°C. Se retiró el sobrenadante y se evaporó
la acetona residual sometiendo la muestra a 30°C durante 30 minutos. El pellet resultante
Metodología 41
se resuspendió en 60 µL de Buffer de solubilización (Tris 100 mM, EDTA 100 mM y Urea
8M) pH 8,5.
Las muestras se mezclaron con 20 µL de una solución compuesta por: 10 µL de 2-
mercaptoetanol y 90 µL de solución colorante (SDS, Azul de Coomasie R-250, glicerol) y
se dejaron en incubación por 5 minutos a 80°C. Se sembraron 15 µL de las muestras en
el gel de tris-tricina SDS al 14% de concentración y se llevó a cabo la electroforesis a 150
V, durante 1 hora y 15 minutos.
Se sometió el gel a una solución de tinción de Azul de Coomasie R-250, seguido
por una solución de desteñido, ambas por 12 horas a agitación constante. El marcador
molecular utilizado fue el Blue Prestained Protein Standard de Biolabs® Inc., con un rango
entre 11-190 kDa.
3.3.5 Espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier
Se analizaron dos muestras de extracto en diferentes etapas del proceso de
extracción, antes y después de la diálisis y otra después del proceso de proteólisis. Para
ello se concentraron por evaporación a 50°C en un horno WTC BINDER, durante 20 horas.
Adicionalmente, se analizó la muestra de biomasa original, para lo cual se mezcló 50 mg
de ésta en 500 µL de agua destilada y se sometió a baño de ultrasonido por 15 minutos.
Los experimentos se realizaron en un equipo FT-IR Bruker Tensor II con ATR de
diamante (Bruker Optics, Alemania) en el Grupo de investigación de Bioquímica Estructural
de Macromoléculas, del Instituto de Química de la Universidad de Antioquia. El
espectrómetro está equipado con un detector MCT fotovoltaico enfriado con nitrógeno
líquido. Las muestras se analizaron con una resolución de 4 cm-1 entre un rango de número
de onda de 4000 a 700 cm-1. El curve fitting fue analizado usando el Software OPUS
(Bruker Optics, Almania). La línea base de los espectros fue corregida y analizada en cada
región seleccionada.
3.4 Actividad antimicrobiana
Para determinar la actividad antimicrobiana del extracto hidrolizado, inicialmente se
preparó la solución de extracto mediante filtración al vacío con un filtro de celulosa de
0,22µm, para eliminar posibles contaminantes.
42 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
En este procedimiento se realizó el método de dilución en caldo (Bustamante, 2015;
Ramírez & Marin Castaño, 2009), para lo cual se implementaron los siguientes
microorganismos: Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC 25923)
y Candida albicans (ATCC 90028).
Las cepas se activaron en caldo TSB (bacterias) y Sabouraud (levadura) por 24
horas a 36°C y se ajustaron con un patrón de McFarland de 0,5.
En tubos de 5 mL, se dispusieron 1233 µL de caldo (TSB o Sabouraud) y 3
diferentes concentraciones de extracto hidrolizado, 33,35% (v/v), 20% (v/v) y 10% (v/v),
correspondientes a 153 µg/mL, 92 µg/mL y 46 µg/mL de proteína, a los cuales se les
agregó 100 µL del inóculo respectivo. Los ensayos se hicieron por triplicado.
Adicionalmente, se hizo un control de viabilidad, que no contenía extracto.
Figura 3. Protocolo de actividad antimicrobiana
Las muestras se dejaron en incubación por 24 horas a 36°C. Una vez trascurrido
este tiempo se hicieron diluciones seriadas de cada muestra en solución salina 0,9% (p/v)
y se sembraron 10 µL de éstas en placa (TSA o PDA) por la técnica de microgota
(Herigstadab, Hamilton, & Heersink, 2001) por triplicado. Las muestras se incubaron a
36°C, 24 horas para las bacterias y 48 horas para la levadura. Por último, se hizo un
recuento de las colonias presentes en cada dilución sembrada. En la figura 3, se explica
de forma sintetizada el procedimiento anterior.
Metodología 43
3.4.1 Porcentaje de inhibición
El porcentaje de inhibición en el crecimiento de las cepas tratadas con el extracto
hidrolizado, se calculó con la ecuación 4 (Mayorga & Parra, 2009).
𝑰𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 (%) =(𝑈𝐹𝐶𝑚𝐿 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
−𝑈𝐹𝐶𝑚𝐿 𝑒𝑣𝑎𝑙𝑢𝑎𝑑𝑜
)
𝑈𝐹𝐶𝑚𝐿 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
∗ 100 (4)
Donde:
𝑈𝐹𝐶
𝑚𝐿 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙: 𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑢𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑑𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑚𝑖𝑙𝑖𝑙𝑖𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑣𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑.
𝑈𝐹𝐶
𝑚𝐿 𝑒𝑣𝑎𝑙𝑢𝑎𝑑𝑜: 𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑢𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑑𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑚𝑖𝑙𝑖𝑙𝑖𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑒𝑣𝑎𝑙𝑢𝑎𝑑𝑜.
3.5 Análisis estadísticos
En muchos de los casos experimentales se realizaron tratamientos unifactoriales y
para el análisis del pH y Temperatura de las enzimas evaluadas se realizó un diseño central
compuesto de superficie respuesta con tres puntos centrales y dos puntos estrella.
La comparación estadística de los diferentes tratamientos propuestos se realizó
mediante análisis de varianza (ANOVA), con el software STATGRAPHICS CENTURION
XVI. Los resultados que presentaron valores de (p-value) < 0,05 fueron interpretados como
variables estadísticamente significativas en comparación a las demás (ver anexo B).
Resultados y discusión 45
4. Resultados y discusión
4.1 Lisis celular y extracción de proteína
La concentración de nitrógeno total y proteína cruda de la biomasa inicial de la
microalga utilizada, cuantificada mediante el método de Kjendhal, se muestra en la tabla
13.
Tabla 13. Concentración de Nitrógeno total y proteína cruda en la biomasa inicial de Nannochloropsis sp.
Muestra Biomasa original
Nitrógeno total (%) 1,7
Proteína cruda (%) 8,84
La importancia de estos valores radica en el cálculo del rendimiento de extracción
de los métodos evaluados.
En este trabajo se implementaron variadas metodologías de lisis, algunas
adaptadas de la literatura, como se aprecia en la tabla 9. Se evaluó la eficiencia de
tratamientos químicos, como extracción con etanol; biológicos, como uso de celulasas
comerciales; y físicos como ultrasonido, congelación/descongelación y diferentes
combinaciones de estos.
De acuerdo con los datos de la tabla 14, se podría decir que la poca eficiencia en
el caso de los tratamientos enzimáticos se debe a la sinergia en la que se encuentran la
celulosa y la hemicelulosa dentro de la pared. La presencia de hemicelulosa en las
microfibrillas de celulosa, reduce el área superficial del sustrato, lo que impide el contacto
con las enzimas. Además, la estructura cristalina de la celulosa es altamente resistente a
la degradación (Zuorro, Miglietta, Familiari, & Lavecchia, 2016). Los tratamientos químicos
46 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
como el tratamiento con etanol, disuelven parcialmente la hemicelulosa de la pared celular,
sin embargo, esto no es suficiente para la liberación de la mayor parte de proteínas
intracelulares (Ursu et al., 2014).
Tabla 14. Rendimiento de extracción de los métodos de lisis celular.
Método Proteína
soluble (%) Desviación estándar
Rendimiento de extracción (%)
Extracción con etanol 0,17 0,00043 1,92
Hidrólisis enzimática 0,14 0,0051 1,62
Congelación/descongelación-Ultrasonido
0,23 0,021 2,53
Por otro lado, Ursu et al. (2014), pudieron concluir, después de estudiar la
extracción de proteínas de Chorella vulgaris, usando un equipo de disrupción de alta
presión bajo condiciones de pH 7 y 12, que si bien los tratamientos llevados a cabo a pH
básicos, pueden lograr un porcentaje de extracción elevado, también pueden modificar las
propiedades funcionales de las proteínas, mientras que los tratamientos a pH neutro
pueden no lograr tanta eficiencia de extracción, pero las propiedades funcionales de las
proteínas no se ven modificadas. Es por esto que, como parte del procedimiento realizado
en este trabajo, siempre se tuvo en cuenta el pH de los extractos obtenidos,
manteniéndolos en 7.
En vista que, en ningún caso se obtuvo un rendimiento de extracción satisfactorio,
el cual puede estar en gran medida atribuido a la morfología de la pared celular de
Nannochloropsis sp., se propuso una metodología, basada en las experiencias anteriores
y que su combinación o secuencia permitiera lograr como requerimiento la disponibilidad
de las proteínas para su adecuado tratamiento. El método de homogenización presentó
buenos resultados en las experimentaciones propuestos como se observa en la tabla 15,
a pesar de que no se encontraron referencias bibliográficas empleando esta metodología
en Nannochloropsis sp.
En los experimentos anteriores de lisis celular se cuantificó proteína soluble en el
sobrenadante como criterio para determinar la efectividad del método en primera instancia,
sin embargo, en el método de homogenización, al aplicar este criterio, se encontró que los
métodos colorimétricos de Lowry (1951), Bradford (1976) y Biuret (Gornall, Bardawill, &
David, 1949), eran afectados por interferencias presentes en la muestra, debido a la
Resultados y discusión 47
liberación de compuestos del interior de la célula. Es por esto que se implementó el
recuento de las células para determinar la disrupción de las mismas.
Tabla 15. Porcentaje de lisis celular bajo diferentes ciclos de homogenización.
Número de ciclos % Lisis celular Desviación estándar
2 25,44 6,18
4 52,20 12,47
8 58,93 6,00
12 80,28 2,67
16 86,66 2,12
Ahora bien, a una mayor cantidad de biomasa, manteniendo constante la velocidad
y la concentración de la solución de biomasa, se evaluaron dos ciclos de homogenización,
10 y 20, alcanzando un porcentaje de lisis celular de 53,9% y 60,1%, respectivamente, tal
y como se aprecia en la tabla 16.
Tabla 16. Porcentaje de células lisadas en el método de homogenización.
Numero de ciclos Porcentaje de Lisis celular Desviación estándar
10 53,9 6,8
20 60,1 3,3
En la figura 4 se muestra el esquema del procedimiento que se realizó. El objetivo
de la diálisis fue eliminar los compuestos que pudieron causar las interferencias en los
métodos de cuantificación, lo que permitiría determinar el rendimiento de extracción.
Figura 4. Protocolo de lisis celular y extracción de proteínas por homogenización.
48 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
En la figura 5, se visualizó la muestra al inicio y al final del tratamiento con un
microscopio Olympus CX21 con un objetivo de 40X (parte superior) y mediante
microscopía electrónica de barrido a 8.000X (parte inferior). Se aprecia la disrupción de las
células de la microalga, al presentar irregularidades en su forma y trozos de tamaños
variados. El aspecto rugoso en la superficie de la biomasa sometida al proceso de
homogenización demuestra que el procedimiento limita la compactación de las células
entre sí, haciéndolas más susceptibles a la disrupción celular. La heterogeneidad en los
tamaños puede deberse a los diferentes esfuerzos mecánicos aplicados, como impacto y
cizalla.
Figura 5. Células de Nannochloropsis sp. al inicio y al final del tratamiento de lisis celular
El porcentaje de proteína soluble en el sobrenadante después del proceso de lisis
y extracción fue de 0,88%, lo cual equivale a un rendimiento total de extracción de 9,93%,
alrededor de 5 veces mayor que los procedimientos realizados previamente. Zhang et al.
(2017) presentaron un resultado similar al lisar biomasa en polvo de Chorella pyrenoidosa,
en un sistema de homogenización, donde tomaron 1 g de ésta en 10 mL de agua destilada
y lo sometieron a 8.000 rpm por 10 minutos, en intervalos de 2 minutos. Los investigadores
obtuvieron un rendimiento de 12,1%. Sin embargo, se resalta que la cantidad de biomasa
Resultados y discusión 49
sometida a ruptura en este trabajo es 60 veces mayor. Algunos métodos tienen buena
efectividad con pequeñas cantidades de biomasa, pero si se quiere escalar el proceso,
existen variables a tener en cuenta, además de la eficiencia de ruptura, como consumo
energético y mínima degradación de los productos (Pan et al., 2017).
Otros métodos mecánicos sobre biomasa de diferentes especies de
Nannochloropsis como la homogenización de alta presión y el uso de molinos de bolas han
presentado mayores eficiencias de extracción. Safi et al. (2017) reportaron un porcentaje
de lisis de 95% al utilizar un homogenizador de alta presión sobre biomasa de
Nannochloropsis gaditana, con una liberación de proteínas aproximada de 50% (p/p). Pan
et al. ( 2017) obtuvo un porcentaje de desintegración de células mayor al 98%, utilizando
un molino de bolas de turbina en la disrupción de biomasa de Nannochloropsis sp. Si bien
algunos autores emplean una combinación de diferentes métodos de extracción para
incrementar la lisis celular, no hay garantía que estos tratamientos produzcan mayor
eficiencia de extracción (R. Zhang et al., 2018).
4.2 Hidrólisis enzimática
4.2.1 Actividad enzimática de proteasas
Como se explicó en la sección anterior, se realizó un ensayo previo para determinar
en qué tiempo el comportamiento de la enzima es lineal, y de esta manera determinar la
actividad enzimática dentro de la región donde la velocidad es inicial. Este comportamiento
lineal se encuentra en el intervalo de 2-15 min y 2 – 20 min para la papaína y pancreatina
respectivamente, por lo tanto, se tomó para ambas enzimas, un tiempo de 10 minutos para
llevar a cabo el ensayo de actividad enzimática (ver gráficas en anexo A).
En la tabla 17, se especifican los valores de concentración de proteína y actividad
específica para cada enzima empleada, según las condiciones del ensayo, nombradas en
el capítulo de metodología. Las curvas de calibración se muestran en el anexo C.
Tabla 17. Concentración de proteína y actividad específica de los extractos enzimáticos
empleados de acuerdo a la metodología de Sigma-Aldrich (2014).
Enzima Concentración de proteína (mg/mL)
Actividad específica (U/mg proteína)
Papaína 0,020 1,53
Pancreatina 0,363 1,18
50 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
4.2.2 Determinación de las condiciones de pH y temperatura
Las figuras 6 y 7 muestran los diagramas del diseño de superficie respuesta para
papaína y pancreatina respectivamente, en lo intervalos de pH y temperatura definidos en
el diseño experimental.
La actividad enzimática de la papaína incrementa hasta una temperatura cercana
a los 37°C y un pH aproximado de 6,5 y a partir de ese punto empieza a disminuir,
formando una parábola en el caso de ambos factores evaluados.
Figura 6. Diagrama de superficie de respuesta estimada en diferentes niveles de pH y
temperatura de la papaína sobre caseína.
Teniendo en cuenta los coeficientes de regresión del modelo obtenido para la
papaína, se obtuvo la ecuación 5:
𝐺𝐻 (%) = −79,18 + 2,65 ∗ 𝑇 + 9,88 ∗ 𝑝𝐻 − 0,03 ∗ 𝑇2 − 0,75 ∗ 𝑝𝐻2 (5)
𝑅2 = 76,92%
En el caso de la pancreatina, no se presentó una parábola en la actividad
enzimática con respecto a los diferentes niveles de temperatura evaluados, es decir, no
hubo un valor máximo de actividad, sino que fue incrementando gradualmente, como una
línea recta. Por ese motivo, se evaluó también una temperatura de 50°C para esta enzima.
Por otro lado, la actividad de la enzima presentó un pico cuando el pH se aproximaba a 7
y a partir de este punto, empezó a disminuir.
Resultados y discusión 51
Figura 7. Diagrama de superficie de respuesta estimada en diferentes niveles de pH y
temperatura de la pancreatina sobre caseína.
El modelo obtenido para pancreatina se muestra en la ecuación 6:
𝐺𝐻 (%) = −73,77 + 0,65 ∗ 𝑇 + 17,84 ∗ 𝑝𝐻 − 0,08 ∗ 𝑇 ∗ 𝑝𝐻 − 0,99 ∗ 𝑝𝐻2 (6)
𝑅2 = 95,32%
Teniendo en cuenta los resultados anteriores, las condiciones de temperatura y pH
que maximizan el grado de hidrólisis, de acuerdo con los modelos planteados en las
ecuaciones 5 y 6, se muestran en la tabla 18.
Tabla 18. Condiciones de temperatura y pH que maximizan el grado de hidrólisis de
acuerdo a las condiciones planteadas para cada enzima.
Enzima Temperatura (°C) pH
Papaína 38,59 6,58
Pancreatina 50 6,92
En la literatura se encuentra reportado un amplio rango de condiciones óptimas
para estas enzimas, especialmente de temperatura, como se muestran en la tabla 19. Sin
embargo, cabe resaltar, que los valores obtenidos en el experimento realizado se
encuentran dentro de los rangos reportados, a excepción de la temperatura óptima de
papaína, que si bien, no pertenece al rango, se encuentra muy próximo del límite inferior.
52 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
Tabla 19. Condiciones de temperatura y pH óptimas reportadas en la literatura para las
enzimas empleadas.
Tipo de enzima
Temperatura óptima (°C)
pH óptimo
Referencias
Papaína 40-65 6-7 (Garcia & Roldan, 2005; Kilara, Shahani, & Wagner, 1977; Pinto et al., 2007)
Pancreatina 37-50 6-8 (Humberto Joaquín Morris et al., 2008, 2001; Villa, 2016)
Como primer paso se determinaron las condiciones que maximizan el grado de
hidrólisis de las enzimas de manera individual, posteriormente el objetivo es buscar una
condición que maximice el grado de hidrólisis sobre el extracto de microalga, al emplear el
coctel enzimático Papaína-Pancreatina. En este sentido, teniendo en cuenta experimentos
previos de proteólisis de biomasa microalgal con las enzimas estudiadas, además que los
intervalos de pH y temperatura son similares, se decidió emplear las siguientes condiciones
para llevar a cabo la hidrólisis con este complejo: pH 7 y 44°C, bajo las cuales se obtiene
un grado de hidrolisis (GH %) esperado de 4,42 y 6,14 para la papaína y la pancreatina
respectivamente al emplear las ecuaciones 5 y 6, utilizando como sustrato de referencia
caseína.
Como se observa en la figura 8, si bien estas condiciones favorecen la acción de
ambas enzimas, no es el punto matemáticamente ideal, sin embargo, debido a que en
trabajos experimentales anteriores (resultados no mostrados), donde se evaluaron las
enzimas individualmente sobre el extracto de proteínas, la pancreatina demostró un
desempeño superior con respecto a la papaína, se buscó resaltar un poco más la acción
del complejo de proteasas presente en la primera enzima, esto debido probablemente a
los demás componentes de la pancreatina empleada (CREON® 25000) (Amilasas y
lipasas).
Resultados y discusión 53
Figura 8. Gráfico de contornos para ambas enzimas utilizadas a diferentes niveles de temperatura y pH.
4.2.3 Hidrólisis enzimática sobre el extracto proteico
Como se mencionó anteriormente, se llevó a cabo la hidrólisis con el cóctel
enzimático sobre tres sustratos diferentes (Caseína, biomasa microalgal sin tratamiento y
extracto de proteínas). El objetivo de incorporar los dos controles (caseína y biomasa
microalgal sin tratamiento) fue comparar el grado de hidrólisis del extracto proteico con una
proteína de referencia, de fácil digestión (caseína) y con un sustrato que posee una
resistencia importante para las enzimas, es decir, la pared celular de la biomasa original o
biomasa microalgal sin tratamiento de lisis celular. En la figura 9, se observan estos
sustratos, después de ser sometidos a hidrólisis con el complejo enzimático.
54 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
Figura 9. Sustratos sometidos a hidrólisis proteica con el complejo enzimático.
El grado de hidrólisis de cada sustrato trabajado a diferentes tiempos, se observa
en la figura 10. Las muestras con una letra en común (del mismo color) no difieren
significativamente al 5% (ver anexo B).
Se alcanzó un mayor grado de hidrólisis sobre el extracto de proteína (>80%) que
sobre la biomasa original (<25%), como se suponía, debido básicamente a la presencia de
la pared celular, que sirve como barrera para las enzimas y limita sus funciones hidrolíticas
sobre la proteína.
No se presentaron diferencias estadísticamente significativas en el grado de
hidrólisis alcanzado en los diferentes tiempos de reacción para el extracto de proteína y la
caseína, es decir, que después de la media hora de reacción, el número de enlaces
peptídicos rotos por la acción enzimática no incrementó significativamente.
En el caso de la biomasa original, se observaron diferencias estadísticamente
significativas antes y después de las dos horas de tratamiento, lo cual puede explicarse
por el hecho de que, durante las primeras dos horas, las enzimas actúan sobre la proteína
soluble de la microalga. Después de este tiempo, las enzimas entran en contacto con la
proteína insoluble intracelular (Humberto Joaquín Morris et al., 2008).
Resultados y discusión 55
Figura 10. Grado de hidrólisis en el tiempo obtenido después de proteólisis enzimática
de papaína-pancreatina a 44oC y pH 7 sobre caseína, biomasa microalgal sin tratamiento
y extracto de proteínas de Nannochloropsis sp
Wang & Zhang ( 2012), evaluaron la acción de tres proteasas diferentes sobre
extracto de proteínas de la microalga Chlorella pyrenoidosa, alcanzando grados de
hidrólisis de 18,31%, 14,33% y 8,47% para alcalasa, papaína y tripsina, respectivamente.
Morris et al. (2001), obtuvieron grados de hidrólisis superiores al 50%, al implementar
combinaciones enzimáticas sobre suspensiones al 10%(p/v) en agua de biomasa
despigmentada de Chlorella vulgaris. Las mezclas de enzimas que lograron estos
resultados fueron papaína-tripsina y papaína-pancreatina. Lo que corrobora los resultados
de este estudio, el uso de mezclas enzimáticas permite obtener hidrólisis más completas,
debido a la especificidad de las enzimas. Vale la pena aclarar que hasta ahora en la
revisión bibliográfica realizada en las diferentes bases de datos analizadas no se presenta
casos de tratamientos enzimáticos con extractos proteicos de Nannochloropsis.
4.2.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Con el propósito de determinar los tamaños de los péptidos y/o proteínas después
de los tratamientos enzimáticos, se realizaron pruebas de electroforesis en un gel de
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0,5 1 2 4 6
Gra
do
de
hid
róls
is (
%)
Tiempo (h)
Biomasa original Caseína Extracto de proteínas
a a
a a
a
a
a ab b b
a a a
a a
56 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
poliacrilamida (SDS-PAGE). En la figura 11, se puede ver el resultado de la acción de las
enzimas sobre las proteínas de la microalga y el marcador molecular M (Blue Prestained
Protein Standard). En la columna 1, se muestran las proteínas presentes en el extracto
proteico antes de someterse a hidrólisis enzimática. Se evidencia la presencia de varias
bandas, lo que permite deducir que existe una variedad de proteínas en el extracto. Las
bandas más prominentes se observan entre 25-32 KDa y entre 32-46KDa.
En la columna 2, se muestra el extracto de proteínas sometido a hidrólisis
enzimática. Como se puede observar, desaparecen algunas bandas presentes en la
columna 1, como aquella de aproximadamente 100 KDa; se atenúan otras, como la de 32-
46 KDa y la de 46-58 KDa, y sobresalen otras, como la de 58-75KDa, haciendo evidente
el efecto de las enzimas, al reducir el tamaño molecular de algunas proteínas.
Figura 11. Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). M) Marcador molecular utilizado. 1) Muestra de extracto antes de hidrólisis. 2) Muestra del extracto después de
someterse a hidrólisis enzimática.
Adicionalmente, mediante el método de Lowry (1956), se midió la proteína soluble
en el extracto antes y después de ser filtrada por la membrana de 3KDa, para determinar
la proporción de los péptidos de bajo peso molecular en el hidrolizado obtenido. Los
resultados se muestran en la tabla 20, los cuales son producto de tres mediciones.
Resultados y discusión 57
Tabla 20. Concentración de proteína en las fracciones obtenidas del extracto hidrolizado.
Muestra Concentración de proteína (g/L)
Desviación estándar
Extracto hidrolizado 0,80 0,03
Extracto hidrolizado <3kDa 0,46 0,02
El porcentaje de proteína presente en la fracción menor a 3 KDa corresponde al
58,16%, lo cual indica que la mayor cantidad de proteína del extracto hidrolizado
corresponde a péptidos de bajo peso molecular, resultados complementarios a los
expuestos en el gel de electroforesis.
4.2.5 Espectroscopia Infrarroja con transformada de Fourier
Se analizaron diferentes muestras con el fin de hacer un seguimiento del proceso
de extracción e hidrólisis de proteínas microalgales. Como se observa en la figura 12, la
muestra de biomasa original de Nannochloropsis sp. presenta dos bandas entre 2954-2850
cm-1 y entre 1710-1740 cm-1. La primera correspondiente a las cadenas alifáticas de lípidos
y la segunda a ésteres de ácidos grasos y cetonas de clorofila (Mecozzi, Pietroletti, &
Tornambé, 2011). En contraste, las muestras de los extractos crudo sin dializar, dializado
e hidrolizado, presentan una banda entre 3000 y 2850 cm-1, con una menor intensidad que
la de la biomasa original de microalga y la banda relacionada con la clorofila desaparece
completamente, lo cual sugiere que en el proceso de extracción por homogenización la
cantidad de compuestos ligados a lípidos y pigmentos de la clorofila tuvieron una baja
remoción. Lo anterior indica que el proceso de extracción realizado fue selectivo a
proteínas y carbohidratos.
La banda en la región comprendida entre 1700 y 1510 cm-1 presenta una ligera
modificación entre los extractos crudo sin dializar y dializado con respecto al extracto
hidrolizado. Si bien las bandas con mayor intensidad en las tres muestras (entre 1600-
1660 cm-1) corresponden a amida I (Kong & Yu, 2007), la muestra de extracto hidrolizado
presenta una banda en 1536 cm-1, atribuida a amida II (CN 18-40%, NH 40-60%) (Dean,
Sigee, Estrada, & Pittman, 2010; Kong & Yu, 2007; Mecozzi et al., 2011), que no presentan
las demás muestras, lo cual podría ser consecuencia del efecto hidrolítico de las enzimas
sobre los enlaces peptídicos de las proteínas.
Por otro lado, en las tres muestras de extracto crudo sin dializar, dializado e
hidrolizado, se presentan los picos típicos de estructuras secundarias (Barth, 2007; Kong
58 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
& Yu, 2007): láminas-β (1635, 1632 y 1637 cm-1), hélices-α (1663, 1659, 1661 cm-1), giros-
β (1687, 1683, 1681 cm-1), respectivamente, demostrando que el método de extracción y
el manejo de los extractos durante el proceso fue lo suficientemente delicado como para
mantener las proteínas plegadas, garantizando su estabilidad biológica.
Los espectros de las muestras de extracto crudo sin dializar y dializado presentan
mucha similitud entre las bandas que la componen, es decir, que los compuestos que se
eliminaron en este proceso fueron básicamente las sales presentes en la biomasa de
microalga, especialmente de sodio por haber sido cultivada en un ambiente marino. Estas
sales no solo interfieren en el método de cuantificación de proteínas, sino también en el
proceso de hidrólisis.
Adicionalmente en la figura 12, se observan los espectros de Buffer fosfato 50 mM,
pH 7, el cual estuvo presente tanto en el proceso de extracción, como de hidrólisis y la
solución de enzimas, es decir, el complejo enzimático papaína-pancreatina, con el fin de
ratificar que ninguno de los dos interfiere en los espectros de los extractos de proteína.
Figura 12. Espectros FTIR de biomasa de Nannochloropsis sp. y los diferentes extractos de proteína obtenidos.
Resultados y discusión 59
4.3 Actividad antimicrobiana
Existen una gran variedad de métodos para determinar la actividad antimicrobiana
de un compuesto. En este trabajo, dado que el extracto hidrolizado de proteínas
presentaba cierta turbidez, se decidió emplear un método de dilución en caldo con recuento
de células en placa por microgota.
El crecimiento de S. aureus y E. coli, presentó diferencias estadísticamente
significativas, con un nivel de confianza del 95%, entre la muestra control (medio e inóculo)
y las tres concentraciones de extracto hidrolizado. Adicionalmente, existen diferencias
entre la mayor concentración (C1: 33,35%(v/v)) y la menor concentración (C3:10%(v/v)) de
hidrolizado sobre el crecimiento celular de ambos microorganismos. En la figura 13, se
aprecia que los porcentajes de inhibición de las bacterias analizadas son ligeramente
mayores en el tratamiento al cual se les agregó la mayor concentración de hidrolizado. Es
decir que, en estos casos, el efecto inhibidor de los compuestos presentes en el
hidrolizado, probablemente péptidos antimicrobianos, es proporcional a la concentración
del mismo dentro del cultivo.
Figura 13. Crecimiento de S. aureus, E. coli y C.albicans con diferentes concentraciones de extracto hidrolizado (C1:33,35%(v/v); C2: 20%(v/v) y C3:10%(v/v)).
Por su parte, C. albicans no presentó un comportamiento similar. Existen
diferencias estadísticamente significativas entre el tratamiento control y los tratamientos
con extracto hidrolizado, sin embargo, con un nivel de confianza del 95%, no se observaron
60 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
diferencias en el crecimiento de la levadura entre aquellos tratamientos con
concentraciones diferentes del hidrolizado enzimático.
Es evidente que el efecto inhibidor también influye el crecimiento de la levadura, sin
embargo, su acción se logró en menor medida comparado con las bacterias, pues el
porcentaje máximo de inhibición fue del 14,46%, mucho menor que 93,14% y 96,65%,
porcentajes máximos de inhibición de S.aureus y E. coli respectivamente, como se aprecia
en la figura 14.
En este trabajo, los porcentajes de inhibición para bacterias, indican que los
compuestos presentes en el hidrolizado son prometedores por su efecto antibacteriano.
Posiblemente, a mayor concentración podrían presentar incluso capacidad bactericida.
Figura 14. Porcentaje de inhibición de E.coli, S.aureus y C.albicans a diferentes
concentraciones de hidrolizado enzimático (C1:33,35%(v/v); C2: 20%(v/v) y C3:10%(v/v)).
El efecto bacteriostático del extracto fue levemente mayor en E. coli, lo cual podría
deberse a la producción de proteasas y liberación al medio por parte de Staphyococcus
aureus, dificultando la acción de los compuestos proteicos presentes en el extracto (Oñate,
Manrique, Patiño, & González, 2017). Aunque el efecto antimicrobiano de péptidos
provenientes de proteína microalgal ha sido comprobado para diversos microorganismos
en este y otros trabajos (El-Baz et al., 2013; Sedighi et al., 2016; Sun et al., 2016), sus
mecanismos de acción no han quedado claros y hace falta investigación al respecto.
Sedighi et al. (2016), mostraron importantes resultados frente a la acción
antimicrobiana de Chorella vulgaris contra E. coli. Después de 16 horas de incubación, la
biomasa de C. vulgaris, proteína purificada con un peso molecular de 62 KDa y el
96,65 95,77 95,1593,14 91,19 90,08
13,25 9,64 14,46
0102030405060708090
100
C1 C2 C3Po
rcen
taje
de
inh
ibic
ión
(%)
Tratamientos
E. coli S. aureus C. albicans
Resultados y discusión 61
hidrolizado de ésta con pepsina, presentaron porcentajes de inhibición de 4%, 21,2% y
34,1% respectivamente. Porcentajes menores que los obtenidos en este estudio.
El-Baz et al. (2013), pusieron a prueba la actividad antimicrobiana de un extracto
proteico de Spirulina platensis, por el método de difusión en disco, reportando halos de
inhibición para Enterococcus faecalis y Candida albicans. Las bacterias E. coli y
Staphylococcus aereus, no se vieron afectadas por el extracto. Es decir, que el extracto
tuvo efecto inhibidor sobre una bacteria Gram positiva y una levadura, pero su acción no
fue eficaz contra bacterias Gram negativas.
Sun et al.(2016), probaron que la fracción peptídica aislada de proteína de Spirulina
platensis SP-1, tuvo efecto antimicrobiano contra E. coli y S.aureus, sin embargo, la
bacteria Gram negativa fue más sensible que la Gram positiva, al presentar un halo de
inhibición de 16 mm, mientras que el halo de inhibición de S. aureus tuvo un diámetro de
12mm.
Aunque este estudio suministró información importante en cuanto a la extracción,
transformación y funcionalidad biológica de las proteínas presentes en la biomasa de
Nannochloropsis sp., aún hace falta mucha investigación en cuanto a las características
de los péptidos obtenidos como hidrofobicidad, cationicidad y anfipaticidad, la secuencia
de aminoácidos en su estructura o su efecto antimicrobiano de forma individual. Cabe
resaltar que los resultados obtenidos abren una brecha al estudio de compuestos
bioactivos de microalgas a nivel regional y nacional y su implementación como compuestos
de origen biológico a nivel industrial.
Conclusiones y recomendaciones 63
5. Conclusiones y recomendaciones
5.1 Conclusiones
Se evaluaron variadas metodologías de lisis celular y extracción, algunas
adaptadas de los reportes encontrados en la literatura, sin embargo, los mejores
resultados obtenidos se lograron mediante el uso de ciclos de homogenización para
la morfología y requerimientos de la microalga utilizada.
Para Nannochloropsis sp., los métodos mecánicos de lisis celular para la extracción
de proteínas, presentan mejores eficiencias en cuanto al rompimiento celular, que
algunos métodos químicos y biológicos, debido a la rigidez de la pared celular.
Al mejorar el grado de hidrólisis del extracto, mediante tratamiento enzimático
Papaína-Pancreatina, aumentan las posibilidades de producir péptidos de bajo
peso molecular con potencial antimicrobiano.
El extracto de proteínas presentó mayor grado de hidrólisis que la biomasa original,
con el complejo enzimático papaína-pancreatina, debido a que éstas actúan sobre
el sustrato directamente y no enfrentan la resistencia de la pared celular. La
proteólisis sobre el extracto permitió lograr un porcentaje de péptidos de bajo peso
molecular (<3KDa) aproximadamente del 58%.
El extracto hidrolizado presentó actividad bacteriostáctica y fungistática contra los
microorganismos E. coli, S.aureus y C. albicans, inhibiendo el crecimiento de los
mismos en 96,65%, 93,14% y 14,46% respectivamente.
64 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
5.2 Recomendaciones
Como complemento a este estudio, se recomienda hacer un análisis de hemólisis
al extracto hidrolizado para determinar si éste puede presentar efectos tóxicos sobre el
organismo. Así mismo, para determinar los compuestos involucrados en la actividad
antimicrobiana, se sugiere hacer una purificación del extracto hidrolizado y determinar la
secuencia de aminoácidos presente en su estructura.
El hecho de encontrar actividad bacteriostática permite inferir posibilidades de
investigación en el área nutracéutica de forma prometedora. Como parte de la actividad
antimicrobiana, se sugeriría evaluar las funciones inmunorreguladora, antiparasitaria y
antitumoral del extracto hidrolizado.
Bibliografía 65
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5e780feae1e4&acdnat=1523914520_788c8a9be7b1bcf9fd4b2ab3e34086bf
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Anexos 75
A. Anexo: Perfil de proteína soluble en el tiempo para papaína y pancreatina.
Figura 15. Perfil de proteína soluble en el tiempo por actividad de la Papaína (E/S 1%
p/p) sobre caseína.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 10 20 30 40 50 60 70
Pro
teín
a so
lub
le (g
/L)
Tiempo (minutos)
76 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
Figura 16. . Perfil de proteína soluble en el tiempo por actividad de la Pancreatina (E/S
1%p/p) sobre caseína.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 10 20 30 40 50 60 70
Pro
teín
a so
lub
le (g
/L)
Tiempo (minutos)
Anexos 77
B. Anexo: Análisis estadísticos
En este anexo se especifican las tablas obtenidas en los análisis estadísticos de los
experimentos realizados en los objetivos 2 y 3 de este trabajo.
Condiciones óptimas de papaína
Tabla ANOVA
Condiciones óptimas de pancreatina
Tabla ANOVA
78 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
Hidrólisis sobre biomasa original
Tabla ANOVA
Dado que el valor p calculado (0,0068) es menor a 0,05, se demuestra estadísticamente
que existe una diferencia entre las medias del grado de hidrólisis sobre biomasa original
entre los diferentes niveles de tiempo, con una confianza del 95%. Para determinar cuáles
son esas diferencias se procedió a realizar la prueba de Múltiples rangos.
Tabla LSD
Empleando el método de diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher, se identificaron
dos grupos homólogos, como se muestra en la tabla superior. No existen diferencias
estadísticamente significativas en los niveles de tiempo que compartan una misma
Anexos 79
columna de X. Con este método hay un riesgo del 5% al decir que cada par de medias es
significativamente diferente, cuando la diferencia real es igual a 0.
Hidrólisis sobre caseína
Tabla ANOVA
Dado que el valor p calculado (0,8531) es mayor a 0,05, no existen diferencias
estadísticamente significativas entre las medias de los grados de hidrólisis sobre caseína,
para los diferentes niveles de tiempo, con un nivel de confianza del 95%.
Hidrólisis sobre Extracto de proteínas
Tabla ANOVA
Dado que el valor p calculado (0,2226) es mayor a 0,05, no existen diferencias
estadísticamente significativas entre la mediana de los grados de hidrólisis sobre extracto
de proteínas, para los diferentes niveles de tiempo, con un nivel de confianza del 95%.
Análisis de varianza para crecimiento de E. coli expuesto al hidrolizado enzimático
Tabla ANOVA
El análisis de varianza muestra que el valor p calculado (0) es menor que 0,05, por lo
tanto, existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medias del
Log(UFC/mL), para los diferentes tratamientos en E. coli. Por ello, se precisó de un análisis
de Múltiples rangos.
80 Obtención de un hidrolizado enzimático de proteína microalgal con potencial
antimicrobiano
Tabla LSD
Según el método de análisis empleado, LSD de Fisher, se encontraron dos grupos
homólogos según la alineación de las X en la columna. No existen diferencias
estadísticamente significativas entre aquellos tratamientos que comparten una misma
columna de X, con un 95% de confianza.
Análisis de varianza para crecimiento de S. aureus expuesto al hidrolizado
enzimático
Tabla ANOVA
El análisis de varianza muestra que el valor p calculado (0) es menor que 0,05, por lo
tanto, existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medias de
Log(UFC/mL), para los diferentes tratamientos en S. aureus. Por ello, se precisó de un
análisis de Múltiples rangos.
Tabla LSD
Según el método de análisis empleado, LSD de Fisher, se encontraron dos grupos
homólogos según la alineación de las X en la columna. No existen diferencias
estadísticamente significativas entre aquellos tratamientos que comparten una misma
columna de X, con un 95% de confianza.
Anexos 81
Análisis de varianza para crecimiento de Candida albicans expuesto al hidrolizado
enzimático
Tabla ANOVA
El análisis de varianza muestra que el valor p calculado (0,0157) es menor que 0,05, por
lo tanto, existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medias del
Log(UFC/mL), para los diferentes tratamientos en Candida albicans. Por ello, se precisó
de un análisis de Múltiples rangos.
Tabla LSD
Según el método de análisis empleado, LSD de Fisher, se encontraron dos grupos
homólogos según la alineación de las X en la columna. No existen diferencias
estadísticamente significativas entre aquellos tratamientos que comparten una misma
columna de X, con un 95% de confianza.
Anexos 82
C. Anexo: Curvas de calibración
Figura 17. Curva de calibración para actividad enzimática de proteasas.
Curva de calibración Lowry:
Dado que los reactivos utilizados en el método de Lowry son fotosensibles, se hizo una
curva de calibración cada vez que se iba a llevar a cabo el método. Sin embargo, la
siguiente gráfica es un ejemplo de ello.
y = 2,84x + 0,0112R² = 0,995
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35
Ab
sorb
anci
a (6
60 n
m)
µmol tirosina
Curva patrón tirosina
Anexos 83
Figura 18. Curva de calibración de BSA para el método de Lowry.
y = 0,527x - 0,0435R² = 0,9972
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Ab
sorb
anci
a( 7
50 n
m)
Concentración de proteína (mg/mL)
Curva patrón BSA
Anexos 84
D. Anexo: Especificaciones de las enzimas empleadas.
CREON 25000®
Laboratorios Abbott
Sustitutivo enzimático pancreático.
Composición: Cada cápsula con microesferas gastrorresistentes contiene: Pancreatina
(polvo de páncreas: Amilasa: 18.000 U. de F. Eur., Lipasa: 25.000 U. de F. Eur., Proteasa
1.000 U. de F. Eur.) 300,00 mg. Excipientes: Macrogol 4000, 75,00 mg; Ftalato de
Hipromelosa 112,68 mg; Alcohol etílico 2,37 mg; Citrato de Trietilo 6,26 mg; Dimeticona
1000, 2,69 mg. Composición de la cápsula: Gelatina, 95,08 mg; Óxido de Hierro (111)
E172, 0,46 mg; Hidróxido de Hierro (III) E 172, 0,08 mg; Dióxido de Titanio, 0, 19 mg;
Dodecilsulfato de sodio, 0.19 mg.
Anexos 85
Figura 19. Ficha dada por el fabricante de la enzima Papaína 4000 DB.