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7/24/2019 Monografia Sobre Cromatografa
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AGRADECIMIENTO
Esta monografa se empez a realizar en julio del2008 y se culmin en agosto del 2008. Durantetodo este tiempo fue necesario tener muchadedicacin y paciencia para la composicin,diagramacin y revisin de los contenidos, sinduda una tarea verdaderamente invalorale, por
lo !ue nos sentimos agradecidos de lacolaoracin de nuestros profesores"
#$%&'( )E*+DE- /E((E('
s mismos a todos !uienes contriuyeron dealguna u otra forma en la elaoracin de lamonografa, pero muy especialmente !uien
1gura en la lista de colaoradores.
DEDICATORIA
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Dedicamos este traajo anuestro profesor #ctor)el3ndez uerrero, poriniciarnos en lainvestigacin y por sergua en nuestras primerase4periencias acad3micasuniversitarias.
Dedicamos el traajo anuestros padres por!ue sonnuestros guas y luz para
alcanzar nuestros m5s grandesanhelos.
NDICE
$&('D/%%$677777777777777777777777..7..77777777777777 0%9:&/*' $" ;$
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2. 9remio el77.77..7777777.77777.7...77777777777777
@. De1nicin777777777777777777777777777777777777
%9:&/*' $$" %*$%%$6 DE %(')&'(>: . %romatografa de reparto 77777777777777...7777777777777 8 2. %romatografa deadsorcin777777777777777777777777777. 2 @. %romatografa engel7777777777777777777777777777777. 2 . %romatografa en gel de capa1na77777777777777777777777.. @2 A. %romatografa de intercamioinico7777777777777777777777 @ B. %romatografa dea1nidad7777777777777777777777777777 2 ?. %romatografa depenetrailidad777777777777.................................. A0
8. %romatografa de interaccin hidrofica77777..7777777777777 AC
%9:&/*' $$$" )+&'D'< DE %(')&'(>: . %romatografaplana77777777777777777........................................B@
.. %romatografa en papel.... ....777777777777777777..777....B@.2. %romatografa de capa1na...................................................................B?
2. %romatografa encolumna..............................................................................? @. %romatografa degases7777777777777777777777777777..... 80 . %romatografa de l!uidos de alta resolucin;9*%......................................8A
%9:&/*' $#">/D)E&' &E'($%'7.7777777...........................7.77777777777777788
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9*$%%$'E< * *$
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9*$%%$'Eue desarrolla por )artin. &iene como soporte un papel de celulosa.
d!uiri una gran e4tensin por su sencillez y presenta la ventaja
de poder utilizar miligramos y microgramos, adem5s presenta la
opcin de utilizar tanto la t3cnica descendente en columna, etc...
como la t3cnica ascendente.
C)oma,o")a45a # %apa 9a
>ue originada por los traajos de los investigadores rusos $zmailov y
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Es una de las t3cnicas m5s utilizadas e importantes, de forma !ue
ha revolucionado el campo de la !umica analtica.
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!ue genera una seJal !ue puede depender de la concentraciny
del tipo de compuesto.
E 1>?@ Ts+#,, *#9': (a %)oma,o")a45a %omo
)3todo en el cual los componentes de una mezcla son separados
en una columna adsorente dentro de un sistema Luyente.
R#%'#,#m#,# (a I.U.P.A.C *#9# (a %)oma,o")a45a *# 4o)ma
mBs amp('a %omo
)3todo usado principalmente para la separacin de los
componentes de una muestra, en el cual los componentes son
distriuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria,
mientras !ue la otra es mvil. *a fase estacionaria puede ser un
slido o un l!uido soportado en un slido o en un gel matriz.
*a fase estacionaria puede ser empa!uetada en una columna,
e4tendida en una capa, distriuida como una pelcula, etc.
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S#" -#!(#mas ha *#9'*o (a %)oma,o")a45a %omo
/n m3todo fsico de separacin en el cual los componentes a
separar se distriuyen entre dos fases, una de las cuales constituye
la fase estacionaria, de gran 5rea super1cial, y la otra es un Luido
fase mvil !ue pasa a trav3s o a lo largo de la fase estacionaria.
*a fase estacionaria puede ser un slido o un l!uido dispuesto
sore un slido !ue actKa como soporte, de gran 5rea super1cial.
*a fase mvil es un Luido puede ser gas, l!uido o Luido
supercrtico !ue se usa como portador de la mezcla.
En la cromatografa ocurren dos fenmenos muy importantes y !ue
son pr5cticamente los rectores del proceso de separacin" la
adsorcin y la asorcin.
*a adsorcin es la retencin de una especie !umica en los sitios
activos de la super1cie de un slido, !uedando delimitado el
fenmeno a la super1cie !ue separa las fases o super1cie
interfacial.
Esta retencin super1cial puede ser fsica o !umica. *a adsorcin
depende de la naturaleza de la sustancia adsorida, de la
temperatura, de la naturaleza y estado de sudivisin del
adsorente, y de la concentracin.
*a asorcin es la retencin de una especie !umica por parte de
una masa y depende de la tendencia !ue tiene 3sta a formar
mezcla o reaccionar !umicamente con la misma.
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C
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CAPITULOII
CLASIFICACIN DE CROMATOGRAFIA
9ara clasi1car gloalmente los procesos cromatogr51cos es
necesario atender a dos criterios 5sicos"
>undamento del proceso cromatogr51co, lo !ue conduce a los
tipos de cromatografas.
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ciones ponen d3 mani1esto !ue en un caso ideal en el !ue la
distriucin venga Knicamente determinada por el reparto, la
resolucin de dos sustancias mejorar5 con el aumento de la
longitud de la fase estacionaria.
1.1 Ejemplos de cromatografa de reparto
*os dos tipos de cromatografa de reparto m5s corrientes son la
cromatografa en papel y la de capa 1na. En los dos casos la matriz
contiene un l!uido, en la cromatografa en papel se trata de las
mol3culas de agua unidas a la celulosa y en la cromatografa de
capa 1na el l!uido unido al soporte es el disolvente utilizado para
formar la capa 1na v3anse las p5ginas CANCC. Estas t3cnicas a
veces se consideran como tipos de cromatografa de adsorcin,
por!ue los efectos de adsorcin entran dentro de la consideracin
de separacinI sin emargo, el principal tipo de accin !ue tiene
lugar es el reparto.
*a cromatografa de reparto tami3n puede realizarse en columnas,
utilizando una matriz !ue no adsora los solutos. *os materiales de
soporte m5s corrientes son la tierra de diatomeas p. e., %elita, el
gel de slice, la celulosa en polvo y algunos de4tranos !ue forman
tramas p. e.,
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*a cromatografa de reparto se utiliza, sore todo, para mol3culas
de ajo pesoN molecular. 9ara reducir la e4tensin por difusin es
decir, el ensanchamiento de los picos, son necesarias zonas de
iniciacin muy pe!ueJas y una separacin r5pida. En los apartados
!ue tratan de cromatografa en papel y en capa 1na, se descriir5
con detalle cmo se realizan estos procesos.
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se une no es una fraccin constante, sino !ue disminuye a medida
!ue disminuye la concentracin. *a velocidad con !ue se mueve la
sustancia est5 relacionada con la fuerza de unin, siendo m5s lento
el movimiento cuanto m5s 1rme es la unin. En consecuencia, las
mol3culas pueden separarse si tienen isolneas de adsorcin
diferentes, deido a !ue sufriran un grado diferente de retraso.
&ala . )ateriales de uso corriente en la cromatografa de
adsorcin.
)aterial
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separados se encuentran e identi1can titulando alcuotas de cada
fraccin ^haciendo mediciones espectroscpicas, prueas
!umicas, radiactividad, etc. En los casos en !ue el an5lisis se
realiza midiendo la asorcin de la luz, se utiliza un
espectrofotmetro de registro continuo. *a muestra pasaO 5 trav3s
de un tuo antes del fraccionamiento, se mide la asorancia en la
longitud de onda apropiada y se representan los valores en un
registrador gr51co de forma continua.
*as columnas pueden ser eluidas de tres formas" el m3todo m5s
sencillo consiste en un Lujo continuo del disolvente a trav3s de la
columna. Este m3todo es de uso corriente en la cromatografa de
intercamio inico y en la cromatografa en gel.
*a elucin por pasos se utiliza, en general, cuando la columna
funciona con propsitos preparativos. *a columna es eluida con un
disolvente hasta !ue se alcanza un volumen previamente
determinado. continuacin se aJade un segundo disolvente. Este
m3todo tiene la ventaja de !ue se pueden disponer las condiciones
de forma !ue un material concreto pueda eluirse en un volumen
astante pe!ueJo. %onsid3rese, por ejemplo, una mezcla de
sustancias en la !ue la sustancia F sufre un fuerte retardo cuando
se emplea el disolvente , mientras !ue las dem5s sustancias
e4perimentan un retraso muy pe!ueJoI adem5s F e4perimenta Oun
retraso muy d3il con el disolvente G. 9or lo tanto, si se lava la
columna con un e4ceso de disolvente , la mayor parte del material
es eluido de la columna, mientras !ue la mayor parte de F
permanece unido a ella.
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se preparan por medio de aparatos del tipo !ue se muestra en la
1gura 8NA. Estos aparatos constan de dos recipientes, un depsito y
una c5mara de mezcla, !ue est5n conectados por sus ases. El
depsito contiene el disolvente m5s concentrado. El l!uido sale de
la c5mara de mezcla y entra en la columna. %omo los niveles
hidrost5ticos deen corresponderse las alturas de los l!uidos no
tienen !ue ser necesariamente iguales, por!ue las densidades de
los l!uidos en amos recipientes puede variar, el li!uido Luye
simult5neamente del depsito a la c5mara de mezcla.
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9or lo tanto, las mol3culas son eluidas de la columna por orden de
tamaJos decrecientes, o, si la forma es relativamente constante
por ejemplo, gloular o cilndrica, por orden de pesos moleculares
decrecientes.
En un an5lisis detallado de la cromatografa en gel, !ueda claro !ue
este efecto est3rico, aun!ue es el principal factor, no e4plica por si
slo el comportamiento cromatogr51co de todas las mol3culas.
'tro factor importante es la carga de la mol3cula, aun!ue 3sta se
mani1esta slo en condiciones de aja fuerza inica, en las !ue las
mol3culas pe!ueJas, fuertemente cargadas, parecen !uedar
e4cluidas de los poros, independientemente de !ue su tamaJo sea
lo su1ciente pe!ueJo. Este efecto se dee, con proailidad, a la
repulsin electrost5tica entre las mol3culas, !ue limita el nKmero
de mol3culas en un poro en cual!uier momento dado. %uando la
fuerza inica es muy pe!ueJa, tami3n parecen e4istir efectos de
adsorcin, al menos en apariencia y en algunos tipos de geles.
3.1 Materiales para la cromatografa en gel
/n gel es un retculo tridimensional cuya estructura se dispone, por
lo general, al azar. *os geles !ue se utilizan como tamices
moleculares constan de polmeros entrecruzados, por lo general,
inertes, !ue no se unen ni reaccionan con el material analizado y
!ue no presentan carga el3ctrica. El espacio del interior del gel est5
ocupado por un l!uido !ue rellena la mayor parte del gel.
*os geles de uso corriente son de tres tipos" de4trano, agarosa y
poliacrilamida.
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recie el nomre de hinchazn. El de4trano se otiene
comercialmente con el nomre de ine
%hemicals, $nc..
*a agarosa !ue se otiene de ciertas algas marinas es un
polmero lineal de DNgalactosa y @,BNanhidroNNgalactosa y forma un
gel !ue se mantiene compacto sin necesidad de
entrecruzamientos, por medio de puentes de hidrogeno.
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*os geles descritos hasta el momento se dilatan en agua y en unos
pocos disolventes org5nicos" glicol, formamida y dimetiisulf4ido.
o sufren hinchazn en alcohol puro, hidrocaruros y la mayora de
los disolventes org5nicos, tanto polares como no polares. o
ostante, sustancias como lpidos, esferoides y algunas vitaminas,
se manejan con mayor facilidad en estos disolventes.
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. Deido a !ue el comportamiento cromatogr51co de casi todas
las sustancias en los geles es independiente de la temperatura, p;,
fuerza inica y composicin de los lampones, se pueden realizar
separaciones pr5cticamente ajo cual!uier condicin. %uando se
traaja con materiales muy l5iles p. e., enzimas esto signi1ca
!ue pueden mantenerse las condiciones para una estailidad
m54ima.
2. )uchas sustancias l5iles no resultan afectadas por la
cromatografa en gel, puesto !ue no hay pr5cticamente adsorcin.
9or ejemplo, algunos enzimas resultan inactivados o alterados por
la unin a super1cies adsorentes o resinas de intercamio inico.
@. E4iste menos dispersin de las andas !ue con otras t3cnicas
cromatoNgr51cas por razones !ue no est5n claras.
. El volumen de elucin se relaciona de forma sencilla con el peso
molecular.
&ala 2.
)ateriales de uso corriente en la cromatografa en gel.
)aterial y nomre
comercial
)argen de
fraccionamiento peso
molecular
De4trano
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GioNgel 9N@00 B0 000 00 000garosa
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dar como resultado la p3rdida de las muestras inestales. o
ostante, la cromatografa en gel proporciona un camino r5pido
para realizar este proceso. 9or ejemplo, las sales y las mol3culas
pe!ueJas pueden eliminarse con rapidez deido a !ue resultan
retrasadas en todos los geles. El intercamio de tampones puede
realizarse haciendo pasar una disolucin de macromol3culas a
trav3s de una columna e!uilirada previamente con el tampn
deseado. %omo las macromol3culas se mueven con m5s facilidad a
trav3s del gel !ue los componentes del tampn original, podr5n ser
eluidas en el tampn en el !u3 se ha e!uilirado el gel. *a
concentracin de macromol3culas se logra con facilidad aJadiendo
partculas secas de gel y utilizando un tipo cuyo tamaJo de poro
sea menor !ue el de las mol3culas con la !ue se est3 traajando.
medida !ue se hinchan los gr5nulos, asoren el agua pero no las
macromol3culas, concentr5ndose 3stas Kltimas. *a mayor parte de
los m3todos de concentracin de macromol3culas presenta el
prolema de !ue tami3n concentran las sales y una concentracin
e4cesiva de sales puede alterar e incluso disociar y desnaturalizar
algunas macromol3culas. Este prolema no e4iste si se utilizan
geles !ue asoran el agua y las sales.
continuacin se descrien algunos ejemplos espec1cos de
cromatografa en traajos preparativos"
. En la sntesis !umica de algunos reactivos es necesario, en
general, separar el producto de las sustancias iniciales. 9or
ejemplo, cuando se preparan anticuerpos Luorescentes haciendo
reaccionar los anticuerpos con isotiocianuro de Luorescena, la
protena conjugada dee separarse del colorante !ue no ha
reaccionado. Esto puede realizarse con
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2. En la titulacin de enzimas o en la determinacin de los
re!uerimientos de cofactores, la preparacin de enzimas contiene a
veces inhiidores de pe!ueJo tamaJo molecular o los mismos
cofactores. &ami3n en los estudios fsicos de algunas mol3culas p.
e., en la espectroscopia de Luorescencia pueden estar presentes
sustancias de interferencia. Estas mol3culas pe!ueJas pueden
eliminarse con facilidad utilizando geles de de4trano o de
poliacrilamida.
@. De forma similar, pueden e4istir contaminantes de gran tamaJo
molecular en mezclas en las !ue est5n analizando mol3culas
pe!ueJas. En estos casos pueden utilizarse de4tranos de poro
pe!ueJo. &ami3n en ocasiones deen separarse 5cidos nucleicos
de protenasI esto puede hacerse algunas veces mediante el
empleo de geles de agarosa, !ue impiden el paso a las protenas y
permiten el paso a los 5cidos nucleicos por el volumen vaco.
. En la mayora de los an5lisis fsicos de 5cidos nucleicos, la
muestra dee estar lire de protenas. Esto puede hacerse con
facilidad. /n ejemplo de inter3s en mi propio laoratorio es la
preparacin de D a partir de e4tractos celulares en crudo, para
el an5lisis con el microscopio electrnico, utilizando la t3cnica del
citocromo c de Hleinschmidt v3ase el captulo @.
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dem5s. El paso en el !ue tiene lugar la separacin por tamaJos
utiliza, casi invarialemente, la cromatografa en gel.
*a cromatografa en gel es tami3n un valioso instrumento
analtico. *a determinacin de pesos moleculares !ue se ha citado
anteriormenteO es un ejemplo importante. 'tros ejemplos son"
. En el estudio del metaolismo del (, algunas fracciones del
( se distinguen, en general, por centrifugacin zonal, o aKn
mejor, por electroforesis en geles de poliacrilamida. *a
cromatografa en gel de agarosa es tami3n muy utilizada. En la
1gura 8N20 se muestra un ejemplo.
2. *as fracciones proteicas del plasma deen ser, a menudo,
determinadas cuantitativamente paraN el diagnstico de algunas
enfermedades humanas. 9uede hacerse directamente en geles de
de4trano y se ha desarrollado como una pruea de utilidad en la
macrogloulinemia e hipergioulinemia.
@. El intercamio de tritio para el e4amen de la estructura de la
protena o el D, re!uiere !ue la macromol3cula sea separada con
rapidez del @;2'. Esto puede hacerse en unos 0 segundos
utilizando geles cargados, deido a !ue el @;2' sufre grandes
retrasos en todos los geles.
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. CROMATOGRFIA EN GEL DE CAPA FINA
*a cromatografa en capa 1na tiene las ventajas de una r5pida
separacin, el empleo de un e!uipo sencillo y una f5cil elucinI
como m3todo analtico, est5 reemplazando a la cromatografa en
papel. *a cromatografa en gel de capa 1na &*, _thinNlayer gel`
ofrece las mismas ventajas, adem5s de todas a!uellas
proporcionadas por la utilizacin de geles.
*a cromatografa en gel de capa 1na es similar a la cromatografa
en capa 1na, en la !ue se e4tiende una 1na capa de material sore
una placa de vidrio, se coloca una gota de la muestra y una fase
mvil atraviesa la capa 1na.
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)ientras !ue la cromatografa en capa 1na se utiliza, sore todo,
con amino5cidos, azKcares, oligosac5ridos, lpidos, esferoides y
otras mol3culas pe!ueJas, la cromatografa en gel de capa 1na se
aplica a protenas, p3ptidos, 5cidos nucleicos, nucletidos y otras
sustancias hidroflicas de gran tamaJo.
El principal uso de la cromatografa en gel de capa 1na se
encuentra en la determinacin de los pesos moleculares de
protenas y p3ptidos.
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la primera, las sustancias a separar se unen al intercamiador
utilizando condiciones !ue originan una unin fuerte y estaleI a
continuacin, se eluye la columna con tampones de diferente p; o
diferente fuerza inica, compitiendo los componentes del tampn
con el material, por los sitios de unin.
*.1 #ropiedades de los intercam+iadores inicos
/n intercamiador inico es, por lo general, un retculo
tridimensional o matriz !ue tiene grupos cargados unidos.
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importante deido a !ue, si se e4cede en su capacidad, los iones
pasar5n a trav3s de la columna sin unirse.
&ala @
9ropiedades de algunos intercamiadores inicos.
)atriz
$ntercamiad
ork
rupo funcional omre
comercialDe4trano >%
D%
>
D
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de4
%elulosa
%
%
%aro4imetilo
>osfo
Dietilaminoetilo
9oliletilenimina
Dietilaminoetilo,
enzoiladoN
naftolilado
%)Ncelulosa
9Ncel
DEEN
celulosa
9E$N celulosa
DEE GDN
celulosa
9G
celulosaEstirenoN
divinilNenceno
>% cido sulfnico A0
crlica D% %aro4lico GioN(e4 ?0>enlica >% cido sulfnico Gio (e4 0Epo4iamina D mino terciario N@
La capacidad aprovechablees la capacidad ajo unas condiciones
e4perimentales determinadas es decir, p;, fuerza inica. 9or
ejemplo, la e4tensin con la !ue un intercamiador inico est5
cargado depende del p; el efecto del p; es menor con los
intercamiadores inicos fuertes. 'tro factor es la fuerza inica,
deido a !ue los iones pe!ueJos situados cerca de los grupos
cargados compiten con las mol3culas de la muestra por estos
grupos. Esta competicin es astante e1caz si la muestra es una
macromol3cula, deido a !ue el elevado coe1ciente de difusin del
ion implica un mayor nKmero de encuentros. 9or lo tanto, conforme
aumenta la concentracin del lampn, la competicin se hace, m5s
intensa.
La porosidadde la matriz es una caracterstica importante, deido
a !ue los grupos cargados se encuentran dentro y fuera de la
matriz. *as mol3culas mayores pueden ser incapaces de penetrar
en los poros, de forma !ue la capacidad disminuye segKn
aumentan las dimensiones moleculares. *a porosidad de las resinas
asadas en el poliestireno se determina por la cantidad de
2
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entrecruzamientos producidos por el divinilenceno la porosidad
disminuye segKn aumenta la cantidad de divinilenceno. %on las
series DoXe4, el porcentaje de divinilenceno viene indicado por un
nKmero situado despu3s de una FI por lo tanto, DoXe4NA0NF8
signi1ca !ue contiene un 8 b de divinilenceno.
*os intercamiadores inicos vienen en distintos tamaJos de
partcula !ue recien el nomre de tamaJo de malla. *as mallas
m5s 1nas presentan una mayor relacin super1cieNvolumen y, por
lo tanto, aumentan la capacidad del intercamiador. 9or otra parte,
las mallas 1nas implican una velocidad de Lujo menor, con lo !ue
puede aumentar la e4tensin por difusin.
De entre tal conjunto de intercamiadores inicos con propiedades
tan diferentes ^carga, capacidad, porosidad, malla^ se puede
hacer la seleccin del m5s apropiado para realizar una separacin
particularmente difcil. En los siguientes apartados se descrie
cmo decidir el tipo de material de la columna y las condiciones
para la unin de los iones y la elucin de los mismos.
*.2 Eleccin del intercam+iador inico
*a primera eleccin !ue se dee hacer es si el intercamiador ser5
aninico o catinico.
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los intercamiadores no deparan la oportunidad de aparejar la
porosidad con el peso molecular.
*os intercamiadores de celulosa han proado ser los mejores para
la puri1cacin de mol3culas grandes como protenas, y
polinucletidos. Ello es deido a !ue la matriz es 1rosa, por lo !ue
todos los grupos funcionales se encuentran en la super1cie y
disponiles, incluso, para las mol3culas mayores.
*a seleccin del tamaJo de malla es di1cultosa. *os tamaJos de
malla pe!ueJos mejoran la resolucin pero disminuyen la velocidad
de Lujo, lo !ue incrementa la dispersin zonal y disminuye la
resolucin. 9or lo tanto, el tamaJo de malla se determina, por lo
general, de forma emprica.
*.( Eleccin del p/ tampn , condiciones inicas
Deido a !ue los lampones est5n formados por iones, tami3n
pueden intercamiar y como resultado puede afectarse el e!uilirio
del p;. 9ara evitar estos prolemas se adopta la llamada regla de
los tampones" se deen utilizar tampones catinicos con los
intercamiadores amnicos y tampones amnicos con los
intercamiadores catinicos. Deido a !ue la fuerza inica es un
factor a tener en cuenta para la unin, dee escogerse un tampn
con elevada capacidad de tamponacin, de modo !ue su fuerza
inica pueda ser lo su1cientemente aja. dem5s, para otener
una uena resolucin se ha encontrado !ue, por lo general, las
condiciones inicas utilizadas para colN car la muestra en la
columna las denominadas condiciones iniciales deen ser
apro4imadamente las mismas !ue las !ue se utilizan para la
elucin de la columna.
*.* E0uili+rio de intercam+io de iones
%ual!uier intercamiador de iones tendr5 sus grupos cargados
unidos electrost5ticamente a contratnos, de forma !ue el conjunto
sea el3ctricamente neutro. *os distintos intercamiadores pueden
A
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mostrar diferente a1nidad por unos contraiones u otros. s, un
conjunto de contraiones de uso frecuente en io!umica, ordenados
de mayor a menor a1nidad, para un intercamiador de aniones
gen3rico, es cfralo o4alato %lN formiato acetato ';N, o,
para un intercamiador de cationes gen3rico, %a2 )g2 H
; a ;. *os otros iones a tomar en cuenta en el
proceso de intercamio son los propios solutos de la mezcla 5
separar. *a mayor parte de las iomol3culas son de naturaleza
inica. *os grupos 5cidos desprotonados aportar5n carga negativa,
mientras !ue la protonacin de los 5sicos dar5 carga positiva. En
el caso particular de los iopolmeros, la presencia de varios grupos
funcional de uno u otro tipo, da cuenta de su car5cter de
polielectrlifos, por lo !ue se podr5n comportar como cationes o
como aniones, segKn !ue el p; del medio sea inferior o superior a
su p$, respectivamente.
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primera es !ue las variaciones del p; del medio !ue alteren la
carga del soluto, modi1car5n la posicin del e!uilirio anterior,
desplaz5ndolo a la derecha o a la iz!uierda segKn !ue ad!uiera
m5s o menos carga. 9or otra parte, dicho e!uilirio podr5 ser
desplazado en un sentido u otro segKn sea la concentracin de a
en el medio ley de accin de masas. s, si el valor de K fuese
muy elevado, el soluto < !uedar5 unido a la resina desplazando a
los iones a.
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intercamiador. En el lmite, cuando la fuerza inica sea muy
elevada, todos los solutos tendr5n fe ' e4clusin de la fase
estacionaria, por lo !ue no podr5n ser resueltos, pero, si se
emplean fuerzas inicas compatiles con la retencin, ser5 posile
resolver los distintos solutos sin m5s !ue ir modi1cando la fuerza
inica. En suma, !ue la elucin con fuerzas inicas programadas
elucin en gradiente, permite al e4perimentador un control 1no
de la resolucin. De hecho, se pueden separar iopolmeros con
muy pocas diferencias en su carga neta ej." resolucin de dos
protenas !ue di1eran slo en uno de sus amino5cidos ionizales.
*. plicaciones de la cromatografa de intercam+io inico
En principio, cual!uier sustancia cargada puede ser
cromatogra1ada con un intercamiador inico. *as resinas
intercamiadoras son las m5s Ktiles para las mol3culas org5nicas
pe!ueJas y pueden utilizarse incluso para separar iones met5licos
p. e., %a2de )g2. *as protenas y los polisac5ridos se separan
mejor con los intercamiadores da celulosa, de4trano y
poliacrilamida. *os intercamiadores de de4trano y poliacrilamida
se han utilizado tami3n e4tensamente en la separacin de
nucletidos, amino5cidos y otras mol3culas pe!ueJas de
importancia iolgica.
@. CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
*a cromatografa de a1nidad es un tipo de cromatografa !ue
utiliza la a1nidad espec1ca entre la sustancia !ue dee aislarse y
una mol3cula a la !ue 3sta puede unirse de forma espec1ca un
ligando. El material de la columna se sintetiza por unin covalente
del ligando !ue puede ser una macromol3culas o una mol3cula
pe!ueJa con una matriz insolule. partir de este momento la
columna es capaz de adsorer de manera espec1ca, a partir de la
disolucin, la sustancia !ue va a ser aislada. *a elucin se realiza
8
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camiando las condiciones, de forma !ue la unin ya no tenga
lugar.
9ara poder llevar a cao la cromatografa de a1nidad deen
comunicarse varias condiciones" la matriz no dee adsorer por
s misma mol3culas de forma signi1cativaI 2 el ligando dee
unirse a la matriz sin alteracin de sus propiedades de uninI @
dee escogerse un ligando cuya unin se fuerte, por!ue aun!ue
una unin d3il consiga retrasar la elucin puede no resultar
adecuada para la separacinI dee ser posile elucin la elucin
sin destruccin de la muestra. *a matriz m5s Ktil es la agasa
ine %hemicals, $nc., deido a !ue presenta
una adsorcin mnima, mantiene unas uenas propiedades de Lujo
despu3s del enlace !umico con el ligando y tolera los e4tremos de
p; y fuerza inica, as como el cloruro de guanidinio ?) y la urea,
!ue se necesitan a menudo para una elucin efectiva. Es posile
ad!uirir agarosa a la cual est3n unidos covalentemente reactivos
!ue puedan enlazar protenas, memranas y esteroidesI o
concavalina , un adsoreI !ue preparado para polisac5ridos y
glucoprotenas !ue contengan residuos TNDNmanosilo y aNDN
glucosilo p. e., memranas celulares y c3lulas enteras, lo cual es
una ayuda adicional.
El principal uso de la cromatografa de a1nidad hasta el momento
ha sido la puri1cacin de protenas, memranas y polisac5ridos.
continuacin se indican algunos ejemplos"
#uri)cacin de enimas:
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#uri)cacin de anticuerpos
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viajan en la fase mvil. En esos casos es conveniente !ue el ligando
no se ancle directamente, sino !ue !uede separado de la matriz
por un razo espaciador.
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matrices para cromatografa de a1nidad, as como los tipos de
ligandos uniles a cada una de ellas.
El anclaje consiste 5sicamente en incuar, ajo agitacin suave, la
suspensin formada por la matriz activada y una disolucin del
ligando. esta suspensin se le aJade la carodiimida si se precisa
de un agente condensante. *as variales e4perimentales a
controlar son, p;, fuerza inica, temperatura y tiempo de
incuacinI
estas dos Kltimas suelen estar inversamente relacionadas ej." para
agarosa activada con %Gr, 2N horas a temperatura amiente o B
horas en c5mara fra a %.
Es imprescindile !ue en la unin covalente del ligando no !ueden
involucradas regiones de su mol3cula !ue sean cruciales para la
interaccin iolgica, o !ue, por encontrarse tan pr4imas al centro
de interaccin, dejen a 3ste inaccesile. )uchas veces, este
ojetivo no se consigue, lo !ue impide la realizacin de este tipo de
cromatografas. 'tras veces, para preservar la capacidad de
interaccin del ligando, se hace preciso reducir su concentracin en
la mezcla de incuacin con la matriz activada. En el mismo
sentido suele resultar efectivo traajar con matrices cuya
proporcin de grupos activos sea reducida, ien por!ue se
ad!uieren con un ajo ndice de activacin, ien por!ue se
someten a un proceso previo de desactivacin lenta y controlada.
%ual!uiera !ue sea la opcin, el ojetivo es reducir la e4tensin del
anclaje covalente, fundamentalmente para evitar las uniones del
ligando por mKltiples sitios. Estas uniones multipunto suelen ser las
principales responsales de la inactivacin de los ligandos, en
especial cuando se trata de ligandos macromoleculares.
&erminada la incuacin entre el ligando y la matriz cromatogr51ca,
se procede a eliminar el e4ceso de ligando y reactivos por
decantacin o 1ltracin del sorenadante, seguido de lavado con
lampn.
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+stos deen ser eliminados para evitar interacciones inespec1cas
con los solutos de la muestra. 9ara ello se suelen lo!uear con
aminas o 5cidos en concentraciones su1cientemente altas 0, a
,0 ). *a incuacin con lampones catinicos asados en &ris, o
amnicos asados en 5cido ac3tico, suele ser su1ciente. En
esencia, se trata de unir en los sitios remanentes otros ;2
%''; distintos a los del ligando. &ras el lo!ueo, un lavado
e1ciente, seguido de e!uilirado en el lampn adecuado, dejar5 a
la fase estacionaria lista para ser empa!uetada en la columna.
.2 plicacin de la muestra , elucin
9or regla general, el volumen de lecho cromatogr51co
empa!uetado es el necesario para traajar segKn la modalidad
descrita en el apartado B.?.2, o en una modalidad intermedia entre
y 2. %uando se emplean fases estacionarias asadas en ligandos
espec1cos de grupo %uadro B.B puede ser necesario traajar con
columnas m5s largas, a 1n de resolver diferentes solutos del mismo
grupo !ue muestren a1nidades parecidas por la fase estacionaria.
El lampn de e!uilirado se har5 escogido de forma !ue se
favorezca la interaccin iolgica de inter3s, a la vez !ue se
reduzcan al mnimo otras interacciones inespec1cas. Dada la
elevada a1nidad !ue suelen mostrar las mol3culas
interaccionantes, lo normal es traajar con fuerzas inicas
relativamente elevadas ej." a%l 0,2 ). /na vez aplicada la
muestra, se continuar5 pasando tampn de e!uilirado hasta lavar
todos los contaminantes. El Lujo de la columna, durante la
aplicacin de la muestra y su posterior elucin, puede ser una
variale crtica en a!uellos casos en !ue las constantes de
velocidad de las reacciones de asociacin y disociacin sean ajas.
%on car5cter general, es recomendale emplear Lujos ajos
durante la aplicacin y la elucin, mientras !ue en los lavados se
podr5n utilizar Lujos altos.
A@
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En ocasiones, la unin del soluto de inter3s es tan fuerte !ue su
elucin slo es posile ajo condiciones incompatiles con la
funcionalidad iolgica, con lo !ue har5 !ue e4cluir el empleo de
este tipo de cromatografa. En situaciones menos e4tremas, se
podr5 acudir a eluciones espec1cas o inespec1cas.
/na elucin espec1ca es la !ue se consigue cuando la fase mvil
tiene algKn agente !ue compite por unirse al ligando anclado.
%omo ejemplo se puede citar la frecuente utilizacin de eluyentes
asados en Nal!uilglucsidos para la elucin de glicoprotenas
puri1cadas mediante cromatografa en %on Nagarosa. Este tipo de
elucin espec1ca ser5 el preferido siempre !ue resulte factile.'viamente, la columna !uedar5 contaminada por el agente
eluyente empleado, pero 3ste se podr5 eliminar por medios m5s
dr5sticos, cuando ya la funcin iolgica no sea una limitacin.
En las eluciones inespec1cas se suele acudir a alterar la fuerza
inica del eluyente, o el p;, o incluso la temperatura. veces es
necesario cominar estos tres recursos, o siendo m5s dr5stico,
alterar la conformacin del ligando, en caso de !ue 3ste sea
macromolecular. %omo Kltima opcin, en caso de !ue todo lo
anterior fallase, se puede acudir al empleo de agentes caotrpicos
ej." Higura B.@0 se recoge un ejemplo de
puri1cacin de una protena inhiidora de una enzima, la cual se
utiliz como ligando anclado covalememente.
.3 Tipos especiales de cromatografa de a)nidad
A
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continuacin se descrien tres sistemas cromatogr51cos !ue
presentan peculiaridades su1cientes para reciir un tratamiento
conceptual diferenciado.
%romatografa de a1nidad sore metales inmovilizados. Esta
variedad cromatogr51ca no se asa en el concepto de
funcionalidad iolgica !ue suyace en otras cromatografas de
a1nidadI de ah !ue muchos autores pre1eran engloarla dentro de
otros tipos cromatogr51cos, en concreto, dentro del intercamio
inico, en una suvariedad !ue podra llamarse intercamio de
ligandos. *o cierto es !ue la denominacin !ue a!u se emplea es
la m5s aceptada en Gio!umica, y justi1ca la areviatura por la !ue
tami3n se la conoce" $)% del ingl3s $mmoilized )etal nity
%hromatographyI tami3n conocida como )%% de )etal %helate
nity %hromatography.
%onviene mencionar !ue se trata de una cromatografa indicada
para la separacin de protenas. s, e4plota las propiedades
!uelantes de muchas protenas, capaces de formar compuestos de
coordinacin con metales de transicin ej." %u2, -n2, i2,
%o2. igura B.@.
El empa!uetado de una matriz de este tipo, seguida del paso de un
eluyente conteniendo alguno de los cationes anteriores, deja la
columna cargada con el metal de transicin. *a posterior aplicacin
de la muestra conteniendo las protenas de inter3s se traducir5 en
la retencin de 3stas, siempre !ue la a1nidad del metal por el
grupo !uelante de la matriz sea superior !ue por las protenas. &al
retencin se muestra muy dependiente del p;, deiendo
AA
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asegurarse un p; en torno a la neutralidad. p; alcalinos los
grupos amino de las protenas se encontrar5n desprotoNnados,
convirti3ndose en los principales responsales de la unin al metal.
Esta situacin ha de evitarse en $)%, ya !ue se trata de favorecer
a las histidinas como principales responsales de la interaccin.
dicionalmente, como forma de eliminar interacciones
electrost5ticas inespec1cas, los lampones de aplicacin y lavado
suelen tener fuerzas inicas elevadas 0,AN,0 ) de a%l.
*a elucin de las protenas retenidas puede llevarse a cao como
en cromatografa de a1nidad, de forma espec1ca o inespec1ca. En
el primer caso, el lampn eluyente ha de contener un agente !ue
compita con las protefnas, desplazandoNlasI por ejemplo,
imidazol, histamina o glicocola. %on vistas a separar diferentes
protenas se puede emplear un gradiente de concentracin de
estos agentes, !ue introduzca la selectividad adecuada. El p; del
lampn de elucin se suele mantener constante a lo largo de todo
el proceso. En el caso de elucin inespec1ca, se emplean
gradientes de p; decrecientes, !ue ir5n protonando los residuos de
histidina. *a selectividad vendr5 entonces determinada por los
particulares valores de pH de las histidinas.
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aprovecharse para puri1car protenas recominantes en un solo
paso.
%romatografa de a1nidad por unin covalente. diferencia de las
cromatografas de a1nidad, y en general de interaccin, 3sta se
caracteriza por la retencin de los solutos mediante unin
covalente a la fase estacionaria. pesar de ello la reversiilidad de
la retencin !ueda asegurada, ya !ue se trata de uniones por
puentes disulfuro. Gajo condiciones reductoras suaves ej." 2N
mercaptoetanol o D&& AN20 m) se puede conseguir la elucin.
eneralmente, la fase estacionaria est5 constituida por una matriz
cromatogr51ca a la !ue se ha anclado covalentemente un grupo
tiopropilo o glutation >igura B.@2. Estas columnas est5n indicadas
para la puri1cacin de protenas con grupos
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temperatura pueden ser incompatiles con la viailidad de las
c3lulas.
. CROMATOGRAFIA DE PENETRA0ILIDAD
+ste es el m5s simple, conceptual y metodolgicamente, de todos
los tipos de cromatografa. El nomre !ue se le ha dado es una
propuesta m5s entre las muchas e4istentesI algunas de ellas son"
cromatografa de 1ltracin en gel, cromatografa de permeacin en
gel, cromatografa de tamizado molecular y cromatografa de e4cluN
sin por tamaJo. %uando este tipo de cromatografa se lleva a cao
en sistemas de alta presin, parece !ue e4iste un consenso en
denominarla como cromatografa de e4clusin por tamaJo
areviado
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m5s empleados en Gio!umica, especi1cando el nomre comercial
por el !ue normalmente se los conoce.
*as micropartculas en !ue est5n divididos estos soportes son
esferas formadas por enrejados de 1ras del polmero
correspondiente. *os huecos o poros de estos enrejados tendr5n un
tamaJo determinado por la concentracin de 1ras y su grado de
entrecruzamiento. En suma, las micropartculas esf3ricas son como
esponjas. Este smil es especialmente v5lido, ya !ue, adem5s de
ser huecas, al ponerse en contacto con el agua se hinchan
consideralemente. En un lecho cromatogr51co empa!uetado con
un soporte de estas caractersticas, har5 !ue considerar !ue hay
l!uido, no slo en los intersticios entre partculas, sino tami3n en
el $nterior de las mismas. l arir la salida del eluyente, el l!uido
en los intersticios se desplazar5 con la velocidad de la fase mvil. El
l!uido atrapado por las partculas del gel no, sufrir5 este arrastre,
protegido como se encuentra por el entramado de 1ras !ue actKa
como matriz de contencin. En esencia, este l!uido intern se
comporta como la fase estacionaria en cromatografa de
penetrailidad.
9ara formarse una uena idea de la o!uedad de las partculas,
asta considerar !ue con ciertos tipos de geles, m5s del 8Ab del
lecho empa!uetado es l!uido. En otras palaras, !ue el volumen
ocupado por las 1ras de polmero lo Knico slido dentro de la
columna es muy pe!ueJo en comparacin con el volumen total del
lecho cromatogr51co >igura B.A. Este volumen total, #&,
calculale a partir del di5metro de la columna, , y de la altura del
lecho, *, ser5
gi VVVL ++=
0
2
.4
.
Donde" #0, volumen de los intersticios entre partculas o volumen
de e4clusinI #, volumen interno de las partculas de gel, o
AC
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volumen de fase estacionariaI #g, volumen ocupado por las 1ras
del polmero. Dado !ue #g, es consideralemente menor !ue #&, es
f5cil intuir la gran esponjosidad de estos geles. En consecuencia,
son geles landos !ue slo pueden emplearse con ajas presiones
hidrost5ticas, so pena de colmatacin y deterioro de la matriz.
En cromatografa de penetrailidad hay !ue camiar un poco los
conceptos !ue se venan manejando. s, no hay !ue considerar
!ue la fase estacionaria permanece completamente est5tica
durante el proceso cromatogr5fco. El eluyente puede acceder al
interior de las micropartculasI a 1n de cuentas, la composicin de
la fase estacionaria y el eluyente es la misma. 9ero, este acceso del
eluyente al volumen interno, #i, no es la consecuencia del Lujo
dictado por la presin hidrost5tica o el omeo perist5ltico. Es la
difusin de las mol3culas del eluyente hacia el interior de las
partculas del gel la !ue da cuenta de la progresiva renovacin de
la fase estacionaria. 9or tal motivo, si se pretende desplazar todo el
volumen interno o fase estacionaria de un lecho cromatogr51co de
este tipo, y para ello se empieza a pasar eluyente, caen dos
opciones" o !ue el Lujo de eluyente sea muy r5pido en compaN
racin con la velocidad de difusin al interior de las partculas, o
!ue sea lento. En este segundo caso, es f5cil ver !ue la renovacin
completa de la fase estacionaria se har5 producido cuando el
volumen de eluyente pasado por la columna sea igual a
#0 #i #t
donde #, es el smolo empleado para hacer referencia al volumen
total de l!uido contenido en el lecho cromatogr51co. 'viamente,
#t #& #g
En el caso de !ue el Lujo de eluyente sea muy r5pido en
comparacin con la difusin de sus mol3culas, puede resultar !ue
la cantidad de eluyente necesaria para la renovacin completa de
la fase estacionaria sea superior a la calculada a partir de B.2@.
En la pr5ctica esto no es deseale, y oliga al empleo de Lujos relaN
B0
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tivamente ajos, como corresponde a una t3cnica donde la
distriucin de los solutos en #, viene goernada por la difusin.
En efecto, pi3nsese en el caso de un soluto cuyas mol3culas fuesen
de un tamaJo tan grande !ue no pudieran penetrar por el
entramado de 1ras de las partculas del gel. &ales mol3culas no se
distriuiran en asoluto en la fase estacionaria, vi3ndose en todo
momento oligadas a viajar por los espacios intersticiales. Esta
situacin sera radicalmente distinta a la de un soluto de mol3culas
tan pe!ueJas !ue no encontraran restriccin alguna, no slo para
desplazarse por los espacios intersticiales, sino tampoco para
difundir a los espacios internos. En todo momento, la concentracin
de estas mol3culas pe!ueJas seria la misma dentro y fuera de las
partculas, 3sto es, en los volKmenes #0y #i.
9ara diferenciar estas dos situaciones e4tremas se suele utilizar el
coe1ciente de reparto, Kav, de1nido como la proporcin del volumen
interno !ue le resulta accesile a una mol3cula de soluto"
i
acc
avV
V
K =
donde #acces el volumen interior de las partculas de gel al !ue
puede acceder un soluto dado. En el caso del soluto de gran
tamaJo antes mencionado, #acc 0 Kav0, mientras !ue para el
soluto pe!ueJo, #acc #i Kav .
En la pr5ctica podr5n encontrarse situaciones como las
comentadas, o intermedias entre ellas. 9or tanto, con car5cter
general, 0 #acc#i y 0 Kav . Es f5cil ver !ue el volumen de
elucin de un soluto vendr5 dado por
#e #0 #acc
y, de acuerdo con B.2A,
#e#0Kav#i
El soluto e4cluido de la fase estacionaria Kav 0 presentar5 un
volumen de elucin igual a #0, lo !ue e4plica !ue a este volumen
B
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se le conozca como volumen de e4clusin. 9or su parte, un soluto
tan pe!ueJo !ue Kav , eluir5 con #e #0 #i#t.
9ara geles muy porosos #g #&, y, de acuerdo con la e4presin
B.2, se puede asumir !ue # t#&. *o anterior tiene una inmediataaplicacin pr5ctica" en cromatografa de penetrailidad se ha de
cumplir !ue, una vez aplicada la muestra, el paso de un volumen
de eluyente igual al volumen geom3trico del lecho cromatogr51co,
dee traducirse en la elucin de todos los solutos presentes en la
muestra >igura B.B.
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de las mol3culas. /n an5lisis en mayor profundidad oligara a
tratar la penetrailidad como una funcin, no slo del tamaJo, sino
tami3n de la forma molecular. mos par5metros est5n presentes
en lo !ue se conoce como di5metro hidrodin5mico de una
mol3cula.
9ara entender el concepto !ue hay detr5s de este par5metro hay
!ue recordar !ue las mol3culas en disolucin est5n en continuo
movimiento traslacional y rotacional. %omo consecuencia de sus
r5pidos movimientos rotacionales en las tres direcciones del
espacio, las mol3culas se comportan como si ocuparan m5s
volumen !ue el de1nido por sus dimensiones geom3tricas. En
concreto, ese volumen de inLuencia descrito por el volteo continuo
tendra forma esf3rica, cuyo di5metro seria el di5metro
hidrodin5mico.
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per1l sigmoidal en las representaciones semilogartmicas de masa
molecular frente a Kav. >igura B.8
igura B.8. *os v3rtices de esta representacin terica
de1nen el llamado intervalo de fraccionamiento de un gel. Es 3sta
una propiedad intrnseca de cada gel, !ue depende de cu5l sea el
tamaJo promedio de sus poros y la distriucin de tamaJo de
3stos. En el %uadro B. se muestran los intervalos de
fraccionamiento de soportes comerciales para cromatografa de
penetrailidad.
En la pr5ctica, los per1les sigmoidales como el de la >igura B.8
tienen una porcin central Kav 0.2 N 0.8 !ue puede ser
considerada lineal. Ello tiene utilidad en la estimacin de masas
moleculares mediante cromatografa de penetrailidad.
.2 Estimacin de masas moleculares
*a metodologa a seguir es ien sencilla.
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molecular uscada. El conjunto de operaciones a realizar se
resumen en el ejemplo pr5ctico !ue se recoge en la >igura B.C.
%on frecuencia, estos an5lisis se llevan a cao sin calcular los
valores de Kav,sino utilizando en su lugar los cocientes #e#0, o
incluso utilizando slo #e. &al forma de operar oliga a traajar
siempre con la misma columna mismo #0, mismo #t.
*a m54ima utilidad de esta evaluacin cromatogr51ca de masas
moleculares de protenas se otiene cuando se comina con la
correspondiente determinacin mediante 9EN
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cuyo intervalo de fraccionamiento sea muy amplio, y a ser posile
caliradas. El per1l de elucin !ue se otenga ej." 280 de las
fracciones recogidas, en el caso de mezclas de protenas,
informar5 sore la distriucin de tamaJo de los componentes en
la mezcla prolema.
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por lo !ue el per1l de elucin !ue engloe sus distriuciones
zonales podr5 resultar asim3trico >igura B.2. En el supuesto de
!ue casualmente dos solutos no resueltos est3n presentes en la
misma concentracin, el per1l de elucin conjunto podra resultar
sim3trico, pero proalemente presentar5 una anchura superior a
la esperale.
*a cromatografa de penetrailidad proporciona un criterio de
pureza negativo m5s severo !ue otros tipos de cromatografa. Ello
tiene !ue ver con la ausencia de interacciones entre solutos y fase
estacionaria. En el resto de tipos cromatogr51cos, el pico de
elucin de un soluto puro puede presentar cierta asimetra lo !ue
se conoce como caeceo o coleo, !ue puede e4plicarse
atendiendo a la dependencia de la interaccin solutoNfase
estacionaria con la concentracin de soluto. %uando esta
dependencia es lineal, el per1l de elucin suele ser sim3trico y
resulta v5lido lo e4puestoI sin emargo, para dependencias no
lineales lo !ue suele ocurrir con cierta frecuencia, la asimetra de
los picos de elucin est5 asegurada, tanto m5s cuanto mayor sea la
concentracin del soluto en la muestra aplicada. *a conclusin es
inmediata, la asimetra de un pico no puede emplearse como
criterio para negar la pureza de una muestra, salvo !ue se pueda
asegurar una interaccin lineal en las cromatografas de adsorcin,
o cuando se trate de un pico de elucin de cromatografas de
penetrailidad, donde la adsorcin no ha de jugar ningKn papel.
nalizar la forma de los picos re!uiere disponer de un registro
gr51co, por ejemplo medidas de asorancia del eluido. igura B.22 ilustra la utilidad de estos registros cominados.
.* !esalado de muestras. %am+io de disol4ente
B?
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/na Ktil aplicacin de la cromatografa de penetrailidad en el
terreno preparativo es el desalado yo camio de disolvente. !u,
el papel !ue ejerce el gel cromatogr51co no es separar diferentes
iopolmeros entre s, sino separarlos del disolvente o las sales !ue
les acompaJen.
Determinados geles %uadro B., est5n formados por un
entramado de 1ras tan tupido, !ue slo los solutos de pe!ueJo
tamaJo podr5n acceder al # i. %asi cual!uier iopolmero presentar5
un Hav 0 en una columna empa!uetada con estos geles.
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cromatografa de intercamio inico los mismos planteamientos
e4perimentales" retencin de los solutos en la columna y posterior
elucin mediante camios en la composicin de los eluyentes.
*a interaccin hidrofica no es una interaccin en s misma, sino
el resultado de la asociacin entre regiones apelares promovida por
entornos acuosos. Esta agregacin hidrofica est5 favorecida
termodin5micamente por el aumento de entropa !ue supone. En
efecto, la solvatacin de las super1cies hidroficas re!uiere !ue
las mol3culas de agua implicadas adopten un orden estricto. l
interaccionar las regiones hidroficas entre s, su super1cie
e4puesta disminuye, y con ello el nKmero de mol3culas de agua
ordenadasI en suma, disminuye el orden gloal. De a!u se derivan
dos conclusiones de importancia pr5ctica" a *a solvatacin inica
disminuye el nKmero de mol3culas de agua disponiles para
solvatar las super1cies hidroficasI la consecuencia es el
favorecimiento de las interacciones hidroficas por las fuerzas
inicas altas, El car5cter entrpico de las interacciones
hidroficas, justi1ca !ue se vean favorecidas por aumentos en la
temperatura.
En una columna de interaccin hidrofica las muestras !ue se
apli!uen han de contener iones en su1ciente cantidad para
favorecer la retencin de los solutos. hora ien, no todos los iones
favorecen por igual las interacciones hidroficasI
incluso, determinados iones las desfavorecen. continuacin, se
listan diferentes aniones y cationes en orden decreciente de su
capacidad favorecedora de las interacciones hidroficas"
9'@N
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caotrpicos.
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En cromatografa de interaccin hidrofica, gran parte de las
veces, las muestras !ue se aplican proceden de un paso previo de
precipitacin con sulfato amnicoI de este modo se asegura !ue la
muestra se encuentre en condiciones idneas para su retencin.
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CAPITULOI II
?2
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TECNICAS CROMATOGRAFICAS
1. CROMATOGRAFIA PLANA
*a cromatografa plana, la integran un conjunto de tecnicas
ampliamente difundidas por la sencillez del e!uipo e4perimental
re!uerido, !ue pueden considerarse incluidas dentro de la
cromatografa li!uida *% deido a !ue la fase mvil es li!uida.
En ella, la fase estacionaria no se encuentra en el interior de unacolumna sino e4tendido en una super1cie plana y la fase mvil
li!uida se desplaza por capilaridad o por adsorcin.
En funcin del tipo de super1cie !ue actue como soporte, e pueden
distinguir dos tipos fundamentales de cromatografa plana"
*a cromatografa de papel
*a cromatografa en capa 1na
?@
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1.1 CROMATOGRAFA EN PAPEL
*a cromatografa de reparto puede realizarse en columnas de
celulosa. *a cromatografa en papel es una variante de este
m3todo, en la !ue el soporte de celulosa adopta la forma de unahoja de papel. *a celulosa contiene una gran cantidad de agua
enlazada, incluso cuando ha sufrido procesos de deshidratacin. El
reparto tiene lugar entre el agua y el disolvente de revelado.
menudo este disolvente es tami3n agua, por lo !ue cae preN
guntarse si realmente el modo de accin en este caso es por
adsorcin o no.
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muestra al comienzo de la migracin de sus componentes, uno de
los factores !ue determina la separacin de los componentes es la
velocidad de soluilizacin de los mismos dentro de la fase mvil.
Despu3s de !ue el $rente del disolvente haya alcanzado un punto
situado cerca del otro e4tremo del papel v3ase la 1gura 8NB, se
saca la hoja de la c5mara y se seca. *as manchas, !ue pueden ser
visiles o no, se detectan a continuacin y se marcan sus
posiciones. *a distancia relativa recorrida por una mancha con
respecto a la distancia recorrida por el frente del disolvente, se
denomina (f. *os valores !ue adopta %$dependen de la sustancia,
del papel y del disolvente utilizado. *os cromatogramas en papel
pueden ser revelados por Lujos ascendentes o descendentes del
disolvente. En la 1gura 8N? se muestra la disposicin e4perimental
para cada uno de los dos tipos. ;ay muy poca diferencia en la
calidad de los cromatogramas y la eleccin, por lo general, es
cuestin de preferencias personales. *a cromatografa con Lujo
descendente tiene dos ventajas"
es m5s r5pida deido a !ue la .gravedad ayuda al Lujo.
2 en las separaciones cuantitativas de materiales !ue poseen
valores de %$ muy pe!ueJos y !ue, por lo tanto, re!uieren
recorridos largos, el disolvente puede recorrer todo el papel.
9resenta la desventaja de !ue el aparato dee montarse con
cuidado, ya !ue la e4istencia de suciedad o un mal contacto en la
zona en la !ue el papel pasa al otro lado de la varilla soporte,puede ocasionar un Lujo no homog3neo y el susiguiente Lujo
acanalado.
/na variante muy Ktil es la cromatografa idimensional en papel.
En este m3todo, despu3s de haerse realizado la cromatografa en
una direccin, se seca el papel y se vuelve a cromatografar en
5ngulo recto con respecto a la direccin original del Lujo, utilizando
un disolvente diferente 1gura 8N8. De esta forma las sustancias
?A
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!ue no se separan en el primer disolvente, pueden separarse en el
segundo disolvente.
D#,#%%': # '*#,'9%a%': *# (as ma%has
*as manchas en los cromatogramas de papel pueden detectarse
por su color, Luorescencia, por las reacciones !umicas !ue tienen
lugar tras pulverizar el papel con distintos reactivos, o por la
radiactividad de las manchas 1gura 8NC. *a deteccin de las
manchas por medio de la autorradiografa utilizando pelcula de
rayos F, se ha descrito en el captulo B. *a identi1cacin se asa,
por lo general, en la comparacin con est5ndar de %,conocido o
por elucin. *a elucin se realiza recortando la mancha y
sumergiendo el papel en el disolvente apropiadoI esto puede
hacerse a menudo de una forma cuantitativa.
H!#((as *a%,'(a)#s !a ap('%a%': #sp#%'a( *# (a
%)oma,o")a45a # pap#( a( #s,!*'o *# (as p)o,#5as
/n prolema importante de la iologa molecular consiste en
identi1car una protena una vez aislada o en identi1car el lugar
donde ha camiado un amino5cido en una protena mutante. *a
t3cnica de la _huella dactilar`, desarrollada por #emon $ngram,
permite realizar identi1caciones de una forma relativamente
sencilla.
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*a huella dactilar de una protena mutante con un Knico camio de
amino5cidos se diferencia de la huella de la proteina normal 1gura
8N0.
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identi1cacin del amino5cido insertado por cada i uno de los t(
supresores conocidos.
'dentifcacin de los cambios de bases producidos por mut(genos
determinados Deido a !ue se conoce la clave gen3tica, esposile identi1car los camios de ases !ue producen una
mutacin en particular.
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sitKa en el intervalo de 0NA m, con lo !ue se pueden conseguir
super1cies especi1cas de hasta 00 m2g. dem5s, mientras en
cromatografa en papel el soporte es normalmente un papel de
1ltro, o lo !ue es lo mismo, las 1ras de celulosa !ue lo forman, en&*% son muchos los slidos !ue pueden actuar como soporte, una
vez pulverizados y e4tendidos" celulosa, poliamida, alKmina o gel
de slice. Este Kltimo, tami3n llamado slica+gel o slica, es, con
diferencia, el !ue m5s se utiliza.
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*a estructura !umica en la super1cie de estas partculas se
caracteriza por presentar grupos silanoles
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punta de una esp5tula en la posicin donde se encuentre un
soluto !ue se desee e4traer. El polvo, o fase estacionaria, raspado
se suspende en algKn disolvente adecuado, con lo !ue el soluto
emeido en 3l se disolver5. )ediante una simple 1ltracin o
centrifugacin se dispondr5 de una disolucin de tal soluto,
separado del resto de contaminantes !ue le acompaJaan en la
muestra inicial. 9ara esta utilizacin de la &*% con 1nes
preparativos suele ser deseale cromatogra1ar un volumen de
muestra mayor O 200 q$ al !ue se cromatografa en aplicaciones
analticas N0 jid.
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%on car5cter general, el procedimiento a seguir ser5 el de rociar la
placa con un l!uido !ue provo!ue la reaccin de deteccin. inalmente, conviene recordar !ue si las muestras
sometidas a &*% se encuentran marcadas radiactivamente, ser5n
de aplicacin los m3todos autorradiogr51cos ya descritos %aptulo
.
CUADRO < M7,o*os *# D#,#%%': # C)oma,o")a45a *# Capa
F'a
M7,o*o Ap('%a%': Co(o)
$nespec1co
#apores de yodo
c.
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ina
g'@';N
cidoiodoplatnico
#erde deromocresol
inhidrina
(odamina
caronlicos
%ompuestoscaronlicos
Gases
cidos
minas primariasamino5cidos
minas secundarias
*pidos
aranja
)arrn
9Krpura negro
zul viol5ceo
)arrn
>luorescenciaamarillo ros5cea
e4c @BB nm
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se consigue depositando la disolucin prolema sore la parte
superior del lecho cromatogr51co >igura B.@. /na vez aplicada la
muestra, se are la columna por el e4tremo opuesto y se deja !ue
la disolucin prolema vaya Luyendo hacia el interior del lecho.
ntes de !ue la parte superior de 3ste se se!ue, se aporta nueva
fase mvil, y as se sigue de modo continuado hasta el 1n del
proceso. El ir pasando fase mvil hasta la salida de los solutos se
llama elucin, y el t3rmino eluidohace referencia a la fase mvil
!ue se. recoge desde la aplicacin de la muestra hasta la salida de
todos los solutos. %on car5cter general, a la fase mvil se la suele
llamar tami3n elu&ente
En su viaje a trav3s de la fase estacionaria, los solutos no slo se
ir5n separando cromatogr51camente sino !ue tami3n difundir5n,
por lo !ue la zona en la !ue viaja cada uno se ir5 ensanchando y
sus lmites difuminando. De este modo, la distriucin de cada
soluto en el eluido de la columna ser5 de tipo gaussiano. Elperfl
de elucin, perfl cromatogr(fco o cromatogramaes la sucesin de
curvas gaussiaNnas !ue informa sore la salida de los diferentessolutos >igura B..
9ara cada soluto, la posicin en el eje de ascisas del
correspondiente pico gaussiano, informa sore el tiempo
transcurrido desde !ue se aplic la muestra hasta !ue se produjo
la elucin de la columna. este tiempo se le llama tiempo de
retencin, t%
ormalmente, el caudal a-u.o de fase mvil /01 mlmin se
mantiene constante durante la elucin cromatogr51ca, luego,
RR tFV .=
8
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siendo 2% el volumen de retencin, tami3n llamado volumen de
elucin, 2e,!ue es el volumen de fase mvil !ue ha de pasar a
trav3s de la columna para !ue eluya un soluto dado.
/n soluto !ue no sufra retraso alguno por la fase estacionariasoluto a en la >igura B., viajar5 en todo momento con la
velocidad de la fase mvil, u9ara una columna de longitud L el
tiempo !ue tarda en eluir este soluto vendr5 dado por"
u
LtM =
donde el sundice 3hace referencia a la fase )vil. El volumen de
elucin de este soluto no retrasado ser5"
MM tFV ..
%on frecuencia t3 yo 23 se designan tami3n como o y 24,
respectivamente, d5ndoles los nomres de tiempo o volumen de
exclusin,pues corresponden a un soluto !ue ni interacciona ni se
reparte con la fase estacionaria, esto es, !ue !ueda e4cluido
completamente de ella. l volumen 23tami3n se le suele llamar
volumen vacio o hueco en ingl3s void volume#, ya !ue
corresponde al volumen del lecho cromatogr51co no ocupado por
las propias partculas de la fase estacionaria fraccin de volumen
de lecho cromatogr51co ocupado por la fase mvil.
%uando un soluto se encuentra en la fase mvil se desplaza con la
velocidad de 3sta, u,pero cuando interacciona o se reparte con la
fase estacionaria su velocidad es nula. 9or tanto, se puede a1rmar
!ue el tiempo de un soluto es la suma del tiempo durante el cual
sus mol3culas viajan en la fase mvil /t3#,m5s el tiempo neto !ue
permanecen inmviles en la fase estacionaria t(I tiempo de
retencin a.ustado#:
8A
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RMR ttt '+=
De la anterior e4presin se deduce !ue el tu de un soluto !ue
e4perimenta un retraso cromatogr51co soluto ben la >igura B.,
se calcula como la diferencia entre su tiempo de retencin t (, y el
tiempo de elucin de un soluto no retrasado t). Este tiempo
ajustado da una idea directa de la mayor o menor intensidad de la
interaccin o reparto del soluto con la fase estacionaria, Onene
sentido utilizar este t(, no en t3rminos asolutos, sino referido al
tiempo de e4clusin, t).
kt
tt
t
t
M
MR
M
R=
=
'
Este cociente, !ue se designa con la letra 5,recie el nomre de
$actor de capacidad,y es caracterstico de cada soluto para unasfases mvil y estacionaria dadas, independientemente de cu5les
sean los valores del Lujo, 0, y de la longitud de la columna, L
(eordenando la ecuacin B.B se llega a
( )kttMR += 1
o en t3rminos de volumen de eluido,
( )kVV mR += 1
8B
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En la puesta a punto de un m3todo cromatogr51co, el ojetivo es
alcanzar un per1l de elucin en el !ue la separacin entre los picos
cromatogr5fcos de dos solutos, y 2, !ue eluyan uno detr5s de
otro, sea ptima. De acuerdo con las ecuaciones B.? y B.8, estas
diferencias vendr5n dadas por
( )
( )121,2,
121,2,
kkVVV
kkttt
MRR
MRR
=
=
donde t(,, t(,2, #(,y #(,2, son los tiemposvolKmenes de retencin
o elucin de los solutos y 2, y 56&M2son sus respectivos factores
de capacidad. %on vistas a la separacin efectiva de amos
solutos, es preciso asegurar !ue las diferencias entre sus valores
de 5 sean adecuadasI pero, adem5s, el ensanchamiento de sus
picos cromatogr51cos no ha de ser tan acusado !ue arruine los
efectos de una uena separacin entre los m54imos. En la >igura
B.A se presentan dos situaciones ien distintas en cuanto a
separacin y anchura de dos picos cromatogr5fcos. El caso
representa un resultado cromatogr51co peor !ue el caso GI
mientras en este Kltimo los dos picos est5n perfectamente
separados, en el caso hay solapamiento entre ellos, lo !ue se
pone de mani1esto en !ue no se alcanza la lnea asal entre la
salida del primer soluto y la del segundo. En de1nitiva, adem5s de
la separacin entre picos, hay !ue tener en cuenta su anchura.
9ara un par de solutos, y 2, un sistema cromatogr51coproporcionar5 un $actor de separacin o selectividad, a,!ue vendr5
dado por
( )12
1
2kksiendo
k
k>=
)odi1car la separacin entre esos dos solutos implicar5, por tanto,
la modi1cacin en la selectividad de la columnaI en suma, alterarla termodin5mica valores de 5#del sistema.
8?
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diferencia de la separacin entre picos, la anchura de 3stos no
viene determinada por factores termodin5micos, sino por factores
cin3ticos apartado B.A. igura.
B.A, en comparacin con el I y ello, a pesar de su menor
selectividad. En t3rminos cualitativos, una columna cromatogr51ca
ser5 m5s e1ciente cuantos m5s estrechos sean los picos de elucin
!ue genere.
En cromatografa se utiliza el concepto deplato terico,para hacer
referencia a cada una de las l5minas en !ue OimaginariamenteO se
puede considerar dividida una columna cromatogr51ca. igura
B.B.
88
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En la pr5ctica, para el c5lculo de nse mide la anchura total del pico
gaussiano a la mitad de su altura, lo !ue se conoce como 8hdel
ingl3s,OXidth at halfNheightO. 9ara un pico gaussiano perfecto,
Xh2.@A +
con lo !ue la e4presin B. se transforma en
2
54.5
=
h
R
w
tn
o en t3rminos de volumen,
2
54.5
=
h
R
w
Vn
donde ahora 8,,tami3n se medira en unidades de volumen.
El valor de nes independiente del pico cromatogr51co escogido
para su evaluacin. %uanto mayor sea el t(o el 2%, deun soluto,
mayor ser5 la anchura de su pico de elucinI pero el cociente de
amos se mantendr5 constante. *gicamente, n depende de la
longitud de la columna. 9or ello, es frecuente halar de platos
tericos por unidad de longitud de lecho cromatogr51co.
lternativamente, se puede especi1car la altura del plato terico,
h,!ue ser5 el resultado de dividir la longitud de la columna, *, por
su nKmero de platos tericos, n"
n
Lh=
*a altura del plato terico se e4presa en unidades de longitud
generlamente milmetros y su valor est5 inversamente
relacionado con la e1ciencia de la colulmna, siendo adem5s
8C
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independiente de la longitud del lecho cromatogr51co. Desde un
punto de vista pr5ctico, la determinacin de n o de h permite tener
una medida de la calidad del empa!uetado de una columna.
;asta a!u se han introducido dos conceptos claves encromatografaI selectividad y e1ciencia. *os respectivos
par5metros y n se han de optimizar con vistas a conseguir !ue
los diferentes solutos de la mezcla inicial eluyan como picos
independientes.
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largos. *a mejor forma de mejorar este factor cin3tico es
empa!uetar lo mejor posile el lecho cromatogr51co, y utilizar
fases estacionarias con un tamaJo de partcula pe!ueJo y
homog3neo apartado B.A.
9or su parte, los factores termodin5micos a considerar son dos,
capacidad, MM, y selectividad,NN. En cuanto al primero, el
margen de maniorailidad es relativamente estrecho. En efecto, 5
puede variar desde ' hasta , sin emargo el cociente MM
tiene un valor lmite de >igura B.8, y 3ste se alcanza
relativamente pronto. s, utilizar sistemas cromatogr51cos !ue
proporcionen valores de fe superiores a 0 no aporta grandes
ventajas, y s considerales inconvenientes en cuanto al
alargamiento de los tiempos de elucin. inalmente, el t3rmino a N6#6 ade la e4presin B.2 es el !ue
resulta m5s Ktil para mejorar la resolucin. El intervalo en !ue
normalmente suele encontrarse a es entre y 2, donde
correspondera a un par de solutos cuya separacin en el
correspondiente sistema cromatogr51co sera imposile, mientras
!ue en el otro e4tremo 2, la separacin cromatogr51ca sera
ciertamente f5cil. %on a variando en el intervalo mencionado, es
f5cil ver !ue el t3rmino /+6#lpuede llegar a variar hasta en tres
rdenes de magnitud >igura B.8.
)ejorar la relacin N se limita, en esencia, a encontrar el par
fase estacionariafase mvil m5s adecuado. &ami3n 3se es el
camino para mejorar en lo posile el otro factor termodin5mico !ue
C2
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inLuye en la resolucin, MM. En la pr5ctica, la seleccin de la
fase estacionaria est5 muchas veces limitada por el tipo de
muestra prolema. En tales casos slo !ueda como variale la
modi1cacin de la fase mvil. fortunadamente en %* se puede
llevar a cao la elucin de los solutos con fases mviles cuya
composicin !umica vaya variando durante la propia elucin, lo
!ue se conoce como elucin en gradienteDe esta forma se puede
ejercer un uen control sore la resolucin de dos solutos, al poder
modi1car los factores termodin5micos sore la marcha.
. CROMATOGRAFA DE GASESEn los tipos de cromatografa de reparto descritos hasta ahora, la
muestra es arrastrada por una fase mvil l!uida sore una fase
estacionaria l!uida, en la !ue el l!uido est5 inmovilizado por
adsorcin o asorcin a un soporte slido. En la cromatografa de
gases *%, _gasNli!uid chromatography` la fase mvil es un gasI
la fase estacionaria es un l!uido adsorido a la super1cie interna
de un tuo o columna /$uncionamiento tubular o capilar#o a unsoporte slido /$uncionamiento en columna empaquetada# como la
tierra de diatomeas, &eLon en polvo o 1nas cuentas de vidrio. En
general, el l!uido se aplica como un slido disuelto en un
disolvente vol5til, como el 3ter. 9or ejemplo, las cuentas de vidrio
se sumergen en una disolucin de polietilenglicol en 3ter. %uando
el 3ter se evapora, cada cuenta !ueda recuierta de
polietilenglicol. la temperatura utilizada para la cromatografa degases, el polietilenglicol funde y permanece en las cuentas como
una pelcula l!uida. *a muestra, !ue puede ser cual!uier
compuesto capaz de ser volatilizado sin sufrir descomposicin, se
introduce como l!uido con un gas inerte ^helio, argn o nitrgeno
^ y a continuacin se calienta. Esta mezcla gaseosa pasa a trav3s
del tuo !ue est5 dispuesto segKn se muestra en la 1gura 8N@.
C@
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En el funcionamiento en columna empa!uetada el tuo tiene de
a 20 metros de longitud y 0,A cm de di5metro. En el m3todo capilar
la longitud es de @0 a 00 metros. 9ara conseguir resoluciones muy
elevadas, se utilizan sistemas capilares de dos Milmetros de tuo.
*os compuestos vaporizados se redistriuyen continuamente entre
la fase mvil gaseosa y la fase estacionaria l!uida, de acuerdo con
sus coe1cientes de reparto y son, en consecuencia,
cromatogra1ados. l 1nal de la columna se usa un detector
apropiado.
D#,#%%': *# s!s,a%'as # #( #!#,#
En el traajo analtico se utilizan, por lo general, tres tipos de
detectores"
*a c3lula de conductividad t3rmica con una sensiilidad
apro4imada de 0 pg, el detector de ionizacin de argn
sensiilidad de 0NA g y el detector de ionizacin de llama
sensiilidad de apro4imadamente 0NAg. *a accin de la c3lulade conductividad t3rmica est5 asada en el hecho de !ue la
resistencia el3ctrica de un alamre es dependiente de la temperaN
tura.
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columna similar a un contador de eigerN)ller y es ionizado
mediante omardeo con partculas
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%ada uno de los detectores indica la cantidad de material !ue sale
de la columna en funcin del tiempo. o ostante, no hay una
indicacin directa de la identidadN del material !ue produce un pico
concreto ni de la cantidad de 3ste !ue e4iste en el pico. 9or
ejemplo, si las sustancias presentes en una mezcla se conocen por
adelantado y el propsito de la cromatografa es determinar la
cantidad de cada una de ellas, los picos suelen identi1carse
preparando una muestra duplicada !ue contenga una pe!ueJa
cantidad de una sustancia conocida !ue se ha aJadido, y volviendo
a cromatogra1ar.
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utilizar un detector no destructivo p. e., la c3lula de conductividad
t3rmica.
*a determinacin cuantitativa de la cantidad de material en un pico
no es un procedimiento directo. 9ara cual!uier compuesto, lacantidad de material es directamente proporcional al 5rea del pico.
o ostante, la constante de proporcionalidad vara con las
sustancias. 9or tanto, lo primero !ue se necesita es identi1car el
material !ue se encuentra en un pico determinado. *a
cuanti1cacin re!uiere la preparacin de una curva est5ndarI es
decir, deen cromatogra1arse diferentes cantidades de la
sustancia y hacer una gr51ca !ue relacione el 5rea del pico con lacantidad de material.
J#,aKas *# (a %)oma,o")a45a *# "as#s
%on la cromatografa de gases se consiguen e4celentes
separaciones. *a velocidad y la sensiilidad son e4traordinarias,
siendo detectales cantidades del orden de 0N2 gramos para
muchas sustancias. Deido a !ue la rapidez del revelado de los
cromatogramas depende de la velocidad de difusin entre las fases
mvil y estacionaria, y deido a !ue la velocidad de difusin de los
gases es mucho mayor !ue la de los l!uidos, el cromatograma de
gases puede ser realizado unas mil veces m5s r5pido !ue el
e!uivalente en la cromatografa l!uida en columna. 9or
consiguiente, las separaciones pueden otenerse, con frecuencia,
en menos de un minuto. dem5s, utilizando un detector no
destructivo y condensando la muestra en la recogida 1nal, es
posile utilizar la cromatografa de gases deN forma preparativa.
*os instrumentos de preparacin en masa pueden puri1car
cantidades importantes del material !ue se est5 tratando, hasta
llegar a gramos.
*a cromatografa de gases puede utilizarse con cual!uier sustancia!ue pueda volatilizarse. 9or lo tanto, hay miles de compuestos
C?
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org5nicos !ue pueden separarse con este tipo de cromatografa.
*as sustancias no vol5tiles pueden e4aminarse, si es posile,
convirti3ndolas en derivados vol5tiles por o4idacin, acilacin,
al!uilacin u otros procesos.
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longitudes entre A0 y A00 cm. *os tiempos de separacin de lasdistintas muestras, eran largos y frecuentemente duraan variashoras.
*os primeros intentos para acelerar el procedimiento cl5sico
mediante la aplicacin de vacio o por omeo, no resultaronefectivo.
*os avances tecnolgicos de los Kltimos aJos han permitido poneren funcionamiento una serie de m3todos cromatogr51cos para los!ue se emplea la denominacin de cromatografa de l!uidos dealta resolucin ;9*%!ue son los m5s utilizados en la actualidad, yse caracterizan por"
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permite la aplicacin de la muestra. la salida de la columna secoloca un detector generalmente de asorcin ultravioleta o deLuorescencia y si se desea recuperar las mol3culas !ue eluyen dela columna, se re!uiere un colector.
En los sistemas modernos el an5lisis de la informacin otenida serealizan mediante una computadora acoplada al e!uipoI lo !uepermite estandarizar la cromatografa, identi1car la naturaleza lospicos eludos y cuanti1car su contenido. *os picos se relacionansegKn su Otiempo de retencinO con est5ndares, !ue permitenidenti1car los amino5cidos presentes en la mezcla. *a cantidadrelativa de cada uno de ellos se determina calculando el 5rea lacurva del pico correspondiente.
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CAPITULO
IJ
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FUNDAMENTO TERICO
*a cromatografa es la t3cnica !ue separa una mezcla de solutos
asada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos!ue se estalece al ser arrastrados por una fase mvil li!uida o
gaseosa a trav3s de un lecho cromatogr51co !ue contiene la fase
estacionaria, la cual puede ser slida o l!uida.
;ay !ue indicar !ue el nomre de la t3cnica es incorrecto, ya !ue no
consiste en escriir con colores. Este nomre proviene de la primera
e4periencia cromatogr51ca realizada, la cual se utilizo para separarpigmentos coloreados de plantas. *a cromatografa fue descuierta
por el ot5nico ruso de origen italiano )ijail &sXett en C0@. &sXett
separo los pigmentos de las plantas cloro1la vertiendo e4tracto de
hojas verde en 3ter de petrleo sore una columna de caronato de
calcio en polvo en el interior de una proeta. o ostante, no e4isten
datos sore la utilizacin de esta t3cnica hasta C@0 cuando Mhun y
*ederer separaron tami3n pigmentos de las plantas usando comoadsorentes alKmina y caronato de calcio. >ue a partir de ah cuando
se inicio el verdadero desarrollo de la cromatogra1a.
9ara e4plicar el fenmeno cromatogr51co es necesario estalecer dos
tipos de fundamento" uno remoto y otro pr4imo
F!*am#,o )#mo,oEste fundamento se encuentra en alguna o
algunas propiedades fsicas o fsico !umicas de los analitos"
soluilidad, adsorcin tendencia a ser retenidos en slidos 1namente
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divididos, volatilidad, tamaJo, carga, reactividad !umica o
io!umica, etc. *a mezcla de sustancias a separar se coloca en una
situacin e4perimental din5mica donde e4hien dos de estas
propiedades, o ien una de ellas pero por duplicado tal como la
soluilidad en dos l!uidos diferentes como ocurre en cromatografa
li!uido N li!uido. Deen cumplirse las condiciones siguientes"
N *os componentes de los sistemas empleados deen estar en intimo
contacto entre si.
N El e!uilirio estalecido entre esos componentes dee ser lo mas
completo posile.
F!*am#,o p):'mo
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cromatogr51ca concreta depender5 de la naturaleza y cantidad de la
muestra, del ojetivo de la separacin y de las limitaciones del
tiempo y e!uipo ase!uile.
9uede hacerse una primera distincin entre las t3cnicas
cromatogr51cas atendiendo a la integracin continua o no del
sistema de deteccin. s, la cromatogra1a no conlleva a un sistema
de deteccin, mientras !ue cual!uier cromatgrafo de l!uidos o
gases lleva incorporado dicho sistema siendo, por tanto, aut3nticos
instrumentos.
IMPORTANCIA DE LA COMATOGRAFA
9uri1cacin de la penicilina.
9uri1cacin de las protenas terapeKticas.
*a t3cnica cromatogr51ca con un enfo!ue al 5rea clnica nos sirve
para identi1car acterias mediante la comparacin otenida del
cromatograma otenido con un patrn predispuesto, para
identi1car distintos tipos de" amino5cidos, protenas, nucletidos,hemogloina, esteroides etc.
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F(a/oo'*#s y 4#o(#s" en el vino la medicin de estas
sustancias permite la determinacin del color, la edad y las
variedades de uva usadas. El ;9*% en cominacin con
colormetros, permiten la determinacin de hasta 22compuestos diferentes simult5neamente.
L5p'*os la determinacin de lpidos animales y vegetales
como" colesterol, triglic3ridos, glic3ridos y esteroles, se asa en
el uso del ;9*% y un detector de Dispersin de *uz Evaporativa
E*
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T)'"('%7)'*os ;9*% con E*
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plicaciones de la cromatografa inica " el an5lisis de drogas y
sus metaolitos, sueros, conservantes de alimentos, mezclas
para vitaminas, azKcares, y preparaciones farmac3uticas.
plicaciones referidas a productos alimenticios encromatografa por e4clusin de tamaJos" separacin de 5cidos
grasos, determinacin de glucosa fructosa y sacarosa en zumos
enlatados.
plicaciones de *a cromatografa de ases.
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Determinacin delperfl del (cido graso, acide & valor del
perxido en la calidad del aceite de oliva contra el almacena.e.
Determinacin cuali y cuantitativa de componentes vol(tiles en
hierbas & especias
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ANEQOS
CROMATOGRAFIA DE REPARTICION
F'"!)a ;=
F'"!)a ;
CROMATOGRAFIA EN GEL
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F'"!)a ;1
F'"!)a ;
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F'"!)a ;
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CROMATOGRAFIA DE PENETRA0ILIDAD
A
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GLOSARIO
B
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%romatografa5*a cromatografa es un