LA BIOTECNOLOGÍA EN LA LA BIOTECNOLOGÍA EN LA PRODUCCIÓN DE PRODUCCIÓN DE

ALIMENTOS FUNCIONALESALIMENTOS FUNCIONALES

Dr. Dr. Humberto Hernández SánchezHumberto Hernández SánchezDeptoDepto. Graduados e Investigación en Alimentos. Graduados e Investigación en Alimentos

Escuela Nacional de Ciencias BiológicasEscuela Nacional de Ciencias BiológicasInstituto Politécnico Nacional, México, DFInstituto Politécnico Nacional, México, DF

ALIMENTOS FUNCIONALESALIMENTOS FUNCIONALES

• No es una categoría que esté en las Normas oficiales

• Es un término descriptivo interno de la industria

• Se podrían definir como alimentos que en general tienen algún beneficio para la salud aparte del nutricional

PROBIÓTICOSPROBIÓTICOS• Los microorganismos

probióticos se pueden definir como cultivos vivos que tienen beneficios documentados sobre la salud

• Los géneros más importantes son Lactobacillus y Bifidobacterium

BacteriocinasBacteriocinas

• Son compuestos de tipo proteico con efecto bactericida contra especies bacterianas muy cercanas

• Pueden existir también complejos de proteína con carbohidrato o lípidos

• Las más estudiadas son las de bacterias lácticas y la nisina (lantibiótico) es la única con el estatus de GRAS

BacteriocinasBacteriocinas

• El objetivo de esta investigación fue estudiar la posible producción de bifidocinas por B. adolescentis, B. breve, B. animalis, B. bifidum, B. longum y B. infantis

Participantes:Rosa Ma. Navarro, Lydia Mota, Rina

González y Humberto Hernández

BacteriocinasBacteriocinas• Se probaron 4 medios líquidos

(M17, Tioglicolato, MRS, TPY) y 5 sólidos (M17, anaeróbico de Brewer, Luria, antibiótico 2, MRS) para desarrollo de los m.o. y producción de bacteriocinas

• La incubación se hizo a 37ºC de 24 a 48 h en anaerobiosis

• Los m.o. de prueba fueron: Listeriamonocytogenes, Staphylococcusaureus, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus y Salmonella typhi

BacteriocinasBacteriocinas• B. bifidum fue la cepa

que produjo mayor actividad inhibitoria

• El caldo TPY fue mejor para crecimiento pero el MRS fue el mejor para la producción de bifidocinas

• Bacillus cereus fue el m.o. más sensible y L. monocytogenes el más resistente

Purificación de las Purificación de las BifidocinasBifidocinas

• Se partió de 6 L de caldo MRS cultivados por 24 h con B. bifiduma 37ºC

• Se centrifugó a 22,100Xg por 30 min y se filtró (0.22 µm)

• Se precipitó con sulfato de amonio al 60% de saturación

• Se concentró por diálisis

Purificación de las Purificación de las BifidocinasBifidocinas

• Se ajustó el pH a 7 y se calentó a 85ºC por 15 min para después incubar a 4ºC toda la noche

• Se centrifugó a 22100Xg por 30 min y se volvió a filtrar

• Se dializó contra agua destilada• Se precipitó con sulfato de amonio al 60%

de saturación

Purificación de las Purificación de las BifidocinasBifidocinas

• Se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida obteniéndose 2 bandas con PM de 62,000 y 93,000

• Yildirim et al. habían reportado la presen-cia de la bifidocina B en B. bifidum con un PM de 4,433

• Se electroeluyeron las bandas• Se probó actividad inhibitoria

Actividad de las Actividad de las BifidocinasBifidocinas

• Ambas bandas tuvieron actividad (juntas y por separado) sobre Bacillus cereus

• Las bifidocinas conservaron su actividad después de 10 min a 90ºC

• Su efecto inhibitorio se mantuvo en el intervalo de pH de 4.5 a 7.2

• Las enzimas α-amilasa, α-quimiotripsina y tripsina afectaron su actividad inhibitoria

Prebióticos. DefiniciónPrebióticos. Definición

• Son ingredientes no digeribles para alimentos que afectan benéficamente al consumidor por medio de una estimulación selectiva del crecimiento y/o actividad de algunos microor-ganismos probióticos (Gibson & Roberfroid, 1995). Generalmente son oligosacáridos no digeribles.

Simbióticos. DefiniciónSimbióticos. Definición

• Es una mezcla de probióticos y prebióticos que afectan benéficamente la salud del consumidor mejorando la supervivencia e implantación de los primeros en el tracto gastrointestinal por medio de una estimulación selectiva de su actividad y/o crecimiento (Gibson & Roberfroid, 1995).

Prebióticos en el mercadoPrebióticos en el mercado

• Fructooligosacáridos - Suntory (Japón)• Isomaltooligosacáridos - Showa

Sangyo (Japón)• Oligomate (galactooligosacáridos) -

Yakult (Japón)• Palatinosa - Südzucker (Alemania)• Polidextrosa

Prebióticos en el mercado (2)Prebióticos en el mercado (2)

• Pirodextrina - Matsutani (Japón)• Raftiline - Orafti (Bélgica)• Oligosacáridos de frijol de soya -

Calpis (Japón)• Xilooligosacáridos - Suntory (Japón)• Lactulosa• Lactosacarosa - Hayashibara (Japón)• Panosa - Hayashibara (Japón)

El El lactosuerolactosuero como medio de como medio de cultivo para cultivo para BifidobacteriasBifidobacterias

• Esta segunda investigación se dedicó a la modificación del suero de quesería para su utilización como medio de cultivo económico para las bifidobacterias

Participantes:Ma. Luisa Mier, Ma. Teresa Cruz

y Humberto Hernández

El El lactosuerolactosuero como medio de como medio de cultivo para cultivo para BifidobacteriasBifidobacterias

• El suero es un subproducto de la industria quesera que sólo se aprovecha en un 30% en México

• El resto se desperdicia siendo un contaminante importante

• Su modificación puede dar otra alternativa importante de uso

El El lactosuerolactosuero como medio de como medio de cultivo para cultivo para BifidobacteriasBifidobacterias

• La primera modificación fue la hidrólisis enzimática de sus proteínas usando extractos crudos de:

1) Mexicaína del látex del fruto del cuaguayote (Pileusmexicanus)

2) Hemisfericina del jugo del fruto del timbirichi (Bromeliahemisphaerica)

El El lactosuerolactosuero como medio de como medio de cultivo para cultivo para BifidobacteriasBifidobacterias

• Selección de la enzima más adecuada:1) Se probaron las 2 enzimas a 100 µg/ml2) El suero se usó a 0.4 y 1%3) Se probaron tiempos de hidrólisis de 5,

10, 60 y 240 min4) La actividad proteolítica se siguió por el

método de la ninhidrina

El El lactosuerolactosuero como medio de como medio de cultivo para cultivo para BifidobacteriasBifidobacterias

• La hemisfericina tuvo una actividad 5 veces superior a la mexicaína

• Con 0.4% de suero y a 35ºC se tuvieron 11,048 UL

• Con 1% de suero y a 45ºC se tuvieron 82,530 UL

El El lactosuerolactosuero como medio de como medio de cultivo para cultivo para BifidobacteriasBifidobacterias

• La lactulosa (galactopiranosilfructosa) resulta de la acción térmica alcalina sobre la lactosa

• Se considera como un prebiótico muy efectivo

• En la leche puede ocurrir libre y unida a la lisina

El El lactosuerolactosuero como medio de como medio de cultivo para cultivo para BifidobacteriasBifidobacterias

• Para inducir la formación de lactulosa en el suero se realizó lo siguiente:

a) Alcalinización a pH 11 con NaOH 1Nb) Se probaron temperaturas de 60, 70 y 80ºCc) Se probaron tiempos de 15 y 20 mind) La lactulosa se determinó por el método de la

antrona después de precipitar la lactosa con alcohol absoluto

e) Las mejores condiciones fueron 80ºC por 15 min (15.8 g/l de lactulosa)

El El lactosuerolactosuero como medio de como medio de cultivo para cultivo para BifidobacteriasBifidobacterias

• Fermentación del lactosuero a pH 6 y 37ºCCuenta viable (UFC/ml) de B. bifidum

Tiempo (h) Suero

normal

Suero

hidrolizado

Suero

hidrolizado y

calentado

0 1.4 X 104 1.5 X 104 1.4 X 104

9 3 X 108 1 X 109 1.5 X 109

18 1 X 1014 1.7 X 1014 6.4 X 1014

Supervivencia de Supervivencia de B. B. bifidumbifidum durante la durante la elaboración de un queso funcionalelaboración de un queso funcional

• El objetivo de este estudio fue comparar la supervivencia de B. bifidum, agregados en forma libre e inmovilizada (2 soportes), durante la elaboración de un queso fresco de tipo untable

Participantes: Marisol Flores, Ma. Eugenia Jaramillo, Marina Labastida, Erika Alvarez y Humberto Hernández

Inmovilización de Inmovilización de ProbióticosProbióticos

• La κ-carragenina es un polisacárido natural extraido de las algas cafés y rojas

• Está constituida por cadenas lineales de D-galactosa y 3,6-an-hidro-D-galactosa

• Se usa comúnmente en alimentos

Inmovilización de Inmovilización de ProbióticosProbióticos

• El ácido algínico es un heteropolisacárido formado por ácido L-gulurónico y ácido D-manurónico

• Se extrae de las algas rojas y otros tipos

• En presencia de iones Cagelifica formando esferas cuya consistencia depende del PM

Inmovilización de Inmovilización de ProbióticosProbióticos

• Las esferas de κ-carragenina(1% gelificadas con KCl 3M) fueron irregulares y de poca firmeza

• Las esferas de alginato (2% gelificadas con CaCl2 0.1 M) tuvieron buena firmeza y un diámetro casi constante de 2.1 mm

Elaboración del queso Elaboración del queso untableuntable• Se reconstituyó leche en polvo

descremada al 10% de ST y se pasteurizó a 62ºC por 30 min

• Se agregó el cultivo de Bifidobacterias (libres o inmovilizadas)

• Se adicionó un 5% de cultivo iniciador para quesos (Lactococcus lactis) y se incubó a 32ºC por 15 h

Elaboración del queso Elaboración del queso untableuntable

• Se cortó la cuajada en cubos de 8 mm cuando se alcanzó un pH de 4.6

• Se cocinó a 54ºC hasta alcanzar la textura ade-cuada (50-60 min)

• Se drenó parte del suero y se lavó la cuajada con agua a 15 y luego a 2ºC

Elaboración del queso Elaboración del queso untableuntable

• Se eliminó completamente el suero

• Se adicionó crema de 17% de grasa (333 g por cada kg de cuajada) y se mezcló bien

• Se enfrió el producto a 5ºC y se dejó reposar de 4 a 6 h

ResultadosResultados

• Los m.o. inmovilizados soportan la congelación hasta por un mes sin disminuir su viabilidad

• Sensorialmente se toleró hasta un 2% de esferas en el queso untable

• Los quesos obtenidos tuvieron en promedio un pH de 4.7, 80% de humedad, 8% de proteína y 6% de grasa

ResultadosResultados

• Viabilidad:Queso con

Probióticos

Cuenta inicial en

la leche (UFC/ml)

Cuenta en que-

so recién elabo-

rado (UFC/ml)

Cuenta en el queso

después de 4 días

(UFC/ml)

Células

libres

2.1 X 109

5 X 106

1.8 X 105

Células

Inmovilizadas

1 X 108

1.8 X 106

1.7 X 106

ResultadosResultadosVariación del peso inicial de esferas de alginato a

pH 2 y 100 rpm

0102030405060708090

100

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

Tiempo (h)

% d

el p

eso

inic

ial

FructooligosacáridosFructooligosacáridos (1)(1)

• Miles de plantas contienen fructooligo-sacáridos, ya que estos compuestos son constituyentes natural de la inulina

• La inulina se encuentra en más de 36,000 plantas y es su reserva de energía

• Comercialmente, se extrae principal-mente de la raíz de la achicoria

FructooligosacáridosFructooligosacáridos (2)(2)• La inulina está formada por cadenas linea-

les de fructosa conectada por enlaces β2 1. Casi todas las cadenas tienen lon-gitudes de 60 y terminan en una glucosa

FructooligosacáridosFructooligosacáridos (3)(3)• El término se ha usado para los 1-β-poli-

fructofuranosil-sacarosa, excluyendo polifructanas y oligofructósidos

FructooligosacáridosFructooligosacáridos (4)(4)Fuente Inulina (%) FOS (%)

Cebolla 2 - 6 2 - 6Alcachofa de Jerusalén 16 - 20 10 - 15Achicoria 15 - 20 5 - 10Poro 3 - 10 2 - 5Agave tequilero (7 años) 22 - 30 3 - 8Ajo 9 - 16 3 - 6Alcachofa 3 - 10 < 1Diente de león 12 - 15 n. d.Salsifí 4 - 11 4 - 11Trigo 1 - 4 1 - 4

FructooligosacáridosFructooligosacáridos (5)(5)

• En el alimento, los FOS proporcionan sabor y la inulina textura

• Síntesis:– Fructosiltransferasas– Presencia en m.o. y plantas– pH óptimo entre 5 y 6.5– Temperatura óptima entre 50 y 60°C

FructooligosacáridosFructooligosacáridos (6)(6)

• Producción industrial– Sistema por lote: enzima soluble– Sistema contínuo: m.o. o enzima

inmovilizados en alginato de calcio en reactores de lecho empacado (1000 L) usando sacarosa concentrada (hasta 700 g/L) como sustrato

– Se obtienen mezclas de Glu, Sac, GF2, GF3 y GF4

FructooligosacáridosFructooligosacáridos (7)(7)• Fuentes vegetales de fructosiltrans-

ferasas– Agave americana– Agave vera cruzae– Asparagus officinalis– Allium cepa– Cichorium intybus– Helianthus tuberosus– Lactuca sativa– Taraxacum officinale (diente de león)

FructooligosacáridosFructooligosacáridos (8)(8)

• Algunos m.o. productores de FOS– Aureobasidium pullulans– Aspergillus japonicus– Aspergillus niger– Aspergillus oryzae– Claviceps purpurea– Penicillium oxysporum– Phytophthora parasitica– Saccharomyces cerevisiae

FructooligosacáridosFructooligosacáridos (9). (9). FuncionalidadFuncionalidad

• Baja dulzura (1/3 de la de la sacarosa)• Prácticamente no aportan energía• No son cariogénicos• Son bifidogénicos• Disminuyen los niveles séricos de

colesterol, fosfolípidos y triglicéridos• En Japón se recomienda una ingesta

diaria de 0.8 g / kg de peso / día

Obtención de una bebida funcional Obtención de una bebida funcional a partir de aguamiela partir de aguamiel

• El objetivo de esta investigación fue la de obtener un producto simbiótico a partir de un prebiótico (aguamiel) y un probiótico(bifidobacterias)

Participantes: Roberto Campos, RosalvaMora y Humberto Hernández

AguamielAguamiel

• El aguamiel es un fluido obtenido del Agave atrovirens karb que normalmente se fermenta para la obtención del pulque

• Las muestras obtenidas prove-nientes de Contepec, Michoacán tuvieron un pH de 6.8, 86% de hume-dad y 10.7ºBx

CarbohidratosCarbohidratos

Carbohidrato Contenido (g/L)Sacarosa 68Fructosa 9.2Glucosa 4.6FOS (incluyendo 15

inulina)El análisis de hizo por el método de

Ting y HPLC

Uso del aguamiel como medio de Uso del aguamiel como medio de cultivocultivo

Crecimiento de 3 cepas de bifidobacterias a 37ºC y 48 hCepa As590 nm AM As590 nmTPYB. bifidum 0.77 1.03B. longum 0.74 0.96B. animalis 0.91 1.12

Pérdida de viabilidad de diferentes Pérdida de viabilidad de diferentes cepas de cepas de BifidobacteriasBifidobacterias en aguamielen aguamiel

• Se inoculó aguamiel a 9ºBx y se incubó a 4ºC por 30 díasCepa % de pérdida de viabilidadB. infantis >25B. longum 11.3B. bifidum 13.5B. adolescentis 18.1B. animalis 9.6

Pérdida de viabilidad de Pérdida de viabilidad de BifidobacteriumBifidobacteriumanimalisanimalis en aguamiel a diferentes en aguamiel a diferentes BrixBrix

• Las muestras se incubaron a 4ºC por 4 díasºBx % de pérdida de viabilidad6.2 1.47.5 1.28.5 1.09.6 0.6

11.8 23.1

Efecto de la temperatura de incubaciónEfecto de la temperatura de incubación

• Cambios en diferentes constituyentes a 30 díasComponente 4ºC 25ºC 35ºC

ºBx 8.1 8.1 7.8pH 7.5 7.1 4.2Acidez(%) 0.5 0.7 3.1Sacarosa(%) 7.1 7.1 5.8B. bifidum 6.9 6.6 <6.0(log UFC/ml)

Evaluación SensorialEvaluación Sensorial• Se evaluó la bebida inoculada con B. bifidum e

incubada a 4ºC por 30 días• El producto tenía un color amarillo paja y un

sabor dulce agradable que fue aceptada por los jueces que la evaluaron

GRACIASGRACIAS