IntroducciIntroduccióón a la n a la EspectrometrEspectrometríía de Masaa de Masa

Algunas aplicaciones de la Espectrometría de Masa

en biología y biomedicina

Espectrometría de Masa• La Espectrometría de Masa es una técnica que permite determinar la masa de moléculas por medio de la medida de la relación masa/carga (m/z).

• La medida de masas moleculares involucra la producción, separación y detección de iones moleculares en fase gaseosa.

• Cada molécula puede originar iones moleculares con distinto número de cargas ( y distintas m/z).

• La masa molecular es una propiedad física fundamental e inalterable de la materia……

Bioespectrometría

• Aplicación de la Espectrometría de Masa al estudio de bio-moléculas: identificación, niveles, modificaciones.

• Incluye la combinación de herramientas de la Bioquímica (cromatografía, electroforesis, bioafinidad y digestiones enzimáticas, entre otras) con la Espectrometría de Masa.

Espectrometría de masa y BiologíaEspectrometrEspectrometríía de masa y Biologa de masa y Biologííaa

Las medidas de masa de péptidos y proteínas (...y de otras macromoléculas) eran extremadamente difíciles de realizar hasta fines de los años 80’, cuando aparecieron dos nuevos métodos para producir iones en fase gaseosa:

• Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI), para muestras sólidas

• Ionización por “Electrospray” (ESI) para muestras líquidas

Espectrometría de masa: equipos de tipo MALDI-TOF

Espectrómetro de masa MALDI-TOF

(Applied Biosystems Voyager DE-PRO)

Espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF

(Applied Biosystems 4800 Analizer)

ESQUEMA:

Instrumento de tecnología MALDI-TOF

Camera

Laser

plate

Pumping Pumping

Beam guide

Timed ion selector Reflector

Lineardetector

Extractiongrids Reflector

detector

4000 Series MALDI TOF/TOF™ Analyzer Training

© 2007 Applera Corporation and MDS Inc.7

Analizador de masa TOF Aceleración

post-irradiación láser

Región de deriva (Tubo de vuelo)Detector

Iones de masas

diferentes

L os iones se separan de acuerdo a sus relaciones de m/z, de manera que los iones más livianos reciben una mayor aceleración .

Los iones más livianos llegan al detector antes que los iones de masas mayores. La medida del “tiempo de vuelo” (TOF) de cada uno se puede usar para calcular su masa.

+20 kV

Espectro de masa por MALDI-TOF de péptidos generados por digestión con tripsina “in gel” de una proteína de membrana de 91 kDa.

Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81

ElementoElemento MasaMasa %%1H 1.0078 99.9852H 2.0141 0.01512C 12.0000 98.9013C 13.0034 1.1014N 14.0031 99.63415N 15.0001 0.36616O 15.9949 99.76217O 16.9991 0.03818O 17.9992 0.20031P 30.9738 100.0032S 31.9721 95.0233S 32.9715 0.7534S 33.9679 4.2136S 35.9671 0.02

79Br 78.9183 50.6981Br 80.9163 49.31

1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 1691.0Mass (m/z)

0

3222.3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ityVoyager Spec #1=>BC=>RSM10000=>MC=>MC=>MC[BP = 1672.8, 3222]

1672.917

Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM)

1672.92

1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 1691.0Mass (m/z)

0

1.6E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1=>BC=>NR(2.00)=>MC=>MC[BP = 1672.9, 16255]

1672.918

Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM)

Resolución en MALDI-TOF

100

5725 5729 5733 5737 5741 5745Mass (m/z)

0

2093

010

20

30

40

50

60

70

80

90

% In

tens

ity

Voyager Spec #1=>MC[BP = 2469.5, 12005]

2xC13

C12

C13

Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina. (aprox. 0.15 pmoles, 0.8 ng, en 1 µl de muestra; matriz: CHCA; R= 13800 FWHM)

Algunas aplicaciones............

CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASA

• Identificación de proteínas– comparación correlativa en una base de datos de

secuencias• Control de calidad

– proteínas recombinantes, reacciones de modificación• Modificaciones postraduccionales

– fosforilación, glicosilación, metilación, etc.• Identificación de dominios

– dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima

• Niveles de expresión– métodos cuantitativos

5000 7000 9000 11000 13000 15000

Mass (m/z)

0

6.0E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1=>BC=>NF0.9[BP = 12364.9, 60367]

12366.46

6187.17

12583.58

12326.17

6292.68

12784.48

Espectro de masa del citocromo c de caballo

A. Molécula entera. Matriz: ácido sinapínico

Mapeo peptídico por EM(Peptide Mass Fingerprinting/MS)

MEMEKEFEQIDKSGSWAAIYQDIRHEASDFPCRVAKLPKNKNRNRYRDVS

PFDHSRIKLHQEDNDYINASLIKMEEAQRSYILTQGPLPNTCGHFWEMVW

EQKSRGVVMLNRVMEKGSLKCAQYWPQKEEKEMIFEDTNLKLTLISEDIK

SYYTVRQLELENLTTQETREILHFHYTTWPDFGVPESPASFLNFLFKVRE

SGSLSPEHGPVVVHCSAGIGRSGTFCLADTCLLLMDKRKDPSSVDIKKVL

LEMRKFRMGLIQTADQLRFSYLAVIEGAKFIMGDSSVQDQWKELSHEDLE

PPPEHIPPPPRPPKRILEPHNGKCREFFPNHQWVKEETQEDKDCPIKEEK

GSPLNAAPYGIESMSQDTEVRSRVVGGSLRGAQAASPAKGEPSLPEKDED

HALSYWKPFLVNMCVATVLTAGAYLCYRFLFNSNT

proteína intacta enzima

proteolítica

péptidos

1000 1160 1320 1480 1640 1800Mass (m/z)

0

2.0E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1=>MC=>BC[BP = 1633.6, 19883]

1168.61

1190.54

1212.53 1433.76

1655.591170.181213.531296.681152.361046.18 1631.621350.70 1478.821124.52 1230.50

1633.82

B. Molécula digerida con tripsina. Matriz: ácido α-ciano hidroxicinámico

Masa Teorica (Da)

Masa Medida (Da)

Error (Da) Residuos Secuencia

1168.61 1168.61 0.00 28-38 TGPNLHGLFGR 1296.71 1296.68 0.03 28-39 TGPNLHGLFGRK 1350.72 1350.69 0.03 89-99 TEREDLIAYLK 1433.77 1433.76 0.01 26-38 HKTGPMLHGGLFGR 1470.68 1470.67 0.01 40-53 TGQAPGFTYTDANK 1478.82 1478.82 0.00 89-100 TEREDLIAYLKK 1478.82 1478.82 0.00 88-99 KTEREDLIAYLK 1633.81 1633.82 0.01 9-22 IFVQKCAQCHTVEK

RESUMEN:

Niveles de información………en la caracterización de proteínas por MS.• medida de masa de una molécula entera 1 valor experimental

• medidas de masas en mapeo peptídico 5-20 valores experimentales

• secuenciado de péptidospor MS/MS más de 100 valores experimentales

…mejora en cantidad y calidad de la información

El Proteoma es dinEl Proteoma es dináámicomico

ProteomaProteoma

Drogas

Estado metabólico

EstrésCondiciones ambientales

Estadío de Desarrollo

Interacciones Proteína-Proteína

Control traduccional y post-traduccional

mARN mARN ADNADNGenomaGenoma

Control transcripcional

Análisis por electroforesis 2D

1000 1500 2000

Mass (m/z)

Identificación de proteínas

Selección de la muestraTratamiento con una enzima proteolítica

Separación en gel 2D

Búsqueda en banco de datos

Extracción de péptidos y análisis de masas

m/z

Protein Prospector HomepageMS-Fit Search

ProFound Search for Protein ProFound Search for Protein IdentificationIdentification

Set KingdomEnzyme used for digestion

Cys Modificatition(reduced, alkylated)

Set Charge state

Search Result after Peptide Mass Fingerprinting

The result showed that in factthe spot contained 2 proteins.Both were identified,Vimentin and Tubulin.

Up to 5 proteins in the same spot could potentially be identified.

Note that the genomeof CHO-cells (hamster) is not sequenced.Therefore the mosthomologues proteins ofrelated species are scored.

Detailed Search Results View

IdentificaciIdentificacióón de una proten de una proteíína na regulada por hierro en membrana regulada por hierro en membrana externa de externa de Sinorhizobium melilotiSinorhizobium meliloti

Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81

FIG. 1. SDS-PAGE analysis of S. meliloti 242 outer membrane proteins. S. meliloti 242 was grown in M3 medium containing 37 µM FeCl3 (lanes 1 and 2), 500 µM EDDHA (lanes 3 and 4), 500 µM EDDHA and 4 µM hemoglobin (lanes 5 and 6), or 500 µM EDDHA and 16 µM hemin (lanes 7 and 8). Outer membrane proteins were extracted as described in the text, electrophoresed in a 10% acrylamide gel, and stained with 0.1% Coomassie brilliant blue. The bracket indicates the position of IROMPs. The positions of molecular mass standards (in kilodaltons) (lane 0) are indicated on the left. St, standards; Hb, hemoglobin; Hm, hemin.

Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81

FIG. 3. Mass spectrum of the 91-kDa outer membrane protein digested in-gel with trypsin obtained by MALDI-TOF mass spectrometry.

Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81

Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81

Identificación de proteínas por MALDI-TOF

• Proteína aislada• Proteína identificada por la masa de los péptidos

(PMF), generados por un método específico:– Enzimático o químico

• Para su identificación, la secuencia de la proteína debe estar en una base de datos

• La identificación es probabilística: según criterios estadísticos

• Identificación de proteínas– comparación correlativa en una base de datos de

secuencias• Control de calidad

– proteínas recombinantes, reacciones de modificación• Modificaciones postraduccionales

– fosforilación, glicosilación, metilación, etc.• Identificación de dominios

– dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima

• Niveles de expresión– métodos cuantitativos

Caracterización de proteínas por espectrometría de masa

362924

20

14

A

B

Pureza/HPLC/GCSFPureza/SDS-PAGE/ GCSF

Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF

A

B

28.952 Da

muestra A

Espectro de masa por MALDI-TOF, del contaminante proteico (spot A en gel 2D).

Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF

A

B

Electroforesis 2D de la materia prima

Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF

867.0 1191.6 1516.2 1840.8 2165.4 2490.0Mass (m/z)

0

2.0E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1=>BC[BP = 1286.8, 20135]

1286

.77

1351

.78

1783

.87

1740

.84

1414

.87

1029

.53

2083

.09

2178

.06

988.

45

2021

.94

1242

.66

1297

.67

1086

.56

MOW

SE Score

#/13(%)

Masses

Matched

% Cov

% TIC

Mean

ErrDa

DataTolDa

MS-Digest

Index #

Protein MW

(Da)/pI

Accession # Species Protein Name

1 4.709e+06

13 (100)

60.0

100.0

-0.011

2

0.0358 93727 28949/5.5 999812

M UNREADABLE

gi|999812|pdb|1BTL| Beta-Lactamase Tem1 (E.C.3.5.2.6)

2 4.709e+06

13 (100)

60.0

100.0

-0.011

2

0.0358 377118 28950/5.3 925716

6 UNREADABLE

gi|9257166|pdb|1CK3|A Chain A, N276d Mutant Of Escherichia Coli Tem-1 Beta-Lactamase

3 3.603e+06

13 (100)

55.0

100.0

-0.011

2

0.0358 590830 31530/5.7 299595

9 M

EXPRESSION VECTOR PPK113

beta-lactamase

Realizado por la Unidad de Bioquímica Analítica del IIBCE/ Laboratorios CLAUSEN

Digestión tríptica: muestra A

• Identificación de proteínas– comparación correlativa en una base de datos de

secuencias• Control de calidad

– proteínas recombinantes, reacciones de modificación• Modificaciones postraduccionales

– fosforilación, glicosilación, metilación, etc.• Identificación de dominios

– dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima

• Niveles de expresión– métodos cuantitativos

Caracterización de proteínas por espectrometría de masa

NO2?

Fosforilación?

Identificación de Modificaciones Postraduccionales

∆ (monoisotopic) modification-17 pyrrolidone carboxylic acid-2 disulfide formation (thiol oxidation)-0.98 amidation0.98 deamidation2 disulfide reduction (thiol formation)

14 methylation16 oxidation (e.g. sulfoxide formation)28 formylation42 acetylation43 carbamylation44 γ-carboxyglutamic acid71 Cys-propionamide79.9568 sulfation79.9663 phosphorylation

M. R. Wilkins et al., J. Mol. Biol. 289: 645-657 (1999).Delta Mass at http://www.abrf.org

Some modifications are natural.Many are the result of handling.

disulfide vs. two thiolsphosphate group vs. sulfate groupgood mass spectrometer neededespecially with large molecules

Common Protein Post-Translational Modifications

IdentificaciIdentificacióón de sitios de n de sitios de fosforilacifosforilacióónn

1 GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTTPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLH51 RDVAVKVLRADLARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAE

101 TPAGPLPYIVMEYVDGVTLRDIVHTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQ151 NGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIARAIADSGNSVTQTAAVIGTAQ201 YLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAYQHVR251 EDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEP301 PEAPKVLTDAERTSLLSSAAGNLSGPRTDPLPRQDLDDTDRDRSIGSVGR

PknB de PknB de MycobateriumMycobaterium tuberculosistuberculosis

1 GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTTPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLH51 RDVAVKVLRADLARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAE

101 TPAGPLPYIVMEYVDGVTLRDIVHTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQ151 NGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIARAIADSGNSVpTQpTAAVIGTAQ201 YLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAYQHVR251 EDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEP301 PEAPKVLTDAERTSLLSSAAGNLSGPRTDPLPRQDLDDTDRDRSIGSVGR

• Identificación de proteínas– comparación correlativa en una base de datos de

secuencias• Control de calidad

– proteínas recombinantes, reacciones de modificación• Modificaciones postraduccionales

– fosforilación, glicosilación, metilación, etc.• Identificación de dominios

– dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima

• Niveles de expresión– métodos cuantitativos

Caracterización de proteínas por espectrometría de masa

2-D DE T. cruzi- RESULTADOS PRELIMINARES

pH 3 10pH 3 10 pH 3 10pH 3 10A) B)

Epimastigotes CL-Brener (vista parcial) A) y B) tratados y no tratados con H2O2 respectivamente

ESTRATEGIA GENERAL PARA EL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASA

ProteProteíínana

Alternativamente, secuenciación de

cada péptido

Verificación de secuencia y detección de modificaciones

postraduccionales .…MS/MS

Espectrómetro de masa

Mezcla de péptidos

Enzima

Masa de los péptidos

Búsqueda en bancos de datos;Identificación de la proteína

MS/MS

MS/MS+

+

+

+ +

+

1 péptido seleccionado para MS/MS

Espectro MS/MS:masa de los fragmentos

Mezcla de péptidos

Espectro MS

y ionsb ions

Proteínas Funcionales

Secuencia ADN mARN Proteínas

Control Transcripcional

Control Traduccional

Control post-traduccional

Del Genoma al Proteoma

Algunas propiedades VITALES de las proteínas no pueden ser predecidas de su secuencia de ADN

Proyectos de Proteoma Humano

~40,000 Proteinas

~>1,000,000 Proteinas Variantes

~>5,000,000 Complejos?

APLICACIONES DE LA PROTEOMICA

Estudios de la funcion y organización Molecular de la celula

Descubrimiento de nuevas moleculasblanco de drogas

Descubrimiento de nuevas actividades

Biologicas y drogas

Predecir respuestas individuales a

drogas

Marcadores para diagnostico deenfermedades

Estudio de modo de accion de drogasy toxicidad

Investigaciones enFisiopatologia

Lase

r

Sample Loading Chamber

Cam

era

Lam

p

4800 MALDI TOF/TOF™

Analyzer Schematic

Sample Plate and Stage

Mirrors

Linear Detector

Reflector Detector

2-Stage Mirror

Mirror Deflectors

Decel Deflectors

X2,Y2 Deflectors

X1,Y1 Deflectors

TIS

Collision Cell

Metastable Suppressor

Source 2

Decel Stack

Source 1Source 1 Lens

Lens 1

CID Lens (Lens 2)

Lens 3

Attenuator

Tubo de vuelo

Detector

4-25 kV

Los iones se separan de acuerdo a sus relaciones de m/z, de manera que los iones más livianos reciben una mayor aceleración.

Los iones más livianos llegan al detector antes que los iones de masas mayores. La medida del “tiempo de vuelo” (TOF) de cada uno se puede usar para calcular su masa.

Espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems 4800 Analizer)

Time-of-Flight Mass AnalyzerSource

Acceleration Drift Region (Flight Tube)Detector

Ions will separate according to their mass-to-charge ratios: light ions accelerated to a higher velocity that heavy ions.

The lighter ions strike the detector before the heavier ions. The time of flight (TOF) can be used to calculate the mass-to-charge ratio.

+20 kV

• Modelo: Voyager DE-PRO (Applied Biosystems, USA).• Datos técnicos:

- Laser de nitrógeno (λ 337 nm)- Voltaje de aceleración: hasta ± 25 kV- Tubo de vuelo: 1.3 m (modo lineal); 2.0 m (modo reflector)- Sistema alto vacío: 2 bombas turbo-moleculares (10-8 Torr)- Rango de masa: 500 Da hasta > 400 kDa - Exactitud de masa : hasta 0.002% (20 ppm)- Sensibilidad (péptidos): subpicomolar

• Posibilidades de operación:- Modo lineal - Modo reflector - "Delay extraction" (DE) - "Post Source Decay“ (PSD) - "Collision-Induced Dissociation“ (CID)