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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE INGENIERÍA
CAMPUS GUANAJUATO (UPIIG)
CENTRO DE INNOVACIÓN APLICADA EN TECNOLOGÍAS
COMPETITIVAS (CIATEC, A.C.)
«MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO
COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA BIODEGRADACIÓN DE
LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS»
T E S I S
PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
INGENIERO BIOTECNÓLOGO
PRESENTA:
ÓSCAR SAÚL MORALES TAFOYA
ASESORES:
M. en C. VERÓNICA JIMÉNEZ HERNÁNDEZ
Dra. MARÍA SORAYA OSEGUEDA ROBLES
SILAO DE LA VICTORIA, GUANAJUATO.
2014
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
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El presente trabajo fue realizado en colaboración con el Dr. Ricardo
Guerra, en el Laboratorio de Ambiental del Centro de
Investigaciones Aplicadas en Tecnologías Competitivas A.C.
(CIATEC), bajo la dirección de la M. en C. Verónica Jiménez
Hernández, y en el Laboratorio de Química I de la Unidad
Profesional interdisciplinaria de Ingeniería Campus Guanajuato
(UPIIG) del Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de la
Dra. María Soraya Osegueda Robles.
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BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
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DEDICATORIA
A mi madre, por hacer realidad cada uno de mis sueños desde el día en que
llegué a este mundo. Te amo infinitamente, gracias.
A mis abuelos, por llevarme de la mano con sus consejos y sabiduría. Por su
cariño y su paciencia. A mi familia, porque son parte medular de mis logros.
A mis amigos, con quienes caminé, tropecé y aprendí. Sé que nuestro viaje
no termina aquí.
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BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
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AGRADECIMIENTOS
«Gracias a la vida, que me ha dado tanto…», de esta manera quiero comenzar con este pequeño
apartado de enormes agradecimientos hacia todo lo que me ha permitido llegar aquí. Y es
precisamente a esa colección de vivencias, alegrías, desencantos y recuerdos, la vida misma…a
la que debo agradecer. Por ponerme en este tiempo y en este lugar, por enseñarme a caminar, a
equivocarme, a rectificar, y a ser muy feliz con lo que me da siempre.
A mi madre, Martha Patricia, por toda esa magia que siempre me ha mostrado. Por hacer
posible lo imposible, por guiarme, cuidarme, alentarme, reprenderme, amarme, y demostrarme
que si los límites existían, para nosotros eran invisibles. Esto es por y para ti.
A Don Jesús y Doña Cuca, mis abuelitos, mis segundos padres, mis héroes y ejemplos de todo
lo bueno que tengo. Sus valores, sus consejos, sus bendiciones y su presencia conmigo me
hacen sentir el más afortunado de todos.
A toda mi familia, mis tíos y tías, primos, por sus palabras de apoyo, por su interés en mí y en
mis proyectos. De manera especial para mis tíos Salvador Morales, Elvira Tafoya, Lupita
Hernández y Concepción Navarrete. Los quiero mucho, gracias.
A mis amigos, en la escuela, los de toda la vida y los que fui conociendo durante este viaje;
esas personas con quienes compartí horas de escuela, estudio, logros, estrés, risas, fiestas,
pláticas interminables, comida recalentada, y un sinfín de aventuras que nos hicieron darnos
cuenta que realmente solo somos tan jóvenes y tan libres una vez en la vida. Mayra, Jonathan,
Gaby, Julio, Caro, Bere, Ricardo, Ale Cruz, Aldo, Ale Reyes, Karla, Daniela, Diana, Pablo,
Ángel, Betzy, y los que faltan, gracias. TTYM BTCHS.
Al Instituto Politécnico Nacional, mi casa de estudios, que me aceptó, me formó y me dio las
herramientas para ser un mexicano consciente de los problemas de su país y procurar
resolverlos. Cierto apartado en el decálogo dice que se es politécnico por convicción y no por
circunstancia; y aunque las circunstancias me trajeron aquí, la convicción, el orgullo y el gusto
de pertenecer me hicieron quedarme con el guinda y blanco. ¡Huelum!
A la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería Guanajuato, mejor conocida como
UPIIG, que pionera en una tierra lejana, fue quien me acogió y a través de los recursos con los
que contaba, me permitió una extraña y agradable estancia. Gracias a todos los profesores,
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quienes me enseñaron que el conocimiento va más allá del saber, y que nunca se es demasiado
sabio, ni demasiado viejo, solo demasiado terco para aprender.
Un agradecimiento especial al CIATEC y al laboratorio de análisis ambientales, por recibirme
y ayudarme con este proceso, por el apoyo intelectual y financiero. Gracias al Dr. Ricardo
Guerra, por confiar en mí para este proyecto.
A Verónica Jiménez, mi asesora y colaboradora principal de todo este trabajo. Por su
compromiso, su pasión, su ética y responsabilidad, por sus consejos que tanto me han servido
en estas nuevas etapas de mi vida. Pero sobre todo gracias por esa infinita paciencia para
conmigo. Sé que no fue fácil.
A la Dra. Soraya Osegueda, profesora, consejera, y amiga, por aceptar ser mi guía en este
trabajo, por su nivel de compromiso, por sus pláticas y vivencias que me llevo conmigo. Por los
aventones, por los consejos y esa disponibilidad para siempre ayudar.
A la profesora Ana Rodríguez, que sin ella y su vinculación nada de esto hubiera sido posible,
por ver en mí el potencial y la pasión por la ciencia que a veces yo mismo olvido.
Al M. en C. Mario Aguilar, por la ayuda intelectual, sus aportes, su interés y su tiempo para la
parte escrita de este trabajo. Su colaboración se refleja en la gran mejoría de lo aquí presentado.
A las personas que conocí, a los lugares donde viví, a las aventuras extrañas y misteriosas, a los
buenos días, a los malos momentos, al proceso inevitable y mágico de crecer y ver en
retrospectiva todo lo que gracias a este trabajo gané, en general a todas las personas que, como
dice una canción, por cada sonrisa que les di recibí una de vuelta.
A quienes preguntaban: «¿Qué tú ya no habías salido?», «¿Cuándo presentas? », «¿Ya
terminaste?»; ahora sí es en serio… ya acabé. ¡Por fin!
A quienes olvido por amnesia o por conveniencia, a los buenos, a los malos, a quienes están y a
quienes ya no; y ya para no prolongar esto, citaré a un conocido cantautor argentino.
Para todos, ¡GRACIAS TOTALES!
Óscar
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ÍNDICE TEMÁTICO
1. INTRODUCCIÓN............................................................................................................ 1
1.1 Marco Teórico .......................................................................................................... 1
1.1.1 El suelo..................................................................................................................... 1
1.1.2 Hidrocarburos y petróleo ......................................................................................... 3
1.1.3 Clases de petróleo..................................................................................................... 6
1.1.4 Contaminación de los suelos por hidrocarburos ....................................................... 8
1.1.5 Suelos contaminados con hidrocarburos en México ................................................. 9
1.1.6 Clasificación de las tecnologías de remediación de suelos ........................................11
1.1.7 Intemperización y biodisponibilidad .......................................................................16
1.1.8 Biorremediación......................................................................................................17
1.1.9 Rutas de biodegradación .........................................................................................18
1.2 Antecedentes ............................................................................................................20
1.2.1 El sureste mexicano y la contaminación de los suelos........................................20
1.2.2 Suelo contaminado en Veracruz ..............................................................................21
1.3 Descripción del problema ..............................................................................................21
2. JUSTIFICACIÓN ...........................................................................................................23
3. HIPÓTESIS ....................................................................................................................24
4. OBJETIVO GENERAL ..................................................................................................25
5. OBJETIVOS ESPECÍFICOS..........................................................................................25
6. DESARROLLO EXPERIMENTAL................................................................................26
6.1 Caracterización fisicoquímica del suelo de Agua Dulce, Veracruz.................................26
6.2 Uso de dos tecnologías para la biorremediación de suelos .............................................27
6.2.1 Diseño de Experimentos ..........................................................................................27
6.3 Establecimiento de condiciones para los experimentos ..................................................30
6.3.1 Establecimiento de condiciones para bioestimulación .............................................31
6.3.2 Establecimiento de condiciones para bioventeo ........................................................31
6.4 Cuantificación de CO2 ...................................................................................................31
6.5 Determinación de pH ....................................................................................................32
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6.6 Determinación de humedad. ..........................................................................................32
6.7 Determinación de conductividad eléctrica del suelo contaminado .................................32
6.8 Determinación de materia orgánica...............................................................................32
6.9 Determinación de hidrocarburos totales a través de espectrofotometría UV- Visible .33
6.10 Determinación de hidrocarburos utilizando espectrofotometría infrarrojo (IR)..........33
6.11 Caracterización de microorganismos presentes en el suelo contaminado. ....................33
6.11.1 Aislamiento y cultivo de microorganismos hidrocarbonoclastos en el suelo
contaminado. ...................................................................................................................33
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................................35
7.1 Cuantificación de parámetros en el proceso de bioestimulación ....................................35
7.1.1 Cuantificación de CO2. ............................................................................................35
7.1.2Cuantificación de pH ...............................................................................................38
7.1.3 Cuantificación de humedad.....................................................................................39
7.1.4 Cuantificación de conductividad eléctrica ...............................................................41
7.1.5. Cuantificación de materia orgánica........................................................................42
7.1.6. Cuantificación de hidrocarburos de fracción pesada (HFP) por espectrofotometría
UV e FTIR.......................................................................................................................47
7.3 Cuantificación de parámetros usando bioventeo. ..........................................................56
7.3.1 Cuantificación de CO2.............................................................................................56
7.3.2 Cuantificación de pH ..............................................................................................58
7.3.3 Cuantificación de humedad.....................................................................................60
7.3.4 Cuantificación de conductividad eléctrica ...............................................................61
7.4 Relación entre actividad metabólica y degradación de los hidrocarburos......................62
8. CONCLUSIONES ...........................................................................................................65
9. PERSPECTIVAS ............................................................................................................66
BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................................67
A. Preparación de medios enriquecidos............................................................................75
B. Análisis estadísticos .....................................................................................................75
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Clasificación de las clases texturales del suelo. El suelo franco arcilloso,
objeto del estudio de este trabajo se encuentra en el centro de la pirámide (Ibáñez
Asensio et al., 2010)……………………………………………………………………….2
Figura 2. Estructuras de las diferentes clases de hidrocarburos. Los hidrocarburos de
mayor presencia en suelos son los aromáticos y asfáltenos…………………………..4
Figura 3. Ejemplos de hidrocarburos saturados que forman parte de la mezcla de
hidrocarburos presente en el petróleo. Se presentan las estructuras más simples y las
más comunes encontradas en los suelos contaminados (Harayama et al.,
1999)……………………………………………………………………………………….4
Figura 4. Ejemplos de los hidrocarburos principales en la fracción aromática del
petróleo. Todos estos compuestos por su estructura, son los más difíciles de degradar a
moléculas más simples……………………………………………………………………5
Figura 5. Ejemplos de estructuras de asfáltenos (izquierda) y resinas (derecha). Como
se observa, los asfáltenos son estructuras más complejas químicamente debido a la
unión de anillos bencénicos y por tanto más insolubles (Harayama et al.,
1999)………………………………………………………………………………………..6
Figura 6. Pluma típica de contaminación en los suelos por la acción de hidrocarburos.
Se observan los fenómenos que rigen los suelos intemperizados (Cortón et al.,
2006)……………………………………………………………………………………….10
Figura 7. Clasificación de las técnicas de remediación para suelos contaminados según
su tipo. La clasificación de la Tabla 5 solo se aprecia en las técnicas biológicas, por ser
más usada en estas (Martınez-Prado et al., 2014)……………………………………..15
Figura 8. Relación costo-tiempo entre algunos de los métodos de remediación de
suelos. Los métodos de bioestimulación y bioventeo se encuentran en el centro de la
gráfica (Reynolds et al., 1997)…………………………………………………………...15
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Figura 9. Representación de los eventos que rigen la biodisponibilidad de las
moléculas contaminantes. El símbolo (●) representa las partículas de hidrocarburo
dentro del suelo……………………………………………………………………………16
Figura 10. Pasos iniciales en la biodegradación de los PAHs por hongos, bacterias y
algas. Estas estructuras degradadas pueden entrar en procesos metabólicos como la β-
oxidación (Cerniglia, 1993)……………………………………………………………....19
Figura 11. Localización geográfica de Agua Dulce, Veracruz. Los municipios aledaños
(Minatitlán y Coatzacoalcos) a la izquierda, son los principales actores en procesos
petroquímicos……………………………………………………………………………..22
Figura 12. Gráfico de producción de dióxido de carbono en los tratamientos utilizados
en el proceso de bioestimulación. Las líneas representan la desviación estándar; los
valores 1 a 12 corresponden a los experimentos, P al testigo (suelo estéril) y N al
control negativo (ladrillo incinerado)…………………………………………………...36
Figura 13. Diagrama de Pareto para sales utilizadas en el diseño de experimentos del
proceso de bioestimulación. La línea azul representa el valor mínimo para que alguna
de las sales sea estadísticamente significativa en el resultado…………………………37
Figura 14. Valores registrados de pH para el tratamiento del suelo usando
bioestimulación. Las líneas representan la desviación estándar; los valores 1 a 12
corresponden a los experimentos, P al testigo (suelo estéril) y N al control negativo
(ladrillo incinerado)……………………………………………………………………....38
Figura 15. Diagrama de Pareto para sales utilizadas en el diseño de experimentos del
proceso de bioestimulación. La línea azul representa el valor mínimo para que alguna
de las sales sea estadísticamente significativa en el valor de
pH…………………………………………………………………………………...……..39
Figura 16. Valores registrados de porcentaje de humedad para el tratamiento del
suelo usando bioestimulación. Las líneas representan la desviación estándar; los
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valores 1 a 12 corresponden a los experimentos, P al testigo (suelo estéril) y N al
control negativo (ladrillo incinerado)…………………………………………..……….40
Figura 17. Valores registrados de conductividad eléctrica para el tratamiento del
suelo usando bioestimulación. Las líneas representan la desviación estándar; los
valores 1 a 12 corresponden a los experimentos, P al testigo (suelo estéril) y N al
control negativo (ladrillo incinerado)…………………………………………...……….42
Figura 18. Valores registrados de materia orgánica para el tratamiento del suelo
usando bioestimulación. Las líneas representan la desviación estándar; los valores 1 a
12 corresponden a los experimentos, P al testigo (suelo estéril) y N al control negativo
(ladrillo incinerado)……………………………………………………………...……….43
Figuras 19 a,b,c. Diagramas de Pareto para la determinación de significancia de las
sales utilizadas para los valores en porcentaje de humedad, conductividad eléctrica
(CE) y materia orgánica. La línea azul representa el valor mínimo para que alguno de
los factores sea estadísticamente significativo en el resultado, cada una de las letras de
los factores representa las sales indicadas en la Tabla
7…………………………………………………………………………………………….44
Figura 20. Ruta metabólica para la degradación del Hexadecano. El producto final es
Palmitoil-CoA (Velasco-Álvarez, 2011)………………………………………………...46
Figura 21. Curva de calibración de fracción asfalténica. Se realizó previa extracción
del hidrocarburo…………………………………………………………………………..48
Figura 22. Valores de fracción pesada de hidrocarburos obtenidos durante los tiempos
del experimento utilizando bioestimulación. Las líneas representan la desviación
estándar; los valores 1 a 12 corresponden a los experimentos, P al testigo (suelo
estéril) y N al control negativo (ladrillo incinerado)…………………………………...48
Figura 23. Curva de calibración para FTIR, usando hexano. La celda utilizada para el
experimento fue de selenuro de zinc……………………………………………………..50
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Figuras 24 a,b.c. Frecuencias de FTIR a los 7, 14 y 28 días obtenidas en el
experimento 9. Se eligió este por ser el que menor cantidad de hidrocarburos de
fracción pesada registró a los 28 días……………………………………………………51
Figura 25. Niveles de producción de CO2 en el suelo contaminado tratado con
bioventeo. La nomenclatura utilizada es como ejemplo: C1 (Corrida) B1 (Reactor) T7
(Tiempo de Experimento…………………………………………………………………57
Figura 26. Valores de pH registrados en diferentes experimentos usando bioventeo. Se
realizó únicamente la cuantificación de los experimentos que obtuvieron resultados
favorables en la cuantificación de dióxido de carbono………………………………...59
Figura 27. Valores de humedad registrados en diferentes experimentos usando
bioventeo. Se realizó únicamente la cuantificación de los experimentos que obtuvieron
resultados favorables en la cuantificación de dióxido de carbono…………………….60
Figura 28. Valores de conductividad eléctrica registrados en diferentes experimentos
usando bioventeo. Se realizó únicamente la cuantificación de los experimentos que
obtuvieron resultados favorables en la cuantificación de dióxido de
carbono…………………………………………………………………………………….61
Figura 29. Relación CO2 producido – Hidrocarburos de Fracción Pesada para el
experimento 9…………………………………………………………………………..…63
Figura 30. Relación CO2 producido – Hidrocarburos de Fracción Pesada para el
experimento C1B2 de bioventeo………………………………………………………...64
Figura 31 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de CO2
producido en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se encuentran los parámetros
estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-Smirnov…………………………76
Figura 32 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de pH
producido en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se encuentran los parámetros
estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-Smirnov…………………………77
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BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
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Figura 33 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de % de
Humedad producido en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se encuentran los
parámetros estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-Smirnov……………..79
Figura 34 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de % de
Materia Orgánica producido en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se
encuentran los parámetros estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-
Smirnov……………………………………………………………………………………81
Figura 35 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de
Conductividad Eléctrica producido en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se
encuentran los parámetros estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-
Smirnov…………………………………………………………………………………....82
Figura 36 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de HFP
producidos en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se encuentran los
parámetros estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-
Smirnov……………………………...............................................................................84
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ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Composición de las fracciones químicas del crudo del petróleo. En la tabla se
muestran algunos ejemplos de los compuestos en las fracciones indicadas (Viñas
Canals, 2005)………………………………………………………………………………. 3
Tabla 2. Clasificación del crudo según el API (American Petroleum Institute) En el
caso del crudo maya, de acuerdo a su clasificación en grados API se considera medio,
sin embargo la cantidad de azufre que contiene lo posiciona como un crudo pesado
(Castillo Gómez, 2014)…………………………………………………………………......7
Tabla 3. Características generales del crudo Maya (Centeno et al.,
2004)………………………………………………………………………………………...8
Tabla 4. Ventajas y desventajas de las tecnologías de remediación in situ y ex situ.
Aunque el lugar de remediación es un factor importante, el tipo de tratamiento es el
que define la estrategia más adecuada para la remediación (Alba-López,
2011)…………………………………………………………………………………….…12
Tabla 5. Comparación de los tipos de tratamientos de remediación de suelos. En él se
muestran. Los tratamientos biológicos son los que a pesar de su duración, son los más
amigables con el ambiente (Alba-López, 2011)…………………………………………14
Tabla 6. Valores propuestos para el uso de sales durante el proceso de
bioestimulación. Las sales, así como las cantidades, fueron evaluadas por distintos
autores……………………………………………………………………………………..28
Tabla 7. Diseño de experimentos obtenido para la selección de fuentes de nutrientes en
el proceso de bioestimulación. Las letras en la tabla 7 se muestran en las columnas de
esta tabla, representando las sales, mientras que los valores 1 y 0 mostrados e n esta
tabla representan valores de los niveles altos y bajos, respectivamente…………….29
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Tabla 8. Diseño de experimentos obtenido para el proceso de bioventeo. Los valores 0
y 1 establecidos en la columna de nutrientes corresponden a la adición de la fuente ; el
1 representa una adición de 90 mL del medio Bushnell Hass, mientras que el 0
corresponde a la misma cantidad pero en agua destilada…………………………….30
Tabla 9. Caracterización inicial del suelo de Agua Dulce. La mayoría de las variables
fueron determinadas mediantes normas oficiales……………………………………...35
Tabla 10. Cofactores necesarios para el funcionamiento de las enzimas descritas. Las
enzimas son específicas para la degradación de un hidrocarburo, sin embargo los
cofactores indicados son comunes dentro de este proceso…………………………….47
Tabla 11. Resultados de análisis de estadística no paramétrica para los datos
colectados de las variables medidas a diferentes tiempos. Se utilizó el método de
Kruskal-Wallis, con un α= 0.05…………………………………………………………..53
Tabla 12. Correlación de coeficientes de Pearson para las variables involucradas en el
proceso de biodegradación de hidrocarburos de fracción pesada utilizando
bioestimulación. Loa valores en negritas son estadísticamente significativos por el p
valor………………………………………………………………………………………..55
Tabla 13. Especies reportadas como degradadoras de hidrocarburos, según la base de
datos de la Universidad de Virginia (Urbance et al., 2003)…………………………….62
Tabla 14. Comparación de medias estadísticas de las formulaciones de los medios las
variables en el proceso de biodegradación de los hidrocarburos de fracción pesada
utilizando bioestimulación. (*DMS Diferencia Mínima Significativa) Valores con la
misma letra son estadísticamente iguales……………………………………………….75
Tabla 15. Composición del medio Bushnell Haas, utilizado para el proceso de
bioventeo…………………………………………………………………………………85
Tabla 16. Valores obtenidos mediante el análisis de varianza para los efectos de las
sales en las variables medidas………………………………………………………….86
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BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
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Tabla 17. Interacciones de medias tiempo-medio entra los medios enriquecidos, los
tiempos y las variables en el proceso de biodegradación de los hidrocarburos de
fracción pesada utilizando bioestimulación. (*DMS Diferencia Mínima Significativa)
Valores con la misma letra son estadísticamente iguales…………………………….88
ÍNDICE DE ECUACIONES
Ecuación 1. Clasificación del crudo de acuerdo al API (American Petroleum
Institute)…………………………………………………………………………………….7
Ecuación 2. Fórmula para el cálculo de dióxido de carbono producido (mg CO2/kg
suelo)………………………………………………………….……………………………32
Ecuación 3. Fórmula para el cálculo del porcentaje de humedad del suelo, según la
NOM-021-SEMARNAT-2000 (AS-06)…………………………………………………32
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RESUMEN
A lo largo de las décadas repetidos derrames de petróleo en toda la región suroccidental de
México han causado daños al medio ambiente. Los hidrocarburos del petróleo son de una
composición fracción pesada y otros compuestos persistentes. Dependiendo de la estructura
química del suelo estos hidrocarburos son complejos y son resistentes a la degradación.
Métodos de mitigación tradicionales como la incineración o excavación causan daños
medioambientales significativos a los ecosistemas costeros, ya que algunos procesos de
remediación fisicoquímicas alteran las propiedades del suelo y pueden propiciar la
aparición de contaminantes tóxicos. Además, debido a la composición única de los suelos
costeros, la mayoría de los métodos de reparación no son factibles para su uso. La falta de
procesos de remediación compatibles con el medio ambiente ha dado lugar a un número
creciente de sitios de derrame sin remediar.
El objetivo de este estudio es mejorar la biodisponibilidad de las muestras de suelo
contaminadas con hidrocarburos intemperizados tomadas de un sitio del derrame llamado
Agua Dulce, ubicada en la región suroeste de Veracruz. El diseño experimental se basa en
el método Plackett-Burman para identificar las variables significativas que participan en
proceso de biodegradación de hidrocarburos persistentes incluyendo fuente de nutrientes,
aireación, humedad y otros. Además, los parámetros fisicoquímicos de las muestras del
suelo fueron medidos para aplicar posteriormente a las nuevas tecnologías de remediación
usando bio-estimulación y bioventeo.
En este trabajo se realizaron las dos técnicas de remediación aplicación de un consorcio
nativo adaptado a suelos contaminados con hidrocarburos persistentes. El cálculo de la
cuantificación total de los hidrocarburos se realizó antes y después del tratamiento, para
identificar la relación entre el crecimiento microbiano y la reducción de Hidrocarburos de
Fracción Pesada (HFP). Al ser los nutrientes esenciales un factor limitante en el aumento de
la biodisponibilidad se encontró la mejor combinación de nutrientes que degrada la mayor
cantidad de HFP a un tiempo de 28 días, que junto con las otras variables medidas, mostró
un porcentaje de eliminación de hasta el 97,5% para el proceso de bioestimulación el cual
operó bajo las siguientes concentraciones de nutrientes NaCl 0.001 g/L; MgSO4 • 7H2O
0.006 g/L; CaCl2 0.002 g/L; NH4)2SO4 1 g/L; KH2PO4 5 g/L; FeCl3 • 6H2O 1 g/L;
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
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(NH4)2PO4 0.01 g/L; NH4Cl 0.25 g/L; KH2NH3 1.065 g/L; FeSO4 0.1 g/L; NH4NO3 0.5
g/L. Las desviaciones estándar se mantuvieron generalmente por debajo del 10%, así
mismo el análisis estadístico se realizó mediante un método no paramétrico, Kruskal-Wallis
con un α=0.05. Una vez identificada la concentración de nutrientes que maximiza la
degradación se puede optimizar los parámetros de operación que conducen a la remediación
de un suelo contaminado con hidrocarburos intemperizados.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
xviii
ABSTRACT
Over the span of decades repeated oil spills throughout southwestern region of Mexico
have caused significant environmental damage. Petroleum based hydrocarbons are of a
heavy fraction composition and considered persistent compounds. Depending on their
chemical structure these weathered soil hydrocarbons are complex and are resistant to
degradation. Traditional mitigation methods such as incineration or involve excavation and
causing significant environmental damage to the fragile coastal ecosystems, as some
physicochemical remediation processes alter the soil s properties and may require the
implementation of toxic pollutants. In addition, due to coastal soil s unique composition,
most remediation methods are not feasible for use. The lack of environmentally compatible
remediation processes has resulted in an increasing number of spill sites.
The objective of this study is to improve the biochemistry of weathered hydrocarbon
contaminated soil samples taken from a spill site named Agua Dulce, located in the
southwestern region of Veracruz. The experimental design is based on the Plackett-Burman
method to identify the significant variables involved with biodegradation process of
persistent hydrocarbons including source of nutrients, aeration, moisture and others. In
addition, the soil samples physicochemical parameters were measured to replicate
remediation technologies which implement bio-stimulation and bioventing.
In this study the two remediation techniques were performed implementing a native
consortium adapted to soil contaminated with persistent hydrocarbons. The calculation of
the quantifying total prior to the introduction of the hydrocarbons was performed before
and after the treatment, to identify the relationship between microbial growth and the
reduction of heavy fraction hydrocarbons (HFH). Because nutrient is a factor that increase
hydrocarbon availability was obtained the best combination of nutrients degraded as much
HFH selected a time of 28 days, which along with the other measured variables, showed a
percentage removal of up to 97.5 % in the bio-stimulation process which operated with the
followed nutrients NaCl 0.001 g/L; MgSO4 • 7H2O 0.006 g/L; CaCl2 0.002 g/L; NH4)2SO4
1 g/L; KH2PO4 5 g/L; FeCl3 • 6H2O 1 g/L; (NH4)2PO4 0.01 g/L; NH4Cl 0.25 g/L; KH2NH3
1.065 g/L; FeSO4 0.1 g/L; NH4NO3 0.5 g/L. The standard deviations were generally lower
than 10%. The non-parametric statistical analysis was carried out by Kruskal-Wallis
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BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
xix
method obtaining an α=0.05. Once identified the best combination of nutrients is possible
to optimize the operational parameters to remediate a contaminated soil with weathered
hydrocarbons.
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Marco Teórico
1.1.1 El suelo
El suelo está integrado por rocas de diferentes tamaños, sustancias de origen orgánico e
inorgánico, aire, agua y organismos vivos. Estos elementos están organizados en partículas
que establecen relaciones topográficas precisas de acuerdo a su tamaño, y ello da lugar a
formación de espacios que se comunican entre sí, como son los poros o canales, que pueden
estar ocupados con aire y agua, estos espacios a su vez, albergan diferentes especies
microbianas tales como bacterias, levaduras y hongos los cuales desempeñan funciones
específicas. El suelo está compuesto por la fase sólida, fase mineral, fase orgánica, fase
líquida y fase gaseosa; y como consecuencia este presenta determinadas propiedades que
determinan su naturaleza (Scragg, 2001).
Las propiedades físicas, químicas y mineralógicas del suelo determinan las características y
la productividad de los mismos; conocerlas permite un mejor desarrollo actividades en él.
Algunas de las propiedades de los suelos son:
Plasticidad: Es la propiedad de los materiales en las que existen las deformaciones sin
rebote; es decir, no hay variación volumétrica y no se desmorona ni se agrieta.
Compresibilidad: Es la capacidad de los suelos para ocasionar una deformación de sus
partículas sin perder sus propiedades por unidad de área.
Resistencia: Fuerza de oposición a la deformación en los suelos.
Permeabilidad: Facilidad de transporte de fluidos dentro de una matriz sólida por unidad de
tiempo; en los suelos esta propiedad se rige por el tamaño de las partículas de los suelos, así
como su separación entre las mismas.
Porosidad: Es la capacidad de un material de absorber en su superficie líquidos o gases.
(García Rivero, 2003)
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2
La fracción orgánica de los suelos contaminados se muestra como un polímero
tridimensional compuesto por hidrocarburos aromáticos y alifáticos con cadenas laterales y
compuestos polares. La presencia de esta fracción orgánica mejora la adhesión de partículas
produciendo suelos con estructuras más estables. Entre más contenido orgánico exista en un
suelo, también será mayor la porosidad, por lo que a los contaminantes exógenos como
metales o hidrocarburos, les será más fácil adherirse a estos (García Rivero, 2003).
En la figura 1 se muestra un gráfico con la clasificación de los tipos texturales de suelos, de
acuerdo a su porcentaje de arcilla, arena y limo.
Figura 1. Clasificación de las clases texturales del suelo. El suelo franco arcilloso, objeto
del estudio de este trabajo se encuentra en el centro de la pirámide (Ibáñez Asensio et al.,
2010).
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3
1.1.2 Hidrocarburos y petróleo
El petróleo es una mezcla de hidrocarburos, conformados por átomos de diferentes
elementos como carbono (C), hidrógeno (H), nitrógeno (N), azufre (S), oxígeno (O), y otros
metales. Es un compuesto de origen orgánico, menos denso que el agua y con un olor fuerte
y característico. Regularmente se utiliza el término «crudo» para denominar el petróleo que
no tiene algún tratamiento (Huang et al., 2004).
Los hidrocarburos componen la familia más importante de compuestos presentes dentro del
crudo del petróleo, por lo que son los principales responsables de la contaminación
ambiental en suelos, aguas y organismos ((SENER), 2014). El tipo de crudo del petróleo
está determinado por el contenido de los hidrocarburos en él, y estos a su vez tienen
distintas subdivisiones: saturados, aromáticos, resinas y asfáltenos, tal como lo muestra la
Tabla 1 (Hager R. Ali, 2012). Algunas de las estructuras principales se muestran en la
figura 2.
Tabla 1.Composición de las fracciones químicas del crudo del petróleo. En la tabla se
muestran algunos ejemplos de los compuestos en las fracciones indicadas (Viñas Canals,
2005).
Fracción del hidrocarburo Composición
Saturada n-alcanos, alcanos de cadena ramificada, isoprenoides,
cicloparafinas y cicloalcanos.
Aromática Hidrocarburos monoaromáticos, diaromáticos, aromáticos
policíclicos (HAP)
Resinas Pirolinas, quinolinas, carbazoles, tiofenos, sulfóxidos y
amidas
Asfáltenos Agregados de HAPs, sulfuros, metaloporfirinas, fenoles y
ácidos grasos.
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BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
4
Figura 2. Estructuras de las diferentes clases de hidrocarburos. Los hidrocarburos de mayor
presencia en suelos son los aromáticos y asfáltenos (Viñas Canals, 2005).
1.1.2.1 Fracción saturada de los hidrocarburos
Los hidrocarburos saturados o alifáticos son aquellos que en su estructura química no
poseen dobles enlaces. Están divididos en función de su estructura química en alcanos o
parafinas y cicloalcanos o naftalenos. Los alcanos a su vez tienen subdivisiones de acuerdo
a las ramificaciones en su estructura lineal; ya sea que contengan un anillo de átomos de
carbono, o que presenten sustituyentes de tipo alquilo a lo largo de su estructura lineal, tal
como se muestra en la figura 3. (Harayama et al., 1999).
Figura 3. Ejemplos de hidrocarburos saturados que forman parte de la mezcla de
hidrocarburos presente en el petróleo. Se presentan las estructuras más simples y las más
comunes encontradas en los suelos contaminados (Harayama et al., 1999).
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5
1.1.2.2 Hidrocarburos aromáticos
Los hidrocarburos aromáticos son aquellos que poseen uno o más anillos aromáticos, y
pueden tener como sustituyentes radicales alquilo. El petróleo incluye compuestos que
poseen de uno a cinco anillos aromáticos. Estos compuestos son muchos más estables que
los cicloalcanos, debido a que comparten sus electrones. El benceno es el más simple de
estos compuestos aromáticos, junto al tolueno y el xileno. Sin embargo, estos primeros al
ser los más presentes y solubles en el agua, son indicadores de contaminación en suelos y
aguas (E. Schroeder et al., 2000).
Los hidrocarburos poliaromáticos (PAH), como el antraceno y fenantreno, surgen de los
diversos procesos industriales a los que el crudo del petróleo es sometido. Generalmente
son poco solubles en agua, y debido al alto peso molecular que poseen, son menos volátiles
y solubles que los hidrocarburos mono y diaromáticos (Largo Pereda, 2014).
Figura 4. Ejemplos de los hidrocarburos principales presentes en la fracción aromática del
petróleo. Todos estos compuestos por su estructura, son los más difíciles de degradar a
moléculas más simples (Viñas Canals, 2005).
1.1.2.3 Resinas y asfáltenos
La fracción del crudo conocida como resinas y asfáltenos, a diferencia de otros compuestos
presentes en los hidrocarburos, contiene compuestos polares no hidrocarbonados. Los
compuestos en general contienen nitrógeno, azufre y oxígeno en altas cantidades. Los
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6
pesos moleculares de estos compuestos oscilan entre 600 y 200,000 g/Mol. Sus estructuras
moleculares son altamente complejas; pueden poseer una gran cantidad de anillos
aromáticos, además de estructuras acíclicas y heterocíclicas unidas a la cadena
hidrocarbonada (Murgich et al., 1999). Son compuestos recalcitrantes, y debido a su
insolubilidad, y a su alto peso molecular propiciado por sus grupos funcionales unidos,
están protegidos de ataques microbianos, siendo casi imposibles de degradar (Eweis et al.,
1999).
Para diferenciar entre resinas y asfáltenos, se utiliza el parámetro de la solubilidad en
disolventes similares al n-heptano. La diferencia radica en la solubilidad de las resinas
sobre los asfáltenos en estos compuestos (Harayama et al., 1999).
Figura 5. Ejemplos de estructuras de asfáltenos (izquierda) y resinas (derecha). Como se
observa, los asfáltenos son estructuras más complejas químicamente debido a la unión de
anillos bencénicos y por tanto más insolubles (Harayama et al., 1999).
1.1.3 Clases de petróleo
Las clases de petróleo se diferencian de acuerdo a su volatilidad y su composición de
elementos. Al calentarse el petróleo se volatilizan los hidrocarburos ligeros (de estructura
química sencilla y bajo peso molecular, mientras que los componentes más pesados tienden
a acumularse en la superficie del suelo debido a su persistencia (Benavides-López et al.,
2006).
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7
Los hidrocarburos están clasificados de acuerdo a su gravedad API (parámetro
internacional del American Petroleum Institute), que diferencia las calidades del crudo. Los
grados API se definen como:
°API = (Ecuación 1)
Donde Sg es la gravedad específica a 60 °F.
En México se producen tres tipos de petróleo crudo: Olmeca, Istmo y Maya. La diferencia
entre estos crudos estriba en su densidad y el contenido de azufre. El crudo Olmeca y el
Istmo están clasificados como superligero y ligero, respectivamente; mientras que el crudo
Maya está clasificado como un crudo pesado, con una densidad de 1.0 a 0.92 g/cm3 y un
contenido mínimo de azufre de 3.3 %, como la tabla 2 muestra (Beltrán-Paz et al., 2006).
Tabla 2. Clasificación del crudo según el API (American Petroleum Institute) En el caso del
crudo maya, de acuerdo a su clasificación en grados API se considera medio, sin embargo
la cantidad de azufre que contiene lo posiciona como un crudo pesado (Castillo Gómez,
2014).
Crudo Tipo de
crudo
° API Densidad
(kg/m3)
% (S)
Istmo Ligero > 31.1 <870 1.45
Maya Medio 22.3 – 31.1 870 – 920 3.3
Pánuco Pesado 10 – 22.3 920 – 1000 3.0
Olmeca Extrapesado <10 >1000 0.8
Aunque de manera general México produce tres tipos de crudo, el Maya constituye casi un
50% de la producción, por lo que es el suelo contaminado es común encontrar una alta
concentración de asfáltenos. En la tabla 3 se muestran algunas de las propiedades del crudo
Maya, donde se observa un alto contenido de S, Vanadio (V), Níquel (N), entre otros
compuestos, los cuales aumentan la viscosidad del crudo propiciando la recalcitrancia y
dificulta su biodegradación.
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BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
8
Tabla 3. Características generales del crudo Maya (Centeno et al., 2004).
Variable Valor
Peso específico
Gravedad API
0.9220
21.51
Análisis elemental (% en peso) Valor
Carbono
Hidrógeno
Oxígeno
Azufre
Nitrógeno
83.96
11.80
0.34
3.51
0.36
Metales, partes por millón (ppm) Valor
Níquel
Vanadio
53
292
Una alternativa para mejorar la biodisponibilidad de los hidrocarburos es el empleo de un
consorcio previamente adaptado a la fracción pesada del crudo Maya, el cual puede ser
empleado simultáneamente con un balance adecuado de nutrientes y oxígeno para
incrementar el potencial de degradación de los hidrocarburos intemperizados. Los
subproductos de la biodegradación: ácidos carboxílicos, biopolímeros, CO2, H2O, entre
otros mejoraran la biodisponibilidad de los hidrocarburos fuertemente sorbidos en el suelo
por fuerzas electrostáticas o de naturaleza química (Díaz-Ramírez et al., 2003).
1.1.4 Contaminación de los suelos por hidrocarburos
La contaminación de los suelos es un problema que ha tomado importancia a lo largo de las
últimas décadas, ya que el crecimiento de la población, así como el de los sectores
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9
industriales y las tecnologías para obtener recursos han sobreexplotado y deteriorado los
horizontes edafológicos. Uso de fertilizantes, pesticidas, depósito de metales, y derrames de
hidrocarburos son las principales vertientes de este problema.
La contaminación de los suelos se clasifica de acuerdo a su origen en endógena y exógena.
La contaminación endógena se produce por la acumulación o aumento de toxicidad en los
elementos presentes del suelo. La contaminación exógena es consecuencia de actividades
relacionadas con procesos en donde el ser humano influye, y es la más grave, ya que puede
llegarse a modificar la matriz misma del suelo en cuestión (Alba-López, 2011). En ambos
aspectos la biodisponibilidad de los compuestos disminuye.
En el suelo, los hidrocarburos impiden el intercambio gaseoso con la atmósfera, e inician
una serie de procesos físico-químicos simultáneos, tales como evaporación y penetración.
De acuerdo al tipo de hidrocarburo, así como a características edafológicas tales como
temperatura, textura humedad, cantidad de suelo contaminado, entre otros, el daño
toxicológico es variable (Benavides-López et al., 2006). Los suelos contaminados tienden a
aumentar su grado de salinidad, lo que dificulta más su tratamiento. Debido a que altos
gradientes de salinidad en un suelo pueden destruir la estructura terciaria de las proteínas,
desnaturalizar enzimas y deshidratar células, lo cual es letal para la microbiota existente y
para muchos microorganismos utilizados para la biorremediación de aguas y suelos (Ortiz-
Salinas et al., 2014).
1.1.5 Suelos contaminados con hidrocarburos en México
México es uno de los países «en vías de desarrollo», y este desarrollo ha permitido una
creciente concentración de la industria petrolera. Hasta 1970 no se aplicaba ningún criterio
ambiental para los procesos derivados del petróleo como extracción, refinación y
distribución. La infraestructura petrolera está integrada por pozos petroleros, baterías de
separación, complejos procesadores de gas, centrales de almacenamiento y bombeo, un
sistema de ductos que recorre las principales refinerías del país y presas para el
confinamiento de desechos procedentes de las operaciones petroleras (Ortínez-Brito et al.,
2009).
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BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
10
A mediados de la década de los 70, hubo una reestructuración masiva de la industria
petrolera, ya que la industria petroquímica se convirtió en uno de los motores del
crecimiento a futuro en México, aunque también se convirtió en una fuente de
contaminación, aunado a la producción de otras sustancias industriales (Quadri, 1994).
Desde esta época, se comenzó el explotamiento de diferentes zonas del país donde se
encontraban yacimientos petroleros, sin tomarse las precauciones adecuadas y causando
una contaminación casi irreversible. Hasta nuestros días, estos sitios no han sido
remediados, ya que muchos han sido olvidados debido a que se encuentran en zonas de
difícil acceso, como ecosistemas pantanosos.
Cuando hay derrames de hidrocarburos en el suelo, se generan «plumas de contaminación»,
donde el petróleo derramado se mueve hacia las capas subyacentes del suelo, contaminando
los mantos freáticos que se encuentran debajo del mismo, como se explica en la figura 6
(Cortón et al., 2006).
Figura 6. Pluma típica de contaminación en suelos por la acción de hidrocarburos. Se
observan los fenómenos que rigen los suelos intemperizados (Cortón et al., 2006).
Recientemente, no se tenía conocimiento sobre el verdadero daño que sufre el suelo al ser
contaminado por diferentes sustancias y desechos industriales. Los hidrocarburos son
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BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
11
elementos que pueden permanecer durante mucho tiempo en el suelo, y causar graves e
irreversibles daños al perfil edafológico.
En tiempos recientes, se han evaluado diferentes tecnologías para la evaluación, tratamiento
y remediación de los suelos contaminados con hidrocarburos, en las diferentes áreas
geográficas de México y el mundo donde existe este problema de contaminación. Se busca
mejorar el éxito de los métodos ya conocidos y la implementación de nuevas alternativas,
siempre que no causen un daño mayor al que están tratando de mitigar y evaluando los
costos de operación.
1.1.6 Clasificación de las tecnologías de remediación de suelos
Las tecnologías para la remediación de suelos se clasifican de acuerdo a los siguientes
principios: estrategia de remediación, lugar en el que se realiza el proceso de remediación y
tipo de tratamiento (De La Rosa-Pérez et al., 2007).
1.1.6.1 Estrategia de remediación.
Para remediar los suelos contaminados, según la bibliografía, existen 3 estrategias básicas:
a) Destrucción o modificación de los contaminantes.
b) Extracción o separación.
c) Aislamiento e identificación de los contaminantes.
(De La Rosa-Pérez et al., 2007)
1.1.6.2 Lugar donde se realiza el proceso de remediación.
De acuerdo a esta clasificación, existen dos maneras de realizar el proceso de remediación
edafológica:
a) In situ. Estos procesos se realizan en el sitio donde se encuentra el problema de
contaminación sin la necesidad de excavar, remover o trasladar el suelo.
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12
b) Ex situ. Estos procesos se realizan fuera del sitio original del suelo; es decir, hay
que realizar procesos de excavación, remoción, dragado o cualquier otro para
realizar la remediación. Posteriormente el suelo es retornado a su sitio original.
(Granda Laso, 2012)
Como indica la Tabla 4, existen algunas ventajas y desventajas de acuerdo al lugar en el
que se realice la biorremediación.
Tabla 4. Ventajas y desventajas de las tecnologías de remediación in situ y ex situ. Aunque
el lugar de remediación es un factor importante, el tipo de tratamiento es el que define la
estrategia más adecuada para la remediación (Alba-López, 2011).
Tipo de
remediación
Ventajas Desventajas
In situ Tratamiento del suelo sin
necesidad de transporte.
Tiempo mayor de tratamiento.
No muestran un comportamiento
homogéneo, no se puede muestrear
periódicamente
Menor costo de remediación.
Ex situ Menor tiempo de tratamiento. Necesidad de remoción y
tratamiento previo.
Mayores costos de operación.
Es posible homogeneizar y
estandarizar el proceso.
Se debe considerar la
manipulación del material y la
exposición al contaminante.
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BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
13
1.1.6.3 Tipo de tratamiento
De acuerdo a los principio de acción, o a la naturaleza de los procesos que tienen lugar en
los suelos, se pueden clasificar las tecnologías de remediación en físicoquímicos, térmicos
y biológicos, y en la Tabla 5 se explican sus ventajas y desventajas.
a) Tratamientos fisicoquímicos. Estos tratamientos basan su principio en el uso de
procesos físicos, químicos o de manera combinada. Utilizan propiedades de los
contaminantes como su densidad y volatilidad, así como procesos químicos como
adición de solventes o transformación de componentes a radicales más libres y más
disponibles, para así ser separados de la matriz del suelo y descontaminarlo
(Coulier-Brasero et al., 2004).
b) Tratamientos biológicos. Los procesos biológicos en la degradación de los
hidrocarburos usan componentes y otros residuos orgánicos como fuente de
carbono. De esta manera, los compuestos muy difíciles de remover o recalcitrantes,
son degradados a estructuras más simples por la acción de estos (Coulier-Brasero et
al., 2004).
c) Tratamientos térmicos. Estos tratamientos permiten la inmovilización, eliminación o
transformación de los contaminantes contenidos en los suelos mediante el aporte de
energía usada como calor. Pueden aumentar la volatilidad de los compuestos e
incluso, si se someten a temperaturas extremas, incinerarlos(Coulier-Brasero et al.,
2004).
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BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
14
Tabla 5. Comparación de los tipos de tratamientos de remediación de suelos. En él se
muestran. La comparación se basa en efectos hacia el ambiente y costo (Alba-López, 2011).
Tratamiento Ventajas Desventajas
Fisicoquímico Costo moderado.
Tiempos de operación
relativamente cortos.
Modificación de propiedades
fisicoquímicas del suelo tratado.
Uso de procesos para separar los
componentes.
Biológico Pocos recursos y costo
moderado.
No genera residuos tóxicos o
subproductos.
Precisa mantener condiciones
favorables durante todo el
proceso.
Tiempo prolongado de reacción.
Térmico Tiempos de remoción cortos.
Ideal para emergencias
ambientales.
Elimina contaminantes con alto
peso molecular.
Costos de operación muy altos.
Genera elementos muy tóxicos.
Condiciones de operación muy
controladas.
La figura 7 muestra las principales técnicas de remediación en base a su clasificación, que
son los métodos biológicos, fisicoquímicos y térmicos, mientras que la figura 8 establece
una relación costo-tiempo entre las tecnologías de remediación más utilizadas para suelos
contaminados.
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15
Figura 7. Clasificación de las técnicas de remediación para suelos contaminados según su
tipo. La clasificación de la Tabla 6 solo se aprecia en las técnicas biológicas, por ser más
usada en estas (Martınez-Prado et al., 2014).
Excavación
Incineración
Choque térmico
Lavado de suelos
Biosuspensión en reactores Composteo
Bioventeo
Bioestimulación
Parceleo (Landfarming)
Mejoramiento de la rizósfera Hielo-deshielo
Tiempo
Figura 8. Relación costo-tiempo entre algunos de los métodos de remediación de suelos.
Los métodos de bioestimulación y bioventeo se encuentran en el centro de la gráfica
(Reynolds et al., 1997).
Técnicas de remediación
Biológicas
Biorremediación
In situ
Bioventeo Bioestimulación Bioaumentación
Land farming Fitorremediación
Ex situ
Fase sólida Biorremediaci
ón por composteo
Biorreactores
Fisicoquímicas
Electroremediación
Extracción de vapor
Lavado de suelos Extracción con
solventes Inundación de
suelos Solidificación Estabilización Tratamientos
químicos Separación física
Térmicas
Desorción térmica
Incineración Vidrificación
Pirólisis
Cost
o
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16
1.1.7 Intemperización y biodisponibilidad
En las áreas edafológicas donde ocurren los derrames de hidrocarburos y que no se tratan
de manera rápida ocurren diferentes procesos; por una parte, los hidrocarburos de fracción
más ligera se eliminan del suelo por procesos naturales como volatilización, mineralización
(transformación a CO2 y agua) y biodegradación de componentes simples. Sin embargo,
aquello hidrocarburos de fracción pesada o con anillos aromáticos abundantes como los
PAH, permanecen y se vuelven recalcitrantes mientras el suelo se «intemperiza» (Teutli-
León et al., 2003).
Para aquellos suelos intemperizados, la remediación se somete a condiciones como el tipo
de hidrocarburos presentes, el grado de impregnación y la concentración de contaminantes
en el suelo. Entre más tiempo de residencia tenga un contaminante en el suelo, se hace
menos disponible a la acción de los microorganismos. De esta manera, se puede definir la
biodisponibilidad como la facilidad relativa con la que un compuesto puede ser usado,
transformado o degradado por los microorganismos nativos presentes en el suelo, y se
entiende como el efecto neto entre la desorción y la biodegradación.(García Rivero, 2003).
En la figura 8 se observa como los fenómenos de transferencia de masa rigen los procesos
de biodisponibilidad de las moléculas en la matriz del suelo.
Figura 9. Representación de los eventos que rigen la biodisponibilidad de las moléculas
contaminantes. El símbolo (●) representa las partículas de hidrocarburo dentro del suelo.
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17
1.1.8 Biorremediación
Se entiende como biorremediación el uso de técnicas que utilizan organismos vivos
(plantas, hongos, microorganismos, etc.) para degradar, remover o transformar compuestos
orgánicos muy tóxicos a moléculas y productos metabólicos más simples. Esta alternativa
de remediación de suelos depende del metabolismo de los organismos presentes en él, ya
que estos deben usar todos aquellos contaminantes (hidrocarburos) como fuente de carbono
y energía (Marks et al., 1994).
La meta final de la biodegradación de los hidrocarburos es su mineralización y su
transformación a formas inorgánicas de elementos comunes como N, S y P. Y aunque no
todos los compuestos derivados del petróleo son susceptibles a la biodegradación, se tiene
en la literatura que los procesos de biorremediación se han usado exitosamente para el
tratamiento de suelos y lodos contaminados con HTPs (Hidrocarburos Totales del
Petróleo), solventes, pesticidas, clorofenoles, explosivos y HAP’s (Semple et al., 2001).
1.1.8.1 Bioestimulación y Bioventeo
Como ya se ha mencionado antes, en los suelos contaminados con hidrocarburos
intemperizados, es necesario promover la desorción de estos mediante la aplicación de uno
o más pretratamientos antes de realizar un proceso de biorremediación (Pollard et al.,
1994). Algunas de las tecnologías que se han aplicado para desorber contaminantes
hidrofóbicos de suelos son: el uso de solventes no polares (tolueno), el uso de surfactantes
no iónicos y la aplicación de tratamientos electroquímicos (Ko et al., 2000). El objetivo de
estos procesos es la biodegradación de hidrocarburos persistentes, que consisten en alterar
las propiedades fisicoquímicas del suelo, con la finalidad de aumentar la porosidad y
movilidad de los hidrocarburos para su posterior desplazamiento de los contaminantes. En
general, para utilizar solventes, se requiere un tratamiento previo del suelo con una alta
cantidad de materia orgánica (Volke Sepúlveda et al., 2002).
Sin embargo, estas tecnologías lejos de proveer una solución para la contaminación,
generan un costo elevado y un suelo completamente modificado en propiedades y
estructura. Afortunadamente, existen procesos biológicos que tienen un costo
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BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
18
considerablemente bajo, además de no generar alguna modificación en las propiedades del
suelo, ni generación de subproductos tóxicos.
La bioestimulación es el método de biorremediación más empleado para reducir la
concentración de contaminantes en el suelo (Cunningham et al., 2000). En este proceso, la
actividad natural de los microorganismos presentes en el suelo contaminado es estimulada
por la adición de soluciones con nutrientes al suelo, así como oxígeno u otro aceptor de
electrones (Gómez et al., 2009). Este proceso busca incrementar los fenómenos de
transferencia de masa en el suelo, donde los compuestos que se encuentran en la fase sólida
como los hidrocarburos hidrofóbicos y algunas sales puedan incorporarse a la fase líquida y
convertirse en compuestos biodisponibles.
El bioventeo es el tratamiento in situ comúnmente empleado en la remoción de
hidrocarburos de fracción ligera; sin embargo también se ha estudiado su aplicación en
compuestos más complejos. El bioventeo emplea flujos de aire bajos y provee sólo el
oxígeno necesario para la biodegradación de los contaminantes mientras minimiza su
volatilización (Maheshwari et al., 2014). Aunque es un método relativamente simple, de
gran eficiencia, tiene menor costo que otras tecnologías y no altera con significancia el
suelo que trata, su desventaja radica en el tiempo tan prolongado de acción para lograr una
eficiente biodegradación de los hidrocarburos (Magalhães et al., 2009).
1.1.9 Rutas de biodegradación
Los compuestos petroquímicos y sus derivados, como los hidrocarburos, PAHs y BTEX
(Benceno, Tolueno, Etilbenceno y Xileno), regularmente son degradados por los
microorganismos presentes en el suelo, que los utilizan como fuente de energía para sus
compuestos metabólicos (Scragg, 2001). Ya que los hidrocarburos son compuestos
estables, su degradación ocurre regularmente mediante procesos aerobios; los hidrocarburos
alifáticos se convierten en alcoholes para posteriormente ser oxidados a ácidos carboxílicos
que entran en la β-oxidación (Cerniglia, 1993).
En el caso específico del benceno, que es un compuesto aromático monocíclico, es
hidroxilado a cis-1,2-dihidroxi-1,2-dihidrobenceno por una enzima dioxigenasa, para
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
19
Hidrocarburos
Aromáticos
Policíclicos
(PAHs)
Bacterias
Algas
Hongos
Algas
Citocromo p
450/metano
monooxigenasa
después convertirse a catecol. A su vez, este compuesto puede seguir dos rutas, como se
muestra en la Figura 9: escisión en orto, que da lugar a cis, cis-muconato, y escisión en
meta, transformándolo en semialdehído 2-hidroximucónico. Ambas rutas generan
compuestos que pueden entrar en el ciclo de Krebs, y ser degradados posteriormente
(Scragg, 2001). Se tomó el benceno como ejemplo, ya que los primeros dos pasos de su
degradación son comunes en la degradación de la mayoría de los hidrocarburos aromáticos
mono y policíclicos.
H
H
OH
OH
OH
H
H
OH
OH
OH
OH
COOH
COOH
COOHCHO
OH
H-
H
H
O
Figura 10. Pasos iniciales en la degradación de PAHs por hongos, bacterias y algas. Estas
estructuras degradadas pueden entrar en procesos metabólicos como la β-oxidación
(Cerniglia, 1993).
Óxido de areno
Reorganización
no enzimática
Epóxido
hidrolasa
Fenol
trans- Dihidrodiol
Quinona PAH Escisión del anillo
Dioxigenasa
Deshidrogenasa
Escisión en orto
Escisión en meta
Ácido cis, cis-
mucónico
Semialdehído 2-
hidroximucónico
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
20
Aunque la biorremediación en suelos ocurre regularmente y es recomendada en
condiciones aeróbicas, no siempre se puede mantener el suelo en condiciones óptimas para
este proceso debido a la cantidad de agua presente, el taponamiento de los poros del suelo,
y la estructura de las partículas que conforman el horizonte del suelo. Los hidrocarburos
aromáticos monocíclicos, policíclicos y alifáticos, algunos asfáltenos y otros derivados del
petróleo pueden ser degradados anaeróbicamente, siempre que puedan obtener oxígeno; del
agua mediante metanogénesis, de los nitratos bajo condiciones nitrificantes y de los sulfatos
mediante condiciones reductoras de azufre. Los hidrocarburos se transforman en
intermediarios fácilmente acoplables al ciclo de Krebs. Sin embargo, la gran desventaja de
este proceso es su lentitud, en comparación a la biodegradación bajo condiciones aeróbicas
(Switzenbaum, 1995).
Se han observado características únicas en la degradación de los hidrocarburos de distintos
pesos moleculares, así como de otras moléculas orgánicas. Una de ellas es la capacidad de
algunas enzimas para utilizar diferentes sustratos a los que utilizan regularmente, llamada
metabolismo gratuito, probablemente resultado de la alta especificidad de la enzima.
Contrariamente, aunque algunas enzimas sean altamente específicas, son imprecisas, a tal
punto de metabolizar sustratos que no proporcionan ningún beneficio al compuesto. Esta
condición se denomina co-metabolismo (Semprini, 1997).
1.2 Antecedentes
1.2.1 El sureste mexicano y la contaminación de los suelos
En el sureste mexicano se encuentran un sinnúmero de sitios con diferentes niveles de
impacto ambiental, todos resultado de la actividad petrolera iniciada hace unos 60 años por
parte del gobierno mexicano. A mediados de la década de los 70s, se comenzó a tomar
conciencia que la actividad petrolera en las zonas costeras estaba dañando no solo al suelo,
si no al agua, flora y fauna al ser en estos sitios los principales lugares de extracción,
refinación y transporte del crudo, como consecuencia ha cambiado considerablemente las
características del suelo (R. H. A. Schroeder et al., 1999), hasta el día de hoy los efectos
negativos por la acumulación de hidrocarburos altamente persistentes ha incrementado.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
21
Se han realizado estudios en cuanto a la biodisponibilidad y aprovechamiento de los
hidrocarburos intemperizados en los suelos costeros contaminados, así como los efectos de
las altas concentraciones de los mismos para la microbiota y para el ecosistema en general.
Debido a esto se emplearon métodos tradicionales durante muchos años (excavación,
incineración), para alcanzar la efectividad y el mejoramiento de las condiciones del suelo
contaminado; sin embargo, no han funcionado exitosamente en lugares inaccesibles donde
maquinaria pesada no puede emplearse y los métodos químicos ocasionan graves daños al
ecosistema. Ante esta situación las demandas en cuanto al desarrollo de tecnologías de
remediación de suelos por parte de PEMEX y el IMP (Instituto Mexicano del Petróleo) es
la apuesta a tecnologías alternativas y amigables como la biorremediación(Zavala et al.,
2002).
1.2.2 Suelo contaminado en Veracruz
El estado de Veracruz ha sido afectado por derrames petroleros, donde los suelos han
alcanzado concentraciones hasta 450 000 ppm de HTPs (Sepúlveda, 2003). La acumulación
de estos hidrocarburos en el suelo por largos periodos de tiempo, da lugar a hidrocarburos
intemperizados, que son más difíciles de remover por los métodos convencionales debido a
los factores físicos, químicos e hidrogeológicos de los suelos costeros (temperatura,
humedad, pH, mineralización del suelo, etcétera). Existe poca información acerca de los
mecanismos físicos, químicos y biológicos de los hidrocarburos intemperizados, que
conducen a su biodegradación. Estas estructuras tienen una alto contenido de heteroátomos
como azufre, nitrógeno, vanadio, níquel, entre otros siendo la fracción asfalténica la más
persistente en los suelos, así mismo la recalcitrancia de estos inhiben la degradación de
hidrocarburos policílicos aromáticos (HAPs) (García-Bautista et al., 2012).
1.3 Descripción del problema
Agua Dulce, municipio del estado de Veracruz, se encuentra al suroeste del estado con
vertientes principales hacia el Golfo de México, y colinda con el estado de Tabasco. Posee
una actividad urbana tranquila y en sus actividades principales destacan la agricultura y el
pastoreo ((INEGI), 2014).
Si bien Agua Dulce no es un municipio con una intensa actividad petrolera, se encuentra en
el centro de la actividad petrolera más importante del territorio mexicano. Como se aprecia
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
22
más adelante (Figura 11), el territorio comprendido de Agua Dulce limita con las zonas de
Minatitlán y Coatzacoalcos, donde se concentra el 98 % de la actividad petrolera básica de
todo el país, con una superficie ocupada total de 2,282 hectáreas (Fernández et al., 2013).
Figura 11. Localización geográfica de Agua Dulce, Veracruz. Los municipios aledaños
(Minatitlán y Coatzacoalcos) a la izquierda, son los principales actores en procesos
petroquímicos.
Debido a los procesos relacionados con la actividad petrolera como la extracción,
refinación y transporte del petróleo y sus derivados en esta zona, se han encontrado
recientemente índices graves de contaminación en aguas y suelos, por lo que es necesaria
una estrategia para la remediación de los ecosistemas.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
23
2. JUSTIFICACIÓN
El incremento de la biodisponibilidad de los hidrocarburos en suelos mediante procesos
biológicos es una alternativa frente a los tratamientos físicos o mecánicos como la
incineración y excavación que se han implementado durante décadas en nuestro país.
Dichos tratamientos además de ser costosos, generan una contaminación muchas veces
mayor que la que están tratando de remediar, por ejemplo durante la incineración donde se
emplean temperaturas a 1000°C se producen PAHs altamente carcinogénicos los cuales
afectan al ecosistema en general. La región del suroeste del país en donde se concentra la
mayor actividad petrolera de nuestro país y por tanto, es la región con un alto registro de
lugares que no han sido tratados desde hace décadas principalmente en ecosistemas
pantanosos o de difícil acceso. El tipo de ambiente extremo, la complejidad de las
propiedades fisicoquímicas del suelo dificulta la biorremediación de los suelos
contaminados con hidrocarburos intemperizados, los cuales incrementan que son altamente
recalcitrantes.
En este trabajo se propone incrementar la biodisponibilidad de los hidrocarburos
intemperizados, por lo que se estudian dos procesos: bioestimulación que es la adición de
nutrientes y agua más la adición de un consorcio previamente adaptado, y un segundo
proceso que es bioventeo que consiste en la adición de nutrientes, un flujo de aire y un
consorcio previamente adaptado. Mediante un diseño factorial fraccionado (Placket
Burman) se estudiará la búsqueda de los parámetros ideales para favorecer el desarrollo de
microbiota que tenga un sistema enzimático capaz de metabolizar los hidrocarburos
mediante el establecimiento de condiciones adecuadas de aire, nutrientes y humedad.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
24
3. HIPÓTESIS
Una combinación adecuada de sales, promueve los procesos metabólicos de los
microorganismos presentes en el suelo costero de Agua Dulce, biotransformando los
hidrocarburos de fracción pesada (HFP) a compuestos más simples; el proceso de
bioestimulación garantiza una remoción de los hidrocarburos de fracción pesada del suelo
tratado, al ser tomados como fuente de carbono por el consorcio nativo de Agua Dulce
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
25
4. OBJETIVO GENERAL
Mejorar la biodisponibilidad de los hidrocarburos intemperizados presentes en un suelo
costero para eficientizar su potencial de biodegradación mediante el proceso de
bioestimulación.
5. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Establecer concentraciones óptimas de nutrientes para maximizar la biodegradación
de los hidrocarburos intemperizados.
Evaluar la capacidad de degradación de un consorcio microbiano nativo adaptado a
hidrocarburos de fracción pesada.
Determinar la relación de propiedades fisicoquímicas del suelo a los tiempos 0, 7,
14 y 28 días para evaluar el mejoramiento del suelo contaminado con hidrocarburos
intemperizados.
Seleccionar la mejor combinación de nutrientes y condiciones para el mejoramiento
de la biodisponibilidad de los hidrocarburos utilizando bioestimulación.
Realizar estudios preliminares de biodegradación mediante bioventeo para obtener
la biodegradación de los hidrocarburos intemperizados.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
26
6. DESARROLLO EXPERIMENTAL
Este trabajo se llevó a cabo en las siguientes etapas: 1) Identificación de las condiciones de
operación de los experimentos a desarrollar a nivel laboratorio, para esto se tomaron
mediciones iniciales de las variables involucradas, se seleccionó el diseño de experimentos
Plackett- Burman, el cual permitirá conocer los efectos principales de 11 factores
(nutrientes esenciales) sobre la variable de respuesta. 2) El monitoreo de las variables de
respuesta se realizarán conforme a la normatividad, con la finalidad de observar si los
valores alcanzados al final de la experimentación se ubican dentro de los estándares
establecidos por la normatividad. 3) La obtención de las concentraciones mínimas
necesarias incrementaran el potencial de biodegradación de los hidrocarburos
intemperizados. 4) Una respuesta del mejor tratamiento se observará en un cambio de las
propiedades fisicoquímicas del suelo, como el pH, la conductividad eléctrica y humedad. 5)
Este trabajo realizó también estudios preliminares de biodegradación de hidrocarburos
adicionando una fuente de nutrientes Bushnell Haas y un flujo de aire implementados en
estudios anteriores, así mismo se aplicó el consorcio microbiano previamente caracterizado
y que contiene las siguientes especies bacterianas: Flavobacterium salisperosum,
Flavobacterium terrae, Flavobacterium saliperosum, Pseudomonas citronellolis,
Pseudomonas delhiensis, Pseudomonas knackmussisi, Ochrobacterium intermedium,
Ochrobactrum cytisi, Ochrobactrum anthrop, y Ochrobactrum tritici todas con un
porcentaje de identidad del 98 % (Jiménez-Hernández, 2014).
6.1 Caracterización fisicoquímica del suelo de Agua Dulce, Veracruz
Se tomaron muestras de suelo en el municipio de Agua Dulce, Veracruz. En las
coordenadas 17° 58’ y 18° 13’ de latitud norte; los meridianos 94° 03’ y 94° 17’ de
longitud oeste; con altitud de entre 10 y 200 m (Planeación, 2014). Este suelo pertenece en
textura al tipo franco-arcilloso. El suelo del que se tomaron las muestras pertenece al tipo
franco-arcilloso, donde al combinar dos propiedades de textura, tiene propiedades
diferentes. Mientras que un suelo arcilloso retiene mucha agua y tiene poca aireación, un
suelo franco facilita la aireación ya que su estructura granular permite interacciones y
fenómenos de transferencia de masa adecuados para el intercambio de nutrientes
(Thompson et al., 1988).
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
27
Para la caracterización de este suelo se determinaron sus principales características como el
pH, temperatura, conductividad eléctrica, capacidad de retención de agua, producción de
CO2, conteo bacteriano, espectro UV, y cuantificación de hidrocarburos de fracción pesada.
6.2 Uso de dos tecnologías para la biorremediación de suelos
Para el suelo contaminado con hidrocarburos de fracción pesada se utilizaron dos
alternativas de biorremediación. En la primera se utilizó bioestimulación; se agregó una
fuente de nutrientes más un consorcio adaptado y se simuló un ambiente húmedo para
favorecer el crecimiento de microorganismos. En la segunda alternativa, se utilizó un
proceso de bioventeo, con una cantidad de nutrientes y un flujo fijo, de manera que fuera un
ambiente adecuado para el crecimiento bacteriano.
6.2.1 Diseño de Experimentos
Un balance adecuado de nutrientes en el suelo, el contenido de humedad y el nivel de
aireación promueven la biotransformación de los hidrocarburos persistentes, por lo que se
desarrolló un diseño de experimentos para identificar qué factores son los más activos en la
biodegradación de los hidrocarburos intemperizados.
El diseño de Plackett-Burman, es un diseño de barrido que permite establecer relaciones
entre las variables de estudio y la de respuesta. Permite reducir el número de experimentos
considerablemente, al tratarse de un modelo ortogonal. La metodología se reduce a dos
niveles; uno alto y uno bajo, y el número de experimentos siempre es un múltiplo de 4. La
ventaja respecto a otros experimentos radica en la reducción de variables sin importancia
para el desarrollo del experimento, considerando sólo las que tengan significancia para el
mismo (Montgomery Douglas, 1991).
Para cada una de las metodologías propuestas en este trabajo se realizó un diseño de
experimentos factorial. Mediante el uso de las sales mostradas (Tabla 6), se realizó el
diseño obteniendo 12 medios enriquecidos para el proceso de bioestimulación, como
explica la Tabla 7. Para el proceso de bioventeo, se realizó otro diseño de experimentos
factorial en cuatro bloques. De esta manera solo se tuvieron en cuenta tres variables:
humedad, inyección de aire y nutrientes (Tabla 8); durante el proceso de bioventeo ya se
partió de una fuente de nutrientes conocida. El medio Bushnell Haas fue usado para el
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
28
aislamiento de las bacterias degradadoras de hidrocarburos (Irfan, 2011), el experimento se
realizó por duplicado invirtiendo los valores del diseño, a todas las corridas se les
adicionaron 30 mL de un consorcio adaptado proveniente del suelo contaminado.
Tabla 6. Valores propuestos para el uso de sales durante el proceso de bioestimulación. Las
sales, así como las cantidades, fueron evaluadas por distintos autores.
Compuesto Nivel alto (g/L) Nivel bajo (g/L)
a) NaCl 0.1 0.001
b) MgSO4 • 7H2O 0.5 0.006
c) CaCl2 1 0.002
d) (NH4)2SO4 1 0.2
e) KH2PO4 5 0.0094
f) FeCl3 • 6H2O 1 0.0004
g) (NH4)2PO4 2 0.01
h) NH4Cl 0.25 0.1
i) KH2NO2 1.065 0.0058
j) FeSO4 1 0.1
k) NH4NO3 0.5 0.0122
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
29
Tabla 7. Diseño de experimentos para el proceso de bioestimulación. Las letras en la tabla 7
se muestran en las columnas de esta tabla, representando las sales, mientras que los valores
1 y 0 mostrados en la tabla representan valores de los niveles altos y bajos,
respectivamente.
Experimento
/Sal
a b c d e f g h i j k
1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1
2 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0
3 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0
4 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1
5 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0
6 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0
7 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1
8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
9 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1
10 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0
11 0 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1
12 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
30
Tabla 8. Diseño de experimentos obtenido para el proceso de bioventeo. Los valores 0 y 1
establecidos en la columna de nutrientes corresponden a la adición de la fuente; el 1
representa una adición de 90 mL del medio Bushnell Hass, mientras que el 0 corresponde a
la misma cantidad pero en agua destilada.
Experimento % Humedad Inyección de aire (L/h) Nutrientes (g/L)
1 30 210 1.47
1b 40 80 0
2 30 80 1.47
2b 40 210 0
3 30 210 0
3b 40 80 1.47
4 40 210 1.47
4b 30 80 0
Aunado a los diseños de experimentos, una vez obtenidos los valores resultantes de las
variables medidas para el proceso de bioestimulación, se realizaron diferentes análisis
estadísticos. Pruebas de normalidad y homogeneidad y homoelasticidad de los datos,
posteriormente análisis de varianza (ANOVA) y pruebas de correlación de Pearson, con un
intervalo de confianza de 95 %para determinar interacciones entre los resultados.
6.3 Establecimiento de condiciones para los experimentos
Ambos tratamientos (bioestimulación y bioventeo) se encontraron las mejores condiciones
de operación gracias al diseño de experimentos Plackett-Burman, estos experimentos se
monitorearon y se tomaron muestras a los tiempos 7, 14 y 28 días.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
31
6.3.1 Establecimiento de condiciones para bioestimulación
En el caso de la bioestimulación, como anteriormente se mencionó, se simuló un ambiente
húmedo dentro de un recipiente de plástico de 2 L, añadiéndole 50 mL de agua destilada.
Cada uno de los 12 experimentos consistió en un frasco de vidrio con 30 g de suelo
contaminado, adicionando 0.7 mL del consorcio adaptado al suelo. Cada experimento se
realizó por triplicado, por lo que al final se tenían 14 recipientes: 12 recipientes con 3
frascos de vidrio, que correspondían a cada una de los experimentos obtenidos, un control
negativo con suelo contaminado estéril y un blanco con ladrillo incinerado, dando un total
de 42 frascos.
6.3.2 Establecimiento de condiciones para bioventeo
Para la realización de los experimentos usando bioventeo, se utilizó un sistema de
reactores, utilizando frascos de vidrio de 1.8 L pintados de negro, para evitar procesos de
fotooxidación. Estos frascos se diseñaron de tal manera que se permitiera la entrada de un
flujo de aire controlado utilizando un filtro fibra de vidrio Whatman, con un diámetro de
0.45 µm, marca Sigma Aldrich, adaptado en la parte posterior del frasco. Esto con la
finalidad de impedir la entrada de partículas de polvo o microorganismos. Estos frascos
contenían 300 g de suelo contaminado con hidrocarburos, un flujo de aire y una cantidad de
nutrientes determinada por el diseño de experimentos (Tabla 9) y en todos los casos se les
añadieron 30 mL del consorcio nativo del suelo contaminado.
6.4 Cuantificación de CO2
Para la cuantificación del dióxido de carbono producido durante los procesos utilizados en
este trabajo se partió de la dinámica de carbono, que usa el NaOH para el atrapamiento del
dióxido de carbono producido durante la respiración de los microorganismos. Este NaOH
se introdujo en los sistemas de bioestimulación y bioventeo en viales de 30 mL y extraídos
de los sistemas para su cuantificación a tiempos de 7, 14 y 28 días. Se tomaron alícuotas de
5 mL de los viales y fueron titulados con una solución de HCl a concentración 1 N y 0.1 N,
usando como indicadores fenolftaleína y naranja de metilo, respectivamente, este proceso
se realizó por duplicado.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
32
Para la determinación de la cantidad de dióxido de carbono producido en mg CO2/Kg suelo
se utilizó la siguiente ecuación:
(Ecuación 2).
6.5 Determinación de pH
El pH se determinó mediante la norma NOM-021-RECANAT-2004, en la que se encuentra
el método utilizado para su determinación. Se utilizó un potenciómetro modelo OAKTON
pH/Conductivity/TDS/°C/°F Meter con una relación suelo-agua de 1:2.
6.6 Determinación de humedad.
Esta característica edafológica se determinó de acuerdo a la NOM-021-SEMARNAT-2000,
el cual establece la metodología en su apartado AS-06. Se utilizó un equipo de secado
marca Sartorius MA 35, tomando una muestra de 0.5 g y registrando la humedad inicial. Se
tomó el tiempo y el porcentaje de humedad de la muestra se determinó mediante la
siguiente fórmula:
(Ecuación 3)
6.7 Determinación de conductividad eléctrica del suelo contaminado
La conductividad eléctrica del suelo contaminado se determinó mediante la NOM-021-
RECANAT-2000, por el método AS-18-2000 que explica la medición de la conductividad
y la determinación de salinidad en el suelo. Se añadió agua desionizada a una muestra de
suelo, se agitó y posteriormente se dejó reposar. Se midió la conductividad eléctrica del
sobrenadante utilizando un conductímetro HACH TDS METER.
6.8 Determinación de materia orgánica
La cantidad de materia orgánica se determinó mediante el método de Walkley y Black,
descrito en el apartado AS-07-2000 de la norma NOM-021-RECANAT-2000, basado en la
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
33
oxidación del carbono orgánico presente en el suelo usando una disolución de dicromato de
potasio (K2Cr2O7), así mismo se usa ácido sulfúrico concentrado (H2SO4) para la
generación de calor, y después se valora con sulfato ferroso (FeSO4).
6.9 Determinación de hidrocarburos totales a través de espectrofotometría UV-
Visible
Para determinar esta característica se adicionaron 10 mL de cloroformo a 5 g de suelo
contaminado, de manera que la desorción de la fracción pesada de los hidrocarburos se
realizara de una manera más eficiente. Posteriormente se siguieron las especificaciones de
la norma NMX-AA-145-SFCI-2000 y se cuantificó la fracción asfalténica resultante por
UV-visible a una longitud de onda de 408 nm, utilizando un espectrofotómetro modelo
Evolution 300, Marca Thermo Scientific. Para la realización de la curva de calibración para
la posterior medición de la fracción asfalténica se realizó a una λ= 408 nm empleando
cinco concentraciones de crudo Maya (previamente volatilizado a 250°C): 0.4, 0.12, 0.08,
0.072 y 0.04 mg/mL y absorbancia 0.435, 0.135, 0.078, 0.072, 0.037, respectivamente,
para lo cual se empleó hexano como solvente.
6.10 Determinación de hidrocarburos utilizando espectrofotometría infrarrojo
(IR).
La caracterización química del hidrocarburo se llevó a cabo utilizando un FTIR (Fourier
Transform Infrared Spectroscopy), el espectro se tomó en la región media y la técnica para
su obtención fue mediante ATR (Attenuation Total Reflactance), y se puede analizar en
fase sólida o líquida. El procedimiento se siguió de acuerdo al protocolo de Rajasekhar
(Yadav et al., 2005).
6.11 Caracterización de microorganismos presentes en el suelo contaminado.
6.11.1 Aislamiento y cultivo de microorganismos hidrocarbonoclastos en el
suelo contaminado.
El método utilizado para el aislamiento y conteo de bacterias hidrocarbonoclastas fue el
método de dilución en placa. El medio líquido para el crecimiento de las bacterias utilizó
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
34
petróleo crudo como fuente única de carbono, más las soluciones obtenidas durante el
diseño de experimentos (Tabla 8) y el medio Bushnell Hass, asegurando de esta manera el
crecimiento únicamente de bacterias hidrocarbonoclastas. Estos medios líquidos se
inocularon con un consorcio nativo previamente adaptado al suelo contaminado (Jiménez-
Hernández et al., 2013) y puesto en agitación durante 48 h a 200 rpm. Una vez transcurrido
el tiempo, se realizaron diluciones con 1 mL del hasta llegar a la concentración 10-8.
Posteriormente se inocularon 0.5 mL mediante extensión en placa en cajas Petri con agar
TSA (Soya Triptocaseína) y agar Dextrosa, por ser fuentes protéicas ideales para el rápido
crecimiento y conteo de colonias, así como su caracterización microscópica y bioquímica
(Díaz et al., 2013). Las cajas se incubaron a 38 °C durante 24 h y se procedió a realizar
observación microscópica y conteo transcurrido este tiempo.
Para la caracterización colonial por color, borde y forma se realizó el aislamiento de las
principales colonias observadas en las cajas. Estas se resembraron por duplicado y se
incubaron a 38 °C. Se verificó el crecimiento y la pureza de las cepas a las 24, 28 y 72 h
mediante la morfología de las colonias.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
35
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Para registrar los cambios en los parámetros medidos durante el experimento, se realizó una
caracterización inicial del suelo contaminado de Agua Dulce, como muestra la Tabla 9.
Tabla 9. Caracterización inicial del suelo de Agua Dulce. La mayoría de las variables
fueron determinadas mediantes normas oficiales.
Variable
Valor/Característica Método
Textura Franco arcilloso Bouyoucos G.J.(1962)
% materia orgánica 6.8 Walkley-Black (1934),
UFC/g suelo seco 1.7 x 105 Conteo en placa
pH 5.5 NOM-021-RECANAT-2004
% Humedad 33.97 NOM-021-SEMARNAT-2000
(AS-06) Conductividad eléctrica (µS/cm)
0.18 NOM-021-RECANAT-2000
(AS-18-2000)
Hidrocarburos de fracción pesada (mg/kg
suelo)
80926.4 NMX-AA-134-CFIDS-2006
Fracción media (mg/kg suelo)
400 NMX-AA-145-SCFI-2000
Asfáltenos y resinas
(mg/kg suelo)
0.0237 Britsh Standard BS4696
(1971).
7.1 Cuantificación de parámetros en el proceso de bioestimulación
7.1.1 Cuantificación de CO2.
La respiración del suelo es un proceso que refleja su actividad biológica, y se manifiesta
con el desprendimiento de CO2 resultante de las reacciones metabólicas de los
microorganismos presentes (García Izquierdo et al., 2003).
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
36
Una vez terminado el lapso de tiempo establecido para cada uno de los tratamientos en
ambos procesos, se extrajo el vial con NaOH contenido y se realizó la técnica de dinámica
de carbono (respirometría) para la cuantificación del CO2 producido.
Figura 12. Gráfico de producción de dióxido de carbono en los experimentos utilizados en
el proceso de bioestimulación. Las líneas representan la desviación estándar; los valores 1 a
12 corresponden a los experimentos, P al testigo (suelo estéril) y N al control negativo
(ladrillo incinerado).
De acuerdo a la figura 12, se aprecia que no hay una producción de CO2 en todos los
tratamientos usados; los que registran un mayor aumento progresivo en la tasa de
respiración son los experimentos 4, 9 y 12 con un valor de 132,180, 94,246 y 92107 mg
CO2/Kg suelo a los 28 días, respectivamente.
En la mayoría los experimentos el valor máximo de producción de dióxido de carbono se
alcanzó al tiempo de 28 días, salvo en el experimento 8 en el que no se agregó ninguna
combinación de nutrientes, y en el experimento 10, donde el valor máximo de este
parámetro se alcanzó al tiempo de 7 días.
Es importante considerar el rol de cada nutriente así como su tipo y concentración en el
suelo contaminado durante el tratamiento (García Araiza, 2012). Normalmente los suelos
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 P N
mg
de
CO
2/k
g su
elo
Experimentos
Cuantificación de CO2
7 días
14 días
28 días
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
37
costeros contaminados con hidrocarburos intemperizados tienen bajas cantidades de
nutrientes por los efectos de lixiviación, sin embargo, al existir un incremento de la
salinidad afecta la degradación de los nutrientes ya que no sol fácilmente adsorbidos por los
organismos, a nivel del campo (cuando hay inundación), al haber un exceso de estos puede
ocasionar eutrofización, la aparición de algas u otros microorganismos que promoverían los
procesos de anaerobiosis (R. H. A. Schroeder et al., 1999).
Figura 13. Diagrama de Pareto para sales utilizadas en el diseño de experimentos del
proceso de bioestimulación. La línea azul representa el valor mínimo para que alguna de las
sales sea estadísticamente significativa en el resultado.
Como se observa en la figura 12, las sales que conforman los diversos experimentos
utilizados para el tratamiento de bioestimulación no son factores determinantes para la
producción de CO2 en el suelo contaminado. Si bien son fuente de nutrientes, no llegan al
valor mínimo para considerarse estadísticamente significantes en el proceso, aunque de
acuerdo a la observación de la figura 13, son necesarias para las actividades metabólicas del
consorcio microbiano presente en el suelo, ya que tomando como referencia los
experimentos 4, 9 y 12 con cualquier otro utilizado en este tratamiento, se pueden apreciar
grandes diferencias en cuanto a la producción de CO2. Otros factores como el pH, el
porcentaje de humedad, la conductividad eléctrica y el contenido de materia orgánica
pueden ser los responsables de procesos metabólicos relacionados a la microbiota presente
en el suelo contaminado.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
38
7.1.2Cuantificación de pH
Para la cuantificación y medición del pH del suelo contaminado sometido a dos
tratamientos, se obtuvieron los siguientes resultados. Para el proceso de bioestimulación los
valores fluctuaron entre 6.5 y 8.25, mientras que en el proceso de bioventeo siempre se
mantuvieron por encima de 7 como mínimo.
Figura 14. Valores registrados de pH para el tratamiento del suelo usando bioestimulación.
Las líneas representan la desviación estándar; los valores 1 a 12 corresponden a los
experimentos, P al control positivo (suelo estéril) y N al control negativo (ladrillo
incinerado).
De acuerdo a la figura 14, en la mayoría d los experimentos se observó un aumento del pH,
especialmente entre los días 14 y 28, a excepción de los experimentos 1, 11 y el control
positivo que entre los días 14 y 28 tendió a acidificar por la lixiviación de nutrientes, sin
embargo esta característica fisicoquímica del suelo tiende a alterarse en función del tipo de
subproductos específicamente de los ácidos carboxílicos provenientes de la hidrólisis
durante la biotransformación de los hidrocarburos. Pero según Leahy (1990), los suelos
contaminados con hidrocarburos son ácidos, y para una óptima biodegradación de los
hidrocarburos persistentes se requiere un pH neutro entre 7.4 y 7.8. Los experimentos que
se encuentran dentro de este rango a los 28 días de iniciado el experimento son: 3, 4, 6, 9 y
10. En función del tipo de nutrientes y su concentración para cada experimento, se estimula
6
6.5
7
7.5
8
8.5
9
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 P N
Val
or
de
pH
Experimentos
pH
7 Días
14 Días
28 Días
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
39
el crecimiento de los microorganismos, aumentando la biomasa y por efecto los procesos
metabólicos relacionados con la degradación de hidrocarburos (Arrieta Ramírez, 2011).
Figura 15. Diagrama de Pareto para sales utilizadas en el diseño de experimentos del
proceso de bioestimulación. La línea azul representa el valor mínimo para que alguna de las
sales sea estadísticamente significativa en el valor obtenido de pH.
Las sales que tienen cierta significancia en los valores registrados de pH son: KH2PO4,
(NH4)2PO4, FeCl3 ∙ 6H2O y MgSO4 ∙ 7H2O. Como se observa, las principales sales que
tienen significancia en el pH contienen fósforo en forma de fosfato. El pH afecta
directamente en la solubilidad del fósforo y en el transporte de metales pesados en el suelo
(Arroyo et al., 2004), también el pH es altamente dependiente de la forma de nitrógeno
aplicada en las plantas y los suelos, mientras que en forma de NO3- alcaliniza el pH, el ión
amonio (NH4+) lo acidifica (Sas et al., 2003).
7.1.3 Cuantificación de humedad
Se realizaron cuantificaciones del porcentaje de humedad del suelo contaminado a los 7, 14
y 28 días, haciendo réplicas para validar los datos.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
40
Figura 16. Valores registrados de porcentaje de humedad para el tratamiento del suelo
usando bioestimulación. Las líneas representan la desviación estándar; los valores 1 a 12
corresponden a los experimentos, P al testigo (suelo estéril) y N al control negativo (ladrillo
incinerado).
En la figura 16 se observa una disminución del porcentaje de humedad por gramo de suelo
en todos los experimentos realizados hacia el día 14. Posteriormente se observa un
incremento del mismo para el día 28. Al principio del experimento el suelo contenía una
humedad aproximada de 77.43 %. Aunque Dibble y Bartha (1976) describieron un rango de
humedad para los procesos de biodegradación de un 30 % hasta un 90 %, Lajoie y Strom
recomendaron un rango óptimo entre el 50 y 70 % de la capacidad de campo del suelo
(Lajoie et al., 1994).
La humedad en un suelo contaminado puede ser un factor limitante en la biodegradación de
los hidrocarburos presentes, principalmente en suelos superficiales que sufran afectaciones
importantes por las oscilaciones importantes en su contenido de agua (Viñas Canals, 2005).
El porcentaje de humedad registrado al inicio del experimento fue de 77.43 %, y el menor
valor se registró en el experimento 8 al día 14, con un valor de 33.36%. El contenido
óptimo de humedad en los suelos depende de la textura del suelo y el contenido de arcilla.
En suelos de granulometría fina con elevados porcentajes de limo y arcilla como los
arcillosos y franco-arcillosos suele haber un rango óptimo de humedad cercano al 40 % de
0
10
20
30
40
50
60
70
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 P N
% d
e H
um
ed
ad
Experimentos
Humedad
7 Días
14 Días
28 Días
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
41
la capacidad de campo (Menn et al., 2000). Cuando existe un exceso de agua en los suelos,
estos se tornan pantanosos, pues al ser arcillosos y tener un alto contenido de agua se
vuelven plásticos, y esto puede inferir en el transporte de oxígeno al medio y comenzar a
operar bajo condiciones anaeróbicas (Arrieta Ramírez, 2011).
7.1.4 Cuantificación de conductividad eléctrica
Al ser medida esta característica en los experimentos donde la bioestimulación fue el
tratamiento elegido, se observaron resultados variados en los tiempos a los que se tomó
muestra. Mientras que a los 14 días de haber iniciado el experimento el mayor valor
registrado fue en el experimento 6, con 1.43 µS/cm, al día 28 se registró en el experimento
9, con 0.94 µS/cm. Se observó particularmente una disminución de este valor en la mayoría
de los experimentos de los 14 a los 28 días.
Figura 17. Valores registrados de conductividad eléctrica para el tratamiento del suelo
usando bioestimulación. Las líneas representan la desviación estándar; los valores 1 a 12
corresponden a los experimentos, T al testigo (suelo estéril) y N al control negativo (ladrillo
incinerado).
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 T N
Co
nd
uct
ivid
ad e
léct
rica
(µ
S/cm
)
Experimentos
Conductividad eléctrica
7 Días
14 Días
28 Días
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
42
Si se observa la figura 17, hay un incremento notable de la conductividad eléctrica en la
mayoría de los experimentos al tiempo de 14 días, registrando valores que casi doblan el
anterior, el del día 7. En algunos experimentos con suelos contaminados, la conductividad
del suelo incrementa al paso del tiempo, debido a la penetración de los frentes ácidos y
alcalinos, además que los cambios de pH pueden solubilizar las especies iónicas; aunado a
esto la generación de subproductos puede generar un cambio en los valores de
conductividad (Acar et al., 1996).
7.1.5. Cuantificación de materia orgánica
La materia orgánica es uno de los parámetros más variables en la biorremediación de suelos
contaminados, ya que aumenta de forma proporcional a la concentración de los
hidrocarburos presentes, especialmente gasolina y combustóleo (Martínez, 2001).
Utilizando el método de Walkley-Black, el contenido de materia orgánica es la suma de la
materia biogénica (descomposición de vegetales y animales), y materia petrogénica
(hidrocarburos).
Figura 18. Valores registrados de materia orgánica para el tratamiento del suelo usando
bioestimulación. Las líneas representan la desviación estándar; los valores 1 a 12
corresponden a los experimentos, P al testigo (suelo estéril) y N al control negativo (ladrillo
incinerado).
0
5
10
15
20
25
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 T N
% m
ate
ria
org
ánic
a/g
sue
lo
Experimentos
Materia orgánica
7 Días
14 Días
28 Días
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
43
En la figura 18 se observan los mayores valores de materia orgánica para la mayoría de los
experimentos durante el tiempo de 14 días, disminuyendo notablemente al día 28; los
experimentos 5, 9 y 10 presentaron la mayor disminución de materia orgánica de 3.78%,
2.17% y 2.54% respectivamente, con respecto a los demás tratamientos cual se asocia a la
degradación de la fuente de carbono del suelo y la biotransformación de los compuestos.
Se puede suponer que con este método cadenas cortas de hidrocarburos (C5 a C9)
volatilizan por la reacción exotérmica con el ácido sulfúrico, mientras que el resto se oxida.
Cadenas más largas (C10 a C23) tienen menor cantidad de compuestos volátiles, por lo que
generalmente al oxidarse, general valores muy altos de materia orgánica; sin embargo, los
hidrocarburos con cadenas más largas (C25 a C35), son difíciles de tratar por el método de
Walkley-Black ya que solo una pequeña parte de ellos son oxidables (Martínez, 2001). Al
observar los valores considerablemente bajos de materia orgánica, se puede inferir la
presencia de hidrocarburos altamente recalcitrantes en el suelo de Agua Dulce. El aumento
de materia orgánica en estos casos es perjudicial para los suelos, ya que al degradarse la
materia biogénica, se está considerando solo el valor de la materia petrogénica, que en este
caso son los PAHs, asfáltenos y resinas (Fan et al., 1994).
Standardized Pareto Chart for % Humedad
0 5 10 15 20 25 30
Standardized effect
F:Factor_F
A:Factor_A
I:Factor_I
G:Factor_G
K:Factor_K
E:Factor_E
J:Factor_J
H:Factor_H
B:Factor_B+
-
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
44
Figuras 19 a,b,c. Diagramas de Pareto para la determinación de significancia de las sales
utilizadas para los valores en a) porcentaje de humedad, b) conductividad eléctrica (CE) y
c) materia orgánica. La línea azul representa el valor mínimo para que alguno de los
factores sea estadísticamente significativo en el resultado, cada una de las letras de los
factores representa las sales indicadas en la Tabla 7.
En los diagramas de Pareto para determinar la significancia de las sales en las variables
medidas, se pueden observar ciertas similitudes; por ejemplo, el factor B (MgSO4), incluso
en pequeñas cantidades es estadísticamente significativo para la obtención de los valores
registrados de humedad y conductividad eléctrica. En suelos arcillosos con potenciales altos
de expansión y contracción, la infiltración del agua hacia las grietas puede crear un
fenómeno ascendente de las sales, haciendo significativamente diferentes las condiciones
de los horizontes superiores del suelo (Villafañe et al., 1994).
Standardized Pareto Chart for CE
0 5 10 15 20 25 30
Standardized effect
F:Factor_F
D:Factor_D
E:Factor_E
J:Factor_J
H:Factor_H
A:Factor_A
K:Factor_K
B:Factor_B
I:Factor_I
C:Factor_C+
-
Standardized Pareto Chart for Materia organcia
0 20 40 60 80 100 120
Standardized effect
I:Factor_I
K:Factor_K
H:Factor_H
D:Factor_D
F:Factor_F
A:Factor_A
G:Factor_G
E:Factor_E
J:Factor_J+
-
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
45
El magnesio (Mg) presente en el suelo está presente regularmente en suelos arcillosos, por
lo que variables como conductividad eléctrica, humedad y pH están directamente
relacionadas con la presencia de este elemento, debido a las características del suelo mismo
(Hernández et al., 2003) En el caso de la materia orgánica, se observa que todas las sales
añadidas son estadísticamente significativas, lo que quiere decir que los microorganismos
aprovechan todos los compuestos añadidos en mayor o menor proporción para la
realización de sus procesos metabólicos, resultando en el aumento de materia orgánica
debido a los mismos.
Los bioelementos presentes en las sales juegan un papel importante en los procesos
metabólicos que desencadenan la degradación de los hidrocarburos de fracción pesada,
elementos como el Ca, Mg, S, Fe, N, y sus formas reducidas, forman parte de importantes
procesos metabólicos celulares como la β-oxidación y la cadena transportadora de
electrones.
La capacidad de biotransformación de los PAHs es un mecanismo muy frecuente en
organismos que recurren a una serie de enzimas que realizan reacciones de conjugación
(sulfo-transferasa, epóxido-hidrolasa, glutatión-S-transferasa y UDP-glicotransferasa). Las
monooxigenasas dependientes del citrocromo P-450 son responsables de la oxidación
enzimática de los PAHs (Li et al., 2001). Al utilizar al hidrocarburo como única fuente de
carbono, dependiendo del microorganismo, del tipo de hidrocarburo y de las condiciones
del medio, el metabolismo se lleva a cabo de diferentes maneras.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
46
Figura 20. Ruta metabólica para la degradación del Hexadecano. El producto final es
Palmitoil-CoA (Velasco-Álvarez, 2011).
Las reacciones para la conversión del hidrocarburo en ácido palmítico y palmitoil CoA se
catalizan por un conjunto de proteínas llamado sistema alcano hidroxilasas. Este grupo
contiene una enzima alcano-monooxigenasa, y dos proteínas solubles: la rubredoxina y
rubredoxina reductasa. Se inicia la transferencia de electrones entre la rubredoxina y la
rubredoxina reductasa a través del NADH. Posteriormente esta proteína transfiere
electrones a un alcano oxigenasa, localizada en la membrana citoplasmática. Una vez
terminado esto, se obtiene palmitoil CoA, que debe ser transportado al interior de la matriz
mitocondrial, usando la carnitina (van Beilen et al., 1994). Posteriormente este palmitoil
CoA se incorpora a la β-oxidación, hasta llegar a la tiolasa y Acetil CoA, productos que
entran directamente en el ciclo de Krebs.
Cada enzima necesaria en el proceso de conversión a palmitoil CoA es ayudada por
cofactores, que no son otra cosa que moléculas no proteicas para que una enzima se active.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
47
Tabla 10. Cofactores necesarios para el funcionamiento de las enzimas descritas. Las
enzimas son específicas para la degradación de un hidrocarburo, sin embargo los cofactores
indicados son comunes dentro de este proceso.
Enzima Cofactor Referencia
Alcano 1-deshidrogenasa Fe+2, Zn, NADH (Matsuyama et al., 1981)
Alcohol deshidrogenasa Fe +2, Zn+ (Levin et al., 2004)
Aldehído deshidrogenasa Fe+2, Mg+2, K+, NAD (Rojo, 2010)
Acetil Co-A sintetasa Ca+2, Mg+2 (Heinnickel et al., 2010)
En la Tabla 10 se muestran los cofactores relacionados para la activación de las diferentes
enzimas que participan en la conversión del hexadecano. Como se observa, el hierro es uno
de los principales actores en casi todos los procesos, al igual que el magnesio. El hierro
participa como transportador de electrones entre proteínas y hacia complejos multi-
enzimáticos, mientras que el magnesio participa en la activación de ácidos grasos, dando
lugar posteriormente a procesos de β-oxidación.
En los resultados obtenidos de las variables medidas, las sales involucradas en los procesos
son el Fe, Mg y Ca. Los niveles altos o bajos de adición de estos bioelementos al suelo
están determinados por la capacidad de retención de los mismos; mientras que adicionando
un nivel alto se puede saturar al suelo, generando cambios en variables como conductividad
eléctrica y pH, logrando un menor porcentaje de remoción de los hidrocarburos, un nivel
muy bajo puede no generar los nutrientes necesarios para los procesos metabólicos de los
microorganismos presentes, impidiendo que los hidrocarburos de fracción pesada sean
retirados.
7.1.6. Cuantificación de hidrocarburos de fracción pesada (HFP) por
espectrofotometría UV e FTIR.
Para la cuantificación de las fracciones pesada y asfalténica se utilizaron dos métodos
analíticos como lo es la espectrofotometría UV visible y FTIR (Fourier Transform Infrared
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
48
Spectroscopy). En la espectrofotometría UV visible se utilizó con un barrido en longitud de
onda de los 200 a los 600 nm, utilizando la siguiente curva de calibración (Figura 21).
Figura 21. Curva de calibración de fracción asfalténica. Se realizó previa extracción del
hidrocarburo.
Figura 22. Valores de fracción pesada de hidrocarburos obtenidos durante los tiempos del
experimento utilizando bioestimulación. Las líneas representan la desviación estándar; los
valores 1 a 12 corresponden a los experimentos, P al control positivo (suelo estéril) y N al
control negativo (ladrillo incinerado).
y = 1.1057x - 0.0061 R² = 0.9991
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 Fra
cció
n a
sfal
ten
ica
Absorbancia
Curva de calibración
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 T N
mg
HFP
/g s
ue
lo
Experimentos
Hidrocarburos de Fracción Pesada (HFP)
7 Días
14 Días
28 Días
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
49
En la figura 22 se observan valores diversos en los diferentes tratamientos de los suelos al
utilizar bioestimulación. Además del suelo testigo, los experimentos 1 y 2 son los que
registran mayor contenido de hidrocarburos de fracción pesada a los 7 días del
experimento. Sin embargo, el análisis de varianza de la fracción pesada con la producción
de CO2 muestra una diferencia significativa, lo que quiere decir que la producción de CO2 y
los procesos metabólicos de los microorganismos del consorcio bacteriano usado influyen
directamente sobre la biodegradación de los hidrocarburos intemperizados. El experimento
1 fue el que registró la menor producción de CO2, y también es el que más contenido de
hidrocarburos registra a los 7 y 14 días; mientras que el experimento 2 al tener un alto
contenido de hidrocarburos de fracción pesada en el día 7, al día 14 registra un decremento
importante de 5470 mg HFP/Kg suelo, que es inversamente proporcional al aumento de
producción de CO2, esto se puede interpretar como procesos metabólicos que degradan los
hidrocarburos de fracción pesada en compuestos más simples.
Para la cuantificación de espectros orgánicos mediante FTIR (Fourier Transform Infrared
Spectroscopy) se realizó previamente la extracción del hidrocarburo del suelo utilizando
hexano como solvente. El análisis cualitativo de los HFPs por espectroscopia de infrarrojo
es un método eficaz para determinar la presencia de un compuesto de interés en suelos y
aguas. La ventaja de esta técnica es su relativa simplicidad y su bajo costo (Arango
Ramírez et al., 2012).
Los diferentes grupos funcionales poseen distintas frecuencias e intensidades de absorción.
Regularmente, los métodos para la medición de HFPs miden la absorción de los enlaces C-
H y la mayoría de los métodos usan una única frecuencia para este grupo funcional (2930
cm-1). Aunque existen otros métodos que realizan la medición de más de una frecuencia, ya
que algunos compuestos más complejos como los enlaces C-H de los compuestos
aromáticos se encuentran en frecuencias de 3100 cm-1 a 3200 cm-1 (Arango Ramírez et al.,
2012).
Se realizó una curva de calibración para FTIR con hexano, y posteriormente se realizó la
corrida de las muestras de hidrocarburos.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
50
Figura 23. Curva de calibración para FTIR, usando hexano. La celda utilizada para el
experimento fue de selenuro de zinc.
De acuerdo a la literatura se buscaron frecuencias cercanas a las reportadas donde se
localizan los enlaces C-H, metilo (CH3) y CH2, donde las bandas están sobre los 2920 cm-1
y los 2950 cm-1.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
51
Figuras 24 a,b,c. Frecuencias de FTIR a los a) 7, b) 14 y c) 28 días obtenidas en el
experimento 9. Se eligió este por ser el que menor cantidad de hidrocarburos de fracción
pesada registró a los 28 días.
C-H
C-H
C-H
CH3
CH3
C-CH2
CH3
C-CH2
C-CH2
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
52
Los resultados obtenidos de los espectros mediante el análisis por FTIR, muestran a los
diferentes tiempos vibraciones muy similares comúnmente citadas en la literatura para los
hidrocarburos, sin embargo los valores de transmitancia difieren, y también se observan
apariciones de nuevas bandas dentro de las frecuencias pertenecientes a la huella digital,
esto se asocia a la producción de metabolitos provenientes de la biodegradación de los
hidrocarburos intemperizados.
7.2 Análisis estadísticos
Los valores obtenidos en la medición de las diferentes variables fueron sometidos a pruebas
estadísticas para evaluar si la combinación de sales afecta los valores de las variables a los
tiempos en los que se midieron.
Al realizar pruebas de normalidad, homogeneidad y homoelasticidad de los datos
obtenidos, se observó que no se distribuyen de manera normal, por lo que fue necesario
aplicar métodos de estadística no paramétrica, utilizando el método de Kruskal-Wallis.
En la Tabla se muestran los resultados de la evaluación no paramétrica mediante el método
de Kruskal-Wallis, así como las hipótesis generadas para cada variable en los diferentes
tiempos, con α= 0.05.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
53
Tabla 11. Resultados de análisis de estadística no paramétrica para los datos colectados de
las variables medidas a diferentes tiempos. Se utilizó el método de Kruskal-Wallis, con un
α= 0.05.
Experimento Tiempo Hipótesis p valor Conclusión
Medición de
CO2
7 días H0 = La combinación de
sales no afecta el valor del
CO2
H1 = La combinación de
sales afecta el valor de
CO2
0.191 No hay evidencia
estadística para rechazar
H0
14 días 0.036 Se acepta la hipótesis
alternativa H1
28 días 0.028 Se acepta la hipótesis
alternativa H1
Medición de pH 7 días H0 = La combinación de
sales no afecta el valor del
pH
H1 = La combinación de
sales afecta el valor de pH
0.015 Se acepta la hipótesis
alternativa H1
14 días 0.014 Se acepta la hipótesis
alternativa H1
Medición de
Conductividad
Eléctrica
7 días H0 = La combinación de
sales no afecta el valor de
C.E.
H1 = La combinación de
sales afecta el valor de
C.E.
0.044 Se acepta la hipótesis
alternativa H1
28 días 0.091 No hay evidencia
estadística para rechazar
H0
Medición de
Materia
Orgánica
7 días H0 = La combinación de
sales no afecta el valor de
M.O.
H1 = La combinación de
sales afecta el valor de
M.O.
0.015 Se acepta la hipótesis
alternativa H1
14 días 0.016 Se acepta la hipótesis
alternativa H1
28 días 0.063 No hay evidencia
estadística para rechazar
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
54
H0
Medición de
Hidrocarburos
de Fracción
Pesada
14 días H0 = La combinación de
sales no afecta el valor de
HFP
H1 = La combinación de
sales afecta el valor de
HFP
0.02 Se acepta la hipótesis
alternativa H1
De acuerdo a los datos arrojados por la Tabla 11, se tienen suficientes pruebas estadísticas
para afirmar que existe una relación entre las combinaciones de sales para los experimentos
y los resultados obtenidos entre las variables, salvo la medición de CO2 a los 7 días, así
como la medición de la materia orgánica y la conductividad eléctrica a los 28 días.
Se realizó también un análisis de correlación de coeficiente de Pearson, en donde se mide el
grado de correlación de distintas variables relacionadas, y su valor se encuentra entre 0 y 1,
alternando de manera positiva o negativa; es decir, puede estar entre 0 y 1 y entre 0 y -1. En
el primer caso, se tendría una correlación perfectamente positiva y en el segundo una
correlación perfectamente negativa (Pedhazur, 1997).
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
55
Tabla 12. Correlación de coeficientes de Pearson para las variables involucradas en el
proceso de biodegradación de hidrocarburos de fracción pesada utilizando bioestimulación.
Loa valores en negritas son estadísticamente significativos por el p valor.
Medios CO2 pH Humedad M.O. C.E. HTP
Medios 1.0000 -0.06357 0.41539 -0.16604 -0.08987 -0.18303 0.01160
p valor 0.5803 0.0002 0.1463 0.4339 0.1087 0.9197
CO2 -0.06357 1.0000 -0.10467 -0.22224 -0.34027 -0.03435 -0.19677
p valor 0.5803 0.3617 0.0505 0.0023 0.7653 0.0842
pH 0.41539 -0.10467 1.0000 -0.21169 -0.49777 -0.30899 0.27374
p valor 0.0002 0.3617 0.0628 < .0001 0.0059 0.0153
Humedad 0.16604 -0.22224 -0.21169 1.0000 0.57477 -0.08389 0.11205
p valor 0.1463 0.0505 0.0628 < .0001 0.4652 0.3287
M.O. -0.08987 -0.34027 -0.49777 0.57477 1.0000 -0.05901 0.27531
p valor 0.4339 0.0023 < .0001 < .0001 0.6078 0.0147
C.E. -0.18303 -0.03435 -0.30899 -0.08389 -0.05901 1.0000 -0.39061
p valor 0.1087 0.7653 0.0059 0.4652 0.6078 0.0004
HTP 0.01160 -0.19677 0.27374 0.11205 0.27531 -0.39061 1.0000
p valor 0.9197 0.0842 0.0153 0.3287 0.0147 0.0004
La tabla 12 arroja datos que sugieren que no hay una correlación fuertemente positiva o
negativa, ya que el mayor valor de correlación se encuentra entre la materia orgánica y la
humedad, con 0.57477, lo que se podría interpretar como una correlación moderada entre
estas dos variables; sin embargo los datos arrojados en los p valores muestran que más de
una correlación es estadísticamente significativa (p < 0.05), como la materia orgánica con
el CO2 y con los HTPs, o la conductividad con los HTPs, entre otros.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
56
El valor en una correlación es muy ambiguo, ya que depende mucho de la naturaleza de los
experimentos que se realizaron, por lo que mientras para unos este valor de 0.57 puede ser
bajo, para otros puede demostrar la validez de los experimentos. Se atribuyen estos valores
a la cantidad de experimentos y a la variabilidad de los datos presentados, ya que los rangos
de los valores en las diferentes variables oscilaban desde decimales hasta miles.
Seguida a esta prueba, se realizó otra entre los factores (medios y tiempo) y las diferentes
variables (CO2, pH, humedad, materia orgánica, conductividad y HTP) para determinar las
interacciones entre las variables y los factores por diferencia mínima significativa.
Estadísticamente se puede inferir una formulación óptima para el mejoramiento de las
condiciones de la biodisponibilidad del suelo de Agua Dulce, en función a los valores de
producción de dióxido de carbono y al porcentaje de remoción de los hidrocarburos totales
del petróleo. La formulación 9 es la que de acuerdo a la bibliografía y el análisis estadístico
el mejor medio que optimiza los variables medidas durante el proceso de bioestimulación,
además de remover la mayor cantidad de hidrocarburos de fracción pesada.
Para los tratamientos del suelo utilizando el proceso de bioventeo no se realizó un análisis
estadístico debido a que no se realizaron réplicas de dichos tratamientos, siendo estos
resultados solo modelos preliminares para el desarrollo de este trabajo. Por esta misma
razón, solo puede haber una comparación cualitativa, cuantitativa pero no estadística de los
resultados obtenidos entre los procesos de bioestimulación y bioventeo.
7.3 Cuantificación de parámetros usando bioventeo.
7.3.1 Cuantificación de CO2
A continuación se presentan resultados experimentales preliminares del estudio de
biodegradación de los hidrocarburos intemperizados mediante la tecnología de bioventeo.
Para el tratamiento del suelo usando bioventeo se realizó el mismo procedimiento para
determinar el CO2 producido durante intervalos de tiempo de 7, 14 y 28 días. Se estableció
una nomenclatura para cada experimento según los datos del diseño de experimentos de la
Tabla 8.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
57
Figura 25. Niveles de producción de CO2 en el suelo contaminado tratado con bioventeo.
La nomenclatura utilizada es como ejemplo: C1 (Corrida) B1 (Reactor) T7 (Tiempo de
Experimento.
Como se aprecia en la figura 25 y siguiendo la nomenclatura indicada en el apartado
anterior, solo se graficaron los valores de producción de los experimentos a 7 y 14 días, ya
que ninguno de ellos registró producción de CO2 a un tiempo de 28 días.
El medio mineral Bushnell Hass es utilizado como un medio mínimo de sales para el
crecimiento de microorganismos en suelos contaminados; se infiere que la cantidad de este
medio aunado al flujo de aire y al contenido de humedad en el suelo favorece o inhibe los
procesos metabólicos. En los valores máximos del experimento C1B1T7 y C1B2T7 son
79,250 y 103,250 mg CO2/Kg suelo, respectivamente. Ambos experimentos se realizaron
con un valor bajo de humedad y con el medio Bushnell Hass como fuente de nutrientes, y la
producción de dióxido de carbono en ambos decrece para el día 14. Sin embargo, el
experimento C1B3 registró producción de CO2, solamente con un flujo alto de aire y sin la
adición del medio Bushnell Hass. Esto puede justificarse como interacciones entre los
subproductos de la biodegradación con la fracción mineral del suelo; al estar en contacto la
fracción mineral libera iones, que pueden ser asimilados como nutrientes en el suelo. La
biodegradación de los hidrocarburos requiere que los sustratos sean oxidados mediante
oxigenasas, por eso es necesaria la presencia de un flujo estéril de aire al medio (Castro et
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
mg
CO
2/K
g su
elo
se
co
Experimentos
Producción de CO2 usando bioventeo
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
58
al., 2004). El flujo de aire es una variable limitante para el control de la tasa de
biodegradación de los hidrocarburos, ya que si el contenido es muy bajo puede que no se
distribuya por toda la matriz del suelo, haciendo anaeróbicas algunas zonas del mismo, y
afectar de manera negativa (Wentz, 1995)
En los suelos costeros y marinos existen relaciones aproximadas de C:N de 30:1, donde el
contenido de N es muy bajo con respecto a otros suelos (Ramón et al., 2013). Cuando los
hidrocarburos poco polares, asfáltenos, resinas u otros elementos de fracción pesada se
encuentran en el suelo, interrumpen las interacciones entre él y los nutrientes, siendo estos
últimos lixiviados. Esto suele ser más común en áreas húmedas, donde las fuertes lluvias y
el alto contenido de humedad aumentan la plasticidad del suelo, influyendo en los
fenómenos de transferencia de masa y la porosidad de las partículas, haciendo más lenta la
biodegradación (Adams et al., 2008).
Los microorganismos requieren un balance de nutrientes para desarrollar sus estructuras y
obtener energía, la mayoría metabolizan materiales inorgánicos para construir sus
componentes orgánicos y obtener energía de estos procesos para sobrevivir, lo cual se
puede obtener adicionando cantidades correctas de sales al suelo.
7.3.2 Cuantificación de pH
Para el tratamiento del suelo usando bioventeo, se registraron valores de todas las corridas,
sin embargo se graficaron aquellos resultados que tienen significancia desde la
cuantificación de dióxido de carbono, por una medida de crecimiento de los
microorganismos, y por tanto de procesos metabólicos que rigen la biodegradación de los
hidrocarburos persistentes.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
59
Figura 26. Valores de pH registrados en diferentes experimentos usando bioventeo. Se
realizó únicamente la cuantificación de los experimentos que obtuvieron resultados
favorables en la cuantificación de dióxido de carbono.
La figura 26 arroja el aumento significativo de pH se registró al tiempo de 28 días en todos
los experimentos, lo que puede inferirse como una disminución de la actividad microbiana.
Los procesos de nitrificación son más rápidos en suelos con rangos de pH neutro a alcalino
que en los de pH neutro a ácido (Coyne, 2000).
Estos valores, todos cercanos e incluso superiores a 8, muestran un pH con cierto grado de
alcalinidad, producto de la biomasa generada por el consorcio microbiano, sin embargo esto
no promueve el crecimiento microbiano y aprovechamiento de nutrientes.
6.8
7
7.2
7.4
7.6
7.8
8
8.2
8.4
C1B1 C1B2 C1B3
pH
Tratamiento
Bioventeo
7 Días
14 Días
28 Días
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
60
7.3.3 Cuantificación de humedad
Para la cuantificación de la humedad en los suelos utilizando bioventeo se obtuvieron los
resultados mostrados a continuación.
Figura 27. Valores de humedad registrados en diferentes experimentos usando bioventeo.
Se realizó únicamente la cuantificación de los experimentos que obtuvieron resultados
favorables en la cuantificación de dióxido de carbono.
Si se observa la figura 27, para los tres tratamientos el valor de humedad disminuye al pasar
del día 7 al día 14, especialmente en el tercer tratamiento (C1B3). También se observa un
descenso crítico en el segundo tratamiento (C1B2) del día 14 al día 28. Al trabajar en un
sistema cerrado, se deben cuidar que las condiciones establecidas permanezcan constantes
durante todo el tiempo de la realización del experimento. Se puede atribuir este valor de
cero a un error instrumental, donde el flujo de aire proporcionado por la bomba hacia el
sistema, se interrumpió debido a los sólidos del suelo.
Un exceso de humedad en el suelo determina una aireación deficiente, que influye tanto en
el desarrollo de su microbiota así como un posible crecimiento de flora en el mismo (Bravo
et al., 2011). En el caso contrario, cuando la humedad del suelo es relativamente baja, estas
0
5
10
15
20
25
C1B1 C1B2 C1B3
% H
um
ed
ad
Tratamiento
Humedad
7días
14días
28días
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
61
condiciones también rigen en su comportamiento y la alteración de sus condiciones, como
su desecamiento o la dramática variabilidad de sus variables como pH, conductividad
eléctrica y materia orgánica (Esqueda Coronado et al., 2012).
7.3.4 Cuantificación de conductividad eléctrica
En cuanto a la medición de la conductividad eléctrica, se realizó el mismo procedimiento
descrito en el apartado AS-18-2000 de la NOM-021-RECANAT-2000, que también se
utilizó para los tratamientos anteriores en el proceso de bioestimulación.
Figura 28. Valores de conductividad eléctrica registrados en diferentes experimentos
usando bioventeo. Se realizó únicamente la cuantificación de los experimentos que
obtuvieron resultados favorables en la cuantificación de dióxido de carbono.
Los valores de conductividad de la Tabla 28 dentro del proceso de bioventeo no son muy
diferentes al del proceso de bioestimulación, donde también se registran valores muy por
encima del inicial. Cuando la conductividad eléctrica aumenta, puede deberse a diferentes
factores como la presencia importante de sales, que permanecen en el suelo al finalizar el
experimento. Este comportamiento es característico de los lodos estabilizados (Montilla et
al., 2006). El valor de la conductividad eléctrica aumentó en promedio de 3 a 4 veces, en
ambos procesos, esto sucede regularmente en suelos contaminados después de un
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
C1B1 C1B2 C1B3
C.E
. (µ
S/cm
)
Tratamiento
Conductividad Electrica
7 Días
14 Días
28 Días
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
62
tratamiento, ya que hay adición de sales y transformaciones de los compuestos presentes,
sin afectar de manera negativa las condiciones del suelo (Trujillo-Narcía et al., 2012).
7.4 Relación entre actividad metabólica y degradación de los hidrocarburos
El aprovechamiento de la capacidad de los microorganismos para la degradación de
compuestos es el sostén principal de los procesos de biorremediación de los suelos. El
conocimiento de las características fisiológicas y bioquímicas así como la genética de los
consorcios microbianos es un requisito fundamental para la elección de técnicas adecuadas
que aseguren el correcto saneamiento del suelo tratado, y evaluar la efectividad del método
utilizado (Moreno et al., 2004).
De acuerdo a «The Biodegradative Strain Database», una base de datos virtual publicada
por la Universidad de Virginia, existen diferentes géneros de bacterias y hongos reportados
como degradadores de diferentes tipos de hidrocarburos, desde los más simples hasta
PAHs.
Tabla 13. Especies reportadas como degradadoras de hidrocarburos, según la base de datos
de la Universidad de Virginia (Urbance et al., 2003).
Géneros
Bacterias Achromobacter, Acidovorax, Acinetobacter, Aeromonas, Agrobacterium,
Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Beijerinckia, Burkholderia, Comamonas,
Corynebacterium, Flavobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Moraxella, Mycobacterium, Neptunomonas, Nocardia,
Paenibacillus, Porphyrobacter, Pseudomonas,
Ralstonia, Rhodococcus, Sphingomonas,
Streptomyces, Vibrio y Xanthomonas,
Hongos Agrocybe, Aspergillus, Candida, Crinipellis,
Chrysosporium, Cunninghamella, Bjerkandera,
Fusarium, Kuehneromyces, Marasmiellus,
Marasmius, Morteriella, Mucor, Naematoloma,
Laetiporus, Phanerochaete, Pleurotus,
Penicillium, Ramaria, Rhizoctonia,
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
63
Rhodotorula, Saccharomyces, Syncephalastrum,
Trametes y Trichoderma
Se realizaron cinéticas microbianas con toma de muestra a los 7, 14 y 28 días de iniciado el
experimento, para la cuantificación de los microorganismos mediante la técnica de conteo
en placa. Se tomaron únicamente observaciones del experimento 9 del proceso de
bioestimulación, por cumplir las condiciones óptimas para el mejoramiento de la
biodisponibilidad de los hidrocarburos observando un aumento en órdenes de magnitud,
registrando el valor máximo al día 7, con 3.7 x 107 UFC/g de suelo; justo en este tiempo se
comienza a observar un decremento de la cantidad de hidrocarburos de fracción pesada, con
2030 mg HFP/Kg de suelo al día 28. De esta manera el porcentaje de biodegradación de los
hidrocarburos de fracción pesada es de 97.5 %.
Figura 29. Relación CO2 producido – Hidrocarburos de Fracción Pesada para el
experimento 9. La línea roja indica el hidrocarburo, mientras que la línea azul las UFC.
De acuerdo a los resultados preliminares del proceso de bioventeo, el experimento C1B2
fue el que registró una mayor remoción de HFP durante el tiempo del experimento; sin
embargo, en la en la figura se observa esta remoción mucho antes del aumento exponencial
del consorcio adaptado agregado; esto se interpreta como una degradación de los
compuestos hidrocarbonados mediante atenuación natural. Según los datos de esta corrida,
se inyectó un flujo de aire de 30 %, 0 fuente de nutrientes y 90 mL de agua, por lo que los
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
0 7 14 21 28
mg
HFP
/kg
sue
lo s
eco
días
Experimento 9
107 U
FC/
g d
e su
elo
se
co
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
64
microorganismos presentes en el suelo solo aprovecharon los nutrientes con los que
contaban para sus procesos metabólicos.
Figura 30. Relación CO2 producido – Hidrocarburos de Fracción Pesada para el
experimento C1B2 de bioventeo. La línea roja representa el hidrocarburo, mientras que la
línea verde el crecimiento del consorcio.
0
20
40
60
80
100
120
140
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
0 5 10 15 20 25
mg
HFP
/kg
de
su
elo
se
co
dias
C1B2
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
65
8. CONCLUSIONES
Se logró mejorar la biodisponibilidad del suelo costero de Agua Dulce mediante el proceso
de bioestimulación.
El experimento 9 (NaCl 0.001 g/L; MgSO4 • 7H2O 0.006 g/L; CaCl2 0.002 g/L; NH4)2SO4 1
g/L; KH2PO4 5 g/L; FeCl3 • 6H2O 1 g/L; (NH4)2PO4 0.01 g/L; NH4Cl 0.25 g/L; KH2NH3
1.065 g/L; FeSO4 0.1 g/L; NH4NO3 0.5 g/L) de bioestimulación registró un 97.5 % de
remoción de los HFP a los 28 días, convirtiéndose en la combinación óptima de nutrientes
y condiciones fisicoquímicas.
Se encontró que la producción de CO2 y la degradación de los hidrocarburos de fracción
pesada no tienen una relación inversamente proporcional. Estadísticamente también se
comprobó la nulidad de la interacción.
No se comprobó ninguna correlación cercana a 1 o -1 entre los parámetros fisicoquímicos
de bioestimulación evaluados mediante las correlaciones de Pearson, sin embargo el p valor
en todos los casos rechaza la hipótesis H0, en la que no existe correlación entre las
variables.
Los bioelementos que tienen mayor participación en la remoción de los hidrocarburos de
fracción pesada son el hierro, el calcio y el magnesio.
Una de las interacciones importantes en el proceso de bioestimulación se encuentra entre
humedad-materia orgánica y pH-materia orgánica, que aunque el valor de 0.5477 supone
una correlación moderada, el p valor indica una estrecha relación.
El proceso de bioventeo, el experimento C1B2 registró porcentajes de degradación de los
HTP similares a los obtenidos en el proceso de bioestimulación, sin embargo no hay
réplicas que puedan validar el resultado obtenido.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
66
9. PERSPECTIVAS
El desarrollo de este trabajo ha generado propuestas para su continuación en la generación
de una nueva tecnología de mejoramiento de la biodisponibilidad de suelos para la que
están contemplados los siguientes puntos:
Utilización de métodos más eficaces para la medición de variables como el CO2.
Reducción de los intervalos de tiempo en las mediciones de las variables de los
experimentos para generar una menor variabilidad de los datos.
Estudiar a detalle los subproductos de la biodegradación, como el tipo de biosurfactante,
ácidos grasos, ácidos carboxílicos que conducen a una mayor precisión de los procesos
metabólicos que se desarrollan durante el experimento de bioestimulación.
Adicionalmente el análisis cromatográfico GS-MS permitirá conocer la disminución de los
compuestos petrolíferos que contienen las muestras del suelo contaminado al inicio y al
final del experimento.
Desarrollo y evaluación de pruebas de toxicidad al suelo remediado, esto con el fin de
corroborar si el nivel de remoción de los hidrocarburos es adecuado para el crecimiento de
plantas y el desarrollo y supervivencia de insectos como gusanos.
Análisis de los resultados obtenidos para la combinación óptima de sales, para su
evaluación financiera y generación de esta combinación a gran escala.
Desarrollo y estandarización de una tecnología alternativa eficaz para lograr la remoción de
los hidrocarburos de fracción pesada en suelos.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
67
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MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
75
ANEXOS
A. Preparación de medios enriquecidos
Tabla 14. Composición del medio Bushnell Haas, utilizado para el proceso de bioventeo.
Sal Cantidad (g/L)
KH2PO4 60
(NH4)2HPO4 60
KNO3 60
FeCl3 3
CaCl2 1.2
MgSO4 * 7H2O 12
B. Análisis estadísticos
1000007500050000250000-25000-50000
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
mg CO2/kg suelo
Po
rce
nta
je
Media 5869
Desv.Est. 17945
N 28
KS 0.372
Valor P <0.010
a) CO2 7 DíasNormal
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
76
150000100000500000-50000
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
mg CO2/kg suelo
Po
rce
nta
je
Media 27143
Desv.Est. 40209
N 28
KS 0.250
Valor P <0.010
b) CO2 14 DíasNormal
150000100000500000-50000
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
mg CO2/kg suelo
Po
rce
nta
je
Media 44714
Desv.Est. 46721
N 28
KS 0.224
Valor P <0.010
c) CO2 28 DíasNormal
Figura 31 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de CO2
producido en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se encuentran los parámetros
estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-Smirnov.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
77
La prueba de bondad de ajuste de Kolmogorov sigue dos hipótesis:
H0 = Los datos analizados siguen una distribución normal.
H1 = Los datos analizados no siguen una distribución normal.
Si el p valor es mayor a α, se acepta la hipótesis H0, de lo contrario se acepta la hipótesis
H1.
9.08.58.07.57.06.56.0
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
pH
Po
rce
nta
je
Media 7.070
Desv.Est. 0.4909
N 28
KS 0.235
Valor P <0.010
pH 7 DíasNormal
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
78
9.08.58.07.57.06.56.0
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
pH
Po
rce
nta
je
Media 7.260
Desv.Est. 0.5153
N 28
KS 0.234
Valor P <0.010
pH 14 DíasNormal
9.08.58.07.57.06.56.0
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
pH
Po
rce
nta
je
Media 7.573
Desv.Est. 0.5352
N 28
KS 0.131
Valor P >0.150
pH 28 DíasNormal
Figura 32 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de pH producido
en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se encuentran los parámetros estadísticos y
el valor p de la prueba Kolmogorov-Smirnov.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
79
7065605550454035
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
% Humedad
Po
rce
nta
je
Media 52.04
Desv.Est. 6.898
N 28
KS 0.136
Valor P >0.150
Humedad 7 díasNormal
5045403530
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
% Humedad
Po
rce
nta
je
Media 39.11
Desv.Est. 4.008
N 28
KS 0.169
Valor P 0.043
Humedad 14 díasNormal
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
80
60555045403530
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
% Humedad
Po
rce
nta
je
Media 44.09
Desv.Est. 6.243
N 28
KS 0.167
Valor P 0.046
Humedad 28 díasNormal
Figura 33 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de % de
Humedad producido en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se encuentran los
parámetros estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-Smirnov.
35302520151050
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
% M.O./g suelo
Po
rce
nta
je
Media 19.62
Desv.Est. 5.730
N 28
KS 0.367
Valor P <0.010
M.O. 7 DíasNormal
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
81
2520151050
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
% M.O./g suelo
Po
rce
nta
je
Media 13.86
Desv.Est. 3.983
N 28
KS 0.386
Valor P <0.010
M.O. 14 DíasNormal
20151050
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
% M.O./g suelo
Po
rce
nta
je
Media 12.85
Desv.Est. 3.798
N 28
KS 0.312
Valor P <0.010
M.O. 28 DíasNormal
Figura 34 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de % de Materia
Orgánica producido en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se encuentran los
parámetros estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-Smirnov.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
82
1.21.00.80.60.40.20.0
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
C.E. (µS/cm)
Po
rce
nta
je
Media 0.7246
Desv.Est. 0.2157
N 28
KS 0.298
Valor P <0.010
C.E. 7 DíasNormal
1.61.41.21.00.80.60.40.2
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
C.E. (µS/cm)
Po
rce
nta
je
Media 0.9093
Desv.Est. 0.2865
N 28
KS 0.136
Valor P >0.150
C.E. 14 DíasNormal
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
83
1.00.90.80.70.60.50.4
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
C.E. (µS/cm)
Po
rce
nta
je
Media 0.7575
Desv.Est. 0.1057
N 28
KS 0.220
Valor P <0.010
C.E. 28 DíasNormal
Figura 35 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de
Conductividad Eléctrica producido en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se
encuentran los parámetros estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-Smirnov.
10005000-500-1000
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
mg HFP/kg suelo
Po
rce
nta
je
Media 2.273737E-13
Desv.Est. 457.9
N 28
KS 0.145
Valor P 0.134
HFP 7 díasNormal
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
84
2500020000150001000050000-5000-10000
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
HFP
Po
rce
nta
je
Media 7209
Desv.Est. 6289
N 28
KS 0.380
Valor P <0.010
HFP 14 díasNormal
14000120001000080006000400020000
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
mg HFP/kg suelo
Po
rce
nta
je
Media 6404
Desv.Est. 2859
N 28
KS 0.115
Valor P >0.150
HFP 28 díasNormal
Figura 36 a,b,c. Gráfica de probabilidad normal (línea azul) para los datos de HFP
producidos en a) 7 días b) 14 días c) 28 días. A la derecha se encuentran los parámetros
estadísticos y el valor p de la prueba Kolmogorov-Smirnov.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
85
Tabla 15. Valores obtenidos mediante el análisis de varianza para los efectos de las sales en
las variables medidas.
Sal p valor
CO2
p valor
pH
p valor
%
Hum
p valor
C.E.
p valor
M.O.
p valor
HFP
NaCl 0.417 0.024 0.049 0.0004 0.032
MgSO4 • 7H2O 0.46 0.049 0.0001 0.033
CaCl2 0.234 0.105 0.023 0.014
(NH4)2SO4 0.223 0.063 0.103 0.0008 0.023
KH2PO4 0.179 0.033 0.006 0.09 0.0001 0.011
FeCl3 • 6H2O 0.2 0.045 0.042 0.0006 0.218
(NH4)2PO4 0.202 0.045 0.013 0.0001 0.001
NH4Cl 0.331 0.12 0.002 0.086 0.001
KH2NH3 0.147 0.015 0.03 0.055 0.004
FeSO4 0.117 0.239 0.005 0.09 0.0001 0.005
NH4NO3 0.308 0.091 0.012 0.046 0.012
R2 98.93 99.89 99.89 99.95 99.99 99.24
R2
(ajustada) 88.30 98.79 99.41 99.48 99.97 97.24
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
86
Tabla 16. Interacciones de medias estadísticas tiempo-medio entra los medios enriquecidos,
los tiempos y las variables en el proceso de biodegradación de los hidrocarburos de fracción
pesada utilizando bioestimulación. (*DMS Diferencia Mínima Significativa) Valores con la
misma letra son estadísticamente iguales.
Tiempo-
Medio
CO2
(mg
CO2/Kg
suelo)
pH Humedad
(%
humedad/g
suelo)
Materia
orgánica
(% M.O.)
C.E.
(µS/cm)
HTP
(mg
HFP/Kg
suelo)
7 días
M1 0 c 6.97 i 63.40 a 21.27 de 0.845 cde 25455 a
M2 2125 c 6.62 q 41.76 ij 23.00 ab 0.605 ef 18605 bc
M3 4500 c 6.85 lmn 55.37 c 22.28 c 0.6 ef 5645 efgh
M4 12750 bc 6.90 jkl 60.35 b 21.00 ef 0.8 cde 3955 fgh
M5 0 c 7.01 hi 44.43 gh 20.85 f 0.84 cde 2915 fgh
M6 0 c 6.95 ijk 63.09 a 22.64 bc 0.85 cde 9685 def
M7 0 c 7.16 e 53.38 cd 19.97 g 0.87 bcde 4153 fgh
M8 0 c 7.3 d 52.51 d 21.45 d 0.865 bcde 5678 efgh
M9 11375 bc 6.85 lmn 55.55 c 19.80 g 0.41 fg 4110 fgh
M10 46417 abc 6.69 p 49.52 ef 23.23 a 0.805 cde 5435 efgh
M11 0 c 6.95 ijk 44.88 g 19.90 g 0.79 cde 6107 efgh
M12 5000 c 6.82 mno 51.76 de 21.59 d 0.835 cde 0 h
Testigo 0 c 8.68 a 48.23 f 17.71 h 0.135 g 24408 ab
14 días
M1 8625 bc 7.54 c 37.74 klm 14.89 mno 0.965 bc 11031 de
M2 88750 a 6.78 o 42.88 ghi 15.30 jkl 0.715 cdef 4088 fgh
M3 51000 abc 6.89 klm 37.88 klm 15.60 j 0.655 cdef 2650 gh
M4 70250 ab 6.97 ij 42.31 hij 14.88 mno 0.785 cde 1977 gh
M5 0 c 7.13 ef 43.71 ghi 15.08 lmn 0.755 cde 2234 gh
M6 13875 bc 7.09 fg 47.98 f 14.74 nop 1.465 a 1770 gh
M7 0 c 7.04 gh 38.62 kl 14.61 op 1.33 a 3868 fgh
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
87
M8 0 c 7.26 d 33.50 n 15.17 klm 0.935 bcd 2645 gh
M9 53375 abc 6.96 ij 35.47 mn 13.80 q 0.72 cdef 7169 efg
M10 75875 a 6.79 no 38.80 kl 16.46 i 0.875 bcde 2030 gh
M11 4250 c 7.99 b 36.64 lm 14.45 p 1.19 ab 1297 gh
M12 14000 bc 7.15 ef 40.20 jk 15.50 jk 0.86 cde 846 gh
Testigo 0 c 8.70 a 35.75 mn 13.52 q 0.62 def 16050 cd
28 días
M1 8625 bc 7.54 c 37.74 klm 14.89 mno 0.965 bc 11031 de
M2 88750 a 6.78 o 42.88 ghi 15.30 jkl 0.715 cdef 4088 fgh
M3 51000 abc 6.89 klm 37.88 klm 15.60 j 0.655 cdef 2650 gh
M4 70250 ab 6.97 ij 42.31 hij 14.88 mno 0.785 cde 1977 gh
M5 0 c 7.13 ef 43.71 ghi 15.08 lmn 0.755 cde 2234 gh
M6 13875 bc 7.09 fg 47.98 f 14.74nop 1.465 a 1770 gh
M7 0 c 7.04 gh 38.62 kl 14.61 op 1.33 a 3868 fgh
M8 0 c 7.26 d 33.50 n 15.17 klm 0.935 bcd 2645 gh
M9 53375 abc 6.96 ij 35.47 mn 13.80 q 0.72 cdef 7169 efg
M10 75875 a 6.79 no 38.80 kl 16.46 i 0.875 bcde 2030 gh
M11 4250 c 7.99 b 36.64 lm 14.45 p 1.19 ab 1297 gh
M12 14000 bc 7.15 ef 40.20 jk 15.50 jk 0.86 cde 1846 gh
Testigo 0 c 8.70 a 35.75 mn 13.52 q 0.62 def 16050 cd
DMS 61330 0.06 2.51 0.39 0.32 6780.8
En la tabla 16 se pueden apreciar valores de medias cambiantes en algunas variables,
dependiendo de la formulación del medio y del tiempo. Esto se confirma con la diferencia
mínima significativa, que en el caso del CO2 y de los HTP muestra valores muy altos, por
lo que la mayoría de estos son estadísticamente iguales.
MEJORAMIENTO DE LA BIODISPONIBILIDAD EN UN SUELO COSTERO PARA EFICIENTIZAR LA
BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS INTEMPERIZADOS.
88
Tabla 17. Comparación de medias estadísticas de las formulaciones de los medios las
variables en el proceso de biodegradación de los hidrocarburos de fracción pesada
utilizando bioestimulación. (*DMS Diferencia Mínima Significativa) Valores con la misma
letra son estadísticamente iguales.
Tiempo-
Medio
CO2
(mg
CO2/Kg
suelo)
pH Humedad
(%
humedad/g
suelo)
Materia
orgánica
(% M.O.)
C.E.
(µS/cm)
HTP
(mg
HFP/Kg
suelo)
M1 10375 cde 7.16 f 49.25 ab 16.76 cd 0.85 bc 12162 b
M2 49542 abc 6.76 i 43.05 c 17.54 b 0.65 e 8354 bc
M3 46583 abcd 7.06 g 45.73 bc 16.92 cd 0.65 e 4198 de
M4 47875 abcd 7.20 ef 49.06 ab 16.80 cd 0.77 cde 2654 de
M5 5208 de 7.34 d 43.73 c 16.00 e 0.79 cde 2701 de
M6 12375 cde 7.23 e 53.05 a 17.02 c 1.06 a 4676 cde
M7 9250 cde 7.41 c 46.75 bc 16.13 e 0.97 ab 3861 de
M8 0 e 7.56 b 43.71 c 16.59 d 0.87 bc 2774 de
M9 63000 ab 7.20 ef 45.25 bc 14.95 f 0.69 de 2550 de
M10 70389 a 7.01 gh 44.46 bc 17.94 a 0.69 de 2688 de
M11 15542 cde 7.41 c 41.96 c 16.07 e 0.91 bc 3559 de
M12 26542 bcde 6.98 h 45.95 bc 17.07 c 0.81 cd 3895 de
Testigo 0 e 8.71 a 42.25 c 15.04 f 0.25 f 18681 a
DMS 43478 0.0642 5.216 0.3916 0.1434 4040.4