InmunofluorescenciaTécnica que se utiliza para la detección de estructuras 

subcelulares que nos permiten estudiarlas con la utilización de anticuerpos acoplados a fluoróforos.

¿Conocen alguna otra técnica para marcar de manera fluorescente una proteína?

Lic. Micaela Daiana Garcia

Función de una proteína

Migración celular

Endocitosis y señalización

Interacciones

Escalas temporales

Localización subcelular

¿Por qué estudiar la localización subcelular de una proteína?

Sin estímulo

Con estímulo

La expresión de proteínas de una célula es dinámica. Esto depende de los estímulosque reciban, los requerimientos energéticos y como ésta interprete los mismosmanifestará cambios en la expresión y distribución de las proteínas de su repertoriogenético.

Ejemplo:

La inmunofluorescencia es un conjunto de técnicas en donde se empleananticuerpos para detectar y localizar, antígenos específicos en células y/otejidos.

No confundir inmunodetección con Transfección ! Proceso por el cual un gen de interés es introducido dentro de la célula eucariota por métodos químicos 

ó físicos.

Fibroblastos de ratón. Inmunodeteccióncon anti beta tubulina (citoesqueleto), y con anti paxilina (adhesiones focales). El 

núcleo se tiñó con DAPI un intercalante del ADN. 

Tubulina Núcleo PaxilinaInmunodetección

Células BHK‐21 fueron transfectadas con el plásmido DsRed‐Mitocondria. Luego la detección de actina se hizo con faloidina

acoplada a Alexa Fluor 488 (citoesqueleto).

Mitocondrias Núcleo ActinaTransfección

Fijación

Permeabilización

Bloqueo

Inmunodetección:‐ Inmunofluorescencia directa‐ Inmunofluorescencia indirecta

1

2

3

4

Pasos claves de una inmunofluorescencia

1Fijación: Preservar la localización, composición y estructura del material biológico aanalizar manteniendo lo más fielmente posible a la situación que existe invivo.Existen distintos métodos de fijación de material biológico. Esto dependerá dedistintos factores como: el tipo de microscopia a utilizar, la estructurasubcelular que se quiera detectar, entre otras.

Glutaraldehído Paraformaldehído Metanol/Acetona

Modo de acción

Por puentes entre grupos aminos de las proteínas

Por puentes entre grupos aminos de las proteínas

Por precipitación de proteínas y carbohidratos

Uso más frecuente

Microscopía electrónica yalgunos estudios de fluorescencia

Estudios de fluorescencia e inmunocitoquímicos

Gran variedad de estudios

Ventajas / Desvantajas

‐ Provee la mayor preservación de estructura fina.‐ Es el más severo de los fijadores.‐ Altera los epitopes.Provoca fluorescencia inespecífica.

‐ Produce menos autofluorescencia que el glutaraldehído.‐ Genera menor cantidad de puentes que el glutaraldehído.‐ Penetra más rápidamente dentro de la célula.

‐ La fijación es más rápida que con los aldehídos.‐ Puede alterar el patrón de localización de los antígenos.‐ Fija y permeabiliza al mismo tiempo.‐ Puede generar contracción en la muestra.

2 Permeabilización:Existen distintos métodos de permeabilización que son mas “suaves” o mas “fuertes”. Esto dependerá de la naturaleza del compuesto permeabilizante a utilizar. Produce poros en las membranas celulares. Lo que permite el ingreso de los anticuerpos a la célula si queremos detectar estructuras internas de la célula.

Célula fijada Permeabilización

Inmunodetección

Célula positiva

Célula negativa

Anticuerpo específico

Isotipo

Se utilizan generalmente detergentes no iónicos que solubilizan los lípidos de la membrana produciendo de manera irreversible o reversible poros en la membrana (por ejemplo Tritón X‐

100, NP40).

3 Bloqueo

• Su función es impedir interacciones inespecíficas de los anticuerpos con elmaterial biológico a analizar y así reducir la marcación inespecífica.

• En general se utilizan soluciones protéicas concentradas (GeneralmenteAlbúmina bovina sérica o gelatina de pescado).

• El anticuerpo primario debe competir con la proteína bloqueante para unirsea su epitope y así detectar la estructura de interés.

• Se reduce la unión inespecífica del anticuerpo por epitopes no específicos.

4 Inmunodetección:

• Los anticuerpos son proteínas que tienen la capacidad reconocerespecíficamente y unirse con alta afinidad a otras moléculas(antígenos).

• La molécula que es reconocida por los anticuerpos se denominaantígeno. Cada antígeno tiene al menos un epitope o regiónreconocida por un anticuerpo.

Anticuerpos

Se trata de moléculas sintetizadas por linfocitos B y capaces de reconocer y 

unirse con alta afinidad a otras moléculas 

Lic. Eliana Fernandez

¿Cómo están compuestos?Las inmunoglobulinas se encuentran formadas por 4 cadenas polipeptídicas: 2 cadenas pesadas (H, en verde) (55 000 dalton) y 2 cadenas livianas (L, en amarillo) (25 000 dalton)

Cada cadena posee regiones variables que permiten el reconocimiento específico de antígenos y otra región Constante.

El antígeno es reconocido por la región variable del anticuerpo.La parte del antígeno reconocida se denomina epitope.

Paratope

Epitope

Epítopes antigénicos

Cada antígeno suele presentar varios determinantes antigénicos o epitopes.

Anticuerpos policlonales

Anticuerpos producidos por diferentes clones de linfocitos

Mezcla heterogénea de anticuerpos que reconocen distintos epitopes de un mismo antígeno

Anticuerpos monoclonales

Anticuerpos producidos por un único clon de linfocitos

Población de anticuerpos homogéneos que reconocen el mismo epitope de un antígeno

¿Cómo se obtienen los anticuerpos policlonales?

¿Cómo se obtienen los anticuerpos monoclonales?

Se obtienen inmortalizando linfocitos B, por fusión con células de mieloma de ratón.

Las células fusionadas (hibridomas) producirán

inmunoglobulinas idénticas a las que producía el linfocito B normal parental y son inmortales como el 

mieloma que le dio origen.

César MilsteinPremio Nobel de Química 1984

¿Cómo debe ser el anticuerpo secundario?

¿Cómo se obtienen los anticuerpos secundarios?

IgG purificadas de conejo

IgG anti‐IgG de conejo hecha en ratón

Gracias!