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Laboratorio de Análisis Instrumental
Sesión: 1
“Análisis cualitativo y cuantitativo de aminoácidos
utilizando derivatización pre-columna con o-ftaldialdehído
(OPA) y separación por HPLC en fase reversa”
Integrantes: Alvaro Zevallos 20084799
Fabiola Bravo 20092302
Lorena Veliz 20084662
Fecha de realización del experimento: 18/09/12
Fecha de entrega del informe: 03/10/12
Lima, 3 octubre del 2012
I .Introducción:
En este laboratorio se trabajó con o-ftaldialdehido (OPA) para la derivatización pre-columna
de una muestra (mezcla de aminoácidos). Esta técnica permitió el posterior análisis por
cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) de la composición de aminoácidos
presentes.
La cromatografía es un método de separación físico, en donde los componentes que van a
ser separados se distribuyen entre dos fases, una estacionaria y otra móvil. En HPLC, la
fase móvil es un disolvente líquido que contiene a la muestra como una mezcla de solutos.
La forma de separación de esta cromatografía se puede dividir en 5 modos de
funcionamiento: cromatografía líquido-sólido, cromatografía líquido-líquido, cromatografía de
fase ligada, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía por exclusión de tamaño. El
modo que se elija dependerá de las propiedades del analito; en nuestro caso, al trabajar con
aminoácidos, se recurrió a la cromatografía de fase ligada para la separación, la cual es un
tipo de cromatografía de reparto de alta resolución.
Existen dos tipos de variaciones; de fase normal (fase estacionaria más polar que fase
móvil) y de fase reversa (fase estacionaria menos polar que fase móvil, los componentes
más polares aparecen primero y una disminución de la polaridad de la fase móvil disminuye
el tiempo de elución).
Debido que las fases móviles pueden ser químicamente activas, los componentes del
equipo deben de estar hechos de materiales resistentes a posibles ataques de dicha fase
(por lo general están hechas de acero inoxidable pasivadas con HNO3 6M).
- Tratamiento de la muestra:
Ciertos analitos no pueden ser detectados de manera directa debido a que presentan poco o
ninguna absorción en el rango UV-Vis en el caso de un detector DAD. Por ello, se recurre a
la derivatización pre o post-columna para detectarlos. Asimismo, la derivatización permite en
ciertos casos un análisis más detallado y una separación más adecuada. En el caso de pre-
columna, la derivatización se realiza antes del análisis y se considera los cambios químicos
de la muestra. En post-columna, la derivatización se efectúa después de la elución de la
muestra y antes de que llegue al detector. Un método más adecuado, al tratar con
aminoácidos, es la derivatización pre-columna con o-ftaldehido (OPA), lo cual ofrece
sensibilidad (pero derivados poco estables). Este método se utiliza para fase reversa y se
obtiene como derivados alquil-isoindoles
- Válvulas de inyección
Estos contienen cámaras de volumen conocido (loop). Estas válvulas tienen dos tipos de
posiciones, posición de llenado y posición de inyección. En la primera, el analito se introduce
al loop con una microjeringa, mientras que la fase móvil pasa directamente a la columna. En
la posición de inyección, la fase móvil arrastra al analito hasta la columna.
- Columnas
Están hechas generalmente de acero inoxidable, tienen una longitud entre 3 y 25 mm y un
diámetro entre 2 y 5mm. El empaquetamiento de la columna suele ser de partículas porosas
uniformes, esféricas o irregulares que tienen diámetros entre 3 y 10μm. Para evitar el rápido
deterioro de la columna, se coloca un dispositivo previo a la columna (pre columna), el cual
retira posibles partículas de gran tamaño que puedan obstruirla.
- Sistema de bombeo
Debido al uso de altas presiones, las bombas utilizadas deben de proporcionar un flujo
aceptable de eluyente. Los sistemas de bombeo deben de estar hechos de un material
inerte frente a los disolventes empleados y suministrar un flujo de eluyente libre de
pulsaciones en el margen de 0.1 y 10ml/min con una presión del 0.5%. Además, deben de
poder generar presiones superiores a 6psi.
- Detector
El detector depende de la naturaleza del analito (los más usados se basan en la absorción
de UV o visible). Este debe de tener un volumen muerto bajo para reducir el engrosamiento
dela banda adicional de la columna. Además, debe de tener un tamaño pequeño y ser
compatible con el flujo de líquido. Uno de los detectores UV-Vis usados en cromatografía
líquida es el detector de arreglo de diodos en el cual se irradia la luz a una celda que
contiene al fluido en movimiento. Este detector es del tipo multiplex y realiza la separación
de luz en el espacio por medio de dispersores de luz como prismas o rejillas y su detección
por medio de un arreglo de diodos.
Figura 1. Reacción de aminoácidos con alquiltiol y OPA.
II .Objetivo(s):
Hacerse familiar con el sistema de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
en fase reversa.
Analizar cuantitativa y cualitativamente un conjunto dado de aminoácidos, empleando
para esto la técnica de derivatización pre-columna con OPA y su separación por
HPLC.
Entender el funcionamiento de la interfaz de control, así como las partes más
resaltantes del instrumento cromatográfico.
Conocer la utilidad de la información proporcionada en el espectro UV.
Estudiar el proceso e importancia de la derivatización en la preparación de las
muestras (para su análisis).
Analizar la composición de aminoácidos en la muestra preparada, por UV, luego de
su exitosa separación.
III .Parte experimental:
1. Materiales: 12 tubos para microcentrífuga de 1.5 mL; micropipetas ajustables hasta
1000, 200 y 20 µL; puntas para micropipeta (de tres distintos tamaños); una gradilla para
tubos de microcentrífuga; papel aluminio y papel toalla; marcador indeleble; y frasco para
desecho de solventes.
Figura 2. Detector de arreglo de diodos.
2. Reactivos:
Tabla 1. Propiedades fisicoquímicas de los aminoácidos empleados (referidos a los L -
comercialmente accesibles).
Aminoácido P.M (g/mol)
Solubilidad (g/L)
Densidad (g/mL)
pH en solución
#CAS
Asparagina 150.14 22 (20°C) 0.530 4.0 - 5.5 5794-13-8Acido aspártico 133.10 4 (20°C) 0.430 2.5 - 3.5 56-84-8
Acido glutámico 147.13 11.1 (25°C) 0.460 3.0 - 3.5 56-86-0
Alanina 89.09 166.5 (25°C) 0.660 5.5 - 6.5 56-41-7Fenilalanina 165.19 27 (20°C) 0.580 5.4 - 6.0 63-91-2
Metionina 149.20 48 (20°C) 0.550 5.0 - 7.0 63-68-3
Serina 105.09 364 (20°C) 0.570 5.0 - 6.0 56-45-1Disponible en: http://www.fichasdeseguridad.com.
Tabla 2. Propiedades fisicoquímicas de los reactivos y solventes empleados.
Reactivo P.M (g/mol)
Solubilidad (g/L) Densidad (g/mL)
Toxicidad (mg/kg)
#CAS
O-ftaldehído 134.13 53 (20°C) 1.13 178 643-79-8Mercaptoetanol 78.13 Miscible (20°C) 1.12 98 60-24-2
Etanol (p.a) 46.07 Miscible (20°C) 0.793 6200 64-17-5Metanol (p.a) 32.04 Miscible (20°C) 0.792 5628 67-56-1
Cloroformo (p.a) 119.38 Miscible (20°C) 1.48 695 67-66-3Acetato de sodio 136.08 613 (20°C) 1.42 3530 6131-90-4
Di-sodiotetraborato 381.32 51.4 (20°C) 1.72 2660 1303-96-4Disponible en: http://www.fichasdeseguridad.com.
3. Instrumentos:
Mezclador tipo vórtex
Marca Thermolyne, modelo Mixer 16700
(Figura 1.)
El mezclador tipo vortex fue usado para la
primera agitación a temperatura ambiente en la
preparación de las muestras, luego de añadir
la solución OPA a la mezcla de aminoácidos.
El resultado fue la separación de las fases. La
agitación fue de aproximadamente 2 minutos
por muestra.
Figura 3. Mezclador tipo Vortex
Microcentrífuga de mesa
Marca Eppendof, modelo Centrifuge 5417C
(Figura 2.)
Una vez más, para separar completamente las
fases, se agito cada muestra, incluyendo la
muestra problema, en la microcentrifuga de
mesa por dos minutos.
Cromatógrafo HPLC
Marca Merck Hitachi; con inyector manual, Bomba cuaternaria y detector DAD. (Figura
3.)
El equipo de HPLC es el instrumento más importante en esta
experiencia. El cromatógrafo Merck-Hitachi usado lleva
acoplado una bomba cuaternaria y un detector de arreglo de
diodos (DAD). Dado que la correcta inyección de la muestra
podría definir el éxito o fracaso del experimento, el cromatógrafo
cuenta con una paleta de inyección la cual va rotando con cada
inserción de la muestra y mostrando diferentes entradas.
Se inyecta la muestra a través de una microjeringa de punta roma con capacidad para 100
µL, cubierta de vidrio y con un émbolo de acero. Se tomaron aproximadamente 60 µL de
cada muestra, y se debe tener en cuenta que la presencia de burbujas puede ocasionar
error en las mediciones, por lo cual es necesario evitarlas; además, dado que el “loop”, es
decir, el depósito en donde se coloca la muestra tiene una capacidad aproximada de 20 µL,
lo recomendable es inyectar el doble de su capacidad para lavar la tubería. La manija de
inyección se rota 45-60° desde su posición inicial (Figura 6.), esta posición se conoce como
“load” y es en la cual la fase móvil fluye desde la bomba cuaternaria a la columna. No toda la
fase móvil es retenida en la columna por lo que el “loop” también está conectado a un puerto
de desechos.
Una vez inyectada la muestra, se debe volver a la posición inicial, y rotar nuevamente la
manija de inyección, esto se conoce como la posición “inject”, y es en donde la muestra es
arrastrada por la fase móvil hacia la columna.
La columna empleada fue Merck RP-18 (fase reversa, octadecilsilano) de 125 mm de
longitud y 4,6 mm de diámetro. Los componentes de la muestra se retrasan
diferencialmente, dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase
Figura 4. Microcentrifuga de mesa
Figura 5. Cromatógrafo HPLC
estacionaria conforme pasan por la columna. Se utilizó una columna de fase reversa de
partícula esférica, en donde la fase estacionaria mantiene un carácter polar. Esta no
presentaba un sentido de flujo determinado y era monolítica, por lo que soportaba flujos
altos. Esta era de acero inoxidable y poseía filtros de acero poroso en su interior. Para
almacenar la columna, se colocan guarda columnas, del mismo material de acero
inoxidable, en los extremos de la misma, de manera manual y realizando un ajuste adicional
con llaves específicas.
Para comprobar si el comportamiento de la columna es el adecuado, se procede a revisar la
hoja de certificación de la misma, en donde se describe un método optimizado con rangos
de valores de asimetría de picos y número de platos esperados. Se especifica, también, los
cuidados que uno debe tener durante su manipulación y las condiciones de trabajo
adecuadas.
Como se ha mencionado antes, el detector utilizado fue en DAD, que permite captar las
señales de todos los λ’s a la vez ya que es sistema multiplex. El arreglo completo de un
sistema de HPLC se observa en la figura 6. Gracias al detector de diodos y al software
utilizado, los espectros obtenidos son tridimensionales y presentan 3 ejes: el eje de
absorbancias, el eje de longitud de onda y el del tiempo de retención, estos se pueden
observar en la figura 7, presentada a continuación.
Figura 6. Sistema HPLC, partes fundamentales.
Teniendo estas tres variables es posible fijar alguna de ellas, como por ejemplo la longitud
de onda, y obtener el cromatograma en base al tiempo de retencion y los espectros UV.
Además del sistema del equipo, es importante ajustar las condiciones adecuadas, en este
caso, se trabajo a una temperatura de 31.4°C. La presión fue ajustada a 1200 psi, sin
embargo, Se observó que cuando el solvente orgánico llegó a un valor entre 40 . El flujo
empleado fue de 1mL/min.
4. Procedimiento:
4.1 Preparación del Reactivo OPA:
Ya que el reactivo necesita un tiempo de 12 horas de preparación anticipada para su uso,
este fue entregado ya listo para trabajar. Fue preparado utilizando 27mg de reactivo OPA en
0.5 mL de etanol y se añadieron 5 mL de buffer de borato de sodio de 0.4M a pH de 9.5,
además, se agregaron 20 mL de mercaptoetanol.
4.2 Preparación de la solución estándar de Aminoácidos:
Esta solución también se nos dio preparada, para la cual se usaron 1 mg de L-aminoácidos,
estos fueron: asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, alanina, fenilalanina, metionina y
serina. A su vez, se disolvieron en 2 ml del buffer de borato mencionado anteriormente.
4.3 Curva de Calibración y Muestra Problema
Para determinar el contenido de aminoácidos en la muestra se realizó una curva patrón para
cada uno de los 7 aminoácidos utilizados. Esto se logra colocando diferentes volúmenes de
la mezcla de aminoácidos en 5 tubos diferentes de microcentrifuga. Los volúmenes
utilizados se indican en la tabla 3.
Figura 7. Cromatograma en tres dimensiones
Tabla 3. Reactivos añadidos en la preparación de cada muestra de aminoacidos.
Como se observa en la tabla 3, los volúmenes de solución estándar y buffer son distintos
para cada tubo. Además, una vez añadido el reactivo OPA se esperaron 2 minutos a
temperatura ambiente, luego de eso se añadieron 200 µL de cloroformo, y se agitaron (cada
uno por un tiempo de 2 minutos) en un Vortex. Una vez terminado, los tubos se colocaron en
una micro-centrifuga y se agitaron a máxima velocidad (8000 revoluciones por minuto) por 2
minutos. La muestra problema se trabajo de igual manera q los estándares anteriores.
Luego, se separó la mayor cantidad posible de la fase acuosa sobrenadante (si es posible
150 µL) y se colocaron en tubos limpios, los cuales se nombraron como se indica en la tabla
3. Una vez listos se tomaron aproximadamente 60 µL de cada muestra y se inyectaron en el
HPLC. Previamente, se lavó la columna con metanol para eliminar cualquier resto de la
solución anterior que haya podido quedar dentro de la columna.
4.4 Cromatografía
Se decidió que la secuencia de inyección de los estándares seria de la siguiente manera:
Tubo N°1, Tubo N°2, Tubo N°3, Muestra Problema, Tubo N°4, Tubo N°5.
Siguiendo la secuencia de inserción correcta que se describió anteriormente para el
cromatógrafo HPLC, uno a uno se inyectaron los estándares y fueron analizados por un
tiempo de aproximadamente 28 minutos cada uno.
La fase móvil era una mezcla de metanol y agua a pH 6 (buffer de acetato de sodio). La
proporción de metanol fue de 20% durante los dos primeros minutos y luego el contenido de
metanol en la fase móvil se fue incrementando por 16 minutos hasta llegar a 48% de
metanol, lo cual permitió eluir todos los aminoácidos menos polares. Luego se aplicó otro
gradiente (de 5 minutos) para volver al 20% de metanol y se esperaron otros 5 minutos para
estabilizar el sistema. Esto se volvió a repetir para cada injección.
Tubo N°1 Tubo N°2 Tubo N°3 Tubo N°4 Tubo N°5 Muestra
0 µL sol.
estándar
5 µL sol.
estándar
10 µL sol.
estándar
20 µL sol.
estándar
50 µL sol.
estándar
50 µL de la
muestra
50 µL buffer 45 µL buffer 40 µL buffer 30 µL buffer 0 µL buffer 0 µL buffer
200 µL de
OPA
200 µL de
OPA
200 µL de
OPA
200 µL de
OPA
200 µL de
OPA
200 µL de
OPA
500 µL de
cloroformo
500 µL de
cloroformo
500 µL de
cloroformo
500 µL de
cloroformo
500 µL de
cloroformo
500 µL de
cloroformo
IV .Resultados:
Se usó una mezcla de soluciones stock de aminoácidos cuyas concentraciones se muestran
en la tabla 4.
Se prepararon curvas de calibración de cinco puntos; el primer punto era el blanco, los tres
siguientes eran diluciones y el quinto era la mezcla sin diluir.
La proporción de concentraciones de los puntos 2, 3 y 4 con respecto al del punto 5 eran
respectivamente de 0,1/1; de 0,2/1 y de 0,4/1.
Tabla 4. Datos de la mezcla de soluciones stock de aminoácidos sin diluir.
Apartir de la información de la tabla 4 se puede deducir la de los demás puntos de las
curvas de calibración. Además, asumiendo que todas las injecciones fueron de 20 ul, y que
los aminoácidos fueron derivatizados completamente y se encontraban solo en la fase
acuosa, la masa total injectada con respecto a la masa total derivatizada se encuentra en la
misma proporción para cada aminoácido en cualquiera de los puntos (o número de tubo de
centrifuga).
Teniendo esto en cuenta se decidió realizar la abtención de las curvas de calibración de
A (área de integración )VsM (ug), donde M es la masa total del aminoácido que fue usada
para la preparación de las soluciones estándar, cuyo valor varía para cada punto. Se prefirió
realizar las curvas respecto a M ya que este valor era conocido, mientras que la masa de
aminoácidos injectada y la relación entre la concentración de la solución inicial y la acuosa
sobrenadante se desconocían.
Por otro lado el orden de elución
de lo aminoácidos se explica solo
por la diferencia en la estructura
de estas, teniendo en cuenta que
los aminoácidos más hidrofílicos
salieron primero por su mayor
afinidad a la fase móvil
(metanol/agua a pH 6), cuya
composición variaba durante el
proceso de separación
cromatográfica. Gráfico 1. Cromatograma de referencia.
ASP GLU ASN SER ALA MET PHEConcentración (mg /ml) 0,5 0,5 0,48 0,53 0,53 0,53 0,5Masa (ug) en 50ul 25 25 24 26,5 26,5 26,5 25
La identificación de los picos se realizó por comparación con el cromatograma de referencia
(Gráfico 1) proporcionado durante la práctica de laboratorio. Además, la figura 8 muestra las
estructuras de los aminoácidos según el orden de elución del Gráfico 1.
1o ASP 2o GLU 3o ASN
4o SER 5o ALA 6o MET 7o PHE
La información obtenida de la cromatografía se puede representar tridimensionalmente (la
intensidad de la señal detectada respecto al tiempo y la longitud de onda). En este caso se
obtuvo esta misma información de la muestra problema en el cromatograma bidimensional
λ (longitud de onda )VsRT (tiempo de retención )del Gráfico 2, donde la intensidad es
representada con una escala de colores. Además, el cromatograma
I ( intensidad )Vs RT ( tiempo deretención ) a 340 nm se muestra en el Gráfico 3 y es la sección
horizontal de la proyección tridimensional del cromatograma
λ (longitud de onda )Vs RT ( tiempode retención ).
Figura 8. Orden de elución de aminoácidos y sus estructuras.
Gráfico 2. Cromatograma de λ (longitud de onda )VsRT (tiempo de retención ).
Luego se prepararon las curvas de calibración A (área de integración )VsM (ug) para cada
aminoácido usando cinco puntos y aplicando una regresión lineal. Esto se logró usando las
áreas de integración (tabla 5) de los picos identificados anteriormente en los cromatogramas
I ( intensidad )Vs RT (tiempo deretención) obtenidos a 340 nm. El gráfico 4 muestra las curvas
de calibración para tres aminoácidos.
Tabla 5. Datos de las áreas de integración de los picos de cada aminoácido.
Tabla 6. Datos de las curvas de calibración para cada aminoácido.
Aminoácidos B A R2
ASP 72397 80886 0.996GLU 67847 72670 0.995ASN 5951.9 14723 0.972SER 27177 66179 0.977ALA 15196 57248 0.944MET 42500 48871 0.994PHE 52029 31122 0.998
Gráfico 3. Cromatograma de I ( intensidad )Vs RT ( tiempo deretención ).
Aminoácidos Tubo N°1 Tubo N°2 Tubo N°3 Tubo N°4 Tubo N°5 Muestra
ASP 15363 274880 480386 844533 1866127 14553
GLU 2780 253573 456083 791786 1742612 611120
ASN - 33998 53714 75018 153722 -
SER - 153929 259236 375604 766464 -
ALA 1660 129320 180574 206214 453045 152627
MET - 167407 305560 530041 1155980 455251
PHE - 159110 307240 585108 1315380 304930
La regresión lineal de las curvas de calibración permitió obtener la ecuación de la linea de
tendencia para cada aminoácido simbolizado por Y=BX+A de manera general. La tabla 6
muestra la información obtenida de estas curvas patrón.
0 5 10 15 20 25 300
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
f(x) = 42500.1898734177 x + 48870.8892405063R² = 0.994148223503028
f(x) = 15195.9027943635 x + 57247.5158227849R² = 0.943593281686545
f(x) = 27177.3632672558 x + 66178.5569620253R² = 0.976520281697809
SERLinear (SER)ALALinear (ALA)METLinear (MET)
Masa (ug)
Á
rea
Luego se compararon los tiempos de retención de los picos del cromatograma de la muestra
problema con los obtenidos en los cromatogramas de las soluciones estándar con el objetivo
de identificar los aminoácidos presentes y conocer el área de integración de los picos
identificados. A continuación se usaron los datos de las curvas patrón mostrados en la tabla
6 para cuantificar la cantidad de cada aminoácido presente en la muestra problema.
Tabla 7.Contenido de aminoácidos en la muestra problema.
Gráfico 4. Cromatograma de I ( intensidad )Vs RT ( tiempo deretención ).
GLU ALA MET PHE
Concentración (mg /ml) 0,16 0,13 0,19 0,11
Masa (ug) en 50ul 7,94 6,28 9,56 5,26
El cromatograma obtenido para el blanco se muestra a continuación:
Se ovtuvieron espectros UV-Vis a partir del cromatograma tridimensional cuendo se elegía
un solo tiempo de retensión. Por ejemplo, los espectros UV-Vis para los aminoácidos
fenilalanina y ácido glutámico se muestran en los gráficos 6a y 6b, y se observa que estos
poseen un perfil muy similar.
(a) (b)
V .Discusión:
Dado que los aminoácidos estudiados no presentan absorción apreciable en el rango UV-
Vis, fue necesario realizar la derivatización de estos con el objetico de que adquieran mayor
capacidad de absorción en el rango UV-Vis. El monitoreo de la absorbancia se realizó a
Gráfico 5. Cromatograma del punto uno, blanco.
Gráfico 6. espectros UV-Vis para la fenilalanina (a) y el ácido glutámico (b).
λmax= 340 nm debido a que los alquilisoindoles obtenidos luego de la derivatización
genralmente absorbían cerca de esta longitud de onda.
De los espectros UV-Vis obtenidos (dos de ellos se muestran en el Gráfico 6), se observó un
perfil similar en todos los casos. Esto se puede deber a que todos presentaban un mismo
grupo cromóforo (el grupo alquilisoindol).
El espectro del ácido aspártico presentó ciertas modificaciones en el patrón del espectro de
un alquilisoindol típico debido a que a ese tiempo de retención co-eluía una impureza de
naturaleza desconocida cuyo espectro de absorción fue observado en el blanco (Gráfico 5).
La fase esacionaria RP-18 utilizada presenta cadenas de octadecilo (apolares) unidas
covalentemente a la superficie de la silica particulada y estas explican el porqué los
compuestos apolares tienen una mayor tendencia a retenerse (Gráfico 1).
La separación en este tipo de columnas es por medio de una distribución del analito en la
fase móvil y en la fase estacionaria. El flujo de la fase móvil permite que los analitos se
muevan a lo largo de la columna. Dado que todos los aminoácidos han sido derivatizados, la
única interacción que los diferenciara será la correspondiente a la cadena R del aminoácido
(Figura 8). Los primeros aminoácidos en eluir fueron los polares ácidos como ácido
aspártico y el ácido glutámico; los siguientes fueron los polares no ionizables como
asparragina y la serina; luego salieró la alanina, que era la menos apolar de los apolares; y
finalmente salieron los más apolares, metionina y fenilalanina (Figura 8).
El gran rango de polaridad que caracteriza a los aminoácidos justifica la necesidad de usar
una fase móvil con gradiente de polaridad para lograr eluir todos los compuestos. El
incremneto de la apolaridad se observa con la subida de la linea azul del Gráfico 3. Además
la buena se paración de los picos observada en todos los cromatogramas (por ejemplo,
Gráfico 3) evidencia la eficacio del uso de una fase móvil variable.
Una forma directa de encontrar los tiempos de retención de los aminoácidos analizados es
mediante la inyección de estándares (bajo las mismas condiciones de separación
cromatográfica). Este infomación se obtuvo del cromatograma de referencia (Gráfico 1).
Sabiendo estos tiempos de retención fue posible asignar cada uno de los picos de los
cromatogramas obtenidos.
Por otro lado, algunos picos observados, como es el caso del ácido glutámico (Gráfico 3),
presentaban cierto ensanchamiento del pico hacia mayores tiempos de retención. Este
ensanchamiento puede explicarse con un equilibrio ácido–base en la solución; lo cual pudo
causar la presencia de dos especies en equilibrio que habrian producido el ensanchamiento
del pico.
Se observó que los valores de las áreas de integración (Tabla 5) de los aminoácidos
presentes en la muestra se encuentran dentro de rango de las obtenidas para las soluciones
estándar. Esto permitió que la aplicación de las ecuaciones de calibración (Tabla 6)
obtenidas no produsciera una fuente de error.
Las valores de altos de R2 mostrados en la Tabla 6 evidencia el alto grado de linealidad de
las curvas de calibración. Esta diferencia en la presición del ajuste se puede observar
fácilmente en la Gráfica 4, donde los puntos azules y rojos no se ajustan a su linea de
tendencia tan bien como los puntos verdes.
Además, la razón por la cual no todos los R2 están alrededor de 0.99 se explica por la
diferencia en estabilidad de los derivados obtenidos, los cuales puderon haberse
descompuesto antes de la injección. Este hecho sería una fuente de error presente en
diferente grado en cada curva de calibración.
Otras posibles fuentes de error que pudieron haberse generado en este experimento se
centran en errores de las mediciones de volumen y masa. El proceso de preparación de la
muestra requiere que todas las muestras analizadas hayan sido tratadas de manera similar
y por el mismo usuario, ya que diferencias en volúmenes medidos o adición de reactivos
pueden alterar las concentraciones de los analitos. La diferencia en los intervalos de dos
minutos que se debian esperar para que se complete la reacción de derivatización también
puede ser una fuente de error.
Por otro lado, la preparación de los bufferes y soluciones usadas en la fase móvil pueden
afectar la separación ya que varían la composición del eluyente. Asimismo, la columna
usada debe estar limpia y equilibrada adecuadamente para poder tener una buena
reproducibilidad en los ensayos. Por último, se debe mencionar la pureza de los estándares
usados ya que la presencia de otros compuestos puede interferir en el análisis produciendo
nuevos picos en el cromatograma o alterando los valores de masa medidos.
Con los experimentos realizados no se puede asegurar que los valores de concentración de
los aminoácidos en la muestra problema (Tabla 7) sean exactos. Para esto sería necesario
analizar una mezcla estándar diferente y con concentraciones conocidas y luego ver cuán
bien resulta el aplicar las ecuaciones de calibración (Tabla 6).
VI .Conclusiones:
El análisis de aminoácidos por HPLC-DAD requirió de un proceso de derivatización
con OPA previo, que permitiese mejorar las propiedades de absorción de estos al
formar alquilisoindoles que absorbiesen en el rango UV-Vis.
Se pudo realizar una separación cromatográfica eficiente de los aminoácidos
estudiados al aplicar HPLC de fase reversa en una columna Merck RP-18.
El gradiente de elución de fase móvil permitió la separación de los picos de los
aminoácidos; los cuales fueron detectados por un equipo de UV-VIS a 340 nm, ya
que absorben entre 200-400 nm.
Se pudieron construir curvas de calibración que presentaban una alta linealidad.
En la muestra desconocida solo se encontraron los aminoácidos ácido glutámico,
alanina, metionina y fenilalanina en concentraciones de 0.16 mg/ml, 0.13 mg/ml,
0.19 mg/ml y 0.11 mg/ml respectivamente.
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