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IDENTIFICACIÓN EN Entamoeba histolytica DE UNA PROTEÍNA
SEMEJANTE A LA PARAFLAGELAR DE Tripanosoma sp y
Leishmania sp
Clave del Proyecto: 20060676
Responsable: Dr Saúl Rojas Hernández
ESM
RESUMEN Entamoeba histolytica es un parásito estricto que no presenta organelos
diferenciados típicos para la locomoción. Aunque se ha sugerido que la actina, la
proteìna mas abundante en su citoplasma se ha relacionado con la motilidad
celular así como, en la invasión tisular de esta amiba. En este trabajo se
analizaron los bancos genomicos de Entamoeba histolytica
(http://www.sanger.ac.uk/Projects/E_histolytica/) y se encontraron dos secuencias
que mostraron homología con el gen de la proteína paraflagelar de 69 y 73 kDa de
Tripanosoma sp y Leishmania sp. Tomando en cuenta estos datos, y utilizando la
técnica de RT-PCR se identifico dos secuencias (Ent1963c12.p1k and Ent
Ent1963c12.q1k) las cuales tienen una gran homología con la proteína
paraflagelar de 73 kDa de Trypanosoma sp and Leishmania sp. Por otro lado
utilizando un suero de conejo anti-H-SDWSETQRQKLRG-OH una secuencia de
aminoácidos correspondiente a los residuos 39-51 de la proteína paraflagelar de
73 kDa de Trypanosoma brucei; se detecto por inmunoblot una banda de 114 kDa
en extractos totales de E. histolytica. Por inmunohistoquímica, esta proteína fue
localizada en los trofozoítos de E. histolytica en el citoplasma cerca de la
membrana celular, cuando las amibas se preincubaron con Con A. Estos
resultados nos estarían indicando que la proteína de 114 kDa de E. histolytica
podría estar participando en la locomoción de E. histolytica y sería la primera
evidencia en E. histolytica existe una proteína paraflagelar parecida a la de
Tripanosoma.
1
INTRODUCCIÓN
Tripanosoma brucei es un protozoario parásito causante de la enfermedad del
sueño en humanos, se transmite a través de un vector la mosca Tsetse (Glossina
palpalis) y afecta a aproximadamente a 60 millones de personas en África (2,3).
Todos los Trypanosomatidos poseen un organelo, el cinetoplastido que contiene
DNA y se localiza dentro de una voluminosa y larga mitocondria, los flagelos
tienen su origen en una cavidad y sus cuerpos básales se localizan encima o
cerca del cinetoplasto (2). El flagelo esta compuesto de el axonema microtubular
(motor celular) y la proteína paraflagelar (PPF) altamente organizada y útil en la
movilidad celular (4).
La PPF es un componente único en kinetoplastidos, euglenophytas y
dinoflagelados, en estudios recientes tanto a nivel bioquímico, genético e
inmunológico han demostrado la presencia de dos proteínas PPF de 69 y 73 kDa
en varios (3).
Los trofozoitos de Entamoeba histolytica son células capaces de penetrar tejidos y
producir lesiones en diferentes órganos de hospederos humanos. Como parásitos
estrictos no presentan organelos típicos bien diferenciados como es la mitocondria,
aparto de Golgi, retículo endoplásmico rugoso centríolos y microtúbulos (8),
poseen una gran plasticidad, movilidad y recambio de membrana plasmática,
características que son reguladas por una interacción coordinada entre el
citoesqueleto y la superficie celular; se ha identificado la actina como la proteína
más abundante del citoesqueleto de Entamoeba histolytica y que esta asociada a
funciones de movimiento y en mecanismos de patogenicidad (5).
Recientemente y gracias a las técnicas de Biología molecular se han identificado
secuencias genómicas que han permitido la identificación de nuevas proteínas.
Esto han permitido la caracterización de genes específicos, particularmente
asociados a cepas patógenas y ello ha ayudado a comprender los mecanismos
de patogenicidad amibiana. Como se ha mencionado anteriormente, en la
Entamoeba histolytica se conoce a la actina como una proteína asociada a
funciones de movilidad y patogenicidad, sin embargo nosotros hemos identificado
2
una secuencia en el banco genómico de Entamoeba histolytica que comparte un
90% de homología con la proteína PFR de otros parásitos de importancia como
Tripanosomatidos. Esto nos hace suponer que la Entamoeba histolytica pudiera
tener una proteína diferente a la actina que le pudiera conferir movilidad y que
además pudiera estar involucrada en la patogenicidad de esta. Por esta razón
decidimos primeramente identificar en Entamoeba histolytica el gen que transcribe
para esta proteína en tripanosomas y posteriormente identificar la proteína.
También se realizará secuenciación para hacer un análisis de la secuencia de esta
nueva variante. El objetivo del presente trabajo fue identificar una proteína
semejante a PFR en Entamoeba histolytica mediante técnicas de RTP-PCR, e
Inmunodetección.
3
MATERIAL Y MÉTODOS
Cultivo de amibas. Se trabajó con trofozoítos de Entamoeba histolytica de la cepa HM1:IMSS, la cual
se cultivó en medio axénico de acuerdo al procedimiento de Diamond (9). Las
amibas se cosecharon durante la fase logarítmica de crecimiento, se despegan
por congelación y se lavaron por centrifugación a 1500 g por 10 minutos con
solución de fosfatos (PBS). Posteriormente a la pastilla celular se le agregó 1 ml
de cóctel de inhibidores de proteasas. Las amibas se rompieron por ciclos de
congelación y ebullición. El extracto resultante se almacenó a -70°C. La
concentración de proteínas se determinó por la técnica de Bradford (10).
Extracción de RNA total de Entamoeba histolytica. Las amibas se cosecharon en fase logarítmica y se lavaron con PBS,
posteriormente se obtuvo el RNA total utilizando el kit Perfect RNATM, Eukaryotic,
Mini (Eppendorf). El RNA purificado se cuantifico usando GENESYSTM 10 Series
(ThermoSpectronic). 5 µg de RNA fueron separados en un gel de agarosa al 5%
que contenía bromuro de etidio en buffer MOPS y 0.2 M de formaldehído. Para
prevenir la contaminación del RNA, las muestras fueron tratados con DNase
(invotrogen) antes de la transcripción reversa. Las muestras fueron almacenadas a
-70ªC
Ensayos de RT-PCR 0.5 µg of RNA fueron transcritos en 20 µl buffer de reacción cMaster RTplusPCR
System (Eppendorf), la reacción se llevo a cabo en un termociclador (Mastercycle
thermocycler Eppendorf). El protocolo se realizo a 50°C 30 min, 94°C 2min, 35
ciclos de desnaturalización (94°C 10 seg), alinamiento (75°C 30 seg), y la
elongación (68°C 45 seg). Los oligonucleotidos específicos se realizaron a partir
de Trypanosoma brucei, usando el programa Fast PCR program, el cual fue
checado con el programa web program Primer3. La secuencia y tamaño de los
primers fue: 5’-AGCTGGTTGCCGCTGTGGACG-3’ (sense) and 5’-
TGTGGGGACCTGCGCCAACTG-3’ (anti-sense), 308 bp para el gen pfr1, y 5’-
TGAGTCCTGCGGCACAGCAGC-3’ (sense) and 5’-
TCGGATACGTGCAGGTCCTGGAC-3’ (anti-sense), 148 bp para el gen pfr2. 10 µl
4
de cada producto de PCR fue usado para la electroforesis en un gel de agarosa al
2% y se visualizo con bromuro de etidio.
Producción de anticuerpos específicos anti-proteína paraflagelar. Para inmunizar a los conejos se utilizo un péptido que corresponde a los residuos
39-51 de la proteína paraflagelar (H-SDWSETQRQKLRG-OH) de Tripanosoma
brucei, conjugado con la proteína acarreadora toxoide diftérico. El conejo se
inmunizo en tres ocasiones con intervalos de 7 días de acuerdo al siguiente
esquema de inmunización: a) la primera inmunización se realizo por la ruta
subcutanea con 1 mg de proteína paraflagelar más adyuvante completo de Freud
b) la segunda inmunización se realizo con 1 mg de proteína paraflagelar más
adyuvante incompleto de Freíd c) la tercera inmunización se realizo por la ruta
intramuscular con 1 mg de proteína en solución salina. A los siete días de la última
inmunización el conejo se sangro por punción cardiaca y la sangre se se
centrifugó a 2,000 rpm/10 min/4°C para obtener el suero. Para purificar la
inmunoglobulina IgG el suero de conejo se paso por una columna de proteína A la
cual se almacenó a -20°C.
Identificación la proteina paraflagelar por la inmunoglobulina IgG específica.
La proteína paraflagelar se detecto en extractos totales de E. histolytica por
inmunoblot. Se corrió el extracto amibiano (10µg/pozo) en geles de poliacrilamida
al 10%. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas
de nitrocelulosa. Posteriormente las membranas se cortaron en tiras y se
bloquearon con leche descremada al 6% toda la noche a 4°C. Las tiras se lavaron
tres veces con PBS-T y se incubaron a 4°C toda la noche con la IgG anti-proteína
paraflagelar diluida 1:100 en PBS-T. Después las tiras se lavaron tres veces con
PBS-T y se incubaron con un anticuerpo peroxidado de cabra anti-IgG de conejo
diluido 1:1000 disuelto en PBS-T, se incubó por 2 h a 37°C o toda la noche a 4°C.
Las tiras se lavaron tres veces con PBS-T y se les adicionó la solución reveladora
(4-cloronaftol más peróxido de hidrógeno). Por último se calculo el peso molecular
de la proteína reconocida por el anticuerpo anti-proteína paraflagelar.
Inmunohistoquímica Interacción de trofozoítos de E. histolytica con los anticuerpos anti-PPF
5
Las amibas se cosecharon en fase logarítmica y se lavaron con PBS a 37°C. Se
fijaron con paraformaldehído al 4% por 2 h a 37°C. Se lavaron tres veces con PBS
y se incubaron con cloruro de amonio 50mM durante 2 horas, las amibas se
lavaron y se ajustaron a una concentración de 1X106 trofozoítos por 1 ml en PBS.
Los trofozoítos se permeabilizaron con Triton X-100 al 0.25% en PBS, después de
lavar las células se incubaron en una solución de H2O2 al 0.3% y NaN3 al 0.1% en
PBS durante 10 min. Posterior al lavado las amibas se incubaron con el anticuerpo
de conejo anti-PPF 1:250 en PBS-T durante 1h. las amibas se lavaron y se
incubaron con el anticuerpo de chivo anti-IgG de conejo conjugado con HRP
(Sigma) 1:250 durante 1 h. La reacción se revelo con DAB (Zymed). Las muestras
incluyeron en glicerol-gelatina y se montaron en portaobjetos. Los controles
negativos se procesaron de la misma manera pero omitiendo el primer anticuerpo.
a) Formación del capping. Las amibas se cosecharon en fase logarítmica, y se lavaron con PBS a 37 °C, y se
ajustaron a una concentración de 1X106 trofozoítos por 1 ml de PBS.
Posteriormente se incubaron con 50ug/ml de Con-A durante 10 min en agitación,
se realizo lavado rápido con PBS a 37°C y se fijaron con paraformaldehído al 4%
por 2 h a 37°C. Se lavaron tres veces con PBS y se incubaron con cloruro de
amonio 50mM durante 2 horas, después de lavar las células se agrego una
solución de H2O2 al 0.3% y NaN3 al 0.1% en PBS, durante 10 min. Posterior al
lavado las amibas se incubaron con 50ug/ml de peroxidasa de rabano durante 30
min; se lavaron y la reacción se revelo con DAB (Zymed), posteriormente se
lavaron, incluyeron en glicerol-gelatina y se montaron en portaobjetos. Los
controles de procesaron de la misma manera pero omitiendo la incubación con la
Con-A.
b) Detección de la paraflagelar Las amibas se procesaron de la misma manera hasta el bloqueo con cloruro de
amonio 50mM durante 2 horas, después de lavar los trofozoítos se incubaron con
Triton X-100 al 0.25% en PBS durante 5 min, después de lavar las células se
incubaron en una solución de H2O2 al 0.3% y NaN3 al 0.1% en PBS durante 10
min. Después de esto las células se incubaron con un suero de conejo anti-PPF
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paraflagelar 1:250 en PBS-T durante 1 h, después de tres lavados con PBS se
aplico el anticuerpo de chivo anti-IgG de conejo conjugado con HRP (Sigma) 1:250
durante 1 h, después de lavar la reacción se revelo con DAB (Zymed), se lavaron
e incluyeron en glicerol-gelatina y se montaron en portaobjetos. Los controles
negativos se procesaron de la misma manera pero omitiendo en primer anticuerpo.
Detección en amibas adheridas a cubreobjetos Las amibas se cosecharon en fase logarítmica y se transfirieron a cubreobjetos
colocados en placas de 24 pozos, se incubaron durante 30 min a 37°C para
permitir la adhesión de los trofozoítos, a cabo el medio de cultivo se retiro y las
células se lavaron con PBS a 37°C y se fijaron durante 30 min con
paraformaldehído al 4% a 37°C. Posteriormente se lavaron con PBS (4 veces) y
se permeabilizaron con una solución de Triton X-100 al 0.25% en PBS durante 5
min, después de lavar se incubaron con cloruro de amonio 50mM durante 30 min,
se lavaron y se agrego una solución de H2O2 al 0.3% y NaN3 al 0.1% en PBS,
durante 10 min. Posterior al lavado se incubaron en una solución de caseína al
0.1% en PBS durante 30 min seguido de 4 lavados con PBS. Los cubreobjetos se
incubaron con el suero de conejo anti-PPF 1:1000 en PBS durante 30 min,
después de tres lavados con PBS las células se incubaron con el anticuerpo de
chivo anti-IgG de conejo conjugado con HRP (Sigma) 1:250 durante 30 min,
después de lavar la reacción se revelo con DAB (Zymed). Las células se
deshidrataron en grados crecientes de etanol, se aclararon y los cubreobjetos se
montaron en portaobjetos con resina sintética.
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RESULTADOS Y DISCUSION
Como ha sido reportado, Tripanosoma tiene dos isoformas de PFR (3). Nuestros
resultados de RT-PCR demostraron la presencia de la isoforma PFR1 de
Tripanosoma en E. histolytica (Fig. 1). Esta proteína tiene un peso de 73 kDa y el
gen que codifica para esta tiene un tamaño de 1702 pb.
Posteriormente en otros ensayos de RT-PCR utilizamos otro juego de primers
(PFR-A y PFR-B) para tratar de obtener el mRNA de esa proteína y después
secuenciar estos amplicones. Los resultados muestran dos amplicones que
pudieran ser los que esperamos ya que el tamaño en pb es aproximadamente el
esperado. (Fig. 1A y 1C). Estos amplicones se purificaron para su posterior
secuenciación (Fig. 1B y 1D).
Detección de proteínas de E. histolytica por inmublot. Extractos totales de E. histolytica se separaron por electroforesis, posteriormente
se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con
el anticuerpo anti-PPF, y por ultimo se agrego un anticuerpo peroxidado de chivo
anti conejo. Una vez revelada la reacción se observo que el anticuerpo anti-PPF
reconoció una banda de 114 kDa (Fig. 2).
Identificación en E. histolytica de una proteina similar a la paraflagelar de Tripanosoma brucei Detección en células en solución. Se observo que las amibas presentan una ligera reacción positiva en su
citoplasma, sin que sea evidente una localización específica de la reacción. (Fig. 1)
Detección de la proteína paraflagelar en amibas preincubadas con concanavalina A. Las amibas incubadas previamente con Con-A mostraron
reacción positiva al péptido en zonas bien localizadas de su citoplasma cercano a
la membrana celular, que probablemente corresponden a las zonas de formación
del capuchón. (Fig. 2b)
Detección en células adheridas a cubreobjetos.
8
Las amibas mostraron en su citoplasma reacción positiva al péptido, siendo esta
de mayor intensidad en expansiones citoplasmáticas de la célula, que
posiblemente corresponden a puntos de adhesión de la célula al sustrato.
A BMarcador Marcador 1000 pb 1000 pb
930 pb 930 pb
C DMarcador Marcador 1000 pb 1000 pb
760pb 760pb
Fig.1 Presencia de genes para la proteína paraflagelar en E. histolytica. A
partir del RNA total de E. histolytica se sintetizaron cadenas complementarias de
cDNA utilizando los primers diseñados a partir de los genes pfr1 y pfr2 de
Trypanosoma brucei, posteriormente por PCR se amplificaron las cadenas de
DNA. Tanto el cDNA como el DNA se separaron en geles de agarosa y se tiñeron
con bromuro de etidio. En A se muestra el cDNA de la banda PFR-A (930pb) y en
B el DNA. En C DNA y D el DNA de la banda PFR-B (750pb).
c
9
250150100
75
50
37
25
1 2
Fig. 2 Inmunodetección de la proteína paraflagelar en extractos de E. histolytica.
Extractos totales de E. histolytica se corrieron por electroforesis, posteriormente
las proteínas se transfirieron a papeles de nitrocelulosa. Las tiras de nitrocelulosa
se incubaron con el anticuerpo anti-PPF. 1. Marcadores de peso molecular. 2.
proteínas detectada por el anticuerpo anti-PPF.
10
Fig 3. inmunoreactividad del anticuerpo anti-PPf y Con A con trofozoítos de E. histolytica . Los trofozítos de E. histolytica se incubaron con el anticuerpo
anti-PPF o con concanavalina. Para el caso de la Con A se agrego peroxidasa de
rabano y para la PPF se agrego un anticuerpo de chivo anti-conejo peroxidado. La
reacción se revelo con diaminobencidiba. En A y B se observa que las amibas
presentan una ligera reacción positiva en su citoplasma, sin que sea evidente una
localización específica de la reacción. En C y D se observa que la Con-A
reconoce a los trofozoítos, los que en su mayoría presentaron la formación de un
capuchón con esta lectina. En E y F las amibas incubadas previamente con Con-
A mostraron reacción positiva al péptido en zonas bien localizadas de su
citoplasma cercano a la membrana celular, que probablemente corresponden a las
zonas de formación del capuchón. En G y H Las amibas mostraron en su
11
citoplasma reacción positiva al péptido, siendo esta de mayor intensidad en
expansiones citoplasmáticas de la célula, que posiblemente corresponden a
puntos de adhesión de la célula al sustrato.
En resumen, los resultados demuestran que en los trofozoítos de E. histolytica se
encuentra un gen que codifica para una proteína que tiene similitud estructural con
la proteína paraflagelar de Tripanosoma. Actualmente se desconoce cual es la
función de la proteína en E. histolytica. Suponemos que puede participar en el
movimiento de los trofozoítos
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