Post on 17-Mar-2020
Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la
actividad sobre sistema nervioso central en modelo murino de
Hypericum juniperinum (Kunth)
Laura Alejandra Mejía Agudelo
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia
Bogotá, Colombia
2017
Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la
actividad sobre sistema nervioso central en modelo murino de
Hypericum juniperinum (Kunth)
Laura Alejandra Mejia Agudelo
Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título
de:
Magister en Ciencias Farmacéuticas
Director (a):
Ph.D Juan Camilo Marín Loaiza
Línea de Investigación:
Fitoquímica y Farmacognosia
Grupo de Investigación:
Grupo de Investigación en Fitoquímica y Farmacognosia de la Universidad Nacional de
Colombia (GIFFUN)
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia
Bogotá, Colombia
2017
(Dedicatoria)
When you are smiling
The whole world
Que también vela por su amargura
Smiles with you
MB.
“I begin with an idea and then it becomes
something else”
PP.
Agradecimientos
A todos los seres vivientes que hicieron parte de este trabajo. “The whole is greater than
the sum of the parts” A.
A mis padres Luis Alfonso Mejia Muñoz y Gloria Inés Agudelo Roa, mi hermano Luis
Alfonso Mejia Agudelo, quienes inundaron mi vida de ciencia desde pequeña, gracias por
sus invaluables enseñanzas y motivación brindada en todo momento.
A los profesores Orlando Rivera Díaz y Jaime Uribe Meléndez quienes me introdujeron al
maravilloso mundo de las plantas.
A mi profesor Juan Camilo Marín Loaiza por aceptarme con mis despistes siendo de otra
disciplina, por sus enseñanzas en muchos momentos de mi vida, por su franqueza y su
tranquilidad.
A mis profesores, Maritza Rojas, Mario Francisco Guerrero, Luis Fernando Ospina y
Javier Rincón, quienes me enseñaron la paciencia, la disciplina, el orden y toma de
desiciones.
A Xavier Marquínez Casas quien me apasionó por la anatomía de las plantas y me
enseñó a valorar las herramientas visuales.
A toda mi familia, mis amigos (Kelly Paez, Ricardo Perez), y compañeros de laboratorio
que me dieron una palabra de aliento, apoyo, cariño en todos los momentos de este
trabajo. Y a Aimer Gutierrez por su colaboración en el aspecto estadístico de este
trabajo, mil gracias.
X Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Finalmente a la Universidad Nacional de Colombia, a la DIB sede Bogotá por el
financiamiento parcial de este proyecto (código 34913); y a la Facultad de Ciencias por
otorgarme la beca de exención de derechos académicos (2015-2017).
Resumen y Abstract IX
Resumen
En Colombia, las enfermedades mentales afectan al 4.7% de la población. Una de las
alternativas complementarias a la terapia alopática para tratar estas dolencias se basa en
el uso de productos naturales. Dentro de las plantas usadas para tratar la depresión se
encuentra la especie europea Hypericum perforatum. Los metabolitos a los que se les
atribuye la actividad antidepresiva de esta especie son hipericina, hiperforina y ciertos
flavonoides. En la búsqueda de una alternativa natural y accesible para el tratamiento de
la depresión, se seleccionó como objeto de estudio la planta nativa Hypericum
juniperinum (L.f.) Kunth. El objetivo del presente trabajo consistió en caracterizar morfo
anatómica, fitoquímica y farmacológicamente la especie H. juniperinum. En el análisis
morfo anatómico se encontró que H. juniperinum quien se encuentra dentro de la sección
taxonómica Brathys, presenta glándulas translúcidas, y carece de glándulas negras
típicas de la sección Hypericum donde está Hypericum perforatum. se encuentran
compuestos de carácter fenólico a lo largo de la hoja, en el floema del tallo y en anteras;
y lípidos en canales de hojas, parenquíma radial del tallo y en algunas estructuras
florales. Por otra parte, en la evaluación fitoquímica preliminar se detectaron metabolitos
de tipo flavonoide, terpenos/esteroides, taninos y saponinas; dentro de las moléculas
aisladas se encuentra la quercetina y el metil ester del ácido 5O cafeoilquínico.
Finalmente, en pruebas psicofarmacológicas en modelo murino evaluando el extracto
metanólico (80%) obtenido de los órganos aéreos de Hypericum juniperinum en tres
dosis de (150, 300 y 500 mg/kg,) y las fracciones de acetato de etilo y butanol dos en
dosis de (150 y 300 mg/kg). se encuentra que el extracto metanólico de H. juniperinum
en la dosis de 500 mg/Kg y la fracción de acetato de etilo en ambas dosis empleadas,
disminuyen el tiempo de inmovilidad en la prueba de nado forzado y se observa una
tendencia de disminución de tiempo de inmovilidad en la prueba de suspensión por la
cola, asociada a un efecto de tipo antidepresivo del extracto metanólico de H.
juniperinum.
Palabras clave: Hypericum juniperinum, flavonoides, antidepresivo, Histoquímica,
anatomía.
X Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Abstract
In Colombia, mental illness affects 4.7% of the population. One of the complementary
alternatives to allopathic therapy for the treatment of these ailments is based on the use
of natural products. Among the plants used to treat depression is the European species
Hypericum perforatum. The metabolites related to the antidepressant activity are
hypericin, hyperforin and certain flavonoids. In the search for a natural and accessible
alternative for the treatment of depression, the native plant Hypericum juniperinum was
selected. The objective of the present work was to characterize the morphoanatomy,
phytochemical and pharmacological activity of H. juniperinum. In the morphoanatomical
analysis it was found that H. juniperinum which belongs to the taxonomical section
Brathys, has translucent glands and it lacks of black glands typical of the Hypericum
section where Hypericum perforatum is found. Phenolic compounds are found throughout
the leaf and in the phloem of the stem, and anthers; lipids in leaf canals, stem radial
parenchyma, and in some floral structures. On the other hand, in the preliminary
phytochemical evaluation, metabolites of flavonoid type, terpenes / steroids, tannins, and
saponins were detected, within the isolated molecules are the quercetin and the 5O
cafeoyl quinic methyl ester. Finally, in the psychopharmacological tests in murine model
evaluating the effect of the methanolic extract (80%) obtained from the aerial organs of
Hypericum juniperinum in three doses of (150, 300 and 500 mg / kg,) and the fractions of
ethyl acetate and butanol in two doses(150 and 300 mg / kg), it was obtained that the
methanolic extract of H. juniperinum at 500 mg / kg and the fraction of ethyl acetate in
both doses used, tend to decrease the immobility time in the forced swim test and a trend
is observed in the tail suspension test, associated to an antidepressant effect of the
methanolic extract of H. juniperinum.
Key words: Hypericum juniperinum, flavonoids, antidepressant, histochemistry,
morphoanatomy.
Contenido XI
Contenido
1. Marco teórico ............................................................................................................ 3 1.1 Depresión ........................................................................................................... 3
1.1.1 Medicamentos disponibles para el tratamiento de la depresión ....................... 5 1.1.2 Productos naturales como alternativa terapéutica ............................................ 7
1.2 Generalidades del Género Hypericum ................................................................ 9 1.2.1 Química y actividades biológicas reportadas para el género Hypericum ........ 10 1.2.2 Hypericum perforatum L. ............................................................................... 12 1.2.3 Género Hypericum en Colombia .................................................................... 14 1.2.4 Hypericum juniperinum (L.f.)Kunth ................................................................. 14
2. Justificación ........................................................................................................... 16
3. Objetivos ................................................................................................................. 17 3.1 Objetivo General .............................................................................................. 17 3.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 17
4. Materiales y Métodos ............................................................................................. 18 4.1 Estudio Morfoanatómico ................................................................................... 18
4.1.1 Histología de los órganos aéreos de Hypericum juniperinum ......................... 18 4.1.2 Histoquímica de los órganos aéreos de Hypericum juniperinum .................... 19
4.2 Estudio Fitoquímico .......................................................................................... 20 4.2.1 Material vegetal ............................................................................................. 20 4.2.2 Extracción y Fraccionamiento ........................................................................ 20 4.2.3 Pruebas fitoquímicas preliminares de Hypericum juniperinum ....................... 21 4.2.4 Aislamiento y purificación de compuestos de H. juniperinum ......................... 22
4.3 Estudio Farmacológico ..................................................................................... 23 4.3.1 Animales ........................................................................................................ 23 4.3.2 Reactivos pruebas farmacológicas ................................................................ 23 4.3.3 Preparación, dosis empleadas y administración de tratamientos ................... 23 4.3.4 Esquema de realización pruebas farmacológicas .......................................... 24 4.3.5 Tamizaje farmacológico en sistema nervioso central en modelo murino ........ 26
Prueba farmacológica para determinar alteraciones de la actividadmotora: prueba del alambre .............................................................................. 26 Pruebas farmacológicas para evaluar la actividad exploratoria ............. 26 Pruebas farmacológicas para evaluar la actividad ansiolítica ................ 27 Pruebas farmacológicas para evaluar la actividad antidepresiva ........... 27 Pruebas farmacológicas para evaluar la actividad sedante: Prueba depotenciación del sueño barbitúrico. ................................................................. 28
XII Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC
en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Pruebas farmacológicas para evaluar la actividad anticonvulsivante:Prueba de convulsiones inducidas por electroshock máximo ....................... 28
4.3.6 Consideraciones éticas ..................................................................................28 4.3.7 Análisis de datos ............................................................................................29
5. Resultados y discusión. .........................................................................................31 5.1 Estudio Morfoanatómico de H. juniperinum (Kunth). ......................................... 31
5.1.1 Tallo de Hypericum juniperinum (Kunth). ........................................................32 5.1.2 Hoja de Hypericum juniperinum (Kunth). ........................................................35 5.1.3 Flor de Hypericum juniperinum (Kunth). .........................................................38
5.2 Estudio Fitoquímico .......................................................................................... 43 5.2.1 Pruebas fitoquímicas preliminares ..................................................................43 5.2.2 Aislamiento y purificación de metabolitos secundarios ...................................45 COMPUESTO P7: ..........................................................................................45 COMPUESTO AM2: .......................................................................................47
5.3 Estudio Farmacológico...................................................................................... 53 5.3.1 Tamizaje farmacológico en sistema nervioso central en modelo murino del extracto metanólico de H. juniperinum. .....................................................................53
Prueba farmacológica para determinar alteraciones de actividad motora:Prueba del alambre ............................................................................................ 53 Pruebas farmacológicas de actividad exploratoria ................................... 53 Pruebas farmacológicas de actividad ansiolítica ..................................... 54 Pruebas farmacológicas de actividad antidepresiva ................................ 55 Pruebas farmacológicas de actividad sedante: Prueba depotenciaciación del sueño barbitúrico ............................................................. 59 Pruebas farmacológicas de actividad anticonvulsivante: Prueba deconvulsiones inducidas por electroshock máximo ......................................... 60
5.3.2 Tamizaje farmacológico en sistema nervioso central en modelo murino de las fracciones de acetato de etilo y butanol de H. juniperinum ........................................60
Pruebas farmacológicas de actividad exploratoria ................................... 61 Pruebas farmacológicas de actividad anisolítica ..................................... 62 Pruebas farmacológicas de actividad antidepresiva ................................ 63 Pruebas farmacológicas de actividad sedante: Prueba de potenciacióndel sueño barbitúrico. ........................................................................................ 65
6. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................69 6.1 Conclusiones .................................................................................................... 69 6.2 Recomendaciones ............................................................................................ 70
7. Bibliografía ..............................................................................................................73
Anexo A ..........................................................................................................................82
Anexo B ..........................................................................................................................84
Contenido XIII
Contenido XIV
Lista de figuras
Figura 1-1.Cifras mundiales referentes a la depresión, tomado y adaptado de (IHME,
2016; WHO, 2017; Ministerio de Salud, 2017). ................................................................. 5
Figura 1-2. Plantas empleadas para el tratamiento de la depresión, tomado y adaptado
de (Sarris et al., 2011). ...................................................................................................... 8
Figura 1-3.Distribución del género Hypericum en el mundo, tomado y adaptado de
(Nürk, 2011). ..................................................................................................................... 9
Figura 1-4. Actividades reportadas en el Género Hypericum, tomado y adaptado de
(Stojanovic et al., 2013; Russo et al., 2014). ................................................................... 11
Figura 1-5.Metabolitos encontrados en el género Hypericum. ....................................... 13
Figura 1-6. Distribución de Hypericum juniperinum (L.f.) Kunth en Colombia, tomada y
modificada de (Bernal et al., 2015). ................................................................................. 15
Figura 4-1. Esquema de fraccionamiento líquido-líquido por la metodología Kupchan
modificada por (Otsuka, 2006). ....................................................................................... 21
Figura 4-2. Fase 1 del tamizaje farmacológico en sistema nervioso central (SNC) del
extracto crudo, en 3 dosis empleadas (150, 300 y 500 mg/kg) de H. juniperinum, en el
modelo murino.(Vectores ilustrativos tomados de freepik y Servier medical art). ............ 25
Figura 4-3. Fase 2 del tamizaje farmacológico en sistema nervioso central (SNC) de las
fracciones del extracto de H. juniperinum en 2 dosis empleadas (150 y 300 mg/kg), en el
modelo murino.(Vectores ilustrativos tomados de freepik y servier medical art). ............. 26
Figura 5-1. Morfología de Hypericum juniperinum. A. Hábito de la planta, tomado de
(Flickr, 2007), B. Disposición de las hojas y flor, C. Distribución de las hojas, D. Longitud
y forma de las hojas, glándulas redondeadas (Línea azul). ............................................. 31
Figura 5-2. A. Corte transversal del tallo de Hypericum juniperinum. Disposición general
de los diferentes tejidos.. ................................................................................................ 34
Figura 5-3. Corte transversal de hojas de Hypericum juniperinum. Disposición general
de los diferentes tejidos. ................................................................................................. 37
Figura 5-4.A. Flor de Hypericum juniperinum. ............................................................... 40
Figura 5-5. Cromatografía en capa fina del extracto metanólico de Hypericum
juniperinum,. Fase móvil: acetato de etilo: ácido fórmico: ácido acético: agua:
diclorometano (100:10:10:11:26). Revelador NP-PEG (UV 365nm). ............................... 44
Figura 5-6.Esquema de purificación del compuesto P7 a partir de la fracción de acetato
de etilo del extracto metanólico de H. juniperinum. ......................................................... 46
Figura 5-7. Estructura de la quercetina.......................................................................... 47
Figura 5-8.Esquema de purificación del compuesto AM2 a partir de la fracción de
acetato de etilo del extracto metanólico de H. juniperinum. ............................................. 48
Contenido XV
Figura 5-9. Estructura del metil ester del ácido 3-O-cafeoilquínico (AM2),. ....................51
Figura 5-10.Efecto del extracto metanólico de H. juniperinum evaluado a 3 dosis (150,
300 y 500 mg/kg) en la prueba de tablero agujereado. ................................................... 54
Figura 5-11.Efecto del extracto metanólico de H. juniperinum evaluado a 3 dosis
(150,300 y 500 mg/kg) en la prueba de laberinto en cruz. .............................................. 55
Figura 5-12. Efecto del extracto metanólico de H. juniperinum evaluado a 3 dosis
(150,300 y 500 mg/kg) en la prueba de nado forzado..................................................... 57
Figura 5-13.Efecto del extracto metanólico de H. juniperinum evaluado a 3 dosis (150,
300 y 500 mg/kg) en la prueba de suspensión por la cola .............................................. 58
Figura 5-14.Efecto del extracto metanólico de H. juniperinum evaluado a 3 dosis
(150,300 y 500 mg/kg) en la prueba de potenciación del sueño barbitúrico. ................... 60
Figura 5-15. Efecto de los extractos de acetato de etilo y butanol provenientes del
fraccionamiento del extracto metanólico de H. juniperinum evaluados a 2 dosis (150, 300
mg/kg) en la prueba de campo abierto ........................................................................... 62
Figura 5-16. Efecto de los extractos de acetato de etilo y butanol provenientes del
fraccionamiento del extracto metanólico de H. juniperinum evaluados a 2 dosis (150, 300
mg/kg) en la prueba de laberinto en cruz en ratones. ..................................................... 63
Figura 5-17. Efecto de los extractos de acetato de etilo y butanol provenientes del
fraccionamiento del extracto metanólico de H. juniperinum evaluados a 2 dosis (150, 300
mg/kg) en la prueba de nado forzado ............................................................................. 64
Figura 5-18. Efecto de los extractos de acetato de etilo y butanol provenientes del
fraccionamiento del extracto metanólico de H. juniperinum evaluados a 2 dosis (150, 300
mg/kg) en la prueba de suspensión por la cola............................................................... 65
Figura 5-19. Efecto de los extractos de acetato de etilo y butanol provenientes del
fraccionamiento del extracto metanólico de H. juniperinum evaluados a 2 dosis (150, 300
mg/kg) en la prueba de potenciación del sueño barbitúrico. ........................................... 66
Contenido XVI
Lista de tablas
Pág.
Tabla 1.Tinciones diferenciales realizadas en órganos aéreos de Hypericum juniperinum.
....................................................................................................................................... 19
Tabla 2. Resultados obtenidos pruebas fitoquímicas preliminares realizadas al extracto
metanólico de H. juniperinum. ......................................................................................... 44
Tabla 3. Desplazamiento químico en δ1H, δ APT 13C-RMN, COSY y HMBC del Metil
ester del ácido 5O cafeoilquinico (AM2). ......................................................................... 51
Contenido XVII
Lista de Símbolos y abreviaturas
Abreviaturas Abreviatura Término
(5HT): Serotonina (À) : Antera (An): Androceo (APVP): Años potenciales de vida perdidos (ATCAs): Antidepresivos tricíclicos y policíclicos (CCD): Cromatografía en capa delgada (CC): Cromatografía en columna (Ca):Caliz (Cn): Canal (Co):Corola (COL): Herbario Nacional Colombiano (Cu):Cutícula (DA): Dopamina (DALYs): Disability adjusted life year- años de vida ajustados a la incapacidad AVAD (DMSO): Dimetilsulfóxido ems: error estándar de la media (Ep):Epidermis (Es): Estilos (Es):Estoma (Et) :Estigma EtOH: Etanol (FAA): Formol:ácido acético: EtOH (10:5:85, formol: ácido acético: EtOH 70%) FeCl3: Cloruro férrico (Fi): Filamento g: Gramos (Gi): Gineceo (HCa): Haz vascular del caliz (HCo): Haz vascular de la corola (Hv): Haz vascular (HvC): Haz vascular central Hz: Hertz (IMAOs):Inhibidores de la monoaminooxidasa (IRSN): Inhibidores de la recaptación de la serotonina/ noradrenalina (ISRSs): Inhibidores selectivos de la recaptación de la serotonina (IR):Infrarojo J: constante de acoplamiento KOH: Hidróxido de potasio KBr: Bromuro de potasio (Le): Lenticelas
XVIII Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC
en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
mA: miliamperios (MAO): Monoaminooxidasa (Me): Médula MHz: Mega Hertz mL: mililitro ms: microsegundos (NE): Norepinefrina NP-PEG: Natural products reagent, polyethylenglycol reagent (Pa): Parénquima (Pe): Parénquima empalizada (Po): Pólen ppm: partes por millón (Pra): Parénquima en radios (Pv): Parénquima vaina Rf: Factor de retención RMN: Resonancia Magnética Nuclear rpm: rotaciones por minuto (S): Surco medial (SARIS): Antagonistas e inhibidores de la recaptación de serotonina (Su): Suber (Te): Tecas (UV): Ultravioleta (Va): Vasos v.o: via oral(Xi): Xilema en radios de parénquima(YLD): Years lived with disability- Años de vida perdidos por la incapacidad AVD(δ): Desplazamiento químico(WHO): World Health Organization
Introducción
El número de personas afectadas por desórdenes mentales va en aumento,
particularmente en los paises de bajos ingresos e inmersos en conflictos armados como
Colombia, esta problemática incrementa el riesgo de sufrir de ansiedad y depresión
(Medicos sin fronteras, 2013). Ambas enfermedades son altamente prevalentes en la
población. En el pais, la primera tiene una prevalencia del 5,3% y la segunda del 4,7%
(WHO, 2017).
La depresión ha contribuido al incremento en las tasas de suicidio en el mundo con
800.000 casos por año (WHO, 2017). Los eventos depresivos están caracterizados por
un periodo de al menos dos semanas en donde hay una pérdida de interés o placer, y al
menos 4 de los siguientes síntomas se presentan: cambios en el sueño, alimentación,
disminución de la energía, concentración o afección de imagen propia (National Institute
of Mental Health , 2016).
Dentro de las terapias empleadas para el tratamiento de la depresión se encuentran los
tratamientos psicológicos y el uso de medicamentos antidepresivos: Antidepresivos
tricíclicos y policíclicos (ATCAs), inhibidores de la monoaminooxidasa (IMAOs),
inhibidores selectivos de la recaptación de la serotonina (ISRS), antagonistas e
inhibidores de la recaptación de serotonina (SARIS) y los inhibidores de la recaptación de
serotonina y noradrenalina (IRSN) (WHO, 2017). Debido a los efectos secundarios tan
marcados (mareo, nausea, efectos cardiacos, disfunción sexual, entre otros) y a los altos
costos que presentan los fármacos antidepresivos convencionales, en estos momentos
hay una tendencia mundial hacia el consumo de productos de origen herbal (Khawam et
al., 2006). Esta postura se da porque los fitomedicamentos tienen menos efectos
secundarios, no generan dependencia y tienen un menor costo, relacionado directamente
con la adherencia al tratamiento farmacológico (Rodriguez-Landa, & Contreras, 2003;
Müller , 2005). Algunas de las plantas empleadas popularmente para el tratamiento de la
depresión son Croccus sativus (Azafrán), Lavandula spp., Rhodolia rosea, Hypericum
2 Introducción
perforatum, entre otras, siendo esta última ampliamente comercializada en Europa y
Estados Unidos generando ganancias que rondan los billones de dólares (Klemow et al.,
2011).
Hypericum perforatum (Hypericaceae), también conocida como “Hierba de san Juan”, es
una planta de origen europeo que ha sido empleada por siglos en preparaciones oleosas
para tratar quemaduras, heridas, inflamación de la piel y dolor. Adicionalmente, cuando
es administrada por vía oral se emplea para el tratamiento de la ansiedad y episodios
depresivos moderados (Greeson et al., 2001).
H. perforatum contiene por lo menos diez clases de metabolitos secundarios que varían
en concentración entre plantas individuales dependiendo de factores genéticos, condición
de crecimiento, preparación y procesamiento del material (Greeson et al., 2001). La
actividad antidepresiva de esta planta ha sido demostrada en modelos animales como el
test de desesperanza aprendida y el modelo de déficit de escape crónico. Metabolitos
como hiperforina y algunos flavonoides se consideran los constituyentes responsables de
dicha actividad (Nathan, 2001).
Actualmente se tienen reportes de 54 especies del género Hypericum para el territorio
colombiano, destacándose H. goyanesii y H. juniperinum como especies promisorias alto
andinas y de páramo, priorizadas por el jardín botánico de Bogotá para procesos de
conservación, reintroducción y restauración ecológica (Pérez- Martinez, 2015). Para
nuestro trabajo decidimos seleccionar a la especie H. juniperinum; ya que al estar
relacionada taxonómicamente con H. perforatum se esperaría que presentara una
composición química similar y por ende una actividad biológica semejante a la de la
especie oficinal. Al no contar H. juniperinum con estudios relacionados con su
composición química, su morfo anatomía, ni la evaluación de su actividad biológica, esta
especie puede ser una alternativa interesante en la búsqueda de plantas colombianas
con actividad antidepresiva, por lo tanto dentro de los objetivos del proyecto se encuentra
la caracterización tanto química como morfoanatómica; así como la evaluación sobre
sistema nervioso central del extracto metanólico y de las fracciones obtenidas a partir de
esta planta.
1. Marco teórico
1.1 Depresión
En el mundo hay alrededor de 350 millones de personas que sufren de depresión y de
acuerdo a las proyecciones es un valor que va a aumentar en los próximos años. Esta
enfermedad es la primera causa de discapacidad a nivel mundial ya que reduce la
productividad en los trabajadores, sinomas como la pérdida de interés y falta de energía,
producen efectos negativos en la vida cotidiana (Lüllmann et al., 2000).
En Colombia los desórdenes depresivos presentan una prevalencia de 4.7% y equivalen
a 4.33% de los años de vida perdidos por la incapacidad YLD (Years lived with disability
– Años de vida perdidos por la incapacidad AVD), dicha medida relaciona el número de
casos presentes de una enfermedad junto con la duración y severidad de la misma
(WHO, 2017). Adicionalmente, la depresión ocasiona el 1.88% de los DALYs (Disability
adjusted life year- años de vida ajustados a la incapacidad AVAD) totales, una medida
referente a la pérdida de años debidos a la incapacidad y mortalidad dados por una
enfermedad en específico. Esto la ubica en el quinto lugar en el ranking de pérdida de
años después de enfermedades no comunicables y enfermedades cardiacas (IHME,
2016) (Figura1-1).
Por otro lado, en la ultima encuesta Nacional de Salud Mental realizada en el 2015 se
encontró que en adolecentes y adultos el transtorno con mayor prevalencia (12 meses),
es el transtorno depresivo mayor y la fobia social; y en general se presentan en mayor
proporción en mujeres que en hombres y en edades entre los 18 y 44 años (Ministerio
de Salud, 2015). Para el año 2013 Médicos y fronteras dan un reporte de salud mental en
zonas donde el conflicto armado estaba en auge (Caquetá, Putumayo, Nariño y Cauca).
De 4455 pacientes atendidos encontraron que, como consecuencia de la violencia, el
67% de las personas presentan síntomas de ansiedad y depresión. Las personas que
4 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
han vivido situaciones como desplazamiento, familiares asesinados o desaparecidos,
tienden a desencadenar cuadros de tipo depresivo, adicionalmente tienen el doble de
propensión a desarrollar ideas suicidas (Médicos sin fronteras, 2013). Más
recientemente, el último boletín de salud mental colombiano, reporta que alrededor de
48.100 personas son tratadas por esta enfermedad, siendo interesante resaltar que la
prevalencia es alta en adultos mayores de la zona urbana y en poblaciones
universitarias (Ministerio de Salud , 2017).
La depresión es el resultado de interacciones entre los factores sociales, psicológicos y
biológicos. Las personas que han sufrido de problemas en su vida como pérdida de
empleo, luto y trauma psicológico tienen una mayor probabilidad de padecer esta
enfermedad, adicionalmente dentro de los grupos en vulnerabilidad se encuentran niños
expuestos al abandono, personas propensas al abuso de sustancias, y personas
enfrentadas a conflictos y desastres naturales, entre otros (WHO, 2013).
Para diagnosticar un paciente con depresión, este debe presentar una sintomatología
coherente con los criterios diagnosticos descritos en el manual de diagnóstico para
desórdenes mentales, (DSM-IV) o en la clasificación internacional de enfermedades y
desórdenes mentales (ICD-10) (Potokar & Thase, 2003). En la depresión el paciente
experimenta síntomas de naturaleza afectiva, cognitiva o somática, como la miseria
profunda, y culpa severa, también se evidencian efectos de naturaleza somática como el
insomnio, pérdida de apetito, constipación, palpitaciones, pérdida de la líbido y en
algunos casos pensamientos de carácter suicida (Lüllmann et al., 2000). Estos síntomas
deben presentarse en la persona diariamente por lo menos durante dos semanas con
una influencia negativa en las experiencias de trabajo, social u otros dominios
importantes de la vida (Potokar & Thase, 2003). Dentro de las soluciones planteadas
para reducir la depresión se encuentran los tratamientos psicológicos como la terapia
cognitiva conductual, la psicoterapia interpersonal, la enseñanza de la relajación y los
medicamentos antidepresivos (WHO, 2013).
5
Figura 1-1.Cifras mundiales referentes a la depresión, tomado y adaptado de (IHME, 2016; WHO, 2017; Ministerio de Salud, 2017).
1.1.1 Medicamentos disponibles para el tratamiento de la depresión
El tratamiento farmacológico de la depresión está relacionado con cambios en los
niveles de los agentes que llevan a cabo el proceso de neurotransmisión, como lo son las
monoaminas serotonina, noreprinefrina y dopamina. Actualmente el tratamiento de esta
afección se realiza con inhibidores de la monoaminooxidasa (IMAOs), antidepresivos
tricíclicos (TCAs), inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (ISRSs), entre
otros (Potokar & Thase, 2003). A continuación se da una breve descripción de estos
fármacos.
6 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
- Antidepresivos tricíclicos y policíclicos (ATCAs):
Estos agentes bloquean la recaptación de noradrenalina y serotonina en la neurona,
incrementando de esta manera la concentración de las monoaminas en el espacio
sináptico produciendo así el efecto antidepresivo asociado a que estos
neurotransmisores regulan funciones cerebrales como el humor, atención, sueño, apetito
y cognición (Hasler, 2010). Algunos ejemplos de fármacos pertenecientes a este grupo
son la imipramina, amitriptilina, desipramina, nortriptilina, protriptilina y doxepina (Harvey,
2012).
- Inhibidores de la monoaminooxidasa (IMAOs):
Los IMAOs aumentan los niveles de serotonina (5HT), norepinefrina (NE) y dopamina
(DA) al bloquear la enzima monoaminooxidasa (MAO); responsable del metabolismo de
estos neurotrasmisores. Estos fármacos presentan efectos irreversibles al unirse
permanentemente a la enzima, inactivándola. Los fármacos de este grupo empleados
son la fenelxina, isocarboxazida y selegilina, entre otros (Harvey, 2012). Estos
medicamentos son efectivos en la reducción de los síntomas de la depresión. Sin
embargo presentan restricciones dietarias (evitar el consumo de alimentos con tiramina)
y efectos menos severos como sedación, boca seca y ganancia de peso (Harvey, 2012).
- Inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (ISRSs):
En 1980 se introducen los inhibidores selectivos de la recaptación de la serotonina
(ISRSs), estos medicamentos aumentan los niveles de 5-HT específicamente, sin
presentar efectos en los otros sistemas de neurotransmisión (Potokar & Thase, 2003).
Los ISRSs inhiben específicamente la recaptación de la serotonina bloqueando
selectivamente los transportadores de serotonina, de esta manera se garantiza una
mayor concentración de la serotonina en el espacio sináptico, dando el efecto
antidepresivo. Algunos fármacos pertenecientes a este grupo son fluoxetina, sertralina,
paroxetina, fluvoxamina y citalopram (Harvey, 2012). Estos fármacos no presentan
cardiotoxicidad como los grupos de medicamentos anteriormente mencionados,
adicionalmente son relativamente seguros a altas dosis; a pesar de esto, los efectos
secundarios incluyen agitación, ansiedad, ataques de pánico, insomnio, disfunción sexual
entre otros, lo que es desagradable para los pacientes y hace que la adherencia al
tratamiento farmacológico sea menor (Potokar & Thase, 2003).
7
Finalmente hacia 1990 aparece un grupo diferente de medicamentos antidepresivos que
presentan una accion dual, los inhibidores de la recaptación de la serotonina/
noradrenalina (IRSN). Dentro de este grupo se destacan la desvenlafaxina, dutoxetina y
venlafaxina (Potokar & Thase, 2003). Estos fármacos son efectivos en el tratamiento de
los sintomas asociados con dolor crónico en pacientes depresivos (Harvey, 2012).
1.1.2 Productos naturales como alternativa terapéutica
Los extractos de plantas presentan un gran número de metabolitos. La actividad biológica
del extracto se puede incrementar por efectos sinérgicos entre los metabolitos presentes.
Estos metabolitos pueden actuar de diferentes maneras, al modificar la absorción,
distribución, metabolismo y excreción de los contituyentes bioactivos, siendo una
alternativa al empleo de una sola molécula purificada (Sarris et al., 2011).
La mayoría de las plantas empleadas para el tratamiento de la depresión, aunque
presentan efectos secundarios, no son tan marcados en comparación con los
antidepresivos convencionales descritos previamente (Sarris et al., 2011). Lo anterior
genera una mayor percepción de seguridad por parte de los pacientes (Saki et al., 2014).
Las plantas Rhodiola rosea, Croccus sativus, Echium amoenum, Lavandula spp., Panax
ginseng, Albizia jullbrissin e Hypericum perforatum han sido empleadas para el
tratamiento de la depresión y cuentan con evidencia experimental que confirma su
actividad (Dwyer et al., 2011) (Figura 1-2). Algunos de los mecanismos de acción
reportados para estas especies son la inhibición de la recaptación de las monoaminas
(serotonina, dopamina y noradrenalina), modulación de la unión de los ligandos a los
receptores de la serotonina, inhibición de la monoaminooxidasa y modulación
neuroendocrina (Sarris et al., 2011). De particular interés resulta Hypericum perforatum,
especie medicinal europea que es indicada para el tratamiento de la depresión y que
cuenta estudios clínicos que validan sus efectos (Maher et al., 2016).
8 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Figura 1-2. Plantas empleadas para el tratamiento de la depresión, tomado y adaptado
de (Sarris et al., 2011).
9
1.2 Generalidades del Género Hypericum
La familia Hypericaceae esta conformada por tres tribus: Cratoxyleae que cuenta con 7
especies, Hypericeae con 494 especies y Vismieae con 102 especies (Nürk, 2011).
Según estudios filogenéticos moleculares, esta familia comprende nueve géneros
(Cratoxylum, Eliea, Harungana, Hypericum, Lianthus, Santomasia, Thornea, Triadenum,
Visnia). Sin embargo, el 80% de la diversidad de este grupo se encuentra representada
por el género Hypericum (Crockett, & Robson, 2011).
El género Hypericum cuenta con 469 especies, distribuidas por todo el hemisferio norte,
en los Ándes, Sur de Africa, sureste de Asia y pocas especies se concentran en
Australasia y Oceanía. El principal centro de diversidad de Hypericum se da en el área
paleártica y en el neotrópico donde el 45% y el 30% de las especies descritas son nativas
(Nürk, 2011) (Figura 1-3).
Figura 1-3.Distribución del género Hypericum en el mundo, tomado y adaptado de (Nürk, 2011).
Este género se encuentra agrupado en 36 secciones taxonómicas definidas por
características morfológicas y rangos de distribución biogeográfica. Dentro de estas
secciones destacan; la sección Hypericum con 42 especies distribuidas en Europa,
África, Asia y América; la sección Brathys que cuenta con 87 especies distribuidas en
Centroamérica, Sudamérica e islas del caribe; y la sección Trigynobrathys con 52
1
0
Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
especies encontradas en Sudamérica, sur de Canadá, este y sureste de Asia, Hawaii,
Australia, Nueva Zelanda y Europa (Crockett, & Robson, 2011).
Las especies de este género se caracterizan por ser árboles, arbustos o hierbas, con
hojas que pueden tener una disposición opuesta, composición simple, con margen entero
sin estípulas con secreciones translúcidas a negras (Glandulas translúcidas y/o
Glandulas negras), flores amarillas pentámeras con pétalos libres y varios estambres en
3 a 5 fascículos, estilos libres y el fruto capsular dehiscente con semillas cafés a negras
(Ernst, 2003).
1.2.1 Química y actividades biológicas reportadas para el género Hypericum
El género Hypericum ha sido ampliamente estudiado desde el punto de vista químico en
casi todas las secciones, aún así, se desconoce la composición química de
aproximadamente el 60% de las especies (Crockett, & Robson, 2011). Algunos ejemplos
relacionados con su composición química, de acuerdo a la sección de donde se agrupan,
son: Para H. strictum, perteneciente a la sección Brathys (misma sección de H.
juniperinum), se han reportado antraquinonas y flavonoides. Para H. laricifolium, de la
misma sección, se han reportado xantonas, ácido caféico, triterpenos, derivados de ácido
benzóico y cinámico. Por otro lado, para H. brasiliense, especie que se encuentra en la
sección Trigynobrathys, se han reportado flavonoides, xantonas, derivados de
fluoroglucinol y terpenos (Crockett et al., 2010). Finalmente para H. maculatum de la
sección Hypericum se ha encontrado flavonoides, ácido clorogénico, hipericinas
pseudohipericinas e hiperforinas, las ultimas en baja cantidad (Rusalepp et al., 2017). Lo
anterior demuestra que, dependiendo de la sección en que se encuentre la especie son
los tipos de metabolitos que esta produce.
Diversos artículos de revisión documentan numerosas actividades para especies del
género Hypericum. Dentro de las principales actividades referenciadas se encuentra la
evaluación de sus propiedades como antidepresivo, antiviral, antimicrobiano,
antiinflamatorio y cicatrizante (Greeson et al., 2001; Ernst, 2003; Saddiqe et al., 2010;
Stojanovic et al., 2013). Algunos de los metabolitos secundarios asociados a estas
actividades son: hipericina y pseudohipericina (naftodiantronas) presentan actividad
11
antiretroviral, hiperforina y adhiperforina (derivados de fluoroglucinol) se relacionan con
las propiedades antidepresivas; y los flavonoides se asocian con inhibición enzimática,
antiinflamatorios, gastroprotectores y antidepresivos (Stojanovic et al., 2013) (Figura 1-
4). Hypericum perforatum es quizás la planta más destacada de este género, por lo que a
continuación se da una breve descripción de la misma en el aspecto químico y su
actividad de tipo antidepresivo.
Figura 1-4. Actividades reportadas en el Género Hypericum, tomado y adaptado de (Stojanovic et al., 2013; Russo et al., 2014).
1
2
Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
1.2.2 Hypericum perforatum L.
La especie Hypericum perforatum (Hypericaceae), conocida popularmente como hierba
de San Juan (en inglés St John´s wort), ha sido reconocida desde la antigüedad por sus
propiedades medicinales. Destaca que Paracelso la empleaba para tratar heridas,
parásitos y desórdenes psicóticos sin embargo, no lo describía como antidepresivo. Solo
fue hasta el año 1630 que Angelo Sala reporta su uso para el tratamiento de la
“melancolía” o la depresión. En el año 1900 se introdujo como antidepresivo y desde la
publicación de la monografia Alemana en 1984 se inicia el proceso de validación de su
actividad (Müller, 2005). Esta planta presenta una amplia distribución que va desde las
islas Azores hasta China y desde la región mediterránea hasta los Himalayas. H.
perforatum, se caracteriza por ser una hierba perteneciente a la sección Hypericum, que
presenta glándulas negras en su tallo, hojas y flores. Las hojas son sésiles o con
pecíolos cortos, glándulas translúcidas en la lámina foliar, inflorescencias con flores de
tamaños entre 15 a 35mm de diámetro, pétalos amarillos, con ovario trilocular, tres
estilos libres y estambres fasciculados (Ernst, 2003).
Los metabolitos característicos de esta especie son hipericina, pseudohipericina e
hiperforina, además de las biflavonas ( I3, II8 biapigenina y amentoflavona), flavonoides
(quercetina) y los glicósidos de flavonoides (rutina, hiperósido, isoquercitrina y
quercitrina). Es importante resaltar que el flavonoide rutina se emplea como marcador
para la autentificación química del extracto vegetal (Crockett, & Robson, 2011) (Figura 1-
5). Los anteriores metabolitos se encuentran principalmente en la sección Hypericum.
Para el caso de las especies pertenecientes a las secciones Brathys y Trigynobrathys, se
ha demostrado que ambas carecen de hipericina, pseudohipericina e hiperforina. Por otra
parte si se ha demostrado la presencia de acilfluoroglucinoles diméricos, compuestos que
los autores consideran unos posibles marcadores quimiotaxonómicos para estas dos
secciones (Crockett, & Robson, 2011; Ccana-Ccapatinta et al., 2013).
La especie H. perforatum se encuentra incluida en la Farmacopea Europea y en la
Farmacopea de los Estados Unidos (USP) y en ambas es indicada para el tratamiento de
la depresión, cura de heridas, eccema y tratamiento de quemaduras (Committee on
herbal medicinal products , 2009). La actividad antidepresiva de extractos, moléculas
aisladas y fracciones enriquecidas en flavonoides ha sido reportada en estudios in vivo
13
(Butterweck et al., 2000; Committee on herbal medicinal products, 2009; Russo et al.,
2014; Ramalhete et al., 2016).
Figura 1-5.Metabolitos encontrados en el género Hypericum.
Clínicamente se ha demostrado que Hypericum perforatum controla la depresión leve y
moderada (Maher et al., 2016). Adicionalmente, el extracto de H. perforatum es
considerado seguro aunque presente efectos adversos e interacciones con
1
4
Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
medicamentos (Committee on herbal medicinal products, 2009). Algunos de los efectos
adversos que se han descrito son: irritaciones gastrointestinales, reacciones alérgicas y
fatiga con una incidencia de 2% a diferencia de los antidepresivos (ISRS) que presentan
una incidencia entre el 20 y 50% con otros efectos secundarios más serios tales como
efectos cardiacos, disfunción sexual, mareo, entre otros (Committee on herbal medicinal
products, 2009). La hiperforina (0.5 a 6 %) es uno de los constituyentes del extracto a los
que se le atribuye la actividad antidepresiva, con un mecanismo de acción mixto similar a
los antidepresivos tricíclicos y a los inhibidores de retoma de la serotonina (IRSS)
(Ramalhete et al., 2016). Sin embargo, extractos que no contienen hiperforina, pero si
presentan flavonoides, mantienen la actividad antidepresiva en modelos farmacológicos
murinos (Butterweck, 2003; Wang et al., 2010).
1.2.3 Género Hypericum en Colombia
En la cordillera de los Andes existe una mezcla compleja de hábitats que van desde
praderas secas y húmedas hasta pantanos acídicos y turberas (Crockett et al., 2010). En
los páramos colombianos se encuentran más de 4700 especies de plantas, que
representan el 17% de la diversidad florística en Colombia. Dichas especies presentan
una distribución limitada a pocas localidades o son endémicas. Según el catálogo de
plantas y líquenes de Colombia reportado por (Bernal et al., 2015); hay 54 especies de
Hypericum en el territorio colombiano. Por otra parte, de las 469 especies de Hypericum,
solo 132 especies cuentan con algún estudio publicado, lo que implica que aún falta por
conocer el potencial de este género (Stojanovic et al., 2013). Teniendo en cuenta que H.
juniperinum no cuenta con investigaciones relacionadas con química, anatomía ni
actividad sobre el sistema nervioso central, particularmente antidepresiva, consideramos
interesante estudiar esta planta nativa desde estas perspectivas.
1.2.4 Hypericum juniperinum (L.f.)Kunth
La planta Hypericum juniperinum K. especie nativa de los páramos colombianos
(Robson, 2015), se caracteriza por ser un arbusto de 0.2 a 2.5 metros de alto, con tallos
de coloración café a naranja, las hojas son sésiles persistentes en el tallo, presenta flores
de 4 a 12 mm con pétalos de color amarillo pálido, esta se encuentra en bosques
abiertos y en áreas pantanosas del páramo y subpáramo entre los 2200 a 3800 m
15
(Pattinson, 2017). En Colombia, H. juniperinum presenta los siguientes nombres
comunes: Chite (Antioquia, Boyacá, Cauca, Cundinamarca y norte de Santander),
guardarocio (Cauca) y Escobo (diferentes regiones de Colombia), (Bernal et al., 2015).
H. juniperinum se encuentra distribuida en la región andina y en la sierra nevada de
Santa Marta, además de los departamentos de Antioquia, Boyacá, Caldas, Cauca,
Chocó, Cundinamarca, Huila, Meta, Magdalena, Norte de Santander, Santander,
Putumayo y Tolima (Figura 1-6) (Bernal et al., 2015). Hypericum juniperinum, solo cuenta
con artículos relacionados con su ecología (Crockett et al., 2010) y un artículo publicado
recientemente que evalúa su actividad antimicrobiana (Plazas, 2017). En cuanto a sus
usos tradicionales, las comunidades reportan el uso de las flores para tratar la tos,
además de emplear las ramas como escobas, para hacer fuego y como protector de
zonas húmedas (Duarte, & Parra, 2015).
Figura 1-6. Distribución de Hypericum juniperinum (L.f.) Kunth en Colombia, tomada y modificada de (Bernal et al., 2015).
1
6
Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
2. Justificación
Las especies del género Hypericum son reconocidas por presentar propiedades
antimicrobianas, antidepresivas y/o anti-inflamatorias. De todas ellas, únicamente
Hypericum perforatum es empleada oficinalmente, aunque no sea la que presenta la
mayor cantidad de constituyentes activos (Stojanovic et al., 2013). En consonancia con
lo anterior, se postula que Hypericum juniperinum, una planta nativa de nuestros
páramos colombianos, debido a su relación quimiotaxonómica es posible que presente
efectos sobre el sistema nervioso central, probablemente asociados con una actividad
antidepresiva. Por otro lado, H. juniperinum no cuenta con estudios que describan su
composición química, ni su morfo anatomía, ni la evaluación de los efectos de ésta en el
sistema nervioso central. Lo anteriormente expuesto representa una oportunidad para
establecer el potencial terapéutico de H. juniperinum como una alternativa para el
tratamiento de la depresión.
3. Objetivos
3.1 Objetivo General
Caracterizar morfo-anatómicamente, químicamente y evaluar la actividad sobre
sistema nervioso central en modelo murino del extracto metanólico de la planta
Hypericum juniperinum
3.2 Objetivos Específicos
- Analizar histológicamente las estructuras presentes en los órganos aéreos
de Hypericum juniperinum.
- Determinar estructuralmente algunos de los constituyentes químicos del
extracto metanólico de Hypericum juniperinum.
- Evaluar la actividad sobre sistema nervioso central en modelo murino del
extracto crudo y las fracciones de Hypericum juniperinum.
18 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
4. Materiales y Métodos
4.1 Estudio Morfoanatómico
4.1.1 Histología de los órganos aéreos de Hypericum juniperinum
Los órganos aéreos (tallos, hojas y flores) de Hypericum juniperinum fueron fijados en
una solución de FAA (10:5:85, formol: ácido acético: EtOH 70%) por 48 h y
posteriormente fueron tratados con los protocolos convencionales de Johansen, (1940),
modificados de la siguiente manera: deshidratación en series de EtOH, 70% por 24
horas, 90%, 96%, 100% por 4 horas c/u; series de EtOH 100% etanol:histochoice®
(agente aclarante) en serie Histoclear (90:10, 70:30, 50:50, 30:70, 100, 100); imbibición
en parafina (paraplast plus, 60 ºC) tres veces por 24 horas c/u. Se realizaron secciones
seriadas o individuales de 7 µm de grosor en un micrótomo de rotación (820 Spencer,
American Optical Company, NY) y fijación en láminas con aplicación del reactivo de
Haupt. Las láminas se colocaron en horno a 60ºC por 24 horas, luego se desparafinaron
mediante dos pasos por xilol 100%, EtOH 50 : xilol 50 por 3 minutos (x2), seguido por
hidratación en series de EtOH 100%, 95%, 70%, 50%, agua destilada por 2 minutos y
tinción con astra-blue acidificado (1g/100 mL de 2% en ácido tartárico) para tinción azul
de polisacáridos de pared celular primaria como celulosa y pectinas por 10 minutos,
seguido por un lavado en agua destilada por 2 minutos y contratinción con fucsina básica
etanólica (0,1 g/100mL en etanol al 50%) por 20 minutos para tinción roja de las paredes
lignificadas y suberificadas, seguido de lavado en agua destilada por 15 segundos.
Después de la tinción se realizó una deshidratación en series de EtOH (50%, 70%, 95%,
100%, 100%; 1 minuto c/u) y de etanol: xilol (70:30, 50:50; 2 minutos c/u), xilol 100% 2
veces por 3 minutos. Al final del proceso se adicionó citoresina sobre los portaobjetos, se
19
montó el cubreobjetos y se dejó secar al aire durante 2 semanas. Por último, se tomaron
fotos de los cortes en un microscopio Olimpus BX50® con moticam pro 2828 en
diferentes aumentos, indicados con barras de escala.
4.1.2 Histoquímica de los órganos aéreos de Hypericum juniperinum
A tallos, hojas y flores frescas de H. Juniperinum se les realizaron cortes a mano alzada y
se llevaron a cabo tinciones diferenciales según lo descrito por (Ruzin, 1999) y
(Johansen, 1940). Los cortes se observaron en un estereoscopio Leika M-205 en modo
multifocus con una cámara MC 170 HD en diferentes aumentos y se tomaron fotos,
donde mediante la coloración característica se detectan algunos de los metabolitos. En
la Tabla 1 se presentan las tinciones realizadas.
Tabla 1.Tinciones diferenciales realizadas en órganos aéreos de Hypericum juniperinum.
Metabolitos Resultado Metodología
Lípidos, cutina y
suberina
Sudan IV: coloración roja
en zonas con presencia del
metabolito
Los cortes realizados se tiñen con
sudan IV por 5 min, luego se lavan
con H2O destilada y se observan
directamente
Lípidos, cutina y
suberina
Sudan III: coloración
naranja en zonas con
presencia del metabolito
A los cortes realizados se les
adiciona una mezcla de Sudan III
0.5% en etanol al 70%
Cutina y suberina,
fosfolípidos, aceites
esenciales
Sudan Black: coloración
negra en zonas con
presencia del metabolito
A los cortes realizados se les
añade una solución de sudan Black
( 70% EtOH+ Sudan Black 0.007g)
Fenoles FeCl3: coloración café
oscuro- negro
A los cortes realizados se les
adiciona FeCl3 12% (0.12g en 10
mL de EtOH)
Lignina (ácidos y
alcoholes
fenilpropílicos)
Fluoroglucinol: coloración
rojiza en zona con la
presencia del metabolito
A los cortes realizados se les
adiciona fluoroglucinol al 1% en
EtOH 96%, luego se les adiciona
HCl al 25%
Flavonoides, KOH: coloración roja en A los cortes realizados se les
20 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
glicósidos
antracénicos
zona con presencia del
metabolito
adiciona una solución de KOH al
10% en etanol, luego se lava con
agua destilada
Alcaloides Dragendorff : coloración
naranja-rojiza en presencia
de alcaloides
Se aplica el reactivo de dragendorff
a los cortes y se evalúa la
presencia de color
Pectinas Rojo rutenio: coloración
rojiza o rosada en zona con
presencia del metabolito
Se adiciona una solución de rojo de
rutenio al 0.02% en agua destilada,
luego se lava y se observa en el
microscopio
4.2 Estudio Fitoquímico
4.2.1 Material vegetal
Las partes aéreas (tallo, hojas y flores) de Hypericum juniperinum fueron recolectadas en
el periodo de época seca en la Vereda Arbolocos, del municipio Cuitiva, Boyacá. El
material vegetal fue clasificado taxonómicamente por especialistas del Herbario
Nacional Colombiano (COL) de la Universidad Nacional de Colombia y se depositó
un ejemplar con el siguiente número de voucher (COL589611). El resto del material
vegetal de Hypericum juniperinum, se secó en una estufa de aire recirculante a 40 °
C y se trituró con cuchillas en una licuadora (Hamilton Beach, Comercial) para su
posterior procesamiento.
4.2.2 Extracción y Fraccionamiento
El material seco (1243 g) se humedeció con un volumen de 1.5 L de metanol al 80%. Se
realizaron 3 procedimientos de extracción por percolación hasta agotamiento,
evidenciado por CCD. A los extractos fluidos obtenidos se les redujo el volumen
mediante presión reducida empleando un rotaevaporador a una temperatura de 40°C y
60 rpm, seguido a esto el extracto se llevó a un baño de María a 50°C hasta sequedad
completa, obteniendose un total 395,58 g.
21
Finalmente se tomaron 100 g del extracto y se realizó un fraccionamiento líquido- líquido
siguiendo la metodología descrita por Kupchan, adaptada de (Otsuka, 2006) (Figura 4-1),
donde se obtuvo la fracción hexánica (1.019 g) 1.3%, fracción clorofórmica (6.774 g)
8.9%, la fracción de acetato de etilo (20.126 g) 26.3%, butanol (34 g) 45.6% y la fracción
acuosa (13.721 g) 18%.
Figura 4-1. Esquema de fraccionamiento líquido-líquido por la metodología Kupchan
modificada por (Otsuka, 2006).
4.2.3 Pruebas fitoquímicas preliminares de Hypericum juniperinum
Teniendo en cuenta la metodología reportada por (Salama, & Calle, 2005); se evaluaron
los siguientes grupos de metabolitos: Alcaloides (Prueba de Mayer, Valser y
Dragendorff), esteroides-glicósidos cardiotónicos (Lieberman-Burchard, Reacción de
kedde, ensayo para digitoxosa, Keller-Kiliani. Vainillina/ácido sulfúrico en CCD),
flavonoides (Shinoda, leucoantocianidinas y cloruro férrico. NP-PEG en CCD), saponinas
(espuma), taninos (gelatina sal, FeCl3), antraquinonas (Borntrager-Kraus y KOH en
placa).
22 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
4.2.4 Aislamiento y purificación de compuestos de H. juniperinum
La purificación de los metabolitos se llevó a cabo mediante técnicas cromatográficas
convencionales. Para la cromatografía en capa delgada (CCD) se utilizaron placas de
silica gel F254 (0.2 mm) marca Merck®. Para la detección de los compuestos se
empleó luz UV o los reactivos de aspersión vainillina al 1% en etanol y ácido
sulfúrico 10% y NP-PEG (NP- 0.25g de Ácido difenilbórico aminoetilester en 25 mL
metanol, PEG-1.25 g de Polietilenglicol 4000 en 25 mL de Etanol ). La cromatografía
en columna (CC) se llevó a cabo empleando Sephadex LH-20 100 marca Sigma-
Aldrich® y sílica gel 60 marca Merck® como fases estacionarias. Como fase móvil se
emplearon mezclas de solventes de diferente polaridad (hexano, cloroformo, acetato
de etilo y metanol, entre otros). Las fracciones fueron reunidas de acuerdo al
seguimiento realizado por CCD.
Los compuestos purificados se analizaron por RMN (resonancia magnética nuclear).
Estos espectros de 1H- y 13C-RMN fueron registrados en dimetilsulfóxido (DMSO-d6)
Merck®, empleando un espectrómetro Bruker DRX® de 400MHz (1H a 400 MHz; 13C 100
MHz). Los desplazamientos químicos (δ) se reportan en ppm en relación con las señales
del solvente (DMSO). Las constantes de acoplamiento (J) se reportan en Hz. Los
espectros de 1D (1H, 13C, APT) y 2D (COSY, HMQC,HMBC) fueron llevados a cabo para
la determinación de las estructuras. Los espectros fueron procesados en el programa
Mes-RecNova. El espectro de Infrarojo (IR) fue realizado en pastillas de KBr empleando
un espectrofotómetro (IR Affinity Shimatzu). El espectro de ultravioleta (UV) fue
registrado por un lector UV/VIS Spectrophotometer Optizen pop. Las lecturas fueron
realizadas en un rango de longitud de onda de 200 a 500 nm. Finalmente, los datos de
espectrometria de masas fueron obtenidos en un equipo LCQ Fleet™ Ion Trap Mass
Spectrometer, equipado con ionización electrospray (ESI) en modo [M-H]- [M-H]+y
MS/MS.
23
4.3 Estudio Farmacológico
4.3.1 Animales
Para el presente estudio se emplearon ratones albinos ICR machos de 7 a 9 semanas
con pesos entre 25 a 40 g. Estos fueron suministrados por el Bioterio del Departamento
de Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia. Para la evaluación del extracto
metanólico, así como de las fracciones obtenidas a partir de este; los ratones se
distribuyeron en grupos de 6 por caja. Los animales permanecieron en un ciclo de 12
horas luz y 12 horas de oscuridad, con consumo de alimento y agua a voluntad. Posterior
a un ayuno de 5 a 6 horas se inició la administración con los correspondientes
tratamientos a evaluar. El protocolo empleado para las pruebas realizadas en el presente
trabajo fue aprobado por el comité de ética de la Universidad Nacional de Colombia.
4.3.2 Reactivos pruebas farmacológicas
Para los diversos ensayos, se emplearon como controles positivos los siguientes
fármacos: 1. Ansiolítico: Clonazepam (Coquan®) en solución oral, 2. Antidepresivo:
Imipramina marca Sigma®, 3. Anticonvulsivante: Fenitoina sódica marca Sigma®, 4.
Patrón de Hypericum: Extracto estandarizado de Hypericum perforatum (OKEY®) y
finalmente para el ensayo potenciación del sueño barbitúrico se empleó el pentobarbital
sódico (Penthal®).
4.3.3 Preparación, dosis empleadas y administración de tratamientos
Los tratamientos empleados se prepararon el día de la realización de las pruebas,
adicionalmente fueron administrados en un volumen de 0.1mL/10g de peso del animal en
todos los casos: Vehículo de administración, extracto metanólico de Hypericum
juniperinum y extracto de Hypericum perforatum en 3 dosis (150, 300 y 500 mg/kg),
fracción de acetato de etilo y butanol de Hypericum juniperinum en 2 dosis (150 y 300
mg/kg), clonazepam (dosis de 0.3mg/kg), imipramina (dosis de 35 mg/kg) y fenitoína
sódica (20 mg/kg) por vía oral (v.o). Finalmente, pentobarbital sódico (45 mg/kg) por vía
intraperitoneal (ip).
24 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Los extractos y fracciones de H. juniperinum junto con el extracto estandarizado de
Hypericum perforatum (OKEY®), el patrón clonazepam, imipramina y fenitoína sódica,
fueron solubilizados en un vehículo que estaba constituido por 10% de propilenglicol,
10% de glicerina, 2% de polisorbato 80 (Tween-80) y 78% agua destilada para completar
el volumen. El pentobarbital sódico fue disuelto en solución salina al 0.9%.
4.3.4 Esquema de realización pruebas farmacológicas
La evaluación farmacológica se realizó en dos fases. En la primera fase se evaluaron 3
dosis del extracto metanólico de H. juniperinum (150, 300 y 500 mg/kg)(Figura 4-2.) y en
la segunda fase se evaluaron las fracciones de acetato de etilo y butanol a dos dosis de
150 y 300 mg/kg (Figura 4-3). Previo al inicio de las pruebas, los animales permanecieron
en un periodo de adaptación al experimentador de una semana, posteriormente fueron
clasificados según la actividad exploratoria basal empleando los modelos de campo
abierto y tablero agujereado en la fase 1 y 2 respectivamente, permitiendo distribuir los
animales en seis grupos heterogéneos según actividad exploratoria basal (en todos los
tratamientos quedaron animales muy exploradores como poco exploradores), con estas
pruebas se balanceó la variable de actividad locomotora basal propia de cada animal.
Cada animal recibió una dosis diaria de su correspondiente tratamiento durante más de
una semana; después de la segunda dosis administrada se inició el esquema de
tratamiento de la siguiente manera, con la salvedad de una prueba por dia: Fase 1
(evaluación de extracto metanólico de H. juniperinum y H. perforatum a 3 dosis): suelo
agujereado, nado forzado, suspensión por la cola, laberinto en cruz, potenciación del
sueño barbitúrico y convulsión por electroshock. Fase 2 (evaluación de fracciones de
acetato de etilo y butanol de H. juniperinum a 2 dosis): campo abierto, nado forzado,
suspensión por la cola, laberinto en cruz, potenciación del sueño barbitúrico, convulsión
por electroshock y el punto final del estudio. Para eliminar el efecto residual resultante de
la administración de pentobarbital se dejó un intervalo de 7 días entre la prueba de
potenciación del sueño y la de convulsión. Con esta batería de pruebas, se buscó
determinar los efectos de los extractos sobre la actividad locomotora (suelo agujereado,
campo abierto), los efectos de tipo antidepresivo (nado forzado, suspensión por la cola),
de tipo ansiolítico (laberinto en cruz), sedante (potenciación del sueño barbitúrico) y
anticonvulsivante (electroshock). Adicionalmente, para explorar posibles alteraciones
25
sobre la actividad motora, se aplicó la prueba del alambre, antes y después de la
administración de los tratamientos.
Figura 4-2. Fase 1 del tamizaje farmacológico en sistema nervioso central (SNC) del extracto crudo, en 3 dosis empleadas (150, 300 y 500 mg/kg) de H. juniperinum, en el modelo murino.(Vectores ilustrativos tomados de freepik y Servier medical art).
26 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Figura 4-3. Fase 2 del tamizaje farmacológico en sistema nervioso central (SNC) de las fracciones del extracto de H. juniperinum en 2 dosis empleadas (150 y 300 mg/kg), en el modelo murino.(Vectores ilustrativos tomados de freepik y servier medical art).
4.3.5 Tamizaje farmacológico en sistema nervioso central en modelo murino
Teniendo en cuenta los reportes de actividad antidepresiva para plantas del
género Hypericum (Committee on herbal medicinal products, 2009) se evalúo el
extracto metanólico de H. juniperinum en 3 dosis y las fracciones de acetato de etilo y
butanol en 2 dosis, ya que existen reportes de actividad en fracciones enriquecidas con
flavonoides de H. perforatum (Butterweck et al., 2003; Bukhari, & Dar, 2013). A
su vez estas fracciones se seleccionaron porque se obtuvieron en una considerable
cantidad luego del fraccionamiento líquido-líquido. Siguiendo los protocolos reportados
(Lapa et al., 2002), los extractos y las fracciones fueron evaluadas en los modelos
que se describen a continuación:
Prueba farmacológica para determinar alteraciones de la actividad motora:prueba del alambre
En este ensayo se posicionan los animales con las patas anteriores en un alambre que
tiene 1 cm de diámetro y 15 cm de longitud a 20 cm de altura, se suelta el animal y se
espera que logre con las patas posteriores agarrarse de este, se considera como
ausencia de respuesta cuando los animales no logran agarrar el alambre 3 veces
sucesivas, esta prueba se realiza antes y una hora después de la administración de los
tratamientos.
Pruebas farmacológicas para evaluar la actividad exploratoria
Prueba de campo abierto
Pasada una hora después de la administración por vía oral de cada tratamiento, los
ratones se disponen en el centro de una caja de medidas (28 cm x 28 cm y de altura 28
cm) dividida en 16 cuadrantes, durante 5 minutos de observación se contabiliza el
número de cruces en el centro y en la periferia. el cruce se define como el paso del ratón
de un cuadrante a otro, al traspasar la línea blanca. El patrón utilizado fue clonazepam a
27
una dosis de 0.3 mg/Kg (v.o), del cual se espera un aumento en el número de cruces en
el centro, debida a su actividad ansiolítica.
Prueba de tablero agujereado
Una hora después de la administración por vía oral de los tratamientos, los ratones se
disponen en el centro de una caja que presenta 16 agujeros de 3.5 cm de diámetro,
durante 5 minutos de observación se contabiliza el número de ingresos de la cabeza del
animal al agujero (Head dippings). El patrón utilizado fue clonazepam a una dosis de 0.3
mg/Kg (v.o), se espera que el patrón tenga una reducción del número de head dippings.
Pruebas farmacológicas para evaluar la actividad ansiolítica
Prueba de laberinto en cruz
Después de la administración por vía oral del tratamiento, cada ratón se dispone en el
centro de un laberinto en cruz que presenta dos brazos abiertos y dos brazos cerrados,
durante los 5 minutos de observación se registra la frecuencia de entrada en cada brazo
y el tiempo de permanencia en cada uno de estos, junto con el tiempo de decisión. De
esta manera se calcula el porcentaje de permanencia en cada zona. El patrón utilizado
fue clonazepam en una dosis de 0.3 mg/Kg (v.o),de quien se espera un aumento en la
permanencia en la zona abierta.
Pruebas farmacológicas para evaluar la actividad antidepresiva
Prueba de nado forzado
Una hora después de la administración por vía oral del tratamiento, cada ratón es forzado
a nadar individualmente durante 5 minutos dentro de un cilindro vertical de plástico
(altura: 40 cm, diámetro: 18 cm) que contiene 15 cm de agua a 25°C. En este ensayo se
registra el tiempo de inmovilidad, definido como el mínimo movimiento realizado por el
animal para mantener la cabeza por fuera del agua y el tiempo de latencia que se define
como el tiempo que tarda el animal en entrar en el primer estado de inmovilidad asociado
con la desesperanza. El patrón empleado fue imipramina en una dosis de 35 mg/kg (v.o),
el cual presentara una reducción del tiempo de inmovilidad, y un incremento del tiempo
de latencia
Prueba de suspensión por la cola
28 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Una hora después de la administración del tratamiento, los animales fueron suspendidos
en el borde de un estante (altura: 20 cm, ancho por cuadrante: 12,5 cm), con cinta
adhesiva colocada en zona media de la cola (5 cm), la duración de la inmovilidad fue
evaluada durante un periodo de 5 minutos. El patrón empleado fue imipramina en una
dosis de 35 mg/kg (v.o), el cual presentara una reducción del tiempo de inmovilidad, y un
incremento del tiempo de latencia.
Pruebas farmacológicas para evaluar la actividad sedante: Prueba depotenciación del sueño barbitúrico.
Una hora después de la administración de cada tratamiento por vía oral, los ratones
fueron inyectados con pentobarbital sódico en una dosis de 45 mg/kg (i.p), en este
ensayo se evaluó el tiempo de latencia (tiempo donde hay pérdida de reflejo de
enderezamiento) y el tiempo de duración de sueño (adquisición del reflejo de
enderezamiento). El patrón utilizado en esta prueba fue clonazepam en una dosis de 0.3
mg/Kg (v.o), el cual presentara un incremento en la duración del sueño y una reducción
en la latencia del mismo.
Pruebas farmacológicas para evaluar la actividad anticonvulsivante: Prueba deconvulsiones inducidas por electroshock máximo
Para esta prueba, y posterior a una hora de administración del tratamiento, a los
animales se les adicionó solución salina al 0.9% en las córneas, luego se les aplicó una
descarga eléctrica de 50 mA de corriente alterna de 60 Hz, durante 0.2 ms con un
estimulador de marca Coulbourn instruments®. En este caso se asume como protección
la ausencia de extensión tónica de las extremidades posteriores en un ángulo superior a
45°. El patrón empleado fue fenitoina sódica en una dosis de 20 mg/kg (v.o), de quien se
espera una ausencia de la convulsión.
4.3.6 Consideraciones éticas
Los experimentos ejecutados en el presente trabajo se realizaron teniendo en cuenta la
Ley N° 84 de 1989 “Por la cual se adopta el Estatuto Nacional de Protección de los
Animales”, principalmente los artículos 23, 24, 25 y 26, y lo establecido por la resolución
008430 DE 1993 “por la cual se establecen las normas científicas, técnicas y
administrativas para la investigación en salud”, en el título V, artículo 87 al 94. Teniendo
29
en cuenta que los resultados experimentales del presente proyecto no se pueden obtener
por otro procedimiento, no pueden ser sustituidos por otros procedimientos análogos
como cultivo de tejidos, modelos computarizados, etc.; y los presentes experimentos son
necesarios para el control, prevención, diagnóstico o tratamiento de enfermedades que
afectan al hombre.
Se tuvieron en cuenta los principios éticos internacionales para la investigación
biomédica con animales- CIOM (Consejo Internacional de Organizaciones Médicas).
Estos animales fueron tratados como seres sensibles, se cuidaron y se emplearon
adecuadamente evitando o minimizando las molestias, la angustia y el dolor, dándoles
las mejores condiciones de vida posible; en el punto final del estudio, se aplicó la
eutanasia de los animales según las guias de AVMA. Al momento de concluir el presente
trabajo los animales fueron dispuestos siguiendo los lineamientos del programa de
gestión ambiental de la Universidad Nacional de Colombia en cuanto al manejo de
residuos.
4.3.7 Análisis de datos
Los datos se expresan como el promedio (de una muestra de seis animales por grupo)
+/- ems (error estándar del promedio). Previo examen de los criterios paramétricos de
distribución normal (prueba de Shapiro Wilk) y homogeneidad de varianzas (prueba de
Barlett), se procedió a un análisis de varianza de una vía, seguido de la prueba
diferencias múltiples de Tukey. Cuando los supuestos paramétricos no se alcanzaron se
aplicó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de diferencias de
Wilcoxon. Se asumió una p<0,05. Para el análisis de los datos se empleó el programa
estadístico de R- Studio. De esta manera se determinaron las diferencias significativas
entre tratamientos.
30 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
5. Resultados y discusión.
5.1 Estudio Morfoanatómico de H. juniperinum (Kunth).
Hypericum juniperinum es una planta con hábito arbustivo (Figura 5-1A), hojas sésiles,
erectas, imbricadas (Figura 5-1 B y 5-1 C), la lámina foliar acicular, con un ápice agudo,
las glándulas laminares se aprecian como redondeadas a simple vista (Figura 5-1D),
presenta flores terminales solitarias, aisladas en pares (Figura 5-1 A); las flores
presentan tamaños de 5 mm en adelante (Figura 5-1B, 5-4 A), con sépalos lanceolados
(Figura 5-4 A), pétalos de color amarillo intenso, oblongos con apice apiculado (Figura 5-
4 A), los estambres son de color amarillo, alargados hasta 5 mm de largo, el ovario
presenta una forma ovoide (Figura 5-4G), con 4 estilos.
Figura 5-1. Morfología de Hypericum juniperinum. A. Hábito de la planta, tomado de (Flickr, 2007), B. Disposición de las hojas y flor, C. Distribución de las hojas, D. Longitud y forma de las hojas, glándulas redondeadas (Línea azul).
32 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
5.1.1 Tallo de Hypericum juniperinum (Kunth).
El tallo de Hypericum juniperinum presenta una prominente capa de súber (Su),
conformada de varias capas de células rectangulares, también se aprecian las lenticelas
(Le) como una proliferación de células laxas; seguido de esto aparece la corteza
parenquimática, luego el floema secundario (Fl) y luego el xilema (Xi), entre estas 2
capas se encuentra el cambium, lo que determina el crecimiento secundario de este tallo.
Finalmente se puede apreciar la médula (Me) con células espaciadas entre si (Figura 5-
2A). El xilema está caracterizado por vasos de tipo reticulado (Vr) y perforados (Vp)
(Figura 5-2B), adicionalmente se encuentra rodeado por filas de parénquima radial (Pra)
que presentan sustancias de tipo oleoso (Figura 5-2C), en esta muestra no se observan
anillos de crecimiento. En el análisis histoquímico se observó que los reactivos de sudan
IV, sudan III y sudan black reaccionan con la suberina del tallo y ciertos aceites de la
muestra dando una coloración roja para las dos primeras tinciones (Figura 5-2D y E) y
negra para la última (Figura 5-2F). Los aceites se almacenan en parénquima radial a
manera de tilides. En cuanto al reactivo de cloruro férrico se observó una coloración
negra, a lo largo del floema, asociada a la presencia de sustancias de tipo fenólico
(Figura 5-2G). En la tinción con fluoroglucinol se observa una coloración rosada-roja
intensa en el xilema del tallo, siendo positiva para paredes lignificadas (Figura 5-2H).
Para el caso de la tinción con KOH se observa una coloración roja a lo largo del tallo sin
ubicación preferencial, esta coloración podría estar asociada a ciertos flavonoides y/o
compuestos antraquinónicos (Figura 5-2I). No hubo presencia de alcaloides en los cortes
realizados en el tallo con la tinión de dragendorff. Finalmente, la muestra de tallo de
Hypericum juniperinum presenta pectina en los vasos del xilema del tallo, dando una
coloración rosada con el reactivo de rojo de rutenio (Figura 5-2J), estos cortes se
comparan frente al blanco (Figura 5-2K).
33
34 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Figura 5-2. A. Corte transversal del tallo de Hypericum juniperinum. Disposición general de los diferentes tejidos. Abreviaturas. Le: Lenticelas, Su: Súber, Me: Médula, Xi: Xilema, Fl: Floema. B. Disposición de los vasos y fibras en corte longitudinal Vr: Vasos reticulados, Vp: Vasos perforados, Pra: Parénquima radial. C. Almacenamiento de
35
sustancia oleosa Ac: Aceite en radios de parénquima. D. Tinción de sudan IV. E. Tinción de sudan III. F. Tinción de sudan Black. G. Tinción de cloruro férrico. H. Tinción con fluoroglucinol. I. Tinción con KOH. J. Tinción con rojo de rutenio. K. Tallo sin tinción (Blanco de tinción).
5.1.2 Hoja de Hypericum juniperinum (Kunth).
Las hojas de Hypericum juniperinum se encuentran dispuestas alternamente en forma
arrosetada, carece de tricomas y presenta estomas de tipo anomocítico que se
encuentran en la cara adaxial (epistomática) (Figura 5-3A y 5-3B), estas hojas están
conformadas externamente por una cutícula gruesa (Cu) que recubre todas las células de
la epidermis (Ep) en ambas caras de la hoja, dichas células son redondeadas. Seguida
de esta se encuentra el parénquima en empalizada (Pe) que está presente a lo largo de
toda la hoja (mesófilo homogéneo de tipo empalizada) con células de forma rectangular,
el haz vascular (Hv) que presenta xilema (Xi) y floema (Fl), y está rodeado por
parénquima a manera de una vaina (Pv), la hoja presenta canales tipo B (Cn) con células
aplanadas (Figura 5-3C y 5-3D). En el análisis histoquímico se apreció que los reactivos
de sudan IV, sudan III y sudan black reaccionan con la cutina presente en la epidermis
(Ep) de la hoja y ciertos aceites presentes en la muestra dando una coloración roja para
las dos primeras tinciones (Figura 5-3 E y 5-3F), y negra para la última prueba (Figura 5-
3G), adicionalmente esta dio positiva en los canales (Cn). En cuanto al reactivo de
cloruro férrico se observó una coloración negra, a lo largo de todos los tejidos de la hoja
mostrando presencia de sustancias de tipo fenólico sin ubicación específica (Figura 5-
3H). Por otra parte, en la tinción de fluoroglucinol se observa una coloración rosada-roja
intensa en el haz vascular (Hv), siendo positiva para paredes lignificadas (Figura 5-3I).
Para el caso de la tinción con KOH se observa una coloración roja en el parénquima
empalizada de la hoja, esta coloración puede estar asociada a ciertos flavonoides y/o
compuestos antraquinónicos (Figura 5-3J). No se encontraron alcaloides en los cortes
realizados y teñidos mediante el reactivo de dragendorff. Finalmente la muestra de tallo
de Hypericum juniperinum presenta pectina en el parénquima de vaina (Pv) que rodea el
haz vascular (Hv) y en las células alrededor del canal(Figura 5-3K). Los anteriores cortes
fueron comparados frente al blanco (Figura 5-3L).
36 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
37
Figura 5-3. Corte transversal de hojas de Hypericum juniperinum. Disposición general de los diferentes tejidos. Abreviaturas. A. Estomas de Hypericum juniperinum ubicados en la cara adaxial.B. Disposición general de las hojas. C. Corte transversal de hoja, con las siguientes estructuras: Cu: Cutícula, Ep: Epidermis, Pe: Parénquima empalizada, Hv: Haz vascular, Cn: Canal, Es: Estoma. D. Haz vascular central de Hypericum juniperinum, presenta, Pv: Parénquima vaina, Xi: Xilema, Fl: Floema. E. Tinción de sudan IV. F. Tinción de sudan III. G. Tinción de sudan Black. H. Tinción de cloruro férrico. I. Tinción con fluoroglucinol. J. Tinción con KOH. K. Tinción con rojo de rutenio. L. Hoja sin tinción (Blanco de tinción).
38 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
5.1.3 Flor de Hypericum juniperinum (Kunth).
La flor de Hypericum juniperinum presenta 4 verticilos florales: Cáliz, corola, androceo y
gineceo; el cáliz y la corola conforman un perianto de tipo heteroclamídeo (Figura 5-4A y
5-4B). El cáliz presenta 5 sépalos amarillos, inervados cada uno por un haz vascular
(HCa) (Figura 5-4C); la corola (Co) presenta 5 pétalos (Figura 5-4A y 5-4D). El androceo
(An) está conformado por aproximadamente 21 estambres libres, con filamento alargado,
con anteras bitecas y tetrasporangiadas, que rodean al gineceo (Gi). En el corte
transversal del cáliz (Ca) y corola (Co) de H. juniperinum se observa externamente la
epidermis (Ep), caracterizada por células redondeadas de tamaños similares, seguido a
esto hay varias capas de células del parénquima (Pa) isodiamétricas, entre las cuales se
observan los haces vasculares. El cáliz presenta un solo haz central (HCa) (Figura 5-4C),
en tanto que en la corola (Figura 5-4 D) hay varios haces vasculares (HCo). En cáliz y
corola se presentan canales (Cn) los cuales varian en el tamaño del lumen, pudiendo
corresponder a canales tipo A. El androceo de H. juniperinum está conformado por un
filamento alargado, con un haz vascular central que presenta las siguientes estructuras:
el filamento (Fi), el surco medial (Sm) donde se inserta la antera (An), que presenta dos
tecas (Te) donde se almacena el polen (Po) (Figura 5-4 E). El filamento presenta a nivel
externo una epidermis (Ep) y un haz vascular central (HvC), con un parénquima con
espacios esquizógenos similar a un aerénquima (Figura 5-4F). El ginecéo de H.
juniperinum está conformado por 3 a 5 estilos (Et) con su correspondiente estigma (Es)
con forma de cabezuela y un ovario (Ov) de tipo unicarpelar y trilocular (Figura 5-4G). En
el corte transversal se observan canales de tipo A rodeando todo el ovario (Figura 5-4B).
En el análisis histoquímico se detectó la presencia de aceites y compuestos de
características lipídicas al hacer reaccionar la muestra con los reactivos de sudan III y
sudan black dando una coloración roja para la primera tinción (Figura 5-4H) y negra para
la siguiente, en los canales (Cn), en las anteras, estigma y finalmente con el polen
(Figura 5-4I). Con el reactivo de cloruro férrico en las anteras, polen y tejidos de cáliz y
corola se observó una coloración negra característica de compuestos de tipo fenólico
(Figura 5-4J). En cuanto a la tinción de fluoroglucinol se observa una coloración rosada-
roja intensa en los haces vasculares de cáliz y corola; para el caso de la tinción de KOH
se observa una coloración roja dispuesta en las anteras y en el estigma de la flor (Figura
5-4K). No hubo presencia de alcaloides en los cortes realizados en la flor. Finalmente, la
muestra de flor de Hypericum juniperinum presenta pectinas en la epidermis de cáliz,
39
corola, anteras y estigma de la flor (Figura 5-4L) estas tinciones están comparados frente
al blanco (Figura 5-4A).
40 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Figura 5-4.A. Flor de Hypericum juniperinum. Disposición general. Abreviaturas. Gineceo (Gi), androceo (An), corola (Co), cáliz (Ca) estructura pentámera. B. Corte transversal de flor. C. Corte transversal del cáliz, con las siguientes estructuras: Epidermis (Ep), Parénquima (Pa), Haz vascular del Cáliz (HCa) y Canales (Cn), D. Corola (Co) junto con el Haz vascular de la Corola (HCo). E. Androceo (An) con el Fi: Filamento, A: Antera, Te: Tecas, Po: Polen, S: Surco medial, F. Estructura interna del filamento de la antera, Epidermis (Ep), Haz vascular central (HvC). G. Gineceo (Gi) con Es: Estilo, Et: estigma. H. Tinción de sudan III en cáliz, androceo y gineceo (de izquierda
41
a derecha). I. Tinción de sudan Black. J. Tinción de cloruro férrico. K. Tinción con KOH. L. Tinción con rojo de rutenio.
Los resultados obtenidos a partir de la caracterización morfoanatómica e histoquímica de
Hypericum juniperinum no se encuentran reportados, por lo que el presente trabajo
constituye un aporte al conocimiento de esta especie que se encuentra en áreas de
páramo colombianas. Sin embargo, la descripción dada en el presente trabajo en cuanto
a las características macroscópicas de la flor, tallo y hojas concuerda con el reporte de la
especie (Robson, 1987); siendo los caracteres que la definen como H. juniperinum, los
tallos erectos, hojas de 6 a 14 mm de largo, estilos de 3 a 5 mm de largo, más largos que
el ovario.
Al estar H. juniperinum agrupada en el género Hypericum, los caracteres definidos que
presenta son hojas simples, enteras con flores amarillas con pétalos libres y con
estambres fasciculados, estilos libres y la presencia de glándulas (negras, rojas o
translúcidas) (Nürk, 2011). La sección Brathys, donde pertenece Hypericum juniperinum,
carece de glándulas negras; típicas de la sección Hypericum a donde pertenece
Hypericum perforatum. Esta especie posee dichas glándulas distribuidas en tallos, hojas,
sépalos y pétalos; y las emplea para el almacenamiento de metabolitos secundarios
(Ciccarelli et al.,2013). pero si presenta glándulas translúcidas, que es un rasgo
característico del género (Ernst, 2003).
En cuanto a las estructuras características de Hypericum, Maggi et al. en el 2004
evidenciaron, mediante la reacción con sudan III, la presencia de aceite esencial en los
canales secretorios y en las glándulas translúcidas de pétalos, sépalos y hojas de
especies de Hypericum italianas; corroborando así lo encontrado por nosotros en H.
juniperinum. Asimismo, la distribución de los canales es similar a la reportada por
Ciccarelli et al. en el 2001, para H. perforatum. Dichos canales están ubicados en el
parénquima de hoja, cáliz y corola. En H. juniperinum solo se observaron canales tipo B
en el corte transversal de la hoja; glándulas translúcidas redondeadas a lo largo de la
hoja y canales tipo A junto con glándulas translúcidas en cáliz, corola y ovario. Estos
canales se comparten en todos los ejemplares del género Hypericum y cuando se
encuentran asociados al mesófilo presentan metabolitos de carácter oleoso y terpénico
(Perrone et al., 2013). La ubicación de las estructuras secretorias en la hoja por debajo
de la epidermis y el hecho de que se presenten en la mayoría de los órganos de la
planta, puede relacionarse que dichas estructuras producen metabolitos secundarios que
42 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
pueden tener un rol defensivo frente a herbívoros y parásitos (Ciccarelli et al.,2001). Por
último, teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la prueba de sudan black donde
en el xilema se encuentran zonas teñidas de color negro en forma de agregaciones de
aceites, se hipotetiza que corresponden a tilides, los cuales se definen como células
parenquimáticas que secretan sustancias a los vasos. Según lo reportado por Micco et
al., (2016), son estructuras que se forman por la oclusión de los vasos, las cuales
almacenan compuestos como gomas, resinas, almidón, cristales y compuestos fenólicos,
estas presentan funciones defensivas a factores bióticos o abióticos.
Los resultados de la parte histoquímica, donde se detectaron metabolitos como aceites,
compuestos fenólicos, flavonoides, son consistentes con las pruebas fitoquímicas
preliminares realizadas con el extracto crudo (ver sección 5.2.1) y estas a su vez con lo
reportado en la literatura para esta especie (Plazas, 2017).
Por ultimo, teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la prueba de sudan black,
donde en el xilema se encuentran zonas teñidas de color negro en forma de
agregaciones de aceites, se hipotetiza que corresponden a tilides, los cuales se definen
como células parenquimáticas que secretan sustancias a los vasos. Según lo reportado
por Micco et al., (2016), son estructuras que se forman por la oclusion de los vasos, las
cuales almacenan compuestos como gomas, resinas, almidón, cristales y compuestos
fenólicos, estas presentan funciones defensivas a factores bióticos o abióticos.
Los resultados de la parte histoquímica, donde se detectaron metabolitos como aceites,
compuestos fenólicos, flavonoides, son consistentes con las pruebas fitoquímicas
preliminares realizadas con el extracto crudo (ver sección 5.2.1), y estas a su vez con lo
reportado en la literatura para esta especie (Plazas, 2017).
Teniendo en cuenta las condiciones de vida en el páramo, H. juniperinum tiene hojas de
tipo cartaceas que presentan menor engrosamiento de paredes, característica reportada
por (Mora-Osejo, 1995) para Hypericum goyanesii, H. mexicanum y H. strictum.
Adicionalmente, presenta un parénquima en empalizada multiestratificado, y una cutícula
gruesa, características de plantas de tipo xeromórfico (Mora-Osejo, 1995). Finalmente, la
disposición de los estomas hacia la cara adaxial de la hoja correlacionada con la
disposición de las hojas en modo arrosetado permite que la planta evite la pérdida de
agua, rasgo esencial para encontrarse en este tipo de ambientes (Mora-Osejo, 1995).
43
5.2 Estudio Fitoquímico
5.2.1 Pruebas fitoquímicas preliminares
Los grupos de metabolitos encontrados en Hypericum juniperinum son: flavonoides/
ácidos fenólicos, esteroides/terpenos, taninos y saponinas (Tabla 2.). Estos resultados
concuerdan con lo reportado para la sección Brathys, que presenta flavonoides como
quercetina, rutina, hiperósido, quercitrina, isoquercitrina; y carece de los metabolitos
biapigeninas, hipericina, pseudohipericina e hiperforina (Crockett, & Robson, 2011). En
cuanto a los terpenos, para el género Hypericum se reportan monoterpenos,
sesquiterpenos, y otros metabolitos como alcanos y aldehídos. En los aceites esenciales
se encuentran sesquiterpenos en alta cantidad, siendo el E-cariofileno el compuesto más
representativo (Guedes et al., 2012). Dentro del aceite fijo de H. perforatum se
encuentran fitosteroles e hidrocarburos (Kokate et al., 2008).
Según lo reportado por (Plazas, 2017), los metabolitos encontrados en las hojas de H.
juniperinum son terpenos, esteroides, fenoles, taninos, flavonoides, quinonas y
cumarinas, y carece de glicósidos cardiotónicos y alcaloides, lo que está de acuerdo con
los resultados presentados en el presente trabajo para el extracto metanólico de las
estructuras aéreas de la planta. Sin embargo, contrario a Plazas (2017) la prueba de
espuma fue positiva para el extracto metanólico de H. juniperinum, aunque se presume la
presencia de saponinas, se requiere hacer la prueba de hemólisis para corroborar este
resultado (Moses et al., 2014). Sin embargo, hay reportes de saponinas en H. perforatum
(Bezáková et al ., 1999) y H. oblongifolium (Khan et al.,2010).
Al analizar la CCD del extracto crudo de Hypericum juniperinum revelada con NP-PEG y
compararla con diversos patrones (rutina-isoquercetina, catequina, quercitrina,
acido tánico, quercetina y extracto de Hypericum perforatum OKEY® ) (Figura 5-5),
en el sistema de elución acetato de etilo: ácido fórmico: ácido acético: agua:
diclorometano (100:10:10:11:26), es posible evidenciar la presencia abudante de ácidos
fenólicos dada la coloración azul característica que presentan y la presencia de
flavonoides con una coloración amarilla, específicamente se detecta quercetina (Rf:
0.85) y rutina (Rf: 0.28). Por otra parte, el extracto de H. juniperinum no presenta
las dos manchas rojas distintivas de H. perforatum que corresponden a hipericina
(Rf: 0.71) y pseudohipericina (Rf: 0.65) (Wagner, & Bladt, 2001). En conclusión, el
extracto de H. juniperinum carece
44 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
de las naftodiantronas hipericina y pseudohipercina, este resultado confirma el hecho de
que la sección Brathys no biosintetiza estos metabolitos (Crockett, & Robson, 2011).
Figura 5-5. Cromatografía en capa fina del extracto metanólico de Hypericum juniperinum,. Fase móvil: acetato de etilo: ácido fórmico: ácido acético: agua: diclorometano (100:10:10:11:26). Revelador NP-PEG (UV 365nm).
Tabla 2. Resultados obtenidos pruebas fitoquímicas preliminares realizadas al extracto
metanólico de H. juniperinum.
Tipo de metabolito Prueba Extracto Hypericum juniperinum
Alcaloides Mayer (+)-precipitado color crema
-
Valser (+)-precipitado color crema
-
Dragendorff (+)-precipitado color rojo-
naranja
-
Flavonoides Cloruro férrico (+)-color azul, morado
+
Shinoda (+)-coloración rojo- violeta
+
Leucoantocianidinas (+)-coloración roja
-
45
Terpenos Lieberman-Burchard (+)-color rojo, azul a verde
+
Glicósidos cardiotónicos Kedde (+)-coloración roja
-
Digitoxosa (+)-coloración roja
-
Keller- Kiliani (+)-coloración roja a verdosa
-
Saponinas Espuma +
Taninos Gelatina (+)-precipitado que toma
color azul cuando se añade cloruro férrico
+
Antraquinonas Borntrager- Krauss (+)-Coloración rosada a roja
intensa
-
5.2.2 Aislamiento y purificación de metabolitos secundarios
COMPUESTO P7:
La fracción de acetato de etilo, se sometió a una columna cromatográfica empleando
sílica gel 60 como fase estacionaria y eluida con solventes y mezclas de solventes de
polaridad ascendente en diferentes proporciones (cloroformo, cloroformo:acetato de etilo,
acetato de etilo, acetato de etilo:metanol y metanol). De este fraccionamiento se
obtuvieron 18 fracciones. La fracción 6 se purificó nuevamente en una columna de sílica
gel con una fase móvil de acetato de etilo a metanol en gradiente obteniendose 18
fracciones; para su posterior análisis se eligió la fracción 10 debido a la detección por
cromatografía en capa fina (CCF) de un compuesto mayoritario. Ésta finalmente se
sometió a una columna de Sephadex LH-20 empleando como sistema de elución
diclorometano: metanol (9:1). Se obtuvieron 38 mg de un polvo de color amarillo que se
denominó P7 (Figura 5-6).
46 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Figura 5-6.Esquema de purificación del compuesto P7 a partir de la fracción de acetato de etilo del extracto metanólico de H. juniperinum.
Para el compuesto P7; en el espectro UV (Anexo A-1) se observan dos bandas en
230 nm y 370 nm, siendo la primera correspondiente al sistema de los anillos A-C
y la segunda asociada al sistema B-C (sistema cinamoil) de un núcleo flavonoide. En el
espectro infrarrojo (Anexo A-2) se observa una señal amplia en 3400 cm-1
correspondiente a estiramientos de O-H, seguido de sobretonos característicos de anillo
aromático en 2000 cm-1, en 1610 cm-1 se observa el estiramiento del carbonilo
C=O, señales de un compuesto aromático con grupos hidroxilo y carbonilo. En el
espectro de 1H-RMN (Ver anexo A-3) se observan 5 señales características de protones
aromáticos con desplazamientos entre δ 6.00 y δ 8.00 ppm. Las señales en δ 6.87 (d,
J=8.4), δ 7.52 (dd, J=6.4 y 2) y δ 7.67 (d, J=2) forman un típico sistema AMX que
corresponde a los protones H5´, H6´ y H2´ del anillo B. Las señales presentes en δ 6.17
(d, J= 2) y δ 6.40 (d, J=2) presentan un acoplamiento meta y corresponden a las señales
H6 y H8 del anillo A. Se destaca también una señal ancha a δ 9.59 correspondiente a
grupos hidroxilo, y una señal de un singlete agudo en δ 12.49 que se atribuye al
hidrógeno de un grupo hidroxilo (H5) que forma un puente de hidrógeno intramolecular
con un carbonilo adyacente (C4).
En el espectro de carbono (13C-RMN) (Ver anexo A-4) se observan 15 átomos de
carbono que corresponden a una estructura típica de un flavonoide (C6-C3-C6). En el
espectro de 13C-RMN se observan las señales a δ 93.38 y δ 98.24 correspondientes a los
carbonos C8 y C6 del anillo A. La señal a δ 135.74 corresponde al carbono que soporta
47
el grupo hidroxilo en C3, la señal a δ 175.83 corresponde a un grupo carbonilo. También
se destacan las señales que se encuentran a campo bajo δ 160.72, δ 164.06, δ 147.73 y
δ 146.77 que corresponden a carbonos aromáticos que soportan grupos hidroxilo en C5,
C7, C3´y C4´, respectivamente. Comparando los datos encontrados con la literatura se
encuentra que el compuesto P7 corresponde al flavonol quercetina (figura 5-7), (Kyriakou
et al., 2012).
En los resultados de la técnica espectrometría de masas (EM-ESI) (Anexo A-12),
se observa un ión pseudomolecular [M-H]- de 301.7 m/z. Con los datos obtenidos
se corrobora que la molécula encontrada en Hypericum juniperinum es quercetina,
molécula ampliamente distribuida en plantas. En el género Hypericum (Crockett, & Robson, 2011),
se reporta en H. perforatum (Avato, 2005), H. scabrum (Jiang et al., 2015), entre otras.
Quercetina (P7): δ1H(400 MHz, DMSO-d6): 6.17(d, 1H, J=2, H6), 6.40 (d, 1H, J=2,H8),
6.87 (d, 1H, J=8.4, H5´), 7.52 (dd, 1H, J=6.4 y 2, H6´), 7.67(d, 1H, J=1.7, H2´), 9.59 (s,
1H, OH), 12.49 (s, 1H, 5-OH). δ13C(101 MHz, DMSO-d6): 93.38 (C8), 98.24 (C6), 102.97
(C10), 115.06 (C2´), 115.62 (C5´), 119.98 (C6´), 121.96 (C1´), 135.74 (C3), 145.08 (C2),
146.77 (C4´), 147.73 (C3´), 156.15 (C9), 160.72 (C5), 164.06 (C7), 175.83 (C4).
Figura 5-7. Estructura de la quercetina.
COMPUESTO AM2:
La fracción de acetato de etilo se sometió a una cromatografía en columna empleando
como fase estacionaria sílica gel 60 marca Merck® empleando mezclas de solventes de
48 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
diferente polaridad; comenzando con hexano, hexano:cloroformo, cloroformo, acetato de
etilo y finalizando con la mezcla acetato de etilo:metanol en diferentes proporciones.
De esta columna se obtuvieron 18 fracciones. Posteriormente, la fracción 9 se fraccionó,
nuevamente, en una cromatografía de columna (sílicagel 60) empleando como sistema
de elución solventes con polaridad ascendente en diferentes proporciones (cloroformo,
acetato de etilo y metanol). De este fraccionamiento se obtuvieron 6 fracciones. Cuando
se reveló la fracción 3 con NP-PEG se observó un compuesto mayoritario de color
amarillo intenso; el cual se fraccionó en una columna de sílica gel con una mezcla de
acetato de etilo:metanol en diferentes proporciones. De la fracción 4 de esta última
columna se obtuvieron 52 mg del compuesto resinoso de color amarillo denominado AM2
(Figura 5-8).
Figura 5-8.Esquema de purificación del compuesto AM2 a partir de la fracción de acetato de etilo del extracto metanólico de H. juniperinum.
Para el compuesto AM2; en el espectro UV (Anexo A-5) se observan dos bandas en 215
nm y 330 nm. En el espectro infrarrojo (Anexo A-6) se observa una señal amplia en 3400
cm-1 correspondiente a estiramientos de O-H, seguido de sobretonos característicos de
anillo aromático en 1750 cm-1; también se observa un estiramiento posiblemente debido a
un doble enlace (C=C), en la señal 1250 cm-1 se observa una flexión de los grupos
hidroxilos de la molécula.
49
En el espectro de 1H-RMN (ver anexo A-7) se observan tres señales características de
protones aromáticos con desplazamientos entre δ 6.50 y δ 8.00 ppm. Las señales en δ
6.76 (d, J=8), δ 6.96 (dd, J= 8.4 y 1.6) y δ 7.02 (d, J=1.2 Hz) forman un típico sistema
AMX que corresponde a los protones H5´, H6´ y H2´, respectivamente. Las señales
presentes en δ 6.08 (d, J=16) y δ 7.36 (d, J=16) se encuentran acopladas y corresponden
a señales de los protones olefínicos H8´ y H7´ que hacen parte de una insaturación con
isomería trans. Se observa una señal desplazada a δ 5.00 (m, J=6.8, 6.8 y 4.5)
correspondiente a un hidrógeno de un carbono metínico (H5) y una señal aguda a δ 3.58
(s) característica de los protones de un grupo metoxilo (O-CH3).
En el espectro de carbono APT 13C-RMN (Anexo A-8) se observan 17 átomos de
carbono distribuidos así: seis carbonos cuaternarios (δ 73.06, δ 125.35, δ 145.37, δ
148.57, δ 165.38, δ 173.64); ocho carbonos metínicos (δ 69.34, δ 71.06, δ 66.86, δ
113.85, δ 114.61, δ 115.85, δ 121.36, δ 145.16); dos carbonos metilénicos (δ 34.90, δ
37.40) y un carbono metílico correspondiente al desplazamiento de δ 51.82. Con esta
información postulamos la estructura de un derivado fenilpropanoide. En el espectro de
APT 13C-RMN (Anexo A-8), se observan los siguientes carbonos: δ 173.64 y δ 165.38
ppm corresponden a carbonos conjugados de ester (C7 y C9), las señales en δ 148.57 y
δ 145.37 ppm corresponden a carbonos aromáticos que soportan grupos hidroxilos (C4´
y C3´). Las señales en δ 145.16 y δ 114.61 corresponden a los carbonos conjugados
olefinicos (C7´y C8´). Una señal en δ 51.82 ppm correspondiente a un carbono de un
grupo metoxilo (-OCH3) y una señal en δ 73.06 correspondiente a un carbono cuaternario
oxigenado (C1). Las señales con desplazamientos a δ 66.86, δ 69.34 y δ 71.06
corresponden a carbonos metínicos alifáticos oxigenados. Las señales a δ 37.40 y δ
34.90 son metilenos.
Del análisis del espectro 1H-1H COSY (Figura 5-9a, Anexo A-9) y (Tabla 3), se confirma
que los protones olefínicos H8´(δ 6.08) y H7´(δ 7.36) están acoplados. Adicionalmente se
aprecian acoplamientos entre los protones aromáticos H5´(δ 6.76) y H6´(δ 6.96). Por otro
lado, el protón H5(δ 5.00) presenta acoplamientos con H6a y H6b, el protón alifático H4(δ
3.59) muestra acoplamientos con H3(δ 3.86), y este a su vez presenta acoplamientos con
H2a (δ 2.08) y H2b (δ 1.75). Finalmente, el espectro COSY muestra acoplamientos entre
los hidrógenos H2a y H2b; y entre H6a y H6b.
50 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Mediante el empleo de los espectros HMQC (Anexo A-10) y HMBC (Anexo A-11) (Tabla
3) se establece que hay conectividad a larga distancia entre H8´(6.08) y los carbonos
C1´(125.35) y C9´(165.38) (Figura 5-9b, correlación destacada del protón olefínico con el
carbonilo éster y el anillo aromático), además H7´(7.36) presenta conectividades con
C1´(125.35), C6´(121.36), C8´(114.61) y C9´(165.38). Estas interacciones permitieron
ubicar la insaturación entre el carbonilo (C9´) y el anillo aromático disustituído, en la
figura 5-9b se destacan sólo las correlaciones de H8´. Por otro lado, las siguientes
interacciones confirman las posiciones de los hidrógenos en el anillo aromático; H5´(6.76)
tiene conectividad con el C1´ (125.35), C3´(145.37), C4´(148.57) y C6´(121.36); H6´(6.96)
muestra correlaciones con el C2´(113.85), C3´(145.37), C4´(148.57) y C7´(145.16); y por
último el H2´(7.02) correlaciona con el C1´, C3´, C4´ y C6´, esta última correlación del
anillo aromático se destaca en la (Figura 5-9b).
Adicionalmente, en el espectro de HMBC se aprecia que la señal con desplazamiento a δ
5.00 (H5) interacciona con los átomos de carbono C1 (δ 73.06), C3 (δ 66.86) C4 (δ
69.34), y C9´(δ 165.38), siendo esta una correlación importante porque establece la
unión del grupo carbonilo éster con la porción alifática de la molécula (Figura 5-9b). Los
protones alifáticos H6 (δ 2.12) están interaccionando con los carbonos C1 (δ 73.06), C2
(δ 37.40), C4(δ 69.34) y el carbonilo C7(δ 173.64) (Ver Figura 5-9b). De igual forma H2
(δ 2.08 y 1.75) correlaciona con C1, C3, C4, C6 y C7. Finalmente, la señal de hidrógeno
a δ 3.58 (-OCH3) se encuentra a tres enlaces de distancia del carbono del carbonilo C7,
correlación observada en la (Figura 5-9b). Lo anterior permite proponer que la porción
del metil éster del ácido quínico se encuentra unida a la porción cafeoil por la posición
C5. Las otras correlaciones presentes en la molécula se pueden apreciar en el (Anexo
A-11).
Para el compuesto AM2 (Anexo A-13), se observa un ion pseudomolecular [M-H]- de
367.04 correspondiente a un metabolito con fórmula C17H20O9. Con los datos obtenidos
se corrobora que la molécula encontrada en Hypericum juniperinum es el metil éster del
ácido 5-O- cafeoilquínico.
Después de realizar el análisis espectroscópico y al comparar las señales de AM2 con
las encontradas en la literatura (Pauli et al., 1999; Clifford, 2017), tenemos que el
51
compuesto AM2 corresponde a un metil éster del ácido clorogénico (metil éster del ácido
5-O-cafeoilquínico) (Figura 5-9). Este metabolito había sido identificado previamente en
Hypericum sikokumontanum (Tanaka et al., 2009) e Hypericum japonicum (Wu et
al.,1998). Este es el primer reporte de esta molécula en H. juniperinum.
a.
b.
Figura 5-9. Estructura del metil ester del ácido 5-O-cafeoilquínico (AM2), a. Flechas negras: acoplamientos observados en el espectro COSY. b. Flechas azules: correlaciones a 2 o 3 enlaces de distancia en el espectro HMBC (correlaciones destacadas de los hidrógenos OCH3,, H5, H6, H8´,y H2´. Para las otras correlaciones presentes ver el anexo A9.
Tabla 3. Desplazamiento químico en δ1H, δ APT 13C-RMN, COSY y HMBC del metil ester del ácido 5-O-cafeoilquínico (AM2).
1H δ(J en Hz) APT 113C-RMN δ COSY HMBC
1 - 73.06
52 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
2 2.08 (1H, m, H2a) 1.75 (1H, dd, J= 12 y 9.6Hz, H2b)
37.40 H2b, H3 H2a, H3
C1,C3,C4,C6,C7
3 3.86 (1H,m)
66.86 H2a, H2b H4
4 3.59 (1H, m) 69.34 H3 C2, C3, C5, C6
5 5.00 (1H,m,J=6.8,6.8 y 4.5 Hz)
71.06 H6a, H6b H4
C1, C3, C4, C9´
6 2.12(dd, 1H, J = 14.0, 3.0 Hz, H2a)
1.93 (2H,dd,J=14.2, y 3.6 Hz H2b)
34.90 H6b, H5
H6a, H5
C1, C2,C4, C7
7 - 173.64
8 3.58(3H,s,OCH3) 51.82 C7
1´ - 125.35
2´ 7.02(d, 1H, J=1.2Hz) 113.85 C1´,C3´, C4´, C6´
3´ - 145.37
4´ - 148.57
5´ 6.76 (d,1H,J=8Hz) 115.86 H6´ C1´, C3´, C4´,C6´
6´ 6.96 (dd,1H,J=8.4 y 1.6Hz) 121.36 H5´ C2´,C3´,C4´,C7´
7´ 7.36 (d,1H, J=16Hz) 145.16 H8´ C1´,C6´, C8´,C9´
8´ 6.08 (d,1H, J=16Hz) 114.61 H7´ C1´, C9´
9´ - 165.38
53
5.3 Estudio Farmacológico
5.3.1 Tamizaje farmacológico en sistema nervioso central en modelo murino del extracto metanólico de H. juniperinum.
Prueba farmacológica para determinar alteraciones de actividad motora: Prueba del alambre
En todos los tratamientos (Extracto crudo en las 3 dosis empleadas y fracciones de
acetato de etilo y butanol en ambas dosis), se encontró que los animales presentaban
una actividad prensil normal, logrando tomar o agarrar con las patas posteriores el
alambre, tanto antes de la administración de los extractos como a la hora después;
mostrando de esta manera que posiblemente H. juniperinum carece de efectos que
alteren la actividad motora que evidencien a nivel neuromuscular (Van Putten, 2011).
Pruebas farmacológicas de actividad exploratoria
Prueba de tablero agujereado
En la prueba de tablero agujereado se encontró que no hay diferencias significativas
en el número de entradas de la cabeza (head dippings) entre los tratamientos en
comparación con el control (Clonazepam), estos valores oscilaron entre 40 y 80
entradas en los tratamientos, mostrando que no hay actividad exploratoria aumentada
para el extracto crudo en las tres dosis evaluadas (150, 300 y 500 mg/kg) (Figura 5-
10). Esta prueba permite evaluar la actividad exploratoria del animal donde el
comportamiento de introducir su cabeza en los agujeros relaciona la inspección del
área de prueba con cierto grado de curiosidad (Vogel, 2008). Para esta prueba el
control empleado, clonazepam, presentó una reducción en la actividad que fue
estadísticamente significativa (p= 0,001) con respecto al vehículo.
54 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Figura 5-10.Efecto del extracto metanólico de H. juniperinum evaluado a 3 dosis (150, 300 y 500 mg/kg) en la prueba de tablero agujereado (Número de head dippings) en ratones machos ICR administrados por vía oral en dosis repetidas, n=6, ± E.M.S, p=‘***’0,001 , ANOVA.
Pruebas farmacológicas de actividad ansiolítica
Prueba de laberinto en cruz
La prueba de laberinto en cruz evalúa el efecto ansiolítico de una sustancia, la cual
genera un aumento en el número de entradas y tiempo de permanencia en la zona
abierta del laberinto (Walf, & Frye, 2007). En el presente trabajo se encontró que no hay
diferencias significativas de los tratamientos frente al vehículo para estos dos
parámetros, p valor= 0.65 y p valor= 0.58 respectivamente (Figura 5-11 A y B). Estos
resultados indican que a estas dosis el extracto de H. juniperinum no presenta actividad
de tipo ansiolítico. El clonazepam, empleado como control mostró un aumento en el
porcentaje de entradas en zona abierta.
55
A.
B.
Figura 5-11.Efecto del extracto metanólico de H. juniperinum evaluado a 3 dosis (150,300 y 500 mg/kg) en la prueba de laberinto en cruz en ratones machos ICR administrados por via oral en dosis repetidas, n= 6, ± E.M.S, ANOVA. A. Porcentaje de permanencia en zona abierta, B. Porcentaje de entradas en zona abierta.
Pruebas farmacológicas de actividad antidepresiva
Los modelos de nado forzado y suspensión por la cola se basan en las acciones de los
antidepresivos conocidos o en las respuestras de estres del animal, implicando que
realmente no se puede definir cuando un ratón esta deprimido. Sin embargo, estos
animales presentan anedonia que se considera el síntoma central de la depresión
(equivalente a la desesperanza- inmovilidad del animal), por lo cual es un modelo
adecuado para la investigación de esta enfermedad (Abelaira et al., 2013).
56 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Prueba de Nado Forzado
El test de nado forzado evalua efectos de sustancias antidepresivas en ratones. En esta
prueba el animal se pone dentro un cilindro con agua de donde no puede salir. Al inicio
de la prueba el animal intentará escapar, pero eventualmente se quedará inmóvil y el
tiempo que permanezca en este estado es el parámetro indicativo del estado de
desesperanza. Varias clases de antidepresivos reducen el tiempo de inmovilidad durante
la prueba al incrementar el nado o el intento de escape (Abelaira et al., 2013). Con
respecto a la prueba de nado forzado se encuentra que el extracto de H. perforatum
presenta una reducción en el tiempo de inmovilidad en las dosis de 300 y 500 mg/kg.
Este resultado concuerda con lo reportado por Bukhari & Dar (2013) y Ramalhete et al.
(2016), para la actividad antidepresiva en prueba de nado forzado de esta especie.
Por otra parte, el extracto metanólico de H. juniperinum presenta actividad a una dosis
de 500 mg/kg, donde se observa una reducción en el tiempo de inmovilidad frente al
vehículo y un aumento en el tiempo de latencia (Figura 5-12 A y B). Estos resultados se
pueden relacionar con una posible actividad antidepresiva. El control imipramina muestra
una reducción tanto del tiempo de inmovilidad como el de latencia. Adicionalmente, y a
partir del ANOVA post hoc tukey, que permite establecer comparaciones multiples entre
los tratamientos; otras diferencias significativas que se presentaron fueron las de las dos
dosis del extracto de H. juniperinum (150 y 300 mg/kg) con el control imipramina,
sugiriendo que estas dosis no presentan actividad antidepresiva p valor<0.01, similares
resultados se obtienen en el tiempo de latencia, estas mismas dosis presentan
diferencias significativas frente al control positivo imipramina, sugiriendo la carencia de
efecto antidepresivo.
57
A.
B.
Figura 5-12. Efecto del extracto metanólico de H. juniperinum evaluado a 3 dosis (150,300 y 500 mg/kg) en la prueba de nado forzado en ratones machos ICR administrados por via oral en dosis repetidas, n=6, ± E.M.S, p= ‘***’ 0,001 ‘**’ 0,01 ‘*’ 0,05, ANOVA. A. Tiempo de inmovilidad (s), B. Tiempo de latencia.
Prueba de suspensión por la cola
El test se basa en el hecho de que los animales al ser suspendidos por la cola, se
someten a un estres a corto plazo y sin posibilidad de escape, lo que conlleva a un
estado de inmovilidad. En esta prueba se mide el tiempo de inmovilidad, siendo menor en
antidepresivos en comparación con el vehículo (Cryan et al., 2005). En esta prueba no se
observan diferencias significativas de los tratamientos frente al vehículo (Figura 5-13 A y
B), sin embargo, hay una tendencia a la reducción del tiempo de inmovilidad en los
extractos de ambos Hypericum frente al vehículo, en el caso del tiempo de latencia,
también se observa un aumento de este tiempo frente al vehículo. Para este grupo
experimental el control de variabilidad se realizó adecuadamente, sin embargo el peso de
58 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
los animales pudo haber tenido un efecto sobre los resultados presentados, siendo
descrito en Vogel, (2008), que los pesos adecuados para realizar esta prueba son entre
25 y 30 g, para el momento de la realización de esta prueba el peso de los animales
estaba en un intervalo de 30 a 40 g, pudiendo influir en el tiempo de inmovilidad y el
tiempo de latencia de esta prueba y el hecho de la carencia de diferencias significativas,
sin embargo la tendencia de reducción de tiempo de inmovilidad es clara.
A.
B.
Figura 5-13.Efecto del extracto metanólico de H. juniperinum evaluado a 3 dosis (150, 300 y 500 mg/kg) en la prueba de suspensión por la cola en ratones machos ICR administrados por via oral en dosis repetidas, n=6, ± E.M.S, p=‘*’ 0,05, (A.) KRUSKALL WALLIS (B.) ANOVA, post Hoc: Tukey. A. Tiempo de inmovilidad (s), B. Tiempo de latencia(s).
59
Pruebas farmacológicas de actividad sedante: Prueba de potenciaciación delsueño barbitúrico
En la prueba de potenciación del sueño barbitúrico se evalua el potencial hipnótico,
sedativo o tranquilizante de una sustancia, lo que se evidencia por el aumento en el
tiempo de duración del sueño al compararse con animales administrados con
pentobarbital (Vogel, 2008). En el presente trabajo se observa que el parámetro de
duración de sueño es prolongado en el control clonazepam habiendo diferencias
significativas frente al vehículo (Figura 5-14B). Por otra parte, los tratamientos no
presentan una prolongación del sueño en los ratones, demostrando que el extracto de H.
juniperinum carece de actividad sedante. En el caso de la latencia del sueño se observa
que el control clonazepam tarda menos tiempo en entrar en el estado de sueño en
comparación con el vehículo (Figura 5-14A). En las diferentes dosis de ambos Hypericum
hay un comportamiento similar al vehículo en cuanto al parámetro de latencia de sueño
sin diferencias significativas entre los tratamientos. Estos resultados concuerdan con lo
reportado en (Sanchez-Mateo et al., 2007) para H. reflexum, donde no hubo una
prolongación del sueño inducido por pentobarbital.
A.
60 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
B.
Figura 5-14.Efecto del extracto metanólico de H. juniperinum evaluado a 3 dosis (150,300 y 500 mg/kg) en la prueba de potenciación del sueño barbitúrico en ratones machos ICR administrados por via oral en dosis repetidas, n=6, ± E.M.S, p=‘*’ 0,05, ANOVA/ KRUSKALL WALLIS. A. Tiempo de latencia (s), B. Duracion del sueño(s).
Pruebas farmacológicas de actividad anticonvulsivante: Prueba de convulsiones inducidas por electroshock máximo
El modelo de convusiones inducidas por electroshock máximo es empleado ampliamente
para evaluar sustancias que puedan tener un potencial anticonvulsivante (Castel-Branco,
et al., 2009), el criterio de protección (sustancia con potencial anticonvulsivante) es la
ausencia de extensión de las patas posteriores en un ángulo mayor de 90º con respecto
al ele corporal, para esta prueba todos los tratamientos a excepción del control empleado
para convulsiones (fenitoina sódica), presentaron la extensión tónica/ clónica y no
lograron recuperar el reflejo postural, sugiriendo la carencia de actividad de tipo
anticonvulsivante.
5.3.2 Tamizaje farmacológico en sistema nervioso central en modelo murino de las fracciones de acetato de etilo y butanol de H. juniperinum
De acuerdo a lo descrito en la literatura para Hypericum perforatum, las fracciones con
alto contenido de flavonoides también presentan actividad antidepresiva (Butterweck et
al., 2003). Para esta fase del ensayo se seleccionaron las fracciones de acetato de etilo
61
y butanol de Hypericum juniperinum, ya que debido a sus características de polaridad se
espera que presenten un alto contenido flavonoides.
Pruebas farmacológicas de actividad exploratoria
Prueba de Campo abierto
Los ratones sometidos a las fracciones de acetato de etilo y butanol (150 y 300 mg/kg),
en esta prueba no presentan un incremento en el número de cruces por el centro por lo
que se descarta una actividad de tipo ansiolítico (Rejón-Orantes et al., 2011) (Figura 5-15
B). A su vez, no se presentó un aumento en el número de cruces totales por lo que las
fracciones de H. juniperinum no afectan la actividad exploratoria (Figura 5-15A). Lo
anterior indica que los efectos generados sobre el tiempo de inmovilidad en la prueba de
nado forzado no son afectados por una actividad estimulante del extracto.
A.
62 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
B.
Figura 5-15. Efecto de los extractos de acetato de etilo y butanol provenientes del fraccionamiento del extracto metanólico de H. juniperinum evaluados a 2 dosis (150, 300 mg/kg) en la prueba de campo abierto en ratones machos ICR administrados por via oral en dosis repetidas, n=6, ± E.M.S,KRUSKALL-WALLIS/ ANOVA. A. Número de cruces centrales, B. Número de cruces totales.
Pruebas farmacológicas de actividad anisolítica
Prueba de Laberinto en cruz
En esta prueba, las fracciones de acetato de etilo y butanol no presentaron diferencias
significativas frente al vehículo, tanto para el porcentaje de entradas como para el tiempo
en la zona abierta (Figura 5-16 A y B), lo que evidencia la ausencia de un efecto
ansiolítico. En cuanto al control clonazepam, se tiene un aumento en el tiempo de
permanencia en la zona abierta del 60% en comparación con el vehículo (30%), y
también un aumento en el porcentaje de entradas de 50% frente a 30%. Cabe anotar,
que en ambos tests no se presenta una diferencia significativa frente al vehículo.
63
A.
B.
Figura 5-16. Efecto de los extractos de acetato de etilo y butanol provenientes del fraccionamiento del extracto metanólico de H. juniperinum evaluados a 2 dosis (150, 300 mg/kg) en la prueba de laberinto en cruz en ratones machos ICR administrados por via oral en dosis repetidas, n=6, ± E.M.S, ANOVA. A. Porcentaje de permanencia en zona abierta, B. Porcentaje de entradas en zona abierta.
Pruebas farmacológicas de actividad antidepresiva
Prueba de nado forzado
En la evaluación de las fracciones de acetato y butanol se encontró que la fracción de
acetato de etilo en las dosis de 150 y 300 mg/kg muestra una reducción del tiempo de
inmovilidad de los ratones con diferencias significativas frente al vehículo (Figura 5-17 A).
Para el caso del tiempo de latencia, se encuentra que no hay diferencias significativas
frente al vehículo, pero se observa una tendencia al aumento de este tiempo para la
fracción de acetato de etilo en ambas dos dosis empleadas (Figura 5-17 B).
64 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
A.
B.
Figura 5-17. Efecto de los extractos de acetato de etilo y butanol provenientes del fraccionamiento del extracto metanólico de H. juniperinum evaluados a 2 dosis (150, 300 mg/kg) en la prueba de nado forzado en ratones machos ICR administrados por via oral en dosis repetidas, n=6, ± E.M.S, , p= ‘***’ 0,001 ‘**’ 0,01 ‘*’ 0,05, ANOVA/ KRUSKALL WALLIS. A. Tiempo de inmovilidad (s), B. Tiempo de latencia.
Prueba de suspensión por la cola
En el caso de las fracciones se encuentra que no hay diferencias significativas entre los
tratamientos para el tiempo de inmovilidad y para el tiempo de latencia (Figura 5-18 A y
B). Sin embargo se observa una tendencia en la disminución para el tiempo de
inmovilidad y un aumento para el tiempo de latencia. Un comportamiento similar se
observa con el control empleado (imipramina).
65
A.
B.
Figura 5-18. Efecto de los extractos de acetato de etilo y butanol provenientes del fraccionamiento del extracto metanólico de H. juniperinum evaluados a 2 dosis (150, 300 mg/kg) en la prueba de suspensión por la cola en ratones machos ICR administrados por via oral en dosis repetidas, n=6, ± E.M.S, ANOVA/KRUSKALL-WALLIS. A. Tiempo de inmovilidad (s), B. Tiempo de latencia(s).
Pruebas farmacológicas de actividad sedante: Prueba de potenciación delsueño barbitúrico.
Se observa que para la prueba de potenciación del sueño barbitúrico las fracciones tanto
de acetato como de butanol no presentan diferencias significativas frente al vehiculo,
pero si frente al control clonazepam (Figura 5-19 A y B), lo que indica que ambos
extractos no tienen efectos inductores o prolongadores de sueño.
66 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
A.
B.
Figura 5-19. Efecto de los extractos de acetato de etilo y butanol provenientes del fraccionamiento del extracto metanólico de H. juniperinum evaluados a 2 dosis (150, 300 mg/kg) en la prueba de potenciación del sueño barbitúrico en ratones machos ICR administrados por via oral en dosis repetidas, n=6, ± E.M.S, p= ‘***’ 0,001, ANOVA/KRUSKALL WALLIS. A. Tiempo de latencia (s), B. Duracion del sueño(s).
Cuando se comparan los tiempos de inmovilidad entre las dos pruebas (nado forzado vs
suspensión por la cola) se encontró que en la prueba de suspensión por la cola hay un
menor tiempo de inmovilidad entre los tratamientos en general en comparación con la
prueba de nado forzado (150 s del vehículo en nado forzado vs 40 s en suspensión por la
cola), estos resultados concuerdan con lo reportado por Cryan et al., (2005), quienes
refieren que la inmovilidad basal varía en las dos pruebas, siendo más baja en la prueba
de suspensión por la cola que en la de nado forzado, esto a su vez podría evidenciar la
falta de diferencia significativa en la prueba de suspensión por la cola.
67
Los resultados obtenidos en la prueba de nado forzado para el extracto de Hypericum
perforatum a una dosis de 300 y 500 mg/kg, concuerdan con los presentados por Paulke
et al., (2007), donde reportan una reducción en el tiempo de inmovilidad en ratas
administradas con extractos de esta especie (400 mg/kg). Al comparar los resultados
obtenidos, H. juniperinum a una dosis de 500 mg/kg tiene un comportamiento similar a H.
perforatum en dosis de 300 y 500 mg/kg, lo que podría sugerir una actividad de tipo
antidepresivo para nuestro extracto. Por otra parte para las fracciones de acetato de etilo
de H. juniperinum en ambas dosis (150 y 300 mg/kg), se apreció una reducción
significativa frente al vehículo en relación con el tiempo de inmovilidad en la prueba de
nado forzado y una tendencia en la reducción del tiempo de inmovilidad en la prueba de
suspensión por la cola. Dicho resultado concuerda con lo reportado por
(Butterweck et al., 2000), donde fracciones de H. perforatum enriquecidas en flavonoides,
presentan una reducción del tiempo de inmovilidad en ratas administradas oralmente.
Adicionalmente Guan & Liu, (2016) y Butterweck et al. (2003), reportan actividad
antidepresiva para fracciones del extracto hidroalcoholico de Hypericum perforatum que
carecían de hipericina e hiperforina, demostrando que los flavonoides, por sí solos,
presentan actividad. Comparando los resultados de actividad obtenidos por las fracciones
de acetato de etilo de Hypericum juniperinum, es posible que la actividad tipo
antidepresiva de esta especie pueda atribuirse también a los flavonoides. Como ya se
mencionó anteriormente, la especies de la sección Brathys, a la que pertenece H.
juniperinum, son ricas en flavonoides pero no producen las naftodiantronas hipericina y
pseudohipericina; ni el derivado de fluoroglucinol poliisoprenilado, hiperforina (Crockett &
Robson, 2011). También es importante destacar que la fracción de acetato de etilo a
dosis menores (150 y 300 mg/kg) que la del extracto crudo (500 mg/kg) tambien mantuvo
la actividad antidepresiva. Lo anterior podría sugerir que quizas la fracción de acetato de
etilo presenta algunos de los constituyentes activos del extracto metanólico de H.
juniperinum.
Se ha reportado la actividad antidepresiva para numerosas especies que se encuentran
en diferentes secciones del género Hypericum. Algunos ejemplos son: H. enshiense
(sección Hypericum) (Wang et al., 2010), H. androsaemum y H. foliosum (sección
Androsaemum) (Ramalhete et al., 2016), y H. reflexum, una especie endémica de las
islas canarias, perteneciente a la sección Adenosepalum (Sanchez-Mateo et al., 2007).
68 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Tambien se ha reportado actividad antidepresiva en especies andinas de Hypericum
provenientes de Brasil (Daudt et al., 2000) y Perú (Ccana-Ccapatinta et al., 2014) y
pertenecientes a las secciones Brathys y Trigynobrathys. Los resultados obtenidos con H.
juniperinum son similares a los encontrados en especies de la sección Brathys, que
presentan actividad antidepresiva, aún en ausencia de los metabolitos a los que
comunmente se les atribuye dicha actividad (hipericina, pseudohipericina e hiperforina)
(Crockett & Robson, 2011). Por lo tanto la actividad antidepresiva mostrada por el
extracto metanólico y la fracción de acetato de etilo de H. juniperinum podría atribuirse a
los flavonoides presentes en esta.
El presente trabajo es la primera evidencia de la actividad antidepresiva de H.
juniperinum. Nuestros resultados abren la puerta a la investigación con otras especies
colombianas de Hypericum desde la perspectiva farmacológica y fitoquímica. Para
pensar en H. juniperinum como una alternativa terapéutica se requieren estudios
adicionales que establezcan la seguridad del extracto, que permitan profundizar en el
mecanismo de acción y determinen los metabolitos responsables de la actividad.
6. Conclusiones y recomendaciones
6.1 Conclusiones
Microscópicamente, H. juniperinum carece de glándulas negras típicas de la
sección Hypericum. Pero presenta glándulas translúcidas, adicionalmente
presenta compuestos de carácter fenólico en el floema del tallo y a lo largo de la
hoja; y lípidos en canales de hojas, y en la superficie de la antera y estilo.
El estudio químico de la planta permitió establecer en el extracto metanólico de H.
juniperinum la presencia de metabolitos tipo flavonoide, ácidos fenólicos,
esteroides, taninos y posiblemente saponinas. No se detectaron alcaloides, ni las
naftodiantronas hipericina y pseudohipericina que si están presentes en H.
perforatum. Adicionalmente, de la fracción de acetato de etilo se purificaron y
caracterizaron espectroscópicamente el flavonol quercetina y metil ester del ácido
clorogénico (metil ester del ácido 5-O-cafeoilquínico) , siendo este el primer
reporte de metabolitos aislados de H. juniperinum.
El extracto de H. juniperinum (500 mg/Kg) y la fracción de acetato de etilo en
ambas dosis empleadas (150 y 300 mg/Kg), disminuyen el tiempo de inmovilidad,
en la prueba de nado forzado, y se observan tendencias de reducción del tiempo
de inmovilidad en la prueba de suspensión por la cola con una posible actividad
antidepresiva.
Por otra parte, las dosis evaluadas del extracto crudo y de las fracciones, no
generaron alteraciones en la actividad motora (prueba del alambre) y ni en la
actividad exploratoria del animal (prueba de campo abierto y tablero agujereado).
En las pruebas de inducción de sueño, convulsiones por electroshock y
evaluación del efecto ansiolítico no se observó ningún efecto a ninguna de las
dosis de extracto evaluadas.
70 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC en
modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
6.2 Recomendaciones
Se recomienda continuar con el proceso de purificación de metabolitos
secundarios de H. juniperinum con el fin de aumentar el conocimiento de la
composición química de especies colombianas de Hypericum. Adicionalmente
sería interesante comparar los perfiles cromatográficos por HPLC del extracto
estandarizado de H. perforatum frente al extracto metanólico y de acetato de etilo
de H. juniperinum, para poder establecer diferencias de metabolitos entre las
plantas.
En cuanto al estudio farmacológico, se recomienda implementar otros modelos
que permitan profundizar en el mecanismo de acción del extracto.
Teniendo en cuenta el efecto antidepresivo que presentó el extracto de H.
juniperinum, se sugiere realizar pruebas de toxicidad al extracto bruto y las
fracciones activas.
7. Bibliografía
-Abelaira, H. M., Reus, G. Z., & Quevedo, J. (2013). Animal models as tools to study the
pathophysiology of depression. Revista Brasileira de Psiquiatria, 35(Suppl. 2), S112-
S120.doi:10.1590/1516-4446-2013-1098.
-Avato, P. (2005). A Survey on the Hypericum Genus: Secondary Metabolites and
Bioactivity. Studies in Natural Products Chemistry,30, 603-634.doi:10.1016/S1572-
5995(05)80043-2.
-Bezáková, L., Psenák, M., & Kartnig, T. (1999). Effect of dianthrones and their
precursors from Hypericum perforatum L. on lipoxygenase activity. Pharmazie,54(9):711.
-Bernal, R., Gradstein, S., & Celis, M. (2015). Catálogo de plantas y líquenes de
Colombia. :Instituto de Ciencias Naturales, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá.
http://catalogoplantasdecolombia.unal.edu.co/index.php?id=22&no_cache=1&L=0&tx_bio
virtual_catalogo%5Baction%5D=list&tx_biovirtual_catalogo%5Bcontroller%5D=Especies&
tx_biovirtual_catalogo%5Bq%5D=Hypericum+juniperinum&filters=.
-Bukhari, I., & Dar, A. (2013). Behavioral profile of Hypericum perforatum (St. John´s
Wort) extract: A comparison with standard antidepressants in animal models of
depression. European Review for medical and pharmacological sciences,17(8):1-8.
-Butterweck, V., Christoffel, V., Nahrstedt, A., Petereit, F., Spengler, B., & Winterhoff, H.
(2003). Step by step removal of hyperforin and hypericin: activity profile of different
Hypericum preparations in behavioral models. Life Sciences.73(5):627-
39.doi:10.1016/S0024-3205(03)00314-X.
-Butterweck, V., Jurgenliemk, G., Nahrstedt, A., & Winterhoff, H. (2000). Flavonoids from
Hypericum perforatum show antidepressant activity in the forced swimming test. Planta
Medica. 66(1): 3-6.
74 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC
en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
- Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falcão, A., & Caramona, M. (2009).The
maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new
antiepileptic drugs. Methods Find Exp Clin Pharmacol, 31(2):101-6. doi:
10.1358/mf.2009.31.2.1338414.
-Ccana-Ccapatinta, G., Correa de Barros, F., Bridi , H., & von Poser, G. (2013). Dimeric
acylphloroglucinols in Hypericum species from sections Brathys and Trigynobrathys.
Phytochemistry Reviews. 14(1): 25-50. doi: 10.1007/s11101-013-9332-2.
-Ccana-Ccapatinta, G.,Serrano ,C.,Urrunaga, E., Choquenaira ,J., Sanchez, W., Crockett,
S., von Poser, G., & Carpio, C. (2014).Assessing the phytochemical profiles and
antidepressant-like activity of four Peruvian Hypericum species using the murine forced
swimming test. Phytochemistry Letters. 10: 107- 112. doi:10.1016/j.phytol.2014.08.007.
-Cho, J., Kim, J., Lee, Y., Lee, H., Shim, H., Lee, J., Kim, S., Ham, K., & Moon, J.(2016).
Four New Dicaffeoylquinic Acid Derivatives from Glasswort (Salicornia herbacea L.) and
Their Antioxidative Activity. Molecules.20;21(8): 1-13. doi: 10.3390/molecules21081097.
-Ciccarelli, D., Andreucci, A., & Pagni, A. M. (2013). The "black nodules" of Hypericum
perforatum L. subsp. perforatum: Morphological, anatomical and histochemical studies
during the course of ontogenesis. Israel Jorunal of plant sciences.49(1):33-40. doi:
10.1560/46Y5-AFWD-TCY0-KGFG.
-Ciccarelli, D., Cesare, A., & Pagni, A. M. (2001). Translucent glands and secretory
canals in Hypericum perforatum L. (Hypericaceae): Morphological, anatomical and
histochemical studies during the course of ontogenesis. Annals of botany. 88(4):637-644.
doi: 10.1006/anbo.2001.1514.
- Clifford, Mike. (2017). Some Notes on the Chlorogenic Acids. 2. NMR Characterisation
Version 3 January 2017. 10.13140/RG.2.2.21311.71848.
-Committee on herbal medicinal products. (2009). Assessment report on Hypericum
perforatum L. Herba. Londres: European Medicines Agency.
Bibliografía 75
-Crockett, S., Eberhardt, M., Kunert, O., & Schübly, W. (2010). Hypericum species in the
Páramos of Central and South America: a special focus upon H. irazuense Kunze ex N.
Robson. Phytochemical Reviews. 9(2):255-269.doi: 10.1007/s11101-009-9148-2.
-Crockett, S. L., & Robson, N. (2011). Taxonomy and chemotaxonomy of the genus
Hypericum. Medicinal and Aromatic Plant Science and Biotechnology. 5(Special issue): 1-
13.
-Cryan, J., Mombereau, C., & Vassout, A.(2005). The tail suspension test as a model for
assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice.
Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (4-5):571–625
-Daudt, R., Von Poser, G., Nevea, G., & Rates, S., (2000). Screening for the
Antidepressant Activity of some Species of Hypericum from South Brazil. Phytotheraphy
Research.14(5): 344–346.
-Duarte, B. & Parra, S. (2015). Plantas del páramo y sus usos para el buen vivir: Páramos
de Guerrero y Rabanal. Bogotá, Colombia:Instituto de Investigación de recursos
biológicos Alexander von Humboldt.
-Dwyer, A., Whitten, D., & Hawrelak, J. (2011). Herbal Medicines, other than St. John’s
Wort, in the Treatment of Depression: A Systematic Review. Alternative Medicine Review.
16(1), (1):40-49.
-Ernst, E. (2003). Hypericum: The genus Hypericum. New York, Estados Unidos: Taylor &
Francis.
-Flickr (2007).Página Quimbaya:
https://www.flickr.com/photos/quimbaya/385778190/in/photostream/.
-Greeson, J. M., Sanford, B., & Monti , D. A. (2001). St. John´s wort (Hypericum
perforatum): a review of the current pharmacological, toxicological, and clinical literature.
Psychopharmacology.153(4):402-414.
-Guan, L., &, Liu, B.(2016). Antidepressant-like effects and mechanisms of flavonoids and
related analogues. European Journal of Medicinal Chemistry.121:47-57. doi:
10.1016/j.ejmech.2016.05.026.
76 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC
en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
-Guedes, A. P., Franklin, G., & Fernandes-Ferreira, M. (2012). Hypericum sp: essential oil
composition and biological activities. Phytochemical reviews. 11(1):127-152.
-Harvey, R. A. (2012). Pharmacology: 5th edition. Philadelphia, Estados Unidos:
Lippincott Williams & Wilkins.
-Hasler, G. (2010). Pathophysiology of depression: Do We Have Any Solid evidence of
interest to clinicians?. World Psychiatry. 9(3):155-161.
-Institute for health metrics and evaluation (IHME). (2016). GBD Compare Data
Visualization. (U. o. Washington, Editor): http://www.healthdata.org/data-
visualization/gbd-compare.
-Johansen, D. A. (1940). Plant microtechnique. New York, Estados Unidos: McGraw-Hill
-Jiang, L., Numonov, S. Bobakulov, K., Nasimullah, M., Zhao, H., & Aisa, H. (2015).
Phytochemical Profiling and Evaluation of Pharmacological Activities of Hypericum
scabrum L. Molecules. 20(6):11257-11271; doi:10.3390/molecules200611257.
-Khan, A., Khan, M., Subhan, F., & Hassan , A.(2010). Antispasmodic, Bronchodilator and
Blood Pressure Lowering Properties of Hypericum oblongifolium – Possible Mechanism of
Action. Phytotherapy Research.24(7): 1027–1032. DOI: 10.1002/ptr.3067
-Khawam, E., Laurencic, G., & Malone, D. (2006). Side effects of antidepressants: An
overview. Cleveland Clinic Journal Of Medicine. 73(4): 351-361.
-Klemow, K., Bartlow, A., Crawford, J., Kocher, N., Shah, J., & Ritsick, M. (2011). Medical
Attributes of St. John´s Wort (Hypericum perforatum). En I. Benzie, & S. Wachtel-Galor,
Herbal medicine 2nd Edition: Biomolecular and Clinical Aspects (pág. 500). Boca Raton,
Estados Unidos: CRC Press.
-Kokate, C., Purohit, A., & Gokhale, S. (2008). Pharmacognosy. Mumbai, India: Nirali
Prakashan.
Bibliografía 77
-Kyriakou, E., Primikyri, A., Charisiadis, P., Katsoura, M., Gerothanassis, I., Stamatis, H.,
& Tzakos, A.(2012). Unexpected Enzyme-Catalyzed Regioselective Acylation of
Flavonoid Aglycones. Organic & Biomolecular Chemistry. 10: 1739-1742.
doi:10.1039/C2OB06784F
-Lapa, A. J., Souccar, C., Lima-Landman, T., & De Lima, T. C. (2002). Métodos de
evaluación de la actividad farmacológica de plantas medicinales. Sao Paulo, Brasil:
CYTED/CNPq.
-Lüllmann, H., Ziegler, A., Mohr, K., & Bieger, D. (2000). Color atlas of pharmacology.
New York, Estados Unidos: Thieme.
-Maggi, F., Ferretti,G., Pocceschi, N., Menghini, L., & Ricciutelli, M.(2004). Morphological,
histochemical and phytochemical investigation of the genus Hypericum of the Central
Italy. Fitoterapia.75(7-8):702-11.doi:10.1016/j.fitote.2004.09.009.
-Maher, A., Hempel, S., Apaydin, E., Shanman, R., Booth, M., Miles, J., & Sorbero, M.
(2016). St. John´s Wort for mayor depressive disorder: A systematic review. RAND health
Q. 9(4):12.
-Médicos Sin fronteras. (2013). Las heridas menos visibles: Salud mental, violencia y
conflicto armado en el sur de Colombia . Bogotá, Colombia: Médicos sin fronteras.
-Micco, V., Balzano, A., Wheeler, E., & Baas, P. (2016).Tyloses and gums: a review of
structure, function and occurrence of vessel occlusions. IAWA Journal. 37(2): 186–205.
-Ministerio de Salud (2017). Boletín de salud mental: Depresión. Bogotá, Colombia:
Subdirección de enfermedades no transmisibles, 1-16.
-Ministerio de Salud (2015). Encuesta de salud mental. Bogotá, Colombia: Ministerio de
salud y protección social.
-Mora- Osejo, L. E. (1995). Estudios Ecológicos del páramo y del bosque altoandino
Cordillera Oriental de Colombia- Tomo 1. Bogotá, Colombia: Editora Guadalupe LTDA.
78 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC
en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
-Moses, T., Papadopoulou, K., & Osbourn A. (2014).Metabolic and functional diversity of
saponins, biosynthetic intermediates and semi-synthetic derivatives. Critical Reviews in
Biochemistry and Molecular Biology.49(6):439-462.doi: 10.3109/10409238.2014.953628.
-Müller , W. E. (2005). St. John´s wort and its active principles in depression and anxiety.
Berlin, Alemania: Birkhäuser Verlag.
-Nathan, P. J. (2001). Hypericum perforatum (St John's Wort): a non-selective reuptake
inhibitor? A review of the recent advances in its pharmacology. Journal of
Psychopharmacology.15(1):47-54.
-National Institute of Mental Health. (Mayo de 2016). Majo Depression Among Adults :
http://www.nimh.nih.gov/health/statistics/prevalence/major-depression-among-
adults.shtml.
-Nürk, N. M. (2011). Phylogenetic Analyses in St.John´s wort (Hypericum): Inferring
Character evolution and historical biogeography. Berlin, Alemania : Freie Universitat.
-Otsuka, H. (2006). Purification by Solvent Extraction Using Partition Coefficient. En S. D.
Sarker, Z. Latif, & A. I. Gray, Natural Products Isolation (págs. 269-275). New Jersey,
Estados Unidos: Humana Press.
-Pattinson, D. (08 de Agosto de 2017). Hypericum online: A site dedicated to Hypericum-
The St John´s Worts. En Hypericum Juniperinum :
http://hypericum.myspecies.info/taxonomy/term/1041/descriptions.
- Paulke, A., Nöldner, M., Schubert, M., & Wurglics, M. (2007). St. John´s wort flavonoids
and their metabolites show antidepressant activity and accumulate in brain after multiple
oral doses. Pharmazie. 63(4):296-302.
-Pauli, G., Kuczkowiaki, U., Nahrstedt, A. (1999). Solvent effects in the structure
dereplication of caffeoyl quinic acids. Magnetic Resonance in Chemistry. 37:827–836.
-Pérez- Martinez, B. A. (2015). Establecimiento in vitro de Hypericum goyanesii Cuatrec.
e Hypericum juniperinum Kunth, a partir del cultivo de semillas. Revista Colombiana de
biotecnologia. 17(2):156-160.
Bibliografía 79
-Perrone, R., De Rosa, P., De Castro , O., & Colombo , P. (2013). A further analysis of
secretory structures of some taxa belonging to the genus Hypericum (Clusiaceae) in
relation to the leaf vascular pattern. Turkish Journal of botany. 37:847-858.DOI:
10.3906/bot-1206-22.
-Plazas, E. (2017). Tamizaje fitoquímico y actividad antibacteriana in vitro de extractos y
fracciones de tres especies colombianas del género Hypericum. Revista Cubana de
plantas medicinales.22(1): 1-14.
-Potokar, J., & Thase, M. (2003). Advances in the management and treatment of
depression. Londres, Reino Unido: Martin Dunitz.
-Ramalhete, N., Machado , A., Serrano , R., Gomes, E., Mota-Filipe, H., & Silva , O.
(2016). Comparative study on the in vivo antidepressant activities of the Portuguese
Hypericum foliosum, Hypericum androsaemum & Hypericum perforatum medicinal plants.
Industrial Crops and Products. 82:29-36.doi:10.1016/j.indcrop.2015.12.014.
-Rejón-Orantes J, Perdomo D, Roldán G. (2011) Pruebas no condicionadas en ratones
para evaluar la actividad ansiolítica de sustancias extraídas de plantas. Universitas
Médica. 52 (1): 78-89.
-Robson, N. (1987). Studies in the genus Hypericum L. (Guttiferae) Botany. Reino Unido:
Bulletin of the British Museum (Natural History).1-106.
-Robson, N. (2015). SIB: Catalogo de especies . en Hypericum juniperinum :
http://www.biodiversidad.co/fichas/4890.
-Rodriguez-Landa , J. F., & Contreras , C. M. (2003). A review of clinical an experimental
observations about antidepressant actions and side effects produced by Hypericum
perforatum extracts. Phytomedicine. 10(8):688-699.
-Rusalepp, L., Raal, A., Püssa, T., & Mäeorg, Ü.(2017).Comparison of chemical
composition of Hypericum perforatum and H. maculatum in Estonia. Biochemical
Systematics and Ecology.73:41-46.doi:10.1016/j.bse.2017.06.004.
-Russo, E., Scicchitano, F., Whalley, B., Mazzitello, C., Ciriaco, M., Esposito, S., Patané,
M., Upton, R., Pugliese, M., Chimirri, S., Mammi, M., Palleria, C., &, De Sarro, G. (2014).
80 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC
en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Hypericum perforatum: Pharmacokinetic, mechanism of action, tolerability, and clinical
Drug-Drug interactions. Phytotherapy research. 28(5):643-655. doi:10.1002/ptr.5050.
-Ruzin, S. (1999). Plant microtechnique and microscopy. New York, Estados Unidos:
Oxford University Press.
-Saddiqe, Z., Naeem, I., & Maimoona, A. (2010). A review of the antibacterial activity of
Hypericum perforatum L. Journal of Ethnopharmacology. 131(3):511-521.doi:
10.1016/j.jep.2010.07.034.
-Saki, K., Bahmani, M., & Rafieian-Kopaei, M. (2014). The effect of most important
medicinal plants on two important psychiatric disorders (Anxiety and depression)- A
review. Asian pacific journal of tropical medicine. 7(1): 34-42. doi:10.1016/S1995-
7645(14)60201-7.
-Salama, A. M., & Calle, J. (2005). Manual de laboratorio Farmacognosia y
fitoquímica.Bogotá, Colombia: Universidad Nacional de Colombia.
-Sanchez-Mateo, C., Bonkanka, C., Prado, B., & Rabanal, R. (2007). Antidepressant
activity of some Hypericum reflexum L. fil. extracts in the forced swimming test in mice.
Journal of Ethnopharmacology.112(1):115–121.
-Sarris , J., Panossian, A., Schweitzer, I., Stough, C., & Scholey, A. (2011). Herbal
medicine in depression, anxiety and insomnia: A review of pshychopharmacology and
clinical evidence. European Neuropsychopharmacology.21(12).1-
21.doi:0.1016/j.euroneuro.2011.04.002.
-Stojanovic , G., Dordevic , A., & Smelcerovic , A. (2013). Do Other Hypericum Species
Have Medicinal Potential as St. John´s Wort (Hypericum perforatum)?.Current Medicinal
Chemistry. 20(18):2273-2295.
-Tanaka, N., Kashiwada, Y., Nakano, T., Shibata, H., Higuchi, T., Sekiya, M., Ikeshiro, Y.,
Takaishi, Y.(2009). Chromone and chromanone glucosides from Hypericum
sikokumontanum and their anti-Helicobacter pylori activities. Phytochemistry.70(1):141-6.
doi: 10.1016/j.phytochem.2008.11.006.
Bibliografía 81
-Vogel, H. G. (2008). Drug discovery and evaluation: Pharmacological Assays. Berlín,
Alemania: Springer .
-Wagner, H., &; Bladt, S. (2001). Plant Drug Analysis: A thin Layer Chromatography Atlas.
Berlín, Alemania: Springer.
-Walf, A., & Frye, C., (2007).The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-
related behavior in rodents. Nature Protocols.2(2): 322–328.
- Wu, Q. , Wang, S. , Du, L. , Wang, L. , Yang, J. and Xiao, P. (1998), Constituents of
Hypericum japonicum. Phytotherapy Research., 12: S164-S168. doi:10.1002/(SICI)1099-
1573(1998)12:1+<S164::AID-PTR285>3.0.CO;2-G
-Van Putten, M.(2011).The use of hanging wire tests to monitor muscle strength and
condition over time . Treat NMD: Neuromuscular network. en http://www.treat-
nmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.2.1.004.pdf
-Wang, D., Bai, J., Sun, F., & Yang , D. (2010). Chemical constituents and antidepressant
activity of the new species Hypericum enshiense occurring in China. Phytomedicine.
17(6): 410-413.doi: 10.1016/j.phymed.2009.07.015.
-World Health Organization (WHO). (2013). Plan de acción sobre salud mental 2013-
2020. Geneva, Suiza : WHO
-World Health Organization (WHO). (2017). Depression and other common mental
disorders: Global health estimates . Geneva, Suiza: WHO.
82 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC
en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Anexo A
1. Espectro UV del compuesto Quercetina ( P7)
Anexo A 1. Espectro UV del compuesto quercetina (P7)
Espectro UV del compuesto Quercetina ( P7)
Anexo A 2.Espectro IR del compuesto quercetina (P7)
Bibliografía 83
2. Espectros obtenidos del compuesto Quercetina (P7)
Anexo A 3. Espectro de 1H RMN del compuesto Quercetina (P7)
Anexo A 4. Espectro de 13C RMN del compuesto Quercetina (P7)
84 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC
en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
3. Espectro UV del compuesto metil ester del 5-O- ácido cafeoil quínico (AM2)
Anexo A5. Espectro UV obtenido del compuesto metil ester del ácido 5-O-cafeoilquínico (AM2)
4. Espectro IR del compuesto metil ester del 5-O- ácido cafeoil quínico (AM2)
Anexo A6. Espectro UV obtenido del compuesto metil ester del ácido 5-O-cafeoilquínico (AM2)
5. Espectros RMN obtenidos del compuesto metil ester del 5-O-ácido cafeoilquínico (AM2)
Bibliografía 85
Anexo A7. Espectro de 1H RMN obtenido del compuesto metil ester del ácido 5-O-cafeoilquínico (AM2)
86 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC
en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Anexo A8. Espectro de 13C RMN obtenido del compuesto metil ester del ácido 5-O-cafeoilquínico (AM2)
Bibliografía 87
Anexo A9. Espectro de 1H-1H COSY obtenido del compuesto metil ester del ácido 5-O-cafeoilquínico (AM2)
Anexo A10. Espectro de 1H-13C HMQC obtenido del compuesto metil ester del ácido 5-
O-cafeoilquínico (AM2)
88 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC
en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Anexo A11. Espectro de 1H-13C HMBC obtenido del compuesto metil ester del ácido 5-O-cafeoilquínico (AM2)
Bibliografía 89
6. Espectrometria de masas de los compuestos P7 y AM2: Full MS (-) [M-H]-
Anexo A12: Espectro de masas del compuesto quercetina (P7) modo [M-H]- y MS/MS
90 Estudio morfo-anatómico, fitoquímico y evaluación de la actividad sobre SNC
en modelo murino de Hypericum juniperinum (Kunth).
Anexo A13: Espectro de masas del compuesto metil ester del ácido 5-O-cafeoilquínico (AM2) modo [M-H]- y espectro de fragmentación MS/MS