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UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE VALENCIA
Estudio de la evolución de las poblaciones microbianas en el proceso de eliminación biológica de materia orgánica y nitrógeno
amoniacal en un SBR
Trabajo final de máster
María Miralles Doménech
Directores
Dra. Aurora Seco Torrecillas
Javier Claros Bedoya
Valencia, Septiembre de 2012
ÍNDICE
Índice
INTRODUCCIÓN
1.1 Generalidades ambientales y legislación ________________________________1
1.2 Contaminación de las aguas _________________________________________5
1.2.1 Características de las aguas residuales _______________________________5
1.2.2 Presencia de nutrientes en aguas residuales. Fósforo y Nitrógeno __________7
1.2.3 Efectos del nitrógeno en el medio natural y la salud humana _______________8
1.2.3.1 Eutrofización________________________________________________________8
1.2.3.2 Toxicidad en la fauna por presencia de amonio, nitrito y nitratos____________9
1.2.3.3 Efectos perjudiciales sobre la salud humana____________________________12
1.3 Sistemas de tratamiento de materia orgánica y nitrógeno __________________12
1.3.1 Procesos físico-químicos__________________________________________12
1.3.2 Procesos biológicos______________________________________________13
1.3.2.1 Nitrificación ________________________________________________________14
1.3.2.2 Desnitrificación_____________________________________________________15
1.3.2.3 Factores que afectan los procesos de nitrificación-desnitrificación _________16
1.3.2.4 Esquemas de tratamiento____________________________________________23
1.3.2.4.1 Esquemas convencionales _________________________________________23
1.3.2.4.2 Esquemas no convencionales ______________________________________26
1.3.2.5 Reactor Discontinuo Secuencial o SBR (Sequencing Batch Reactor) ______31
1.3.2.5.1 Etapas de funcionamiento de un reactor SBR _________________________31
1.3.2.5.2 Parámetros de funcionamiento de un reactor SBR _____________________34
1.3.2.5.3 Ventajas e inconvenientes del sistema SBR __________________________36
1.3.2.6 Microorganismos implicados en los sistemas de eliminación_____________37
1.3.2.6.1 Clasificación y características de las bacterias ______________________39
1.3.2.6.2 Técnicas de caracterización y cuantificación________________________42
1.3.2.6.3 Técnica de hibridación in situ (FISH)______________________________45
OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
2 Objetivos y plan de trabajo ___________________________________________47
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Descripción del montaje experimental _________________________________49
3.2 Procedimiento experimental _________________________________________51
3.2.1 Parámetros de operación _________________________________________51
3.2.1.1 Selección del inóculo y características del agua residual________________51
I
Índice
3.2.1.2 Etapas de operación del reactor___________________________________52
3.2.1.3 Parámetros de funcionamiento____________________________________54
3.2.2 Puesta en marcha del reactor ______________________________________55
3.2.3 Operación y seguimiento del proceso ________________________________55
3.2.3.1 Analíticas físico-químicas ________________________________________56
3.2.3.1.1 Sólidos suspendidos totales y sólidos suspendidos volátiles_____________56
3.2.3.1.2 Ácido acético y alcalinidad _________________________________________57
3.2.3.1.3 Amonio, nitrito, nitrato y fósforo _____________________________________58
3.2.3.2 Analíticas microbianas __________________________________________58
3.2.3.2.1 Técnica de Hibridación In Situ FISH _________________________________59
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Puesta en marcha_________________________________________________69
4.2 Seguimiento del proceso ___________________________________________71
4.2.1 Evolución de los parámetros físico-químicos __________________________72
4.2.2 Evolución de las poblaciones microbianas ____________________________76
4.2.2.1 Análisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias amonioxidantes _________76
4.2.2.2 Influencia del pH y la concentración de oxígeno disuelto en la población de AOB __________________________________________________________________84
4.2.2.3 Análisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias nitritoxidantes ___________86
4.2.2.4 Influencia del pH y la concentración de oxígeno disuelto en la población de NOB _____________________________________________________________________90
4.2.2.5 Análisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias desnitrificantes __________93
4.2.2.6 Influencia del pH y la concentración de oxígeno disuelto en la población de desnitrificantes.____________________________________________________________97
CONCLUSIONES
Conclusiones _______________________________________________________100
BIBLIOGRAFÍA
Bibliografía_________________________________________________________102
II
Índice
III
ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 Esquemas de eliminación biológica de nitrógeno: A) Wuhrmann, B) Ludzack-
Ettinger, C) Ludzack-Ettinger modificado, D) Bardenpho, E) Canales de oxidación _____________________________________________________ 25
Figura 2 Esquema del proceso de nitrificación-desnitrificación vía nitrito____________ 27
Figura 3 Esquema de una EDAR con un reactor SHARON de nitritación parcial _____ 28
Figura 4 Proceso combinado nitrificación parcial-ANNAMOX ____________________ 29
Figura 5 Esquema del sistema SBR. Adaptado de Wilderer et al., (2001) __________ 33
Figura 6 Árbol filogenético hasta ahora conocido de los organismos amonioxidantes basado en la secuencia 16S rRNA (Seviour y Nielsen, 2010). Las líneas filogenéticos asociadas a sistemas de aguas residuales están indicadas mediante flechas _______________________________________________ 38
Figura 7 Árbol filogenético hasta ahora conocido de los organismos nitritoxidantes basado en la secuencia 16S rRNA (Seviour y Nielsen, 2010). Las líneas filogenéticos asociadas a sistemas de aguas residuales están indicadas mediante flechas _______________________________________________ 39
Figura 8 Fotografía del montaje experimental ________________________________ 49
Figura 9 Esquema del montaje experimental _________________________________ 50
Figura 10 Esquema del procedimiento experimental ____________________________ 51
Figura 11 Secuencia y duración de las 5 etapas de trabajo del reactor SBR__________ 53
Figura 12 Árbol filogenético basado en el 16S rARN de los principales linajes de bacterias amonioxidantes. Se ha destacado en azul las sondas empleadas en el presente trabajo de investigación. Los paréntesis indican la cobertura de las sondas. (Nielsen et al., 2009) ____________________________________________ 59
Figura 13 Árbol filogenético basado en el 16S-rARN de los principales linajes de bacterias nitritoxidantes. Los paréntesis indican la cobertura de las sondas. (Nielsen et al., 2009) ____________________________________________ 60
Figura 14 Árbol filogenético basado en el 16S-rARN de los principales linajes de bacterias desnitrificantes. Los paréntesis indican la cobertura de las sondas. (Nielsen et al., 2009) ____________________________________________ 61
Figura 15 Evolución de la concentración de sólidos suspendidos durante la primera semana del período experimental __________________________________ 69
Figura 16 Evolución de la concentración de amonio, nitrito y nitrato durante la primera semana del período experimental en la fase final de la etapa de reacción ___ 70
Figura 17 Evolución de la concentración de ácido acético durante la primera semana del período experimental en la fase final de la etapa de reacción _____________ 70
Figura 18 Evolución de la concentración de sólidos suspendidos en el licor mezcla a lo largo del período experimental _____________________________________ 72
Índice
IV
Figura 19 Evolución de la concentración de ácido acético en el licor mezcla en la fase final
de la etapa de reacción __________________________________________ 73
Figura 20 Evolución de la concentración de los compuestos nitrogenados (amonio, nitrito y nitrato) en el licor mezcla en la fase final de la etapa de reacción __________ 74
Figura 21 Evolución de la concentración de los compuestos nitrogenados (amonio, nitrito y nitrato) en el licor mezcla en la fase final de la etapa anóxica _____________ 75
Figura 22 Porcentaje de AOB en el licor mezcla detectado con la sonda NSO1225 en relación con la sonda EUBmix. Concentración de nitrógeno amoniacal en la fase final de la etapa de reacción_______________________________________ 76
Figura 23 Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias de dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las β-proteobacterias AOB identificadas por la sonda NSO 1225. Imágenes tomadas a 63x ____________________________________ 78
Figura 24 Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias totales del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las β-proteobacterias AOB identificadas por la sonda NEU. Imágenes tomadas a 63x ____________________________________ 82
Figura 25 Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las β-proteobacterias AOB identificadas por la sonda Nmo218. Imágenes tomadas a 63x _________________________________ 83
Figura 26 Porcentaje de bacterias amonioxidantes en el licor mezcla detectadas con las sondas NSO1225, Nmo218 y NEu en relación con la sonda EUBmix _______ 84
Figura 27 Porcentaje de bacterias nitritoxidantes en el licor mezcla detectadas con las sondas NIT3 y Ntspa712 en relación con la sonda EUBmix. Concentración de nitrito y nitrato en la fase final de la etapa de reacción___________________ 87
Figura 28 Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las β-proteobacterias NOB identificadas por la sonda Ntspa712. Imágenes tomadas a 63x ________________________________ 89
Figura 29 Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las bacterias desnitrificantes identificadas por la sonda AT1458. Imágenes tomadas a 63x__________________________________ 95
Figura 30
Porcentaje de bacterias desnitrificantes (DES) en el licor mezcla detectadas con las sondas AT1458 y PAR651 en relación con la sonda EUBmix. Concentración de nitrito y nitrato en el licor mezcla al final de la fase anóxica de la etapa de reacción ______________________________________________________ 97
Índice
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Legislación española para el tratamiento de aguas residuales _____________ 3
Tabla 2 Requisitos de los vertidos procedentes de instalaciones de tratamiento de aguas residuales urbanas sujetos a lo dispuesto en el Anexo I (cuadro 1) de la Directiva Europea 91/271/CEE y modificación de la Directiva Europea 98/15/CEE _____________________________________________________ 4
Tabla 3 Listado de parámetros analizados en aguas residuales urbanas____________ 6
Tabla 4 Influencia del pH en el procesos de nitrificación________________________ 18
Tabla 5 Procesos influenciados por la presencia de nitrito ______________________ 19
Tabla 6 Relación de la temperatura con el proceso de nitrificación _______________ 21
Tabla 7 Clasificación de bacterias amonioxidantes y nitritoxidantes_______________ 40
Tabla 8 Características de las bacterias nitrificantes __________________________ 41
Tabla 9 Componentes principales en el agua residual _________________________ 52
Tabla 10 Temperatura y TRC sugerido para la nitrificación ______________________ 54
Tabla 11 Frecuencia de muestreo y análisis de los parámetros físico-químicos_______ 56
Tabla 12 Sondas de hibridación empleadas en la identificación micriobiológica ______ 62
Tabla 13 Volúmenes de reactivos en función del porcentaje de formamida para la preparación de la solución de hibridación ____________________________ 67
Tabla 14 Volúmenes de reactivos en función del porcentaje de formamida para la preparación de la solución de lavado ________________________________ 67
Tabla 15 Porcentajes de bacterias amonioxidantes, nitritoxidantes y desnitrificantes en relación con la sonda EUBmix (dominio Eubacteria) en el inóculo empleado para sembrar el reactor SBR __________________________________________ 71
Tabla 16 Porcentajes de AOB en el licor mezcla en relación con la sonda EUBmix____ 79
Tabla 17 Porcentajes de NOB en el reactor licor mezcla en relación con la sonda EUBmix (dominio Eubacteria) ____________________________________________ 88
Tabla 18 Porcentajes de desnitrificantes en el reactor licor mezcla en relación con sonda EUBmix (dominio Eubacteria)______________________________________ 93
V
INTRODUCCIÓN
Introducción
1.1 Generalidades ambientales y legislación
Los recursos naturales que emplean numerosos sectores en sus sistemas
productivos se han incrementado de manera considerable en las últimas décadas,
tanto por el aumento poblacional como por los cambios en los hábitos de consumo, lo
cual ha aumentado el total de residuos generados.
Las políticas de conservación del medio ambiente surgidas en los últimos 30
años han impulsado el desarrollo de técnicas que permiten optimizar el
aprovechamiento de los materiales, reduciendo las necesidades de materias primas y
por tanto, minimizando la generación de productos de desecho. La implantación de
sistemas que faciliten la reutilización posterior de la materia prima, así como el uso de
materiales que al finalizar su vida útil puedan ser gestionados desde una perspectiva
más respetuosa con el medio ambiente son algunas de las técnicas empleadas para
reducir los recursos necesarios.
Existen un gran número de residuos de naturaleza y características muy
diversas cuya gestión varía en función de aspectos tales como la tecnología
disponible, los posibles usos posteriores (reutilización, reciclaje), etc. En función del
sistema de producción al que nos estemos refiriendo, los materiales y las fuentes de
energía empleados variarán. No obstante, existe un recurso que se emplea
prácticamente en la totalidad de los sistemas productivos, el agua.
Se trata de un bien imprescindible para la vida que está sometido a una
explotación continua, lo cual disminuye su disponibilidad al tiempo que su calidad se
ve seriamente afectada.
Las fuentes de agua (manantiales, ríos, lagos, mares, etc.) sufren procesos de
contaminación tanto naturales (precipitaciones que incorporan impurezas contenidas
en el aire y el suelo a los medios receptores), como artificiales (incorporación de
sustancias contaminantes orgánicas e inorgánicas de origen industrial y urbano). Sin
embargo, mientras que la contaminación natural puede ser contrarrestada por los
procesos de autodepuración de que constan los sistemas naturales, la degradación de
los cursos y masas de agua por parte de actividades humanas superan en muchos
casos los niveles de contaminación que permiten la regeneración de las fuentes
receptoras.
Este hecho se debe al aumento demográfico y urbanístico, al desarrollo
industrial y a la intensificación de las actividades agrícolas y ganaderas que han
provocado el deterioro paulatino de la calidad del agua, entendiendo como calidad el
conjunto de características físicas, químicas y biológicas que hacen que el agua sea
apropiada para determinado uso.
1
Introducción
En los entornos naturales, tanto el estado del agua como su cantidad deben
mantenerse en unos estándares ambientales óptimos, para lo cual se han desarrollado
políticas de gestión, control y protección. Estos métodos de protección adquieren
especial relevancia con la disminución progresiva de las reservas hídricas, tal y como
ocurre con los países enclavados en la cuenta mediterránea.
El problema de la escasez de agua se ha visto agravado por los efectos del
cambio climático mundial, y aunque en las regiones pertenecientes a climas
mediterráneos los desequilibrios entre el agua demandada por la población y los
recursos hídricos son un hecho histórico, la dinámica de poblaciones y las
modificaciones climáticas han hecho que esta situación se agrave de manera
considerable. Por este motivo la depuración de aguas y su posterior reutilización se
han convertido en actividades necesarias para el mantenimiento tanto de los entornos
naturales como de determinadas actividades de producción.
El interés del presente trabajo se centra en el punto a partir del cual el agua ha
finalizado su fase productiva y pasa a ser un residuo que debe regenerado para que
sea posible su reintroducción en el medio natural sin que ello suponga ningún tipo de
riesgo para el medio ambiente y/o la salud pública.
Las aguas residuales son aquellas que proceden de la utilización de un agua
natural o de la red, y que por lo general son recogidas mediante un sistema de
alcantarillado para su envío a una estación depuradora de aguas residuales (EDAR).
Puesto que constituyen un importante foco de contaminación, deben ser sometidas a
tratamiento antes de su vertido.
Deben cumplirse los criterios de calidad establecidos, de forma que los niveles
de contaminación que queden en el efluente tratado puedan ser asimilados de manera
natural por el medio receptor.
Las técnicas empleadas así como los requisitos de vertido (expresados como
rangos cuantitativos de una serie de características fisicoquímicas y biológicas) vienen
definidos en la legislación correspondiente.
Legislación
A nivel europeo, la Directiva 91/271/CEE del Consejo, de 21 de mayo de 1991
sobre el tratamiento de las aguas residuales urbanas controla la gestión de las aguas
residuales. Esta directiva recoge las medidas necesarias para garantizar que todas las
aguas residuales urbanas y de determinados sectores industriales reciban el
tratamiento adecuado antes de su vertido. Se complementa con la Directiva 98/15/CE
de la Comisión de 27 de febrero de 1998 que modificó el cuadro 2 del Anexo I de la
Directiva 91/271/CEE, concerniente al vertido a zonas sensibles propensas a la
2
Introducción
eutrofización de aguas residuales urbanas procedentes de instalaciones de
tratamiento.
Además de la Directiva europea, en España existe una amplia legislación
referida al control de las aguas residuales. Algunas de las principales normativas se
indican en la Tabla 1.
Tabla 1. Legislación española para el tratamiento de aguas residuales
Título Contenido
Real Decreto Ley 11/1995, de 28 de diciembre.
Establece las normas aplicables al tratamiento de las aguas residuales urbanas y que constituye la transposición de la Directiva 91/271/CEE y una complementación a las leyes 29/1985, de 2 de agosto, de Aguas y 22/1988, de 28 de julio, de Costas.
Real Decreto 509/1996, de 15 de marzo, de desarrollo
del Real Decreto-ley 11/1995 de 28 de
diciembre.
Establece las normas aplicables al tratamiento de las aguas residuales urbanas.
Real Decreto 2116/1998, de 2 de octubre, por el que se modifica el Real Decreto 509/1996, de 15 de marzo,
de desarrollo del Real Decreto Ley 11/1995, de
28 de diciembre.
Establece las normas aplicables al tratamiento de las aguas residuales urbanas.
Real Decreto 995/2000, de 2 de junio.
Fija objetivos de calidad para determinadas sustancias contaminantes y se modifica el Reglamento de Dominio Público Hidráulico, aprobado por el Real Decreto 849/1986, de 11 de abril.
Real Decreto 1620/2007, de 7 de diciembre.
Establece el régimen jurídico de la reutilización de las aguas depuradas.
El objetivo de estas normativas es el de asegurar una correcta gestión de las
aguas residuales así como unos niveles de carga contaminante en las aguas tratadas
admisibles por el medio natural, tanto si se trata de aguas residuales urbanas como de
aguas residuales industriales.
En la Tabla 2 se indican los valores máximos permitidos de algunos de los
parámetros principales según la Directiva Europea 91/271/CEE y la modificación
llevada a cabo por la Directiva Europea 98/15/CEE.
3
Introducción
Tabla 2. Requisitos de los vertidos procedentes de instalaciones de tratamiento de aguas residuales urbanas sujetos a lo dispuesto en el Anexo I (cuadro 1) de la Directiva Europea 91/271/CEE y modificación de la Directiva Europea 98/15/CEE.
Parámetro Concentración Porcentaje mínimo de reducción
Demanda química de oxígeno (DQO) 125 mg/L 75
Demanda bioquímica de oxígeno sin nitrificación (DBO5 a 20 °C) 25 mg/L 70-90
Total de sólidos en suspensión 35 mg/L 90
Fósforo Total 2 mgP/L (10.000-100.000 h-e*) 1 mgP/L (>100.000 h-e) 80
Nitrógeno Total 15 mgN/L (10.000-100.000 h-e) 10 mgN/L (>100.000 h-e) 70 - 80
*h-e: habitantes equivalentes: Carga orgánica biodegradable con una demanda bioquímica de oxígeno de cinco días de 60 gramos de oxígeno por día.
En el caso de las concentraciones de nitrógeno y fósforo, los valores de vertido
indicados son obligatorios si el medio receptor está considerado como zona sensible a
la eutrofización o con tendencia a estarlo en un futuro próximo (Directiva 98/15/CEE).
Bajo esta consideración se encuentran embalses, ríos, lagos, parques nacionales,
parques naturales, lagunas, marjales, estuarios, bahías, rías y calas de toda España.
Sin embargo, para los núcleos de población de menos de 10.000 habitantes la
Directiva no establece una concentración límite de vertido o un porcentaje específico
de reducción. No obstante afirma que se debe hacer un tratamiento adecuado, que es
aquel que después del vertido permite respetar los estándares de calidad del medio
receptor. A falta de objetivos de calidad, en la práctica las estaciones depuradoras
localizadas en esos puntos adoptan como requisitos de vertido los valores de la Tabla
1.
4
Introducción
1.2 Contaminación de las aguas
1.2.1 Características de las aguas residuales
Las aguas residuales pueden ser de tres tipos:
- Aguas residuales domésticas: aquellas procedentes de zonas de
vivienda y de servicios, generadas principalmente por el metabolismo
humano y las actividades domésticas.
- Aguas residuales industriales: todas las aguas residuales vertidas
desde locales utilizados para efectuar cualquier actividad comercial o
industrial, que no sean aguas residuales domésticas ni aguas de
escorrentía pluvial.
- Aguas residuales urbanas (ARU): las aguas residuales domésticas o la
mezcla de las mismas con aguas residuales industriales y/o aguas de
escorrentía pluvial.
Las aguas residuales domésticas están compuestas principalmente por materia
orgánica, en su mayor parte biodegradable, así como cantidades importantes de
nitrógeno, fósforo y sales minerales. En cambio, la composición de las aguas
residuales industriales varía en función de la actividad, conteniendo en muchos casos
sustancias que por su alta carga contaminante y/o su peligrosidad están sujetas a una
legislación específica que prohíbe su vertido a colectores, por lo que deben ser
tratadas previamente.
Las aguas residuales urbanas unifican estos dos tipos de vertidos, sin
embargo, las características de cada vertido urbano van a depender del núcleo de
población en el que se genere, influyendo parámetros tales como el número de
habitantes, la existencia de industrias dentro del núcleo, tipo de industria, etc.
La contaminación generada en el agua puede ser de tres tipos:
- Física: provoca modificaciones en parámetros tales como turbidez,
color, olor, sabor, temperatura, radiactividad, espumas, conductividad,
etc.
- Química: tanto por la alteración de los componentes químicos naturales
del agua (incrementando o reduciendo su concentración) como por la
adición de sustancias que modifican ciertos parámetros como salinidad,
pH, oxígeno disuelto, aniones (cloruros, nitratos, nitritos, fosfatos,
sulfuros, cianuros), cationes (sodio, calcio y magnesio, amonio, metales
5
Introducción
pesados) y compuestos orgánicos como grasas y aceites, que
modifican tanto las características físicas como químicas.
- Biológica: debida a la introducción de microorganismos patógenos tales
como bacterias, virus, protozoos y otros organismos transmisores de
enfermedades que son un riesgo a nivel medioambiental y de salud.
En la Tabla 3 se presentan algunos de los parámetros que se determinan para
la caracterización de las aguas residuales urbanas.
Tabla 3. Listado de parámetros analizados en aguas residuales urbanas.
Parámetro Parámetro
Color Compuestos inorgánicos: Olor pH Sólidos (suspendidos y disueltos) Alcalinidad Temperatura Cloruros Materia orgánica: Metales pesados
Carbohidratos Nitrógeno Grasas y aceites Fósforo Pesticidas Contaminantes prioritarios Fenoles Azufre Proteínas Gases: Contaminantes prioritarios Sulfuro de hidrógeno Tensoactivos Metano Compuesto orgánicos volátiles (COV) Oxígeno
Constituyentes biológicos: Animales Plantas Virus y bacterias
Fuente: METCALF y EDDY, INC (1995)
En cuanto a los principales parámetros que se determinan a nivel de laboratorio
y que permiten controlar el buen funcionamiento del sistema de depuración de aguas
se pueden destacar los siguiente: sólidos suspendidos totales (SST) y sólidos
suspendidos volátiles (SSV), pH, conductividad, DQO, DBO5, nitrógeno amoniacal,
nitratos, nitritos, nitrógeno total y fósforo total. Sus valores de concentración aportan
información importante acerca del estado de las aguas.
La modificación de las características físico-químicas y biológicas del agua da
lugar a procesos de diversa gravedad en función de la naturaleza de los
contaminantes.
6
Introducción
Dentro de la gran variedad de sustancias de origen industrial y doméstico que
pueden pasar a formar parte de las aguas naturales y que resultan perjudiciales para
el medio ambiente, las más comunes son los compuestos de nitrógeno (N) y fósforo
(P).
1.2.2 Presencia de nutrientes en aguas residuales. Fósforo y Nitrógeno
En los últimos 20 ó 30 años las concentraciones de nitrógeno y fósforo en
muchos mares y masas de agua continentales casi se han duplicado debido a los
vertidos de origen industrial, doméstico y agrícola, superando los niveles normales de
concentración naturales.
A continuación se indican las fuentes y las formas químicas de los compuestos
de fósforo y nitrógeno de mayor relevancia, haciendo especial hincapié en los
compuestos nitrogenados, ya que es la base de estudio del presente trabajo.
Fósforo
Puede presentarse en el suelo en forma orgánica o inorgánica, disuelto o en
suspensión. Generalmente procede del desgaste de ciertas rocas (ej. apatita), del
lavado de suelos y principalmente de los detergentes polifosfatados (regularizados por
el Reglamento 648/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo, sobre detergentes).
Este nutriente es absorbido con facilidad por las partículas del suelo y aunque
se trata de un elemento de escasa movilidad, en determinadas condiciones puede
alcanzar las aguas subterráneas y/o aguas superficiales.
En aguas residuales las formas predominantes generalmente son los
ortofosfatos (PO4-3 ,HPO4
-2 ,H2PO4¯, H3PO4) con un porcentaje del 85%, mientras que
los polifosfatos (P2O7) y el fósforo orgánico, alcanzan valores del 15% (Jiménez,
2010).
Nitrógeno
En cuanto al nitrógeno, una elevada proporción (alrededor del 30%) llega a
través de la contaminación atmosférica. Se trata de un compuesto más móvil que el
fósforo y puede ser lavado a través del suelo o transferirse al aire por desabsorción del
amoniaco o por desnitrificación.
Inicialmente está presente en el agua residual en forma de nitrógeno orgánico
(urea y proteínas), pero es transformado rápidamente a partir de reacciones
bioquímicas a amoniaco (NH3) o a amonio (NH4+). La forma predominante es el
7
Introducción
amonio como consecuencia del pH característico del agua residual, aunque a pH
básico el equilibrio se desplaza hacia la forma no ionizada (Russo, 1985). La Ecuación
1 muestra la relación entre estas dos formas.
La forma oxidada predominante es el nitrato (NO3¯), ya que el nitrito (NO2
¯) es
muy inestable, al ser fácilmente oxidable a nitrato. Si existe acumulación de nitrito en
el medio, éste mantiene un equilibrio químico con el ácido nitroso (HNO2) en función
del pH y la temperatura (Ecuación 2).
Ecuación 2
Ecuación 1OHNHOHNH 234 +↔+ −−
22 HNOHNO ↔+ +−
Las variaciones en la concentración de estos compuestos se deben a los
procesos biológicos que llevan a cabo una gran diversidad de microorganismos. En el
campo de la depuración de aguas, la actividad bacteriana de estos microorganismos
se emplea como sistema de tratamiento para la eliminación del nitrógeno a través de
dos procesos principales: nitrificación y desnitrificación.
1.2.3 Efectos del nitrógeno en el medio natural y la salud humana
Las actividades humanas han alterado de manera significativa el ciclo global
del nitrógeno, aumentando la presencia de iones de amonio, nitrito y nitrato en el
medio acuático en muchas regiones del planeta.
La acumulación de estos compuestos en las aguas superficiales y subterráneas
puede dar lugar a efectos adversos en la salud humana y el medio ambiente, algunos
de los cuales se describen en los siguientes apartados.
1.2.3.1 Eutrofización
Se produce por un exceso de nutrientes en el agua y consiste en un
crecimiento acelerado de biomasa (fitoplancton, algas asociadas y macrófitas), siendo
más elevada la velocidad de producción de los niveles tróficos inferiores que la
velocidad de consumo por parte de los niveles tróficos superiores (Paerl, 1988).
8
Introducción
Los problemas que tienen lugar en un medio eutrofizado son tanto físico-
químicos como biológicos: aparición de olores, incremento de la turbidez, reducción
del oxígeno disponible, incremento de compuestos perjudiciales procedentes de la
descomposición de materia orgánica, variaciones de pH, etc. Estas modificaciones
afectan a la biodiversidad del medio natural, perjudicando las especies con mayor
sensibilidad a los cambios (por ejemplo, menor tolerancia a bajos niveles de oxígeno
disuelto) ya que únicamente son capaces de sobrevivir aquellas que logran adaptarse
a las nuevas condiciones del entorno.
La problemática de los vertidos con elevadas cargas de nutrientes varía en
función de la masa de agua receptora. En el caso de aguas continentales, las aguas
lénticas (lagos, lagunas, pantanos, etc.) se ven más seriamente afectadas por su bajo
índice de renovación hídrica. En cambio, las aguas lóticas (ríos, manantiales,
barrancos, etc.) son masas de agua de carácter fluvial que permiten la salida de estos
nutrientes hacia estuarios, deltas, mares y océanos. Cuando los nutrientes alcanzan
las aguas marinas y oceánicas provocan los denominados “blooms” de algas por el
enriquecimiento en compuestos nitrogenados, que es un factor limitante del
crecimiento en los medios acuáticos marinos.
Los principales parámetros que controlan los fenómenos de eutrofización son:
la disponibilidad de una fuente de carbono asimilable, la intensidad lumínica para llevar
a cabo los procesos fotosintéticos y la presencia de oxígeno disuelto. También existen
factores que pueden inhibir los procesos de crecimiento de los microorganismos y las
algas, como metales pesados y compuestos inorgánicos (EPA,1993).
En el caso de que se alcancen niveles graves de eutrofización, las aguas
pueden dejar de ser aptas para la mayor parte de los seres vivos, convirtiendo
entornos naturales en ecosistemas degradados, cuya recuperación supone
importantes inversiones.
1.2.3.2 Toxicidad en la fauna por presencia de amonio, nitrito y nitratos
La presencia de estos compuestos en cantidades anormalmente elevadas
puede dar lugar a una serie de efectos perjudiciales que varían en función de la
concentración y la forma nitrogenada. A continuación se citan algunas de las posibles
consecuencias.
Amonio
El ión amonio (NH4+) y el amoniaco (NH3) se encuentran estrechamente
relacionados mediante un equilibrio químico.
9
Introducción
El amoniaco tiene carácter tóxico tanto en masas de agua dulce como salada a
concentraciones de entre 1 y 10 mg/L. Su acción tóxica puede ser debida a algunas de
las siguientes causas (EPA, 2007):
- Destrucción del epitelio branquial
- Estimulación de la glucólisis y supresión del ciclo de Krebs
- Inhibición de la producción de ATP y reducción de sus niveles
- Alteración de la actividad osmorreguladora
- Disrupción del sistema inmunológico
Todo ello provoca que a diferentes concentraciones puedan darse problemas
de elevada gravedad como daños branquiales a niveles en torno a 0.06 mg/L, muerte
de las especies más sensibles con valores de amoniaco de 0.2 mg/L y muerte de
especies tolerantes al NH3 a niveles cercanos a 2.0 mg/L. Además de pérdidas de
equilibrio, desorientación, hiperexcitabilidad, incremento del ritmo respiratorio,
reducción de la excreción de nitrógeno, reducción del porcentaje de eclosió y menores
tasas de crecimiento (EPA, 2007).
Por otro lado, niveles elevados de Na+ y Ca2+ en el medio acuático pueden
reducir la susceptibilidad de los animales a la toxicidad del amoniaco (Chambers, et
al., 2001). Esto explicaría el hecho de que, en general, los animales de agua dulce
muestren una menor tolerancia a la presencia de amoniaco respecto de los animales
de aguas marinas.
Nitrito
El nitrito (NO2¯) y el ácido nitroso (HNO2) están estrechamente relacionados a
través de un equilibrio químico. Las concentraciones relativas de NO2¯ y HNO2
dependen básicamente del valor de pH del agua, ya que elevadas concentraciones de
nitrito y bajo pH favorecen la formación de ácido nitroso. (Russo, 1985). Ambos
compuestos poseen una elevada toxicidad, sin embargo en rangos de pH entre 7.5 y
8.5, típicos de ecosistemas acuáticos, la concentración de nitrito es del orden de 4 a 5
veces superior que la concentración de ácido nitroso (Russo, 1985, Camargo y Alonso,
2006).
Algunos de los efectos perjudiciales del nitrito son:
- Reducción de los niveles de cloro, provocando un desequilibrio
electrolítico grave.
- Modificaciones en los niveles de potasio intracelular y extracelular que
afectan los potenciales de membrana y los neurotransmisores
10
Introducción
provocando contracciones musculares que afectan a la función
cardiaca.
- Formación de compuestos nitrosos de carácter mutagénico y
cancerígeno.
- Represión del sistema inmunitario, con la consiguiente la disminución
de la tolerancia a las enfermedades bacterianas y parasitarias.
En general, la concentración de nitrito en aguas superficiales es muy baja, pero
puede aparecer ocasionalmente en concentraciones inesperadamente altas debido a
la contaminación de aguas residuales industriales y domésticas (Prat et al., 1999).
En aguas superficiales bien oxigenadas, el nivel de nitrito no suele superar la
concentración de 0.1 mg/L (Stumm y Morgam, 1981). Los valores entre 0.1 y 0.9 mg/L
pueden presentar problemas de toxicidad dependiendo del pH (Erikson, 1985), y
valores por encima de 1 mg/L son totalmente tóxicos y representan un impedimento
para el desarrollo de la vida piscícola y el establecimiento de un ecosistema fluvial en
buenas condiciones (Prat et al., 1999).
Nitrato El ión nitrato en medios acuáticos no se encuentra formando especies
desionizadas por tanto, la toxicidad de este compuesto se debe únicamente al efecto
de la forma iónica (Camargo et al., 2005).
Puesto que el nitrato tiene una baja permeabilidad branquial, presenta un
menor índice de toxicidad respecto a otros compuestos nitrogenados, Sin embargo, la
fauna acuática más sensible puede verse afectada si es sometida a niveles en torno a
10 mg/L durante períodos prolongados de tiempo (Camargo y Alonso, 2006).
En general los animales marinos son más tolerantes que los animales de agua
dulce a la toxicidad del nitrato, aunque determinados invertebrados marinos en estado
larvario pueden mostrar sensibilidad a concentraciones relativamente bajas de nitrato
en el medio acuático (Muir et al., 1991).
Los niveles máximos de nitrato recomendados están entre 2.9 y 3.6 mg/L con
el fin de asegurar la protección de la fauna acuática tanto continental como marina y
un nivel máximo más restrictivo de 2 mg/L (Camargo et al., 2005) para proteger
aquellas especies más sensibles.
11
Introducción
1.2.3.3 Efectos perjudiciales sobre la salud humana
La ingesta de nitrito y nitrato procedentes de aguas contaminadas puede
inducir metahemoglobinemia, que consiste en la transformación de hemoglobina en
metahemoglobina, que no es capaz de realizar el intercambio de oxígeno. En el caso
de los infantes (principalmente menores de 4 meses) puede provocar cianosis,
taquicardia, convulsiones, asfixia y en último término la muerte (Fewtrell, 2004).
Evidencias científicas sugieren además que la ingestión prolongada de nitratos
y nitritos puede resultar en procesos de mutagénesis y teratogénesis, en el desarrollo
de linfomas y cánceres, enfermedades coronarias, infecciones del tracto respiratorio, y
malformaciones en los recién nacidos (Carmago y Alonso, 2006). Además, la
formación de nitrosaminas a partir de la presencia de elevadas concentraciones de
nitritos en el organismo tiene un alto poder cancerígeno y tóxico (Russo, 1985).
Por otra parte, el enriquecimiento en nutrientes de los ecosistemas acuáticos y
la proliferación de algas tóxicas pueden causar, de manera indirecta, efectos adversos
sobre la salud humana dando lugar a trastornos fisiológicos y diversos síndromes de
intoxicación (Busse et al., 2006).
Como se ha visto hasta ahora, la problemática derivada del incremento en la
concentración de compuestos nitrogenados en las masas de agua no afecta
únicamente el medio ambiente y a la viabilidad de los diferentes hábitats, sino también
al ser humano.
A nivel práctico, las actuaciones para reducir la presencia de estos compuestos
en las aguas pueden llevarse a cabo en la fuente de origen (cambios en el sistema de
producción, empleo de sustancias menos contaminantes, etc.) o mediante su
eliminación posterior en estaciones depuradoras empleando esquemas de tratamiento
basados en procesos físicos-químicos y biológicos.
1.3 Sistemas de tratamiento de materia orgánica y nitrógeno
1.3.1 Procesos físico-químicos
Los procesos físicos-químicos empleados para eliminar el nitrógeno de las
aguas residuales son tecnologías de tratamiento de uso limitado debido a su elevado
coste, su funcionamiento irregular, y los problemas de explotación y mantenimiento
(Metcalf y Eddy, 1995). Las técnicas de mayor relevancia son (Rodrigo et al., 1999):
12
Introducción
Arrastre con aire (stripping) Consiste en la basificación del agua hasta alcanzar un pH en el que el equilibrio
NH4+/NH3 esté desplazado hacia la formación de amoníaco, que se elimina por
arrastre con aire.
Intercambio iónico
Se basa en la utilización de un intercambiador iónico (ejemplo, zeolita
clinophlolita) que presenta gran afinidad por el amonio. Supone el inconveniente de la
saturación del intercambiador que obliga a regenerarlo periódicamente.
Cloración al breakpoint
Consiste en la oxidación del amonio a nitrógeno gaseoso con hipoclorito. Tiene
buenos rendimientos, pero hace necesario un tratamiento del agua con carbón
activado o con SO2 para eliminar el exceso de hipoclorito en el agua tratada.
Precipitación por estruvita (MAP, magnesium ammonium phosphate) Este sistema de eliminación de nitrógeno consiste en la coprecipitación del
nitrógeno amoniacal y el fósforo ortofosfórico mediante la adición de óxido de
magnesio, formando una sal llamada estruvita (MgNH4PO4, fosfato amónico
magnésico hexahidratado).
Se emplea como tratamiento previo al sistema biológica en aguas residuales
urbanas y permite la eliminación de fósforo y nitrógeno junto con la obtención de un
fertilizante de liberación lenta si se cumplen las restricciones en cuanto al contenido en
metales pesados (Lopetegui et al., 2005).
1.3.2 Procesos biológicos
La eliminación de materia orgánica y nitrógeno en las estaciones depuradoras
se aborda generalmente por la vía biológica, sometiendo a la biomasa a condiciones
aerobias, anóxicas o anaerobias en función de los requerimientos de cada tratamiento.
Como principales ventajas de los procesos biológicos cabe destacar el elevado
rendimiento de eliminación, la alta fiabilidad, la relativa facilidad de control y el
moderado coste (Metcalf y Eddy, 1995).
En las estaciones depuradoras urbanas, entre un 5% y un 10% del nitrógeno
total contenido en el agua residual afluente es eliminado en etapa de decantación
primaria en forma de nitrógeno orgánico particulado. Por otro lado, en los sistemas de
fangos activos convencionales se elimina entre un 10% y un 30 % del nitrógeno total
13
Introducción
14
para satisfacer las necesidades nutricionales de la biomasa, que se estiman entre un
12% y un 13 % en peso de la biomasa formada (Sedlak, 1991). En la mayoría de los
casos esta eliminación no es suficiente para conseguir cumplir requisitos de vertido por
lo que se requiere de la aplicación de tratamientos específicos de eliminación de
nitrógeno.
Las reacciones que permiten la eliminación de nitrógeno son la nitrificación y la
desnitrificación, que vienen detalladas a continuación.
1.3.2.1 Nitrificación
La nitrificación consiste en la transformación del nitrógeno amoniacal a nitrato
por acción de un conjunto de bacterias autótrofas denominadas nitrificantes. Las
bacterias encargadas de realizar este proceso utilizan el carbono inorgánico (CO2 o
HCO3¯) como fuente de carbono, y obtienen la energía necesaria para su crecimiento a
partir de la oxidación del nitrógeno amoniacal. Este proceso se realiza en dos etapas
llevadas a cabo por dos grupos diferentes de microorganismos.
Las bacterias amonioxidantes (AOB) oxidan el amonio a nitrito en un proceso
denominado nitritación (Ecuación 3), y posteriormente las bacterias nitritoxidantes
(NOB) oxidan el nitrito a nitrato en un proceso denominado nitratación (Ecuación 4). La
Ecuación 5 se representa la reacción de oxidación global de amonio a nitrato.
OHHNOONH AOB2224 24232 ++⎯⎯→⎯+ +−+
En la Ecuación 6 se considera la reacción de síntesis de los microorganismos
implicados, que asimilan una fracción del amonio del agua residual para el tejido
celular. En esta reacción de síntesis, se asume como fórmula química de la biomasa
C5H7NO2.
Ecuación 5
Ecuación 4
Ecuación 3
−− ⎯⎯→⎯+ 322 22 NOONO NOB
ETAPA 1
ETAPA 2
OHHNOONH 2324 22 ++⎯→⎯+ +−+ REACCIÓN
GLOBAL
Introducción
15
−
La reacción global representativa del proceso de nitrificación obtenida a partir de
las reacciones de oxidación y síntesis de biomasa corresponde con la
ecuación 7:
Teniendo en cuenta esta reacción, se observa que en el proceso de nitrificación
se produce un consumo considerable de alcalinidad que supone un importante
descenso del pH del medio. La compensación del pH tiene lugar durante el proceso de
desnitrificación, que viene descrito a continuación.
1.3.2.2 Desnitrificación
Las bacterias encargadas de llevar a cabo este proceso son heterótrofas
capaces de (en ausencia de oxígeno) emplear el nitrito o el nitrato como aceptor de
electrones para degradar la materia orgánica.
La reacción general de desnitrificación se representa en la Ecuación 8, con el
metanol (CH3OH) como fuente de carbono orgánico.
En la Ecuación 9 se considera la síntesis de biomasa (C5H7NO2), la
degradación de la materia orgánica del agua residual (C10H19O3N) y el consumo de
nitrógeno amoniacal. La reacción global de eliminación de nitrato se puede escribir
como (WEF y ASCE, 1998):
−
3
Ecuación 8
Ecuación 7
Ecuación 622752432 54 ONOHCOHNHHCOCO +→+++
⎯→⎯+++ −2432 37224 ONHHCOCO
+− +++⎯→⎯ HOHNONOHC 422021 23275
⎯→⎯++−3233 167.0833.0 COHOHCHNO
−+++⎯→⎯ 3222 33.155.0 HCOOHCON
Ecuación 9 ⎯→⎯++++ +−+4331910 267.0267.0345.0 NHHCOHNOHCNO
OHCONNOHC 222275 3.2655.05.0612.0 +++⎯→⎯
Introducción
La efectividad de este proceso de eliminación de nitrógeno es máxima cuando
en el sistema no existe oxígeno disuelto disponible (condiciones anóxicas). De lo
contrario, las bacterias emplean como aceptor de electrones el oxígeno, cuya
asimilación se ve favorecida frente al nitrato, por lo que si existen ambos compuestos,
no tiene lugar el proceso de desnitrificación. El motivo es que el crecimiento bacteriano
en presencia de nitrato resulta menos eficiente que el crecimiento en presencia de
oxígeno, ya que no se genera la misma cantidad de energía en forma de ATP por
unidad de DQO (Demanda Química de Oxígeno) degradada (Brock, 2003).
Como ya se ha indicado anteriormente, el consumo de protones y la producción
de CO2 asociados a esta reacción supone un aumento de la alcalinidad, que
compensa la disminución de alcalinidad del proceso previo de nitrificación. Por ello la
desnitrificación es una etapa de gran importancia, ya que permite estabilizar el sistema
además de que elimina de forma muy eficiente el nitrógeno del agua.
1.3.2.3 Factores que afectan los procesos de nitrificación-desnitrificación
En relación a los factores que intervienen en los sistemas de depuración de
aguas residuales, existen numerosos agentes físico-químicos que afectan los
procesos de nitrificación y desnitrificación llevados a cabo por los microorganismos.
Por tanto, un adecuado desarrollo de la población bacteriana es la clave para obtener
unos rendimientos de eliminación de materia orgánica y nutrientes que cumplan con
los objetivos establecidos.
La densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes en un reactor depende
de diversos factores, siendo algunos de los siguiente parámetros ambientales los de
mayor relevancia: oxígeno disuelto (OD), pH, alcalinidad, temperatura, concentración
de nutrientes, salinidad, luz, presencia de tóxicos (como por ejemplo, metales
pesados) (Henze et al., 2002). Además de factores relacionados con el diseño del
sistema, como el ratio DBO/Nitrógeno.
En este apartado se van a comentar los principales factores que influyen en el
desarrollo bacteriano, haciendo especial hincapié en el pH y los nitritos.
Alcalinidad y pH
El pH es un parámetro que influye en la velocidad de los procesos biológicos
por lo que valores fuera del intervalo fisiológico de funcionamiento provocan la
ralentización del crecimiento de los microorganismos.
16
Introducción
El rango de valores de pH adecuado para que se den los procesos de
nitrificación y desnitrificación se halla entre 7 y 9, con un rango óptimo entre 7.5 y 8.5
(Metcalf y Eddy, 1995; Van Haandel y Van der Lubbe, 2007).
En la nitrificación se reduce el nivel de HCO3¯ generando una disminución de la
alcalinidad del medio. La mayor proporción de esta alcalinidad se consume en la
neutralización de los protones liberados en la oxidación del ión amonio (7.14 mg de
alcalinidad como CaCO3) mientras que durante la desnitrificación se producen 3.57 mg
de alcalinidad como CaCO3.
Para evitar que un sistema de nitrificación-desnitrificación se acidifique
progresivamente es necesario que la alcalinidad residual sea superior a 50 mg
CaCO3/L (Villaseñor, 1997, Gerardi, 2002).
En cuanto a la influencia del pH en la velocidad de crecimiento bacteriano,
aunque afecta a todas las bacterias, su efecto es más significativo en determinadas
poblaciones, como por ejemplo las bacterias autótrofas y las bacterias acumuladoras
de polifosfato (PAO). Las bacterias autótrofas presentan su máxima velocidad de
crecimiento para valores de pH en torno a 8 y en el caso de las bacterias heterótrofas,
el pH adecuado para su desarrollo comprende un intervalo de entre 7 y 8.
Cuando el valor de pH excede los rangos mínimo o máximo puede darse la
limitación del crecimiento bacteriano. Los procesos pueden ser biológicos, afectando
directamente a la actividad enzimática por la inhibición de los sitios activos de las
enzimas debido a la unión de H+ y OH¯ (García y Fernández-Polanco, 1996), lo cual
provoca una pérdida de actividad en las células. O químicos, reduciendo la
concentración disponible de HCO3¯ (fuente de carbono) (Carretero, 2010).
Según Grunditz y Dalhammar (2001), el pH óptimo para bacterias
amonioxidantes y nitritoxidantes está próximo a 8 y se observa una disminución similar
en la actividad de ambas bacterias para valores de pH inferiores o superiores, aunque
las bacterias AOB se encuentran menos afectadas a valores de pH elevados. Por otra
parte, Ju y Nallagatla (2003) obtuvieron que para concentraciones elevadas de
amonio, la máxima velocidad de nitrificación tenía lugar a un valor de pH de 7.6,
mientras que con concentraciones bajas de amonio, el pH óptimo se desplazaba hacia
valores superiores ya que conforme aumenta el valor del pH también lo hace el
porcentaje de moléculas de nitrógeno amoniacal en forma de NH3 (verdadero sustrato
de las bacterias amonioxidantes).
En la Tabla 4 se presentan los rangos de pH y su influencia sobre la actividad
de las bacterias nitrificantes.
17
Introducción
Tabla 4. Influencia del pH en el procesos de nitrificación.
pH Efecto sobre la nitrificación
4.0 a 4.9 Presencia de bacterias nitrificantes (nitrificación organotrófica) 5.0 a 6.7 Velocidad de nitrificación lenta 6.7 a 7.2 Velocidad de nitrificación se incrementa 7.2 a 8.0 Velocidad de nitrificación constante 7.5 a 8.5 Nitrificación por bacterias nitrificantes
Fuente: Gerardi (2002)
Compuestos nitrogenados: Amonio, nitrito y nitrato Son las fuentes de energía o dadores de electrones de las bacterias
nitritoxidantes y desnitrificantes. Por esta razón son factores limitantes de gran
relevancia en el crecimiento bacteriano. No obstante, si se hallan presentes en una
elevada concentración puede llegar a inhibir el desarrollo de las bacterias (Anthonisen
et al., 1976; Glass y Silverstein, 1998; Surmacz-Gorzka et al.,1996).
Tanto el pH como la temperatura modifican el equilibrio en el que se hallan
presentes (Anthonisen et al., 1976; Claros et al., 2010). Un pH elevado provoca la
inhibición del proceso de nitrificación debido al propio efecto del pH (Claros et al.,
2010). Mientras que un pH bajo inhibe el proceso por efecto del propio pH y por la
generación de ácido nitroso a partir de iones nitrito.
Las bacterias nitritoxidantes son más sensibles que las amonioxidantes a los
efectos de inhibición provocados por amonio y nitrito (Vadivelu et al., 2007), aunque
hay una enorme disparidad en los valores recopilados en bibliografía. Las poblaciones
de Nitrosomonas y Nitrobacter pueden verse seriamente afectadas cuando la
concentración de amoniaco alcanza valores de 10 mg/L y 0.1 mg/L respectivamente
(Gerardi, 2002). Y en cuanto al ácido nitroso, ambos géneros se ven inhibidos a una
concentración de 1.0 mg/L.
El efecto inhibitorio que causa el nitrito sobre la actividad bacteriana es objeto
de interés en numerosos procesos, tal y como muestra la Tabla 5.
Zumft (1993) informó que muchas especies de bacterias son susceptibles a la
toxicidad del nitrito a causa de la formación del complejo metal-nitrosyl que ocurre
cuando los iones NO o los radicales NO interactúan con enzimas bacterianas. Otra
posible causa de la inhibición por nitrito es la presencia de ácido nitroso y su influencia
en el crecimiento celular (Almeida, 1995).
18
Introducción
Tabla 5. Procesos influenciados por la presencia de nitrito.
Proceso Inhibición (%)
Nitrito (mg/L) Referencia
Oxidación de amonio 60 280 Stein and Arp (1998) Oxidación de amonio 0-80 80-3000 Groenewg et al., (1994) Oxidación de amonio 50 42-70 Muller et al., (1995) Anammox 100 >280 Jetten et al., (1999) Remoción anóxica de fósforo n.s. 5-10 Kuba et al., (1996) Remoción anóxica de fósforo 100 >8 Meinhold et al., (1999) Síntesis de ATP n.s. 380 Almeida et al., (1995a) Desnitrificación 100 308 Almeida et al., (1995a) Desnitrificación a pH 6 100 250 Glass et al., (1997) Crecimiento de Clostridium spotogenes 50 140 Cui et al., (1992) Crecimiento de Pseudomonas denitrificans 27 100 Komaros and Lyberatos (1997) Crecimiento de Pseudomonas fluorescens 60 98 Almeida et al., (1995a) Crecimiento de Pseudomonas fluorescens 100 308 Almeida et al., (1995a) Metanogénesis 100 70 Klüber and Conrad (1998a) Nitrificación 40 100 Dahl et al., (1997) Nitrificación 20 100 Philips and Verstraete (2000)
Fuente: Romero (2010)
También es importante destacar las implicaciones económicas que puede tener
un incremento en la concentración de nitrito en plantas de tratamiento biológico
- Una concentración elevada de nitrito en el proceso de cloración de la
etapa terciaria de desinfección reduce la capacidad desinfectante del
cloro ya que parte de su función oxidante es empleada para oxidar
estos compuestos (Gerardi, 2002).
- Provoca el incremento en el consumo de oxígeno debido a la formación
de tetróxido de dinitrógeno (N2O4) que se genera abióticamente a partir
de nitrito y compite por el oxígeno en el proceso de oxidación de amonio
llevado a cabo por la encima amoniomonooxigenasa (AMO), que oxida
el amoniaco a hidroxilamina. Por tanto, un incremento en la
concentración inicial de nitrito provoca el incremento de la
concentración de N2O4provocando un aumento de la constante de
semisaturación para el oxígeno.
- Una elevada concentración de nitrito en el medio tiene un efecto
estimulante sobre el desarrollo de microorganismos filamentosos
(Musvoto et al., 1999). Casey (1999) halló que bajo condiciones de
elevada concentración de nitrito, cuando el fango activo era sometido a
alternancia de condiciones aeróbicas/anóxicas, se producía una
acumulación intracelular de NO durante el periodo de anoxia en
19
Introducción
bacterias formadoras de flóculos, aunque no en filamentosas,
provocando su inhibición en la etapa de consumo de oxígeno. De esta
manera las bacterias filamentosas experimentaban una ventaja
competitiva sobre las formadoras de flóculos y proliferan.
Oxígeno disuelto
El consumo de oxígeno en el proceso de nitrificación supone que por cada mg
de N-NH4 (nitrógeno en forma de amonio) oxidado a N-NO3 (nitrógeno en forma de
nitrato) se necesitan 4.57 mg de oxígeno, de los cuales 3.44 mg son consumidos por
las bacterias amonioxidantes y 1.13 mg por las bacterias nitritoxidantes. Mientras que
en la desnitrificación, una concentración que supere valores entre 0.3 mg O2/L y 1.5
mg O2/L inhibe el proceso de desnitrificación (Ciudad et al., 2005; Zafarzadeh et al.,
2011).
Las bacterias autótrofas nitrificantes son más sensibles que las bacterias
heterótrofas a la falta de oxígeno, habiéndose observado que concentraciones de
oxígeno disuelto inferiores a 1 mg/L conducen a una reducción significativa de su
velocidad de crecimiento (Grady et al., 1999). En sistemas con bajas edades de fango
y alta carga, el consumo de oxígeno es elevado y pueden crearse deficiencias en el
interior de los flóculos, ante las cuales las bacterias nitrificantes son muchos más
sensibles que las heterótrofas (Villaseñor, 1997)
Las bacterias amonioxidantes (AOB) tienen una constante de saturación
diferente a la de las bacterias nitritoxidantes (NOB). Existen estudios que indican que
las bacterias AOB tienen menor afinidad por el oxígeno que las bacterias NOB
(Hellinga et al., 1998; Pérez, 2001) y otros que por el contrario, proponen una
constante de afinidad mayor para las NOB (Wiesmann, 1994; Guisasola et al., 2005;
Ciudad et al., 2005).
En cuanto al efecto del oxígeno sobre las bacterias desnitrificantes, es
importante tener en cuenta que muchas bacterias nitrificantes son facultativas y por
tanto pueden llevar a cabo la desnitrificación en ausencia de oxígeno y presencia de
compuestos oxidados de nitrógeno (Seviour y Nielsen, 2010), por tanto su crecimiento
no se verá tan afectado como en el caso de las bacterias no facultativas.
Temperatura
La temperatura afecta a varios factores, como por ejemplo los valores de las
constantes de equilibrio ácido/base, la solubilidad de las sustancias, los coeficientes
de difusión y la actividad enzimática.
20
Introducción
Una mayor temperatura, dentro del rango considerado como óptimo, supone un
aumento de la velocidad de crecimiento debido a que se incrementa la rapidez de las
reacciones enzimáticas. Sin embargo, si se exceden los límites máximos se produce la
desnaturalización de las proteínas y la alteración de las membranas lipídicas, lo que
provoca la muerte celular.
Por otro lado, temperaturas inferiores a los valores óptimos provocan una
disminución de la velocidad de crecimiento al impedir el adecuado funcionamiento de
la membrana celular por el cambio de estado de los lípidos de la membrana, que
pasan de ser fluidos a cristalinos. En la Tabla 6 se presentan los rangos de
temperatura y su efecto sobre el proceso de nitrificación.
Tabla 6. Relación de la temperatura con el proceso de nitrificación.
Temperatura Efecto sobre la nitrificación
> 45 ºC Se detiene el proceso 28 ºC a 32 ºC Rango de temperatura óptimo
16 ºC Aproximadamente el 50% de la velocidad óptima
10 ºC Reducción significativa de la velocidad de nitrificación. 20% de la velocidad óptima
< 5 ºC Se detiene el proceso Fuente: Gerardi (2002)
El proceso de nitrificación puede desarrollarse en un intervalo de temperatura
comprendido entre 8ºC y 30ºC (Gerardi, 2002), aunque a temperaturas bajas es
necesario incrementar los tiempos de retención celular para lograr mantener los
niveles de eliminación de nutrientes y materia orgánica.
La temperatura óptima para las bacterias amonioxidantes es aproximadamente
de 35ºC y para las bacterias nitritoxidantes el intervalo óptimo de temperatura se
encuentra entre 35ºC y 42ºC (González et al., 2010). Mientras que para las bacterias
desnitrificantes el rango de temperatura va de 0ºC a 50ºC, con un valor máximo de
desnitrificación a 40ºC (Lolmede et al., 2000).
Luz
La inhibición por luz es significativa en la superficie del agua, donde se observa
una reducción del 50% de la actividad de las bacterias nitrificantes a intensidades de
luz de un orden de magnitud tres veces menor que la intensidad a plena luz del día
(Prosser, 1989).
21
Introducción
Nutrientes En todo proceso biológico es necesaria la existencia tanto de nutrientes como
de micronutrientes, por lo que se debe verificar que la carencia de alguno de ellos no
inhiba el proceso: N, S, P, K, Mg, Ca, Fe Na y Cl (Pérez, 2001; González et al., 2010).
Sustancias inhibidoras
En sistemas de tratamiento de aguas residuales industriales es frecuente que
las poblaciones bacterianas se vean afectadas ante vertidos que provoquen una
modificación en las condiciones del afluente, inhibiendo la actividad bacteriana durante
largos períodos de tiempo o incluso provocando su muerte.
El efecto de las sustancias tóxicas sobre las bacterias depende de la
concentración de dicha sustancia y del tiempo de exposición. Las sustancias tóxicas
más referenciadas en el campo de las aguas residuales son algunos metales y ciertos
compuestos inorgánicos: Z, Cu, Ni, Ci, Cd, As, Cr, fluoruros, yoduros, cloroformo,
fenol, tiourea, hidracina, etanol, etilendiamina, anilina y acetona (Blum y Speece, 1991;
Pérez, 2001, González et al., 2010).
Ratio Demanda Biológica de Oxígeno (DBO)/NKT Se ha observado experimentalmente que existe una correlación entre la
capacidad de eliminación de nitrógeno de los procesos de fangos activos y el cociente
DBO/NKT, donde DBO es la demanda biológica de oxígeno y NKT es el Nitrógeno
Kjeldahl, fracción que contiene el nitrógeno orgánico reducido y el amoniacal.
La fracción de organismos nitrificantes disminuye al aumentar la proporción
DBO5/NKT y por tanto se produce una pérdida de eficacia. En sistemas combinados
de eliminación de materia orgánica y nitrógeno esta proporción es superior a 5,
mientras que en los sistemas en los que se separan ambos procesos, en la etapa de
nitrificación la proporción es superior a 3 (Bitton, 2011).
Por otro lado, en el proceso de desnitrificación a medida que aumenta la
relación DBO/NKT, hay mayor disponibilidad de materia orgánica fácilmente
biodegradable lo cual permite un desarrollo eficaz del proceso (Carretero, 2010).
Dióxido de carbono
La limitación en el crecimiento autótrofo se produce por falta de fuente de
carbono (CO2), aunque es difícil encontrar este tipo de limitación debido a su elevada
solubilidad. No obstante, en el caso de que el caudal de aireación no contenga CO2,
es importante asegurar cierto nivel de carbono en el medio para que no se produzca la
limitación.
22
Introducción
Transferencia de materia En el caso de cultivos en suspensión, la transferencia de materia entre fases
puede limitar el crecimiento de las bacterias. En el caso de biomasa inmovilizada hay
que tener en cuenta, además, la transferencia entre la fase líquida y la sólida y la
posterior difusión en el sólido (Garrido et al., 1997).
Salinidad
Las bacterias son capaces de sobrevivir en ambientes con altos niveles de
salinidad, manteniendo su citoplasma en el mismo nivel osmótico que el del medio
ambiente circundante (Oren, 1999). Sin embargo, recientes estudios han determinado
que se da una reducción de la actividad de las bacterias o una inhibición total cuando
se somete la biomasa a elevadas concentraciones de salinidad (Claros et al., 2010;
Moussa et al., 2006).
Estudios como los llevados a cabo por Vredenbergt et al., (1997) y Dincer et al.,
(1999) determinaron que la salinidad tiene un efecto más negativo sobre las bacterias
nitritoxidantes que sobre las amonioxidantes.
A continuación se describen los principales esquemas de tratamiento
existentes.
1.3.2.4 Esquemas de tratamiento
Aunque se ha hecho especial hincapié en el proceso empleado en este trabajo,
Reactor Secuencial Discontinuo, más conocido por sus siglas en inglés como sistema
SBR (Sequencing Batch Reactor), en el siguiente apartado se describen algunos de
los procesos más empleados, así como aquellos que se han desarrollado en los
últimos años y que están en proceso de investigación e implementación.
1.3.2.4.1 Esquemas convencionales
Los esquemas de tratamiento más ampliamente difundidos para la eliminación
biológica de nitrógeno consisten básicamente en la disposición de etapas aerobias y
anóxicas en las que se realizan los procesos de nitrificación y desnitrificación. En
función de la posición relativa de las zonas, estos sistemas se clasifican en sistemas
de predesnitrificación y sistemas de postdesnitrificación (Rodrigo et al., 1999).
En la predesnitrificación el agua residual es tratada primero en una etapa
anóxica y posteriormente en una etapa aerobia. Los nitratos llegan al reactor anóxico
23
Introducción
por medio de una corriente de recirculación interna, utilizándose para la desnitrificación
la materia orgánica contenida en el agua residual. La postdesnitrificación consiste en una etapa previa aeróbica en la cual la
materia orgánica contenida en el agua residual ha sido consumida y es necesaria la
adición de una fuente de carbono externa (generalmente, en forma de metanol) o bien
la alimentación de parte del agua residual bruta directamente al reactor anóxico. La
materia orgánica procedente de la degradación de la biomasa endógena puede
complementar las anteriores fuentes de carbono.
Estos sistemas pueden operarse en cultivos de lecho fijo o en suspensión. El
método en suspensión está ampliamente extendido, siendo el más sencillo el que
corresponde a una configuración de etapas anóxica/aerobia. Esta configuración ha
dado origen a varios esquemas de proceso, entre los que podemos destacar los
siguientes y cuyo esquema de tratamiento viene representado en la Figura 1.
Wuhrman Es un proceso de postdesnitrificación. Esto implica la necesidad de emplear
una fuente de carbono orgánico para la desnitrificación, obteniéndose por norma
general bajos rendimientos en cuanto a eliminación de nitrógeno.
Configuración Ludzack-Ettinger y Ludzack-Ettinger modificado Ambos procesos son de predesnitrificación, diferenciándose en que, en el
proceso modificado, la corriente de recirculación interna es independiente de la de
recirculación de fangos, mientras que en el Ludzack-Ettinger la recirculación de fangos
realiza también la recirculación de nitratos.
Esquema Bardenpho En este sistema se adicionan dos etapas al proceso base, una anóxica o de
postdesnitrificación y una aerobia o de postaireación. En la etapa de
postdesnitrificación la materia orgánica utilizada es la procedente de la degradación de
la biomasa endógena. De esta manera, se consigue un aumento en el rendimiento de
eliminación de nitrógeno oxidado. La etapa de postaireación elimina por arrastre el N2
formado durante la desnitrificación, mejorando de esta forma la sedimentabilidad del
fango
24
Introducción
25
Figura 1. Esquemas de eliminación biológica de nitrógeno: A) Wuhrmann, B) Ludzack-Ettinger, C) Ludzack-Ettinger modificado, D) Bardenpho, E) Canales de oxidación
A. Proceso Wurhmann
Purga Recirculación de fangos
Decantador Reactor aerobio
Reactor anóxico
B. Proceso Ludzack-Ettinger
Purga Recirculación de fangos
Decantador Reactor aerobio
Reactor anóxico
C. Proceso Ludzack-Ettinger modificado
Purga Recirculación de fangos
Decantador Reactor aerobio
Reactor anóxico
Recirculación interna
Recirculación de fangos
Recirculación interna
Purga
Decantador Reactor aerobio
Reactor anóxico
Reactor aerobio
Reactor anóxico
D. Proceso Bardenpho
Aireadores
Aireadores
Recirculación de fangos
Decantador
Purga
E. Canal de oxidación
Introducción
Canales de oxidación continuos y de fases Las operaciones de mezcla y aireación son fundamentales en estos reactores.
En uno o en varios puntos del canal se suministra oxígeno, originándose dos zonas
entre cada dos puntos de aireación: una aerobia (en la que conforme aumenta la
distancia al punto de aireación disminuye la concentración de oxígeno) y una anóxica
(que comienza cuando la concentración de oxígeno es cero y se prolonga hasta
alcanzar el siguiente punto de aireación). El tamaño de ambas zonas variará a lo largo
del tiempo dependiendo del caudal y características del agua residual, pudiendo ser
ajustado mediante el control de la aireación. Es fundamental un control de la operación
de mezcla para que no se produzca, como consecuencia de la agitación, una aireación
del fango en las zonas anóxicas. Por lo general, estos procesos se operan con
elevadas edades de fango para favorecer el proceso de nitrificación.
1.3.2.4.2 Esquemas no convencionales
Muchos estudios se centran en las limitaciones técnicas y económicas de los
procesos de nitrificación-desnitrificación en sistemas que tratan aguas residuales con
elevadas cargas de nitrógeno y bajas cargas de carbono orgánico (Paredes et al.,
2007).
Por este motivo, se han desarrollado diferentes esquemas de tratamiento que
han puesto de manifiesto la posibilidad de optimizar el rendimiento de eliminación de
nitrógeno (en su mayor parte en forma de amonio) que suele provenir de corrientes de
recirculación interna de la planta (sobrenadante de la digestión anaerobia) o de
vertidos de determinados procesos industriales.
Potenciación de organismos nitrificantes en un sistema BABE®
Se trata de un proceso biológico de crecimiento y acumulación de organismos
nitrificantes (Bio-Augmentation Batch Enhanced) (Zilverentant, 1999) que contribuye a
optimizar la eliminación biológica del nitrógeno de la línea de aguas de una EDAR. El
objetivo de este esquema de tratamiento es potenciar el proceso de nitrificación en
sistemas de fangos activados que trabajan a bajas temperaturas (<15ºC) y por tanto
tienen limitada la velocidad de crecimiento de los organismos nitrificantes (Salem,
2003).
El proceso consiste en un reactor independiente que emplea como afluente la
corriente procedente de la deshidratación de fangos y una pequeña fracción del fango
de recirculación proveniente del sistema biológico. Mediante la alta concentración de
26
Introducción
27
bacterias autótrofas nitrificantes presentes en la corriente de recirculación y la elevada
concentración de nitrógeno del agua de deshidratación, se potencia el crecimiento de
los microorganismos, incrementando la eficiencia del sistema y reduciendo el TRC
necesario para conseguir la nitrificación. La corriente generada en el reactor BABE® es
introducida en la línea principal de la EDAR, mejorando el porcentaje de eliminación
global de nitrógeno de la planta.
Nitrificación-desnitrificación vía nitrito
La Figura 2 muestra el esquema de nitrificación-desnitrificación vía nitrito.
Consiste en la oxidación del amonio a nitrito, evitando que el proceso de oxidación
continúe. En el sistema global, el consumo de oxígeno necesario empleando este
proceso se reduce un 25% en la etapa aerobia, y supone un ahorro de materia
orgánica de entre un 40% y un 60% en la etapa anóxica, además de que se produce
un 300% menos de biomasa (Ciudad, 2007).
222324 NONNONONONONH NOBAOB ⎯→⎯⎯→⎯⎯→⎯⎯→⎯⎯⎯ →⎯⎯⎯→⎯ −−−+
Figura 2. Esquema del proceso de nitrificación-desnitrificación vía nitrito
Para llevar a cabo este proceso se requiere reducir la actividad de las bacterias
que realizan el paso de nitrito a nitrato, y los principales parámetros sobre los que se
puede actuar son: oxígeno disuelto (OD), pH, temperatura y tiempo de retención
celular. La concentración de OD es un adecuado parámetro de control de la oxidación
de amonio a nitrito debido a que las bacterias amonioxidantes (AOB) y las
nitritoxidantes (NOB) poseen distinta afinidad por el oxígeno, con una mayor
sensibilidad de las NOB a bajas concentraciones de OD (Wiesmann, 1994; Garrido et
al., 1997).
Por otra parte, el pH es un parámetro que permite controlar el equilibrio de las
formas iónicas y no iónicas del medio. Alcanzar un pH alcalino tiene dos efectos en las
bacterias NOB: la inhibición por amoníaco y la limitación por sustrato (Ciudad, 2007).
Sin embargo, se ha observado que puede darse la aclimatación a concentraciones
crecientes de amoniaco (entre 0.1 y 10 mg N-NH3/L) entre la población de NOB
(Villaverde et al., 2000), por lo que se han desarrollado sistemas de trabajo que
Paso 2
O2 Nitrificación Materia orgánica
DesnitrificaciónPaso 1
Introducción
28
emplean la temperatura como parámetro de control. Trabajando en un rango de entre
28ºC y 34 ºC y una baja retención de sólidos es posible reducir la concentración de
bacterias nitritoxidantes en el reactor (Hellinga et al., 1998).
Dada la dificultad para mantener estable en el tiempo una eficiente oxidación de
amonio junto con la inhibición de la oxidación de nitrito a nitrato se han desarrollo
diversos esquemas de tratamiento. Éstos involucran además de la nitrificación parcial,
la desnitrificación, empleando para ello los principales sistemas existentes, como son
los cultivos en suspensión o en soporte sólidos, los reactores secuenciales (SBR) o de
flujo continuo (RCTA) y la combinación de procesos en reactores independientes o en
un único reactor.
Algunos de los principales esquemas de tratamiento se describen a continuación.
Nitrificación parcial: SHARON
El sistema SHARON (Single reactor High activity Ammonia Removal Over Nitrite)
permite tanto la eliminación de nitrógeno por la vía del nitrito como la desnitrificación,
que puede realizarse con el objetivo de controlar el descenso del pH y/o lograr una
completa eliminación del nitrógeno siguiendo la ruta del nitrito.
Se fundamenta en la selección de bacterias AOB frente a bacterias NOB al
trabajar en rangos de temperatura elevados, que favorecen el crecimiento de las
bacterias amonioxidantes de modo que con tiempos de retención celular adecuados,
es posible reducir la concentración de bacterias nitritoxidantes en el reactor (Hellinga,
1998). El proceso se realiza alternando etapas aerobias y anóxicas, en un único
reactor o en un sistema de reactores independientes, operando a altas temperaturas
(30ºC – 40ºC), con un rango de pH entre 7 y 8.
En la Figura 3 se representa un esquema de una EDAR que incluye el reactor de
nitritación parcial para el tratamiento independiente de la corriente del sobrenadante
procedente de la desnitrificación del fango digerido anaeróbicamente.
Figura 3. Esquema de una EDAR con un reactor SHARON de nitritación parcial
Recirculación de fangos
Reactor biológico
Purga
Decantador
Reactor nitritación
Efluente deshidratación
Digestor anaerobio
Deshidratación
Introducción
29
Oxidación anaerobia de amonio: ANAMMOX Se trata de un proceso en el que bajo condiciones anóxicas el amonio es
convertido a nitrógeno gaseoso empleando nitrito como aceptor de electrones (Van
Dongen, 2003). Este tratamiento necesita de una nitrificación parcial previa que
permita obtener una relación entre amonio y nitrito próxima al 50%.
Los organismos involucrados en el proceso son bacterias autótrofas conocidas
como ANAMMOX, (ANaerobic AMMonia OXidation). Al ser autótrofas no requieren de
una fuente externa de carbono orgánico, siendo el dióxido de carbono su principal
fuente de carbono para el crecimiento (Van de Graaf, 1997). Estos organismos
emplean únicamente el nitrito como aceptor de electrones (Van Loosdrecht, 2005).
Los parámetros óptimos de trabajo deben mantener un pH en un rango de
valores entre 8 y 8.5 y una temperatura superior a 25ºC. Es importante tener en cuenta
que si la concentración de nitrito alcanza valores de entre 20 y 40 mg/L durante un
periodo de exposición superior a 24 horas, el proceso puede verse interrumpido de
forma irreversible (Fux, 2003).
Combinación de nitrificación parcial y ANAMMOX
En el proceso ANAMMOX, el amonio y el nitrito son consumidos de forma casi
equimolar, por lo que podría ser combinado con un proceso de nitritación parcial. Una
de las posibles opciones es el proceso SHARON, de forma que únicamente la mitad
del amonio sea oxidado a nitrito. Parte del amonio del agua residual es oxidado a
nitrito y el efluente de este proceso, que contiene amonio y nitrito a partes iguales, se
emplea como afluente del proceso Anammox, convirtiendo amonio a nitrógeno gas.
La complementación de ambos procesos autótrofos supone la eliminación de la
necesidad de una fuente de carbono externa y la reducción del consumo de oxígeno
entre un 50 % y un 60% (Van Hulle, 2005). Sin embargo, es importante mantener bajo
control dos parámetros principales: el oxígeno residual en el efluente del proceso de
nitrificación parcial, ya que podría inhibir a la actividad de las bacterias Anammox, y la
relación NH4+/NO2
¯, manteniéndola en un ratio 1.0:1.3.
Figura 4. Proceso combinado nitrificación parcial-ANNAMOX
0.1 NO3¯ NH4
+ NO2¯
NITRITACIÓN
ANAMMOX NH4
+
O2
0.9 N2
Introducción
Eliminación de nitrógeno con oxígeno limitado: CANON y OLAND
Se trata de un método de tratamiento que emplea un reactor de soporte sólido
que permite generar una biopelícula en la que se combinan simultáneamente los
procesos de nitrificación parcial y de oxidación anaerobia de amonio. En la zona
superficial de la biopelícula en contacto con el licor mezcla, la concentración de OD es
mayor y permite los procesos aerobios de nitrificación parcial, mientras que en las
capas inferiores se dan las condiciones que permiten el proceso de oxidación
anaerobia de amonio.
Los sistemas más conocidos son el sistema CANON (Completely Autotrophic
Nitrogen removal Over Nitrite) y el sistema OLAND (Oxygen Limited Aerobic
Nitrification-Denitrification) que difieren en la configuración del reactor.
Ambos procesos emplean la misma ruta de eliminación. Por lo tanto, pueden
ser denominados de forma colectiva como procesos de eliminación de nitrógeno con
limitación de oxígeno. Es una alternativa eficiente a la eliminación convencional de
nitrógeno que supone un ahorro de costes, especialmente para el tratamiento de
aguas residuales que contienen altas concentraciones de amonio pero carecen de
carbono orgánico.
Proceso CANON
Se trata de un sistema que consiste en la integración de la nitrificación
parcial y el proceso ANAMMOX y que transcurre en un único reactor de lecho
fijo. Bajo condiciones de oxígeno limitado, los dos grupos de bacterias
involucrados en los procesos de nitritación y ANAMMOX convierten
secuencialmente el amonio a nitrito y después a nitrógeno gas.
Este proceso es económicamente favorable ya que puede llevarse a cabo
en condiciones de oxígeno limitado además de no requerir una fuente externa
de carbono orgánico, ya que se trata de un proceso completamente autótrofo
(Third et al., 2001).
Proceso OLAND El proceso OLAND puede ser considerado como una variación del
proceso CANON. La reacción del amonio y el nitrito en la segunda fase del
sistema (ANAMMOX) es estequiométrica produciendo únicamente nitrógeno
gas, mientras que en el proceso CANON, se genera cerca del 11% de nitrato
respecto del total de nitrógeno en forma de N-NH4+ (Third et al., 2001) ya que la
relación nitrito:amonio es 1:3.
30
Introducción
1.3.2.5 Reactor Discontinuo Secuencial o SBR (Sequencing Batch Reactor)
Este tipo de reactores, más ampliamente conocidos por sus siglas en inglés,
SBR (Sequencing Batch Reactor), se han desarrollado como una variación del proceso
de fango activado. Es un sistema relativamente simple y compacto, ya que el
tratamiento completo tiene lugar en un mismo reactor.
El proceso consta de varias etapas que se reproducen de manera secuencial y
periódica, empleando tiempos que han sido previamente establecidos. Por tratarse de
un sistema por fases que ocurren en un mismo reactor, es posible combinar diferentes
etapas en función de los objetivos de calidad exigidos en el agua efluente.
1.3.2.5.1 Etapas de funcionamiento de un reactor SBR
Las etapas de funcionamiento de que consta este sistema son (Metcalf Eddy,
1995; Wilderer et al., 2001):
Etapa 1: Llenado Se lleva a cabo la adición de sustrato (agua residual) al reactor. Esta fase puede
constar de 3 sub-fases, que son:
- Llenado estático: el sistema completo está en modo no operativo
mientras que el agua es admitida en el reactor. Se produce la
acumulación de materia orgánica y nutrientes.
- Llenado con mezcla: el sistema de homogeneización del tanque está
operativo durante el proceso de admisión de sustrato. Tiene lugar una
mínima actividad aeróbica y generalmente se producen reacciones
anaeróbicas o anóxicas.
- Llenado con aireación: los sistemas de homogeneización y aireación
forzada están operativos, de modo que tienen lugar reacciones
aeróbicas y en muchas ocasiones permiten la simultaneidad de
condiciones anóxicas y aerobias en el interior de los flóculos.
Las reacciones que tienen lugar durante la etapa de llenado se completan
durante la etapa de reacción.
31
Introducción
Etapa 2: Reacción Tienen lugar los procesos de degradación de la materia orgánica y de
nitrificación-desnitrificación. Existen dos sub-fases posibles:
- Reacción con mezcla: se lleva a cabo la homogeneización sin emplear
el sistema de aireación forzada, lo que da lugar a un mínimo porcentaje
de reacciones aerobias y permite que se produzcan las reacciones
anóxicas y anaerobias.
- Reacción con aireación: permite la completa aireación del sistema y los
procesos de eliminación de nitrógeno.
El grado de interacción entre las aguas residuales que entran con un nuevo ciclo
y la biomasa que permanece en el tanque al finalizar el ciclo previo depende del grado
de aireación y mezcla del sistema. La duración de este período puede ser previamente
establecida para caudales de características físico-químicas y biológicas estables en el
tiempo, o se puede modificar en caso de caudales variables. Para ello se establece
como parámetro el consumo de oxígeno disuelto, que es un buen indicador del estado
de las reacciones biológicas de degradación y eliminación de materia orgánica y
nutrientes.
Etapa 3: Sedimentación Permite la separación de la biomasa y el agua tratada clarificada (sobrenadante).
El tiempo está definido, aunque la flexibilidad de este sistema permite variaciones en
la duración de esta etapa en función del estado de los flóculos y de la velocidad de
sedimentación. Uno de los parámetros empleados para determinar la finalización de
esta etapa es el volumen alcanzado por los fangos sedimentados.
Etapa 4: Vaciado El sobrenadante clarificado es extraído del sistema. La importancia del control
de esta etapa radica en evitar que junto con el clarificado sea arrastrado el fango
sedimentado. Para ello se emplean sensores que detienen la extracción en función del
nivel del manto.
Etapa 5: Purga
La eliminación del exceso de fangos permite mantener el tiempo de retención
celular, asegurando que los tiempo de funcionamiento escogidos sean efectivos.
Generalmente se lleva a cabo tras el vaciado, eliminando el porcentaje de fangos que
puede variar en función de las necesidades de la planta.
32
Introducción
En lo que respecta al diseño de este tipo de reactores, los parámetros más
importantes a tener en cuenta son: el número de ciclos, la duración y el orden de cada
fase, el tiempo de llenado así como la cantidad de agua residual introducida al reactor
y el tiempo de retención celular.
Los elementos principales de que consta un sistema de tratamiento de reactor
continuo secuencial son los siguientes y vienen esquematizados en la Figura 5:
- Pretratamiento: se emplea para la eliminación de gruesos, arenas y
grasas.
- Tanque de retención: asegura un caudal homogéneo de entrada a los
reactores.
- Reactor biológico: tiene lugar las reacciones de degradación y
eliminación de materia orgánica y nutrientes. El número de reactores
varía en función de las necesidades de la planta y determina tanto los
tiempos de llenado como la duración de los ciclos.
- Cámara de cloración: elimina elementos patógenos del agua tratada.
- Tanque de retención: permite homogeneizar el flujo de caudal efluente.
Purga
Purga
Purga
Reactores biológicos
Tratamiento primario
Tanque de retención
Cámara de cloración
Tanque de retención
(…)
Purga
Figura 5. Esquema del sistema SBR. Adaptado de Wilderer et al., (2001)
El número de reactores depende de los objetivos de calidad a alcanzar en el
agua efluente, ya que al incrementar la cantidad de reactores, se mejora la capacidad
de respuesta para tratar caudales variables mediante la modificación en los tiempos de
funcionamiento. De este modo se asegura un caudal efluente estable que facilite la
operación de los tratamiento secundarios, así como un volumen de vertido al medio
receptor que no sobrepase la capacidad del mismo.
33
Introducción
En cuanto a los posibles sistemas de funcionamiento existen 4 grupos en función
de la periodicidad del caudal y de las etapas empleadas que engloban los principales
métodos de operación de los reactores SBR:
- Caudal afluente periódico, una fase de reacción y una fase de
inactividad.
- Caudal afluente variable, fase de reacción y sin fase de inactividad
(necesidad de tanque de retención).
- Caudal afluente periódico, un selector y fases no reactiva y de
inactividad.
- Caudal afluente continuo.
Estos sistemas pueden orientarse para la eliminación de materia orgánica,
compuestos orgánicos y nutrientes (nitrógeno y/o fósforo). En cuanto a la eliminación
biológica de nitrógeno, la literatura propone diferentes esquemas de proceso,
principalmente a través de variaciones en el orden y la duración de las etapas,
coincidiendo en la necesidad de asegurar la disponibilidad de sustrato durante la fase
de desnitrificación mediante la adición de fuentes de carbono externas o modificando
los parámetros de funcionamiento, como con la sucesión de fases aeróbicas/anóxicas
breves o dividiendo la carga afluente.
1.3.2.5.2 Parámetros de funcionamiento de un reactor SBR
A continuación se indican los principales parámetros a considerar cuando se
trabaja con un reactor SBR (Balaguer, 2012): Variables relacionadas con el volumen (Vi)
Se define VT como el volumen total de reacción, es decir, el volumen del
reactor después de la fase de llenado. VS es el volumen que ocupa el fango
sedimentado tras la fase de sedimentación. V0 es el volumen del licor mezcla en el
reactor tras la fase de vaciado y previamente a la fase de llenado del siguiente ciclo,
compuesto por el volumen que ocupan los fangos decantados más el volumen
ocupado por el clarificado no extraído en la fase de vaciado. VF es el volumen de agua
residual que se añade en la fase de llenado de cada ciclo.
Variables relacionadas con la duración de cada ciclo (ti)
Se denomina Tc al tiempo de duración de cada ciclo y ti al tiempo de duración
de la fase i. Se distinguen las fases de llenado (tF), de reacción (tR), de sedimentación
34
Introducción
35
(tS), de vaciado (tD) y de reposo (tI), de forma que el tiempo de duración del ciclo es la
suma de los tiempos de duración de cada fase.
Tc = Σ ti = tF + tR + tS + tD + tI
Frecuencia del ciclo (n)
Es el número de ciclos por día. Define además del tiempo de duración del ciclo,
Tc, y el volumen de llenado de cada ciclo, VF. Donde Q es el caudal de agua residual a
tratar en m3/día.
Ratio de tiempo de llenado (RTLL)
Se expresa como el cociente entre el tiempo de llenado (tF) y el tiempo que dura
el ciclo (TC).
Ratio de intercambio de volumen (RIV)
Se calcula como el cociente entre el volumen de agua residual añadida en la fase
de llenado (VF) y el volumen total (VT).
Tiempo de retención hidráulico (TRH) Se define como el cociente entre volumen total de reacción y el caudal a tratar.
Ecuación 14
Ecuación 13
Ecuación 11
Ecuación 10
nTc
1= n
QVF = //
Ecuación 12C
F
TtRTLL =
T
F
VVRIV =
QVTRH T=
Introducción
Además también puede expresarse en función de TC:
C
F
O
F
FOT TVV
VmVV
QV
TRH ⋅⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛+=
⋅+
== 1)(
Ecuación 15
Tiempo de retención celular Se trata del tiempo necesario para que los microorganismos puedan
desarrollarse y determina el tiempo en el que el fango es extraído del reactor. Se
calcula como la masa de fango contenida en el reactor, MX, dividido por el caudal
purga de los mismos, PXT.
reacciónXT
X tPM
TRC ×= Ecuación 16
Donde:
reactorSSTreactorX CVM ×=
purgaSSTpurgaXT CQP ×=
Carga másica Representa la relación entre la demanda bioquímica de oxígeno que llega al
tratamiento biológico con la masa de fangos del reactor dando idea de la relación entre
el alimento y los microorganismos presentes en el reactor.
1.3.2.5.3 Ventajas e inconvenientes del sistema SBR
En cuanto a los inconvenientes y las ventajas podemos destacar los siguientes
(EPA, 1999):
Inconvenientes - En comparación con los sistemas convencionales, se requiere un nivel
mayor de sofisticación de las unidades de programación temporal y
controles, especialmente en sistemas de mayor tamaño. Esto requiere
un nivel de conocimientos elevado para su mantenimiento.
- Existe el riesgo potencial de arrastre de lodos flotantes o sedimentados
durante la fase de descarga del reactor en algunas configuraciones de
SBR.
36
Introducción
- La sedimentación en el propio tanque puede provocar el taponamiento
de los dispositivos de aireación durante ciclos operativos específicos,
dependiendo del sistema de aireación utilizado por el fabricante.
- Es necesaria la homogenización de caudales en función de los
procesos utilizados aguas abajo.
Ventajas
- Las etapas tiene lugar en un único reactor.
- Elevada capacidad para la retención de biomasa, que mejora los
procesos en los que intervienen organismos autótrofos.
- Tiene una gran flexibilidad de operación y de control. Versatilidad para
trabajar con fluctuaciones de caudal y de concentración de materia
orgánica.
- Ahorro potencial de inversión de capital por la eliminación de
sedimentadores y otros equipos y por las menores necesidades de
espacio.
- Mejor control del crecimiento de organismos filamentosos y de
problemas de decantación.
- Menor tiempo de control requerido.
- Fácil reconocimiento y corrección de los problemas de decantación.
Este sistema se emplea habitualmente para tratar caudales de pequeño volumen
y de carácter intermitente, y se emplean tanto para vertidos industriales como
municipales gracias a sus ventajas en la flexibilidad operacional (EPA, 1999).
Sin embargo, a pesar de sus importantes ventajas, por tratarse de un método
biológico de tratamiento está sometido a una serie de factores que pueden afectar la
evolución del proceso de depuración.
Una vez repasados algunos de los principales sistemas de tratamiento de aguas
residuales, a continuación se describen los microorganismos que intervienen en los
procesos biológicos de eliminación de materia orgánica y nutrientes así como las
diversas técnicas empleadas para su detección y cuantificación.
1.3.2.6 Microorganismos implicados en los sistemas de eliminación
Existen numerosos estudios que profundizan en la microbiología de los
procesos de nitrificación-desnitrificación (Wagner et al., 1996) y de eliminación de
fósforo (Mino et al., 1998) ya que se trata de los dos contaminantes principales en las
37
Introducción
aguas residuales. Sin embargo, el siguiente apartado se centrará en aquellos
microorganismos encargados de los procesos de eliminación de nitrógeno.
Como se ha comentado anteriormente, hay dos grupos de bacterias
filogenéticamente distintos que en conjunto realizan el proceso de nitrificación. Las
bacterias amonioxidantes (AOB) y las bacterias nitritoxidantes (NOB). El proceso final
de eliminación de nitrógeno es llevado a cabo por bacterias desnitrificantes, acerca de
las cuales los conocimientos existentes no son tan profundos como en el caso de las
AOB y NOB.
En las Figuras 6 y 7 se presentan los árboles filogenéticos de los
microorganismos amonioxidantes y nitritoxidantes hasta ahora conocidos.
Figura 6. Árbol filogenético hasta ahora conocido de los organismos amonioxidantes basado en la secuencia 16S rRNA (Seviour y Nielsen, 2010). Las líneas filogenéticos
asociadas a sistemas de aguas residuales están indicadas mediante flechas.
38
Introducción
Figura 7. Árbol filogenético hasta ahora conocido de los organismos nitritoxidantes basado en la secuencia 16S rRNA (Seviour y Nielsen, 2010). Las líneas filogenéticos
asociadas a sistemas de aguas residuales están indicadas mediante flechas.
El desconocimiento acerca de las bacterias desnitrificantes se debe a que
pertenecen a muy distintos géneros (Metcalf y Eddy, 1995) y a que los estudios de
identificación que se han llevado a cabo mediante métodos de aislamiento y cultivo no
representan el total de bacterias desnitrificantes que intervienen en los procesos
biológicos de una estación depuradora (Thomsen et al., 2007).
A continuación se describen los grupos de microorganismos que intervienen de
manera más relevante en la depuración de las aguas residuales y las técnicas
empleadas para su identificación.
1.3.2.6.1 Clasificación y características de las bacterias
Los microorganismos responsables de la nitrificación biológica se pueden
dividir en dos grupos, los nitrificantes autótrofos y los nitrificantes heterótrofos. Esta
clasificación se basa en el modo de obtener energía para el crecimiento.
39
Introducción
Tabla 7. Clasificación de bacterias amonioxidantes y nitritoxidantes CLASE ORDEN FAMILIA GÉNERO ESPECIE
Nitrosomonas
N. aestuarii N. communis N. europaea N. eutropha N. halophila N. marina N. nitrosa N. oligotropha N. ureae
Nitrosospira N. briensis N. multiformis N. tenuis
Nitrosolobus N. multiformis
βproteobacteria Nitrosomonadales Nitrosomonadaceae
Nitrosovibrio
Chromatiaceae Nitrosococcus
N. oceani N. halophilus N. nitrous N. mobilis
AM
ON
IOXI
DA
NTE
S
γproteobacteria Chromatiales
Ctothiorhodospiraceae Nitrococcus
αproteobacteria Rhizobiales Bradyrhizobiaceae Nitrobacter
N. alkalicus N. hamburgensis N. vulgaris N. winogradskyi
PHYL
UM
: Pro
teob
acte
ria
δproteobacteria Desulfobacterales Noctuoidea Nitrospina N. gracilis
DO
MIN
IO: E
ubac
teria
PHYL
UM
: N
itros
pira
e
Nitrospira Nitrospirales Nitrospiraceae Nitrospira N. marina N. moscoviensis
NIT
RIT
OXI
DA
NTE
S
Fuente: Jiménez (2010)
Los géneros que dominan los diferentes sistemas de tratamientos de aguas
residuales (Tabla 7) pertenecen al phylum Proteobacteria, y entre ellos destacan:
Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosovibrio y Nitrosolobus, que participan
en la primera etapa de la nitrificación. La segunda fase la llevan a cabo las bacterias
del género Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrospira y Nitrospina (Wagner et al., 1995;
Brock, 2003; Rodríguez y Peñuela, 2009, Avendaño et al., 2010). Todos los miembros
de estos dos grupos son bacterias gram-negativas quimioautótrofas, es decir, utilizan
compuestos químicos inorgánicos como fuente de electrones para la inmovilización de
carbono inorgánico. Los microorganismos quimioautótrofos, por lo general, son
aerobios (emplean oxígeno como aceptor final de electrones).
La Tabla 8 presenta las características de los principales géneros de bacterias
amonioxidantes y nitritoxidantes.
40
Introducción
Tabla 8. Características de las bacterias nitrificantes
Características Género Grupo Hábitats
Oxidan amonio Gram-negativas, bacilos cortos o
largos, móviles por flagelo polar o inmóviles, sistemas de membrana periféricos
Nitrosomonas Beta Aguas residuales, agua dulce, agua marina y suelos
Cocos grandes móviles, sistemas de membrana vesicular o periférico
Nitrosococcus Gamma Agua dulce, agua marina y suelos
Espirales móviles por flagelos peritricos, ningún sistema de membrana aparentes
Nitrosospira Beta Suelo
Pleomórficas lobuladas, células compartimentadas, móviles por flagelo peritricos
Nitrosolobus Beta Suelo
Bacilos incurvados Nitrosovibrio --- Suelo
Oxidan nitrito Bacilos cortos, se reproducen por
gemación, a veces móviles por flagelo terminal único o no móviles, sistema de membrana organizada como un casquete polar
Nitrobacter Alpha Suelo, agua dulce y agua marina
Bacilos largos inmóviles y sin sistema de membrana aparente
Nitrospina Delta Agua marina
Cocos grandes, móviles por uno o dos flagelos terminales y sistemas de membrana distribuidos aleatoriamente en tubos
Nitrococcus Gamma Agua marina
Células en forma de helicoidal a vibrioide, inmóviles, sin membranas internas
Nitrospira Grupo Nitrospirae
Agua marina y suelo
Fuente: Brock (2003)
Respecto a las bacterias desnitrificantes, existe una gran variedad taxonómica
(Metcalf y Eddy, 1995; Parés y Juárez, 1997). Pueden ser aerobias autótrofas o
heterótrofas y pertenecer a distintos géneros, entre los que se pueden destacar:
- Autótrofas: Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus, Agrobacterium
- Quimiolitrótofos: Thiobacillus, Thiomicrospira, Nitrosomas
- Diazótrofos: Rhizobium, Azospirillum
- Fotótrofos: Rhodopseudomonas
- Arqueobacterias: Halobacterium
41
Introducción
- Heterótrofas: Achromobacter, Aerobacter, Alcalibacter, Alcaligenes,
Bacillus, Brevibacterium, Flavobacterium, Lactobacillus, Micrococcus,
Proteus, Pseudomonas y Spirillum.
La variedad de tipos de bacterias capaces de llevar a cabo el proceso de
desnitrificación permite que bajo diferentes circunstancias (modificaciones de OD, pH,
temperatura, fuente de carbono, etc.) pueda tener lugar este proceso. Sin embargo,
los conocimientos acerca de las bacterias que tienen un papel más relevante en el
proceso de desnitrificación son escasos.
De entre los géneros de bacterias desnitrificantes que se consideran de mayor
interés en estaciones depuradoras destacan Azoarcus y Aquaspirillum (Thomsen et
al., 2007), Thauera y Zoogloea (Juretschko et al., 2002; Thomsen et al., 2007) y
Rhodocyclus (Thomsen et al., 2007), pertenecientes al phylum Betaproteobacteria. Los
resultados de estos estudios se obtuvieron a partir de muestras procedentes de
plantas de tratamiento de aguas residuales de diferentes orígenes, con diseños y
sistemas de operación diversos. Este hecho sugiere la posibilidad de que las bacterias
desnitrificantes, gracias a su capacidad para desarrollarse ocupando nichos ecológicos
diferentes en función de la fuente de carbono, sean capaces de colonizar ambientes
muy diversos pudiendo llevar a cabo su función desnitrificante (Thomsen et al., 2007).
1.3.2.6.2 Técnicas de caracterización y cuantificación
Actualmente las técnicas utilizadas para la detección y cuantificación de la
diversidad microbiana se dividen en técnicas convencionales de cultivo, técnicas
inmunológicas y técnicas moleculares basadas en el ADN.
A continuación se citan algunas de las más empleadas en la identificación y
cuantificación de poblaciones de microorganismos en sistemas de depuración de
aguas (Seviour y Nielsen, 2010).
Métodos convencionales
Corresponden a técnicas de cultivo convencional y no convencional, análisis
microscópico y Número Más Probable (NMP).
- Microscopía óptica: que puede ser de contraste de fases, de
interferencia, de campo oscuro, de fluorescencia y de luz ultravioleta.
Se emplea a nivel de laboratorio en las estaciones depuradoras y
42
Introducción
aunque en su mayoría no permite realizar la identificación de bacterias,
aporta información valiosa acerca del estado del fango.
- Tinción bacteriana: que permite la diferenciación celular y la
identificación a grandes rasgos. Son muchas las clases de tinciones
disponibles, sin embargo únicamente se emplean determinados tipos en
los sistemas de fangos activados (Jenkins et al., 2004), siendo la tinción
GRAM unas de las más extendidas. También es posible llevar a cabo la
determinación de la viabilidad bacteriana in situ mediante kits, cuya
metodología se basa en las diferencias en la permeabilidad de la
membrana celular bacteriana (Seviour y Nielsen, 2010).
- Técnica del número más probable (NMP) y sembrado selectivo de
placas (Matulewich et al., 1975): es uno de los métodos más extendidos
para la detección y cuantificación de bacterias en sistemas complejos.
Sin embargo, estas técnicas requieren mucho tiempo y a menudo
subestiman el número de bacterias ya que aíslan los microorganismos
de acuerdo a sus necesidades nutricionales, lo que da lugar a sesgos al
favorecer el crecimiento de determinadas especies frente a otras.
Estos procedimientos son lentos y laboriosos puesto que se tiene que aislar el
microorganismo (lo cual no en todos los casos es posible) y permitir su desarrollo en
un medio de cultivo hasta que alcance un tamaño o una etapa de crecimiento
adecuados para su identificación. Además de que en muchos casos no es posible
llevar a cabo la determinación de los tipos de bacterias presentes en una muestra de
manera precisa.
Por este motivo se han desarrollado otros métodos que permiten la identificación
in situ y la cuantificación. Se basan en la especificidad de los anticuerpos y en las
secuencias de ácidos nucleicos, son las llamadas técnicas inmunológicas y técnicas
moleculares.
Métodos inmunológicos
Se han desarrollado técnicas inmunológicas de identificación y cuantificación que
consisten en el uso de anticuerpos marcados con fluorescencia.
Este método es de alta sensibilidad e incluso puede identificar serotipos
específicos. Las células objetivo tienen que ser aisladas primero como cultivos puros y
43
Introducción
los anticuerpos producidos a menudo sólo reconocen unas pocas cepas de una
especie determinada. Posteriormente se desarrollaron los anticuerpos para la
detección de enzimas de amonioxidantes y nitritoxidantes que solucionan los
problemas de los anticuerpos que únicamente reconocen epítopos de la pared celular
(Aamand et al., 1996). Estos nuevos anticuerpos se usaron con éxito en la detección
de bacterias AOB y NOB en muestras ambientales (Bartosch et al., 1999; Fiencke y
Bock, 2004), así como en estudios fisiológicos de enzima clave (Pinck et al., 2001).
Sin embargo, se trata de un método de elevado coste, destructivo, no permite la
visualización de la célula y únicamente permite detectar células individuales en
suspensión.
Otras metodologías que permiten tanto la identificación como la cuantificación de
bacterias son los métodos moleculares basados en ADN y ARN.
Métodos moleculares basados en ADN y ARN
Los métodos moleculares de identificación de microorganismos se basan en el
estudio de las moléculas de ADN y ARN mediante técnicas basadas en la Reacción en
Cadena de la Polimerasa (RCP o PCR, por sus siglas en inglés) y en la hibridación de
ADN.
La PCR permite obtener un elevado número de copias del fragmento a amplificar
a partir de una pequeña concentración de ADN, prescindiendo del cultivo de los
microorganismos. Mediante esta técnica, es posible realizar el análisis de ciertas
regiones de los genes 16S, 23S y 5S del ADN recombinante, usando cebadores que
reconocen la secuencia nucleotídica de las regiones específicas. Generalmente se
emplea el nucleótido 16S rARN (Degrange y Bardin, 1995; McCaig et al., 1999), ya
que contiene zonas que son comunes para microorganismos filogenéticamente
semejantes y se trata de un gen relativamente corto, de aproximadamente 1500pb
(Holzer, 2007; Fukushima y Bond, 2010).
Dentro de las técnicas de hibridación mas utilizadas podemos destacar la técnica
de los Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica (RFLP’s) (Rodríguez-
Herrera et al., 2009). Consiste en extraer ADN de un cultivo puro de un
microorganismo o bien de una muestra y digerir el ADN con enzimas de restricción
(enzimas que cortan el ADN en sitios específicos). Posteriormente estos fragmentos
de ADN son separados en un gel de agarosa utilizando electroforesis. Esta
metodología es muy específica, sin embargo, no es muy rápida ni muy sensible (se
requiere 103 a 106 copias de la molécula o secuencia de interés para dar un resultado
44
Introducción
fiable) y se considera como un método semi-cuantitativo para el análisis de la
diversidad y la dinámica de ecosistemas microbianos.
Otra técnica que se emplea en el campo de la cuantificación e identificación es la
Citometría de Flujo. Consiste en medir las características de dispersión de la luz y la
fluorescencia que poseen las células conforme se las hace pasar a través de un rayo
de luz. Al atravesar el rayo, las células interaccionan con éste causando la dispersión
de la luz.
Basándose en la difracción se puede evaluar el tamaño de las células que pasan
(parámetro Forward Scatter) y al medir la reflexión de la luz de manera lateral se
evalúa la granularidad o complejidad de éstas (parámetro Side Scatter). Además de la
dispersión de la luz, si previamente a su análisis las células se sitúan en presencia de
anticuerpos monoclonales marcados con moléculas fluorescentes, se puede evaluar
que células poseen los antígenos complementarios a los anticuerpos monoclonales
usados, permitiendo el análisis multiparamétrico. Por tanto, esta técnica permite
combinar las medidas de distintos parámetros determinados sobre la misma célula y
relacionarlos. Sin embargo, una de sus más importantes desventajas es que las
células deben encontrarse individualmente en suspensión en un fluido.
Junto con las técnicas citadas hasta ahora, existen otras metodologías como el
estudio de comunidades y su funcionalidad mediante Chips de ADN (del inglés DNA
microarray), que consiste en una superficie sólida a la cual se une una colección de
fragmentos de ADN. Su funcionamiento se basa en la medición del nivel de hibridación
entre la sonda específica y la molécula diana, indicándose generalmente mediante
fluorescencia y analizándose por análisis de imagen.
La Microautoradiografía (MAR) es una técnica que se emplea para ensayos de
viabilidad, cuantificación de bacterias capaces de consumir un sustrato específico,
estudios de actividad autótrofa, toma de ortofosfatos y el uso potencial de diversos
aceptores de electrones por PAO, GAO (Organismos Acumuladores de Glicógeno) y
bacterias filamentosas. Consiste en la visualización mediante una emulsión sensible a
la radiación de un sustrato radiomarcado que es consumido por células individuales
(Seviour y Nielsen, 2010). Esta técnica suele emplearse en combinación con el
método FISH (Fluorescente in situ hybridization), que se desarrolla a continuación en
el siguiente apartado.
1.3.2.6.3 Técnica de hibridación in situ (FISH)
La técnica FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) es una metodología
citogenética utilizada para detectar y localizar la presencia o ausencia de
45
Introducción
determinadas secuencias de ADN o ARN. Mediante el análisis FISH podemos
identificar in situ bacterias que pertenecen a un grupo taxonómico específico (clase,
género, especie, etc.).
Esta técnica utiliza sondas de ADN marcadas con un agente de color
fluorescente (fluorocromo), que se unen a la fracción 16S del rARN de la bacteria,
generando una fluorescencia en las bacterias con la fracción de rARN coincidente
(Amann et al., 1990).
Se basa en la aplicación de los procesos de hibridación que se producen entre
secuencias complementarias de material genético. La doble hélice de ADN se
desnaturaliza mediante la aplicación de una elevada temperatura y al disminuir la
temperatura, las hebras se vuelven a unir por sus bases complementarias. Una
secuencia de ADN se puede unir a otra de ADN o también a una secuencia de ARN
complementaria, produciéndose un híbrido ADN-ADN, o ADN–ARN. De este modo,
una secuencia de ADN o de ARN de cadena simple que es complementaria de la
secuencia de interés (también llamadas sondas), puede utilizarse para identificar con
gran exactitud la presencia de la secuencia en preparaciones de ADN, ARN.
La sonda debe ser lo suficientemente grande como para hibridar específicamente
con su objetivo, pero no tan grande como para impedir el proceso de hibridación.
Para que una sonda sea específica, debe hibridar con su diana, pero no con las
otras cadenas de ácidos nucleicos presentes en la muestra. La especificidad varía con
la extensión de la cadena y las condiciones de hibridación, por lo que es posible
ajustarla a diferentes niveles filogenéticos.
La técnica FISH permite verificar la existencia de una especie determinada de
bacteria en una muestra compleja. Si disponemos de la sonda específica, es posible
identificar la presencia de una bacteria determinada, conocida como bacteria “diana”.
La diana es la cadena de ARN o ADN que se puede detectar utilizando la sonda. Estas
secuencias pueden localizarse en cromosomas, en plásmidos, en mitocondrias y en
ribosomas. Ciertas regiones de los ribosomas se encuentran en todos los seres vivos,
otras son comunes a todas las bacterias, y unas pocas se hallan en los miembros del
mismo género o especie, lo que permite utilizar la estructura ribosómica para
determinar la taxonomía bacteriana.
En las técnicas de hibridación in situ, el ADN de la célula puede ser teñido de
forma independiente del marcaje de la sonda específica. Esto se conoce como
contratinción y tiñe la cantidad total de bacterias presentes en la muestra. De esta
forma, podemos saber la cantidad de bacterias hibridadas respecto a la cantidad total
de bacterias. El compuesto más utilizado es el DAPI (diclorhidrato de 4',6-diamidino-2-
fenilindol), que emite fluorescencia en azul cuando es excitado por luz ultravioleta.
46
Introducción
En cuanto a las sondas, se suelen emplear secuencias de ADN y no de ARN ya
que las primeras son más resistentes a la degradación por nucleasas. Las sondas son
marcadas con fluorocromos como el FITC, rodamina, CY-3, CY-5, que emiten
fluorescencia bajo las condiciones apropiadas de excitación, haciendo posible su
visualización mediante un microscopio de fluorescencia.
47
OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
Objetivos y Plan de Trabajo
El objetivo principal de este trabajo de investigación es el estudio de la
evolución de las poblaciones microbianas en los procesos de eliminación biológica de
materia orgánica y nitrógeno amoniacal presentes en el agua residual bajo condiciones
ambientales estables y variables.
Para alcanzar este objetivo principal se plantean los siguientes objetivos
específicos:
Montaje, puesta en marcha, mantenimiento y monitorización de un
reactor discontinuo (SBR) operado para la eliminación biológica de
materia orgánica y nitrógeno amoniacal de una corriente de agua
residual con concentración típica urbana.
Estudio de la influencia del oxígeno y el pH sobre la actividad y el
desarrollo de los microorganismos involucrados en los procesos de
nitrificación-desnitrificación.
Seguimiento de la evolución de los microorganismos implicados en los
procesos de eliminación de materia orgánica y nitrógeno amoniacal
mediante la aplicación de la técnica molecular de hibridación in situ
FISH.
Para alcanzar los objetivos planteados en este trabajo de investigación se ha
llevado acabo el plan de trabajo que se describe a continuación:
1. Diseño, montaje y puesta en marcha del reactor. Operación y
seguimiento mediante los dispositivos de control y medición, para unas
condiciones de pH y OD fijadas.
2. Mantenimiento del sistema: preparación de alimento artificial,
calibración de sondas y tareas de limpieza.
3. Realización de analíticas físico-químicas de los parámetros necesarios
para el seguimiento de los procesos biológicos.
4. Aplicación de la técnica FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) para el
seguimiento de la evolución de las poblaciones microbianas.
48
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y Métodos
3.1 Descripción del montaje experimental
Los datos experimentales para el estudio del proceso se obtuvieron mediante el
montaje de un reactor secuencial discontinuo (SBR, Sequencing Batch Reactor) a
escala de laboratorio. Para ello se empleó un reactor cilíndrico de metacrilato de
diámetro 30 cm y altura 35 cm con un volumen útil de 7 L. En la Figura 8 se muestra el
montaje experimental.
Figura 8. Fotografía del montaje experimental
En la Figura 9 puede observarse el esquema del montaje experimental. La
línea azul corresponde a los dispositivos que realizaban la toma de datos y la línea
negra indica los elementos que intervenían en el funcionamiento del sistema y que
estaban dirigidos por el software de control implementado en el ordenador.
La monitorización del sistema se realizó en tiempo real mediante sondas de
pH, conductividad, potencial redox, temperatura y oxígeno disuelto (OD). La
información de todas las sondas, excepto la sonda de OD, era transmitida al
ordenador a través de un analizador multiparamétrico (marca Consort C832). El
oxígeno era medido y transmitido por un oxímetro (marca Oxi 340 WTW) y
supervisado desde el ordenador mediante un sistema de control on-off que mantenía
la concentración de OD en niveles previamente establecidos.
49
Materiales y Métodos
50
Figura 9. Esquema del montaje experimental
Los registros de las variables monitorizadas eran almacenados cada 30
segundos para su análisis posterior.
Por otro lado, el llenado y vaciado estaban controlados por el software del
ordenador mediante electroválvulas, bomba peristáltica y sensores de nivel. Una
electroválvula permitía la entrada del agua residual en el reactor mediante la acción de
una bomba peristáltica. La salida del agua clarificada estaba controlada por la acción
de la electroválvula ubicada en la conducción de la corriente efluente. Con el objetivo
de evitar el desbordamiento en caso de fallo del sensor de nivel se instaló una
conducción de salida en el extremo superior del reactor.
El control del tiempo de retención celular estaba automatizado mediante la
programación de los tiempos de apertura y cierre de la electroválvula.
En cuanto a la aireación, se llevaba a cabo mediante una soplante que
suministraba el aire por una conducción central a 4 difusores de piedra porosa
situados en la parte inferior del reactor. Un sistema de control on-off regido por el
ordenador se encargaba de mantener el oxígeno en la etapa de reacción aerobia en
un intervalo de concentración determinado.
La fuente de materia orgánica escogida fue ácido acético (CH3-COOH) ya que
se trata del ácido graso volátil dominante en los sistemas de aguas residuales (Henze
Dosificadores
Amonio Acético
Rebose
Agua residual afluente
Aireación
Baño termostático
Sensor de nivel Sondas: Amarilla: pH Roja: Redox Negra: Conductividad Gris: temperatura
Oxímetro
Registro de datos
Control del proceso
Agitador mecánico
Agua residual efluente.
Purga
Electroválvula
Electroválvula
Materiales y Métodos
et al., 1994; Raunkjær et al., 1995; Buchauer, 1997, Constantine y Fick, 1997; Bernat y
Wojnowska-Baryła, 2007; Khanitchaidecha, et al., 2010) y como fuente de nitrógeno
amoniacal se empleaba cloruro amónico (NH4Cl). La dosificación se llevaba a cabo
tras la etapa de llenado mediante dos dosificadores de alta precisión (marca Liquino
711 Metrohm).
La homogeneización del licor mezcla se realizaba con un agitador mecánico
(marca Heidolph de 50 Hz y 35-2800 rpm). La velocidad de giro estaba controlada por
un regulador de potencia con el objetivo de minimizar la reaireación del reactor.
La temperatura en el reactor se mantuvo a 20ºC y estuvo controlada mediante
la recirculación de agua procedente de un baño termostático (marca Haake).
3.2 Procedimiento experimental
El procedimiento experimental está esquematizado en la Figura 10.
Selección de los parámetros de
operación
Puesta en marcha del reactor
Operación y seguimiento del
proceso
Figura 10. Esquema del procedimiento experimental
En primer lugar se llevó a cabo la selección de los parámetros de operación,
estableciéndose los criterios de funcionamiento. En segundo lugar se procedió a la
puesta en marcha del reactor. Y por último durante la fase de operación y seguimiento
se controló el funcionamiento del sistema mediante la revisión diaria de los valores
aportados por las sondas de monitorización.
Las tareas de mantenimiento y limpieza del reactor y los aireadores así como la
calibración de las sondas y los dosificadores se realizaron una vez por semana.
3.2.1 Parámetros de operación
3.2.1.1 Selección del inóculo y características del agua residual
El inóculo se obtuvo de la EDAR “Conca del Carraixet”, localizada en Alboraia
(Valencia). El esquema de tratamiento de esta planta se basa en la eliminación de
51
Materiales y Métodos
materia orgánica y nutrientes mediante un sistema de fangos activados con
decantación primaria y secundaria.
El agua residual empleada, cuya composición se presenta en la Tabla 9, se
formuló para que simulase las principales características de una corriente de agua
residual urbana (Metcalf and Eddy Inc, 1995).
La fuente de carbono se obtuvo a partir de una disolución concentrada (70000
mg DQO/L) de ácido acético (CH3COOH) y el nitrógeno amoniacal se obtuvo a partir
de una disolución concentrada (21000 mg N/L) de cloruro de amonio (NH4Cl). El
volumen adicionado de ácido acético y nitrógeno amoniacal al inicio de cada etapa de
reacción permitió alcanzar en el licor mezcla una concentración de 210 mg DQO/L y
30 mg N/L, respectivamente.
Tabla 9. Componentes principales en el agua residual.
Compuestos Concentración (mg/L)
CaCl2 2.50 K2HPO4 14.00
MgSO4·7H2O 50.70 NaHCO3 671.56
FeCl3.6H2O 0.029 CuSO4.5H2O 0.060
Na2MoO4.2H2O 0.120 ZnSO4.H2O 0.240 MnCl2.4H2O 0.240
H3BO3 0.300 CoCl2.6H2O 0.300
KI 1.274
Con el objetivo de evitar reacciones bioquímicas en el bidón de
almacenamiento del agua residual, tanto la materia orgánica como el nitrógeno
amoniacal se almacenaban y dosificaban de forma independiente.
3.2.1.2 Etapas de operación del reactor
Las etapas de operación del reactor se establecieron para un total de 4 ciclos
diarios con una duración de 6 horas/ciclo completo. La representación esquemática
puede observarse en la Figura 11.
52
Materiales y Métodos
Afluente
Etapa Vaciado 6 minutos
Etapa Anóxica 105 minutos
Etapa Llenado
6 minutos Efluente
Ciclo 6 horas
Etapa Aerobia
210 minutos Etapa Decantación
33 minutos
Figura 11. Secuencia y duración de las 5 etapas de trabajo del reactor SBR
El inicio del ciclo tenía lugar durante la etapa de llenado. Se trabajó mediante
un sistema de llenado con mezcla según el cual el reactor se llenaba con el agua
residual a tratar mediante un bombeo uniforme mientras que el sistema de agitación
aseguraba una buena homogeneización con el fin de establecer un óptimo contacto
entre los microorganismos y el sustrato existente. El tiempo establecido para realizar
esta etapa fue de 6 minutos, asegurando que se alcanzase el volumen útil del reactor
(7 litros).
A continuación tenía lugar la etapa de reacción con una duración total de 315
minutos. Esta etapa estaba compuesta por dos fases: la fase anóxica que tenía una
duración total de 105 minutos y en la que el sistema de aireación estaba desactivado y
se mantenía la homogenización del licor mezcla, y la fase aerobia en la que la
aireación entraba en funcionamiento. Del tiempo total de reacción, un 35%
correspondió a la etapa anóxica y un 65% a la etapa aerobia.
53
Materiales y Métodos
A continuación comenzaba la etapa de decantación, cuya duración se
estableció en 33 minutos, y finalmente la etapa de vaciado del agua clarificada
durante 6 minutos.
3.2.1.3 Parámetros de funcionamiento
Para la realización de los cálculos de los parámetros de funcionamiento se
fijaron el tiempo de retención hidráulico (TRH) y el tiempo de retención celular (TRC):
- Tiempo de retención hidráulico: se estableció en 18 horas.
- Tiempo de retención celular: se estableció en 14 días para asegurar el
proceso de nitrificación teniendo en cuenta que la temperatura de
trabajo fue de 20ºC (Gerardi, 2002).
Tabla 10. Temperatura y TRC sugerido para la nitrificación
Temperatura Tiempo de retención celular
10 ºC 30 días 15 ºC 20 días 20 ºC 15 días 25 ºC 10 días 30 ºC 7 días
Fuente: Gerardi (2002)
Los cálculos realizados fueron los siguientes:
Caudal purga A partir del tiempo de retención celular se determinó el caudal purga:
reacciónpurga
reactorreacción
SSTpurgapurga
reactorSSTreactor tQV
tCQCV
TRC ×=×××
= Ecuación 17
Donde:
CSST reactor= Concentración de sólidos suspendidos totales en el reactor SBR
Qpurga= Caudal de purga
CSST purga= Concentración de sólidos suspendidos totales en la purga
Y puesto que la concentración de sólidos suspendidos en el reactor y en el
caudal de purga son iguales ya que la purga se realiza cuando el sistema está
54
Materiales y Métodos
homogeneizado minutos antes de la finalización de la etapa de reacción, la
aplicación de la ecuación resulta en:
( )
horasdíacicloshorashoras
QLdías aerobioanóxico tt
purga 24/45.375.1714
×+×=
Qpurga = 0.4375 L/día = 0.1094 L/ciclo
Determinación del caudal afluente
A partir del valor del tiempo de retención hidráulico se determinó el caudal
afluente diario, teniendo en cuenta el tiempo real de reacción en el que los
microorganismos realizan el proceso nitrificación-desnitrificación (etapa aerobia y
etapa anóxica). En base a esta premisa y a partir de la ecuación 18, el caudal afluente
obtenido fue el siguiente.
reacciónAfluente
reactor tQV
TRH ×= Ecuación 18
( )dL
horasdcicloshorashoras
horasdhoras
LQ aerobioanóxico ttAfluente /8
24/45.375.1
24118
7=
×+×=
3.2.2 Puesta en marcha del reactor
Una vez establecidos los parámetros de operación y realizado el montaje se
puso en funcionamiento el reactor.
En los días posteriores a la puesta en marcha se controló el proceso para
asegurar que funcionase correctamente. Para ello se llevaron a cabo analíticas de
amonio, nitrito y nitrato que permitieron confirmar el desarrollo de los procesos de
nitrificación y desnitrificación y la idoneidad del agua residual formulada así como de la
materia orgánica empleada.
3.2.3 Operación y seguimiento del proceso
A continuación se describen los procedimientos empleados para las
determinaciones físico-químicas y microbianas llevadas a cabo para el seguimiento del
funcionamiento reactor y de la evolución de las poblaciones bacterianas.
55
Materiales y Métodos
3.2.3.1 Analíticas físico-químicas
Los parámetros estudiados y la frecuencia en la toma de muestras y análisis se
presentan en la Tabla 11.
Tabla 11. Frecuencia de muestreo y análisis de los parámetros físico-químicos.
Parámetro Frecuencia
Sólidos suspendidos totales (SST)
Sólidos suspendidos volátiles (SSV) 1 vez por semana
DQO (ácido acético) Alcalinidad
Fósforo Amonio Nitrito Nitrato
2 ó 3 veces por semana
Las determinaciones analíticas se llevaron a cabo empleando las técnicas que
se describen a continuación.
3.2.3.1.1 Sólidos suspendidos totales y sólidos suspendidos volátiles
Las concentraciones de sólidos suspendidos totales y volátiles se obtuvieron
siguiendo la metodología del Standard Methods for the examination of water &
wastewater (APHA, AWWA & WEF, 2005):
1. Se toma una cápsula de porcelana a temperatura ambiente del
desecador y se pesa en la balanza analítica junto con un filtro de
tamaño de poro 0.45μm. (P1)
2. Se obtiene un volumen del licor mezcla que se pasa a través del filtro.
Para agilizar el proceso de filtración se emplea una bomba de vacío.
3. El filtro con los sólidos retenidos se coloca en la cápsula de porcelana y
se introduce en estufa a una temperatura de 105ºC hasta alcanzar peso
constante (eliminación total de la humedad).
4. Tras enfriarse en el desecador, se pesa el conjunto filtro más sólidos
retenidos. (P2)
5. A continuación, se coloca en la mufla a 550ºC durante 1 hora.
6. Una vez transcurrida 1 hora, se extrae la cápsula y se añade carbonato
amónico (CH5NO3) hasta cubrir totalmente el filtro.
56
Materiales y Métodos
57
7. Se introduce de nuevo en la estufa a 105 ºC durante 1 hora.
8. Finalmente, la cápsula con la muestra calcinada se pasa a un
desecador y una vez a temperatura ambiente, se obtiene un nuevo
peso. (P3)
El valor de los sólidos suspendidos totales se obtiene mediante la siguiente
fórmula:
SST muestraVolumenPP 12 −= Ecuación 19
Los sólidos restantes tras el proceso de calcinación corresponden a los sólidos
suspendidos no volátiles (ecuación 20) y la diferencia entre estos y los sólidos totales
da como resultado los sólidos suspendidos volátiles.
3.2.3.1.2 Ácido acético y alcalinidad
El equipo empleado para llevar a cabo este análisis fue un titrador marca 716
DMS Titrino de la firma comercial Metrohm. Este dispositivo emplea el método de
valoración ácido-base propuesto por Moosbrugger et al., (1992, 1993) para la
determinación de los siguientes parámetros:
- Sa: ácidos grasos volátiles considerados como ácido acético (mg/L)
- CT: concentración total de carbonato: [H2CO3] + [HCO3¯] + [CO3
2¯]
(mol/L)
El método consiste en la realización de una valoración mediante un ácido, en
este caso ácido clorhídrico (HCl) 0.1N, hasta alcanzar los puntos de pH seleccionados,
que son: 6.7, 5.9, 5.2 y 4.3.
Una vez se dispone de los volúmenes de ácido que han sido necesarios para
alcanzar los valores de pH, es posible examinar la influencia de concentraciones
conocidas de otros ácidos y bases (además del carbonato y los ácidos volátiles).
Para ello, se introducen los siguientes parámetros en un software desarrollado
por el grupo de trabajo denominado VALORA:
Ecuación 20SSNV muestraVolumenPP 13 −=
Materiales y Métodos
- Temperatura, (ºC)
- Conductividad, (mS/m)
- pH inicial
- Volúmenes empleados de ácido, (mL)
- Concentración de amonio, (mg/L)
- Concentración de fosfato inorgánico, (mg/L)
- Concentración de sulfuro, (mg/L)
Además del análisis de los ácidos grasos volátiles, este procedimiento permite
la determinación de la alcalinidad asociada al carbonato, que viene expresada como
carbonato de calcio (CaCO3).
3.2.3.1.3 Amonio, nitrito, nitrato y fósforo
Las concentraciones de amonio (NH4+), nitrito (NO2
-), nitrato (NO3-) y ortofosfato
(PO43-) fueron determinadas mediante la utilización de un analizador multiparámetro
selectivo espectrofotométrico, SmartchemTM200 de la casa Metrohm.
Este analizador se basa en métodos colorimétricos siguiendo los
procedimientos establecidos en el Standard Methods for the Examination of Water &
Wastewater (2005).
Las muestras son previamente filtradas y colocadas en las cubetas de análisis.
Una vez introducidos los protocolos de análisis de cada muestra, el brazo robótico
succiona un volumen del orden de microlitros de muestra y de reactivos, mezclándolos
en una cubeta individual para obtener los resultados del análisis colorimétrico.
Finalmente toma una lectura directa en la cubeta a la longitud de onda
correspondiente. A continuación, realiza una prueba de calidad midiendo una
concentración conocida con el objetivo de asegurar la fiabilidad del análisis.
3.2.3.2 Analíticas microbianas
La toma de muestras para las determinaciones microbianas se llevó a cabo una
vez por semana en función de las condiciones del reactor.
Las muestras eran preparadas mediante un proceso de fijación para determinar
posteriormente la población bacteriana existente mediante la técnica de Hibridación
Fluorescente In Situ o FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) por sus siglas en inglés
Este procedimiento permitió llevar a cabo un seguimiento del estado de las
poblaciones de las bacterias amonioxidantes (AOB), nitritoxidantes (NOB) y
58
Materiales y Métodos
59
desnitrificantes y su evolución a lo largo de las diferentes fases del periodo
experimental.
3.2.3.2.1 Técnica de Hibridación In Situ FISH
La técnica FISH (Fluorescent In Situ Hybridisation) consiste en la hibridación de
una sonda con una parte específica del 16S RNA bacteriano (Wagner et al., 1995). La
sonda se elabora mediante la síntesis química de nucleótidos y se marca con un
agente de color fluorescente (fluorocromo). Las bacterias de un grupo taxonómico
específico (especie, género o clase entre otros), al ser hibridadas con una sonda
específica, pueden ser identificadas empleando un microscopio de fluorescencia.
et al., 1995). La
sonda se elabora mediante la síntesis química de nucleótidos y se marca con un
agente de color fluorescente (fluorocromo). Las bacterias de un grupo taxonómico
específico (especie, género o clase entre otros), al ser hibridadas con una sonda
específica, pueden ser identificadas empleando un microscopio de fluorescencia.
En las Figuras 12, 13 y 14 se pueden ver las principales sondas disponibles para
la detección de bacterias amonioxidantes, nitritoxidantes y desnitrificantes
respectivamente, así como los rangos de cobertura. En azul se han destacado las
sondas empleadas en el presente trabajo de investigación.
En las Figuras 12, 13 y 14 se pueden ver las principales sondas disponibles para
la detección de bacterias amonioxidantes, nitritoxidantes y desnitrificantes
respectivamente, así como los rangos de cobertura. En azul se han destacado las
sondas empleadas en el presente trabajo de investigación.
Figura 12. Árbol filogenético basado en el 16S rARN de los principales linajes de bacterias amonioxidantes. Se ha destacado en azul las sondas empleadas en el presente
trabajo de investigación. Los paréntesis indican la cobertura de las sondas. (Nielsen et al., 2009)
Figura 12. Árbol filogenético basado en el 16S rARN de los principales linajes de bacterias amonioxidantes. Se ha destacado en azul las sondas empleadas en el presente
trabajo de investigación. Los paréntesis indican la cobertura de las sondas. (Nielsen et al., 2009)
Nse
1472
Materiales y Métodos
Figura 13. Árbol filogenético basado en el 16S-rARN de los principales linajes de bacterias nitritoxidantes. Los paréntesis indican la cobertura de las sondas.
(Nielsen et al., 2009)
60
Materiales y Métodos
Figura 14. Árbol filogenético basado en el 16S-rARN de los principales linajes de bacterias desnitrificantes. Los paréntesis indican la cobertura de las sondas.
(Nielsen et al., 2009)
61
Materiales y Métodos
En la Tabla 12 se detallan las sondas empleadas en este estudio, así como
algunos datos de interés (secuencia de nucleótidos, bacterial señal y referencia donde
ha sido descrita la sonda).
Tabla 12. Sondas de hibridación empleadas en la identificación micriobiológica.
Sonda Secuencia (5’-3’) Organismo Referencia
Bacterias totales (Dominio Eubacteria)
EUB338 I * GCT GCC TCC CGT AGG AGT Amman et al., (1990)
EUB338 II GCA GCC ACC CGT AGG TGT Planctomycetales Daims et al., (1999)
EUB338 III GCT GCC ACC CGT AGG TGT Verrucomicrobiales Daims et al., (1999)
Bacterias Amonioxidantes
NSO1225 LNA CGC CAT TGT ATT ACG TGT GA Betaproteobacterial AOB Mobarry et al.,
(1996)
NEU CCC CTC TGC TGC ACT CTA Nitrosomonas spp. Wagner et al., (1995)
Competidora
NEU : CTE TTC CAT CCC CCT CTG CCG
Comamonas spp., Acidovorax spp.,
Hydrogenophaga spp., Aquaspirillum spp.
Brachymonas denitrificans, Rhodocyclus purpureus y
Leptothrix discophora
Schleifer et aI., (1992)
Nsv443 CCG TGA CCG TTT CGT TCC G Nitrosospira spp. Mobarry et al., (1996)
Nmo218 CGG CCG CTC CAA AAG CAT Nitrosomonas oligotropha-lineage
Gieseke et al., (2001)
Nse1472 ACC CCA GTC ATG ACC CCC Nitrosomonas europea,
N. halophila, N. eutropha, Kraftisried-Isolat
Juretschko et al., (1998)
Nmv TCC TCA GAG ACT ACG CGG Nitrosococcus mobilis (“Nitrosomonas”) lineage
Juretschko et al., (1998)
Bacterias Nitritoxidantes
Ntspa712 CGT CTT CGC CAC CGG CCT TCC Mayoría phylum Nitrospirae Daims et al., (2001)
Competidora Ntspa712 CGT CTT CGC CAC CGG TCT TCC Desulfovibrio.desulfuricans Daims et al.,
(2001)
NIT3 CCT GTG CTC CAT GCT CCG Nitrobacter spp. Wagner et al., (1996)
Competidora NIT3 : CNIT3 CCT GTG CTC CAG GCT CCG Competidora Wagner et al.,
(1996)
Bacterias Desnitrificantes
DEN67 CAA GCA CCC GCG CTG CCG Grupo desnitrificantes a partir de methanol
Ginige et al., (2005)
AT1458 GAA TCT CAC CGT GGT AAG CGC Grupo Azoarcus-Thauera-Castellaniella
Rabus et al., (1999)
PAR651 ACC TCT CTC GAA CTC CAG Género Paracoccus Neef et al., (1996)
* A partir de las las tres sondas EUB338 (I, II y III) se obtuvo una sonda denominada EUBmix.
62
Materiales y Métodos
A continuación se describen los procedimientos para la identificación
microbiana mediante la técnica FISH (Alonso, 2003):
I. Preparación de los portaobjetos: 1. Se preparan los portaobjetos, que en este caso son de 10 celdas, 8
mm de diámetro y están impresos con una capa de teflón.
2. Se lavan en una solución jabonosa de agua desionizada.
3. Se enjuagan con agua desionizada.
4. El secado se lleva a cabo a temperatura ambiente y con medidas de
protección para evitar que se depositen impurezas en la superficie de
los portaobjetos (24 horas).
5. Se prepara una solución de inmersión, compuesta por 100 mL de
agua destilada a una temperatura de 60ºC en los que se disuelven 0.1
gramos de gelatina y 0.01 gramos de KCr(SO4)2·12H2O. Una vez
obtenida la solución, se enfría a 50ºC y los portas se sumergen
durante 5 segundos.
6. Se dejan secar al aire, nuevamente protegidos.
7. Una vez secos están ya preparados para su almacenaje y posterior
utilización.
II. Procedimiento de fijación de muestras: Bacterias GRAM negativas 1. Se extrae 1 mL de biomasa de la muestra, se vierte a un tubo de
microcentrífuga y se centrifuga a 5000 rpm durante 3 minutos.
2. Se retiran 750 μL de sobrenadante.
3. Se añaden 3 volúmenes de paraformaldehído (PFA) (750 μL) por 1
volumen de muestra (250 μL) y se mantienen a 4ºC durante 1 hora.
4. Se centrifuga a 5000 rpm durante 3 minutos y se retira el
sobrenadante.
5. Se añaden 900 μL de tampón fosfatos salino (PBS) 1X, se
resuspende y se centrifuga a 5000 rpm durante 3 minutos. Se repite
este paso 3 veces.
6. Se retira todo el PBS 1X y se añaden dos soluciones: 700 μL de
etanol frío (4ºC) y 300 μL de PBS 1X y se homogeneiza.
7. Se almacena a 4ºC.
8. La concentración final de biomasa es de entre 108 y 109 células/mL.
9. Las muestras se guardan a -20 ºC.
63
Materiales y Métodos
Protocolo para la obtención de las soluciones de paraformaldehído (PFA) y
tampón fosfatos salino (PBS):
PFA:
- Se calientan 65 mL de agua mili-Q a 60ºC. - Se añaden 4 g de paraformaldehido. - Se añade una gota de solución NaOH y se agita con rapidez hasta que
la solución se ha clarificado (entre 1 y 2 minutos). - Se quita de la fuente de calor y se añaden 33 mL de PBS 3X. - Se ajusta el pH a 7.2 con ácido clorhídrico (HCl). - En caso de que se produzcan cristales, es importante eliminarlos
mediante un procedimiento de filtración estéril a través un filtro de 0.2
μm. - Se enfría rápidamente y se almacena a 4ºC.
PBS 1X:
- Se disuelven 257.9 gramos de Na2HPO4·12H2O y 43.7 gramos de
NaH2PO4·2H2O en 1000 mL de agua destilada. Después se disuelven
en esta solución 754 gramos de NaCl. Se ajusta a pH 7.2.
- Para obtener PBS 3X, se prepara una dilución 1 en 30 a partir del PBS
1X y agua destilada (1 PBS 3X+ 29 agua destilada).
- Se esteriliza mediante autoclave.
Previamente a la hibridación de las muestras es importante su identificación en
función de la numeración y del porcentaje de formamida para asegurar la correcta
hibridación posterior, ya que cada sonda requiere una concentración de formamida
determinada para el proceso de hibridación.
A continuación se hace la selección de las sondas para posteriormente pasar a
la fijación de las muestras y posterior hibridación.
III. Aplicación de las muestras en los portaobjetos: 1. Se pone un volumen de 6 μL de muestra en los pocillos del
portaobjetos.
2. Se seca en estufa a 55 ºC.
3. Se realiza la deshidratación de las muestras de los portaobjetos
mediante la inmersión progresiva en tres tubos Falcon que contienen
64
Materiales y Métodos
soluciones de etanol (CH3CH2OH) de concentración creciente: 50% -
80% - 98%, dejando transcurrir un tiempo de 3 minutos para cada
inmersión.
4. Tras la deshidratación y el secado al aire, las muestras están listas
para ser hibridadas.
Protocolo para la obtención de las soluciones de alcohol:
Etanol 50%:
- Se disuelven 100 mL de etanol en 100 mL de agua destilada
- Se conserva en tubos Falcon a temperatura ambiente.
Etanol 80%:
- Se disuelven 160 mL de etanol en 40 mL de agua destilada
- Se conserva en tubos Falcon a temperatura ambiente.
Etanol 98%:
- Reactivo etanol absoluto grado PRS.
- Se conserva en tubos Falcon a temperatura ambiente.
IV. Procedimiento de hibridación: 1. Se ponen 8 μL de la solución de hibridación (ver Tabla 13) en cada
pocillo con muestra.
2. Las sondas han sido previamente atemperadas y mantenidas en
oscuridad. Se vierte 1μL de sonda general EUBmix y 1 μL de la sonda
específica sobre la muestra en cada pocillo.
3. Se introduce un papel de celulosa en un tubo Falcon de 50 mL de
forma que cubra el 50% de las paredes del tubo.
4. La solución de hibridación restante se vierte en el tubo Falcon para
humedecer el papel de celulosa y crear una cámara de hibridación.
5. El portaobjetos con las muestras hibridadas se introduce dentro del
tubo Falcon, manteniendo siempre la posición horizontal.
6. Se mantiene en estufa a 46ºC entre 1 y 2 horas.
7. Se prepara 50 ml de la solución de lavado (ver Tabla 14) en un tubo
Falcon, se recubre con un film protector para evitar que la luz
ambiente pueda dañar las sondas y se calienta en un baño térmico a
48ºC durante el tiempo necesario para la hibridación.
65
Materiales y Métodos
8. Se saca el tubo Falcon que contiene el portaobjetos de la estufa. Se
extrae el portaobjetos y se introduce en el tubo que contiene la
solución de lavado y se mantiene en el baño durante 15 minutos.
9. Se extrae el portaobjetos y se lava con agua mili-Q enfriada.
10. Se seca al aire en oscuridad.
11. Se almacena a −20ºC en oscuridad.
En este punto la muestra ya está preparada para ser observada al microscopio
de epifluorescencia
Protocolo para la preparación de los reactivos necesarios para la obtención de
las soluciones de hibridación y de lavado. En las Tablas 13 y 14 se indican los
volúmenes correspondientes en función del porcentaje de formamida:
Solución de hibridación:
- 360 μL de Cloruro Sódico 5M (NaCl)
• Disolución patrón: 292.2 g de cloruro sódico en 1000 mL de agua
destilada.
• Disolución 5M: 800 mL de NaCl y ajustar hasta 1000 mL.
• Se esteriliza en autoclave a 121ºC durante 15 minutos y
posteriormente filtrar.
- 40 μL de HCl-Tris
• Se pesan 121.1 gramos de Tris y se disuelven en 800 mL de agua
destilada. Se añaden 42 mL de HCl concentrado y ajusta hasta
1000 mL con agua destilada.
• Se esteriliza en autoclave a 121ºC durante 15 minutos y
posteriormente filtrar.
- x μL de formamida
- y μL de agua Mili-Q
• Se esteriliza en autoclave a 121ºC durante 15 minutos y
posteriormente se filtran 200 mL de agua Mili-Q.
- 2 μL de SDS 10%
• Se pesan 121.1 gramos de SDS y se disuelven en 100 mL de
agua destilada.
• Se esteriliza en autoclave a 121ºC durante 15 minutos y
posteriormente filtrar.
66
Materiales y Métodos
Solución de lavado:
- x μL de Cloruro Sódico 5M (NaCl)
- 1 mL de HCl-Tris
- y μL de EDTA 0.5M
- 50 μL de SDS 10%
- Agua Mili-Q hasta ajustar a 50 mL
Tabla 13. Volúmenes de reactivos en función del porcentaje de formamida para la preparación de la solución de hibridación
Formamida (%) Reactivos
(μL) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Formamida 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Agua Mili-Q 1498 1398 1298 1198 1098 998 898 798 698 598
NaCl 5M 360 360 360 360 360 360 360 360 360 360
HCl-Tris 1M 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40
SDS 10% 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Tabla 14. Volúmenes de reactivos en función del porcentaje de formamida para la preparación de la solución de lavado.
Formamida (%) Reactivos
(μL) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
NaCl 5M 6300 4500 3180 2150 1490 1020 700 460 300 180
HCl-Tris 1M 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
EDTA --- --- --- 500 500 500 500 500 500 500
SDS 10% 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
Agua Mili-Q 42650 44450 45770 46300 46960 47430 47750 47990 48150 48270
V. Observación al microscopio: 1. Se sacan los portaobjetos almacenados a -20ºC para que alcancen la
temperatura ambiente manteniéndolos en oscuridad.
2. Se añade una pequeña cantidad de aceite de montaje en la esquina
de cada pocillo y se recubre con un cubreobjetos eliminado el exceso
de aceite.
67
Materiales y Métodos
3. Se observa al microscopio de epifluorescencia empleando los filtros
adecuados según los fluorocromos utilizados.
4. Una vez enfocada la muestra, se toman 20 parejas de fotografías (40
en total). 20 con el filtro de la sonda general EUBmix y 20 con el filtro
de la sonda de la bacteria diana, manteniendo el mismo campo en
ambas fotografías.
La técnica de análisis microbiológico empleada permite tanto la identificación
de los grupos de bacterias, como la obtención de datos cuantitativos.
Se ha utilizado un microscopio de fluorescencia DM2500 dotado de una
cámara digital Leica DFC420c para la identificación y captura de imágenes. La
visualización de las muestras se realizó con un objetivo de 63x (Leica63x/0.80 N
PLAN).
La cuantificación bacteriana se ha realizado siguiendo la metodología
desarrollada por Borrás (2008).
La técnica establece la captura de imágenes de entre 20 y 40 campos que
sean representativos de la muestra hibridada. Posteriormente, las imágenes son
introducidas en un software de cuantificación, que devuelve un informe detallado de
los porcentajes de área ocupados por las bacterias presentes en la muestra hibridada.
Este programa trabaja con las imágenes tomadas bajo el microscopio de
epifluorescencia en términos de áreas, comparando la superficie ocupada por el total
de bacterias presentes en el campo (sonda EUBmix) y el área ocupada por las
bacterias que han sido hibridadas con la sonda específica.
El resultado final es un número que representa el porcentaje en área de una
especie bacteriana en la muestra, acompañado de su error estándar, calculado como
la desviación estándar dividida por la raíz cuadrada del número de campos analizados.
68
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Resultados y Discusión
69
4.1 Puesta en marcha
Al inicio de la puesta en marcha se llevaron a cabo analíticas físico-químicas
para confirmar la adaptación de la biomasa a las nuevas condiciones de operación. En
la Figura 15 se puede observar como durante la primera semana la concentración de
sólidos suspendidos totales se fue reduciendo de forma progresiva pasando de un
valor medio en torno a 2750 mg SST/L a aproximadamente 2000 mg SST/L.
El ratio SST/SSV se mantuvo estable y los sólidos suspendidos no volátiles se
mantuvieron en un valor en torno a 500 mg SSNV/L.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Con
cent
raci
ón d
e só
lidos
sus
pend
idos
(mg/
L)
SST SSV SSNV
T (días)
Figura 15. Evolución de la concentración de sólidos suspendidos en el licor mezcla al final de la etapa de reacción durante la primera semana del periodo experimental
En las Figuras 16 y 17 vienen representadas la evolución de los compuestos
nitrogenados y la materia orgánica respectivamente, medidos al final de la fase de
reacción durante la primera semana.
Tal y como se puede observar en la Figura 16 los organismos presentes fueron
capaces de llevar a cabo el proceso de nitrificación adecuadamente.
Asimismo, en la Figura 17 se puede observar que la materia orgánica
adicionada fue consumida prácticamente en su totalidad, por lo que el proceso de
desnitrificación se estaba produciendo correctamente.
Resultados y Discusión
70
0
4
8
12
16
20
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Con
cent
raci
ón d
e co
mpu
esto
s ni
troge
nado
s (m
g N
/L)
Título del gráfico
1
AMONIO EFLUENTE NITRITO EFLUENTE NITRATO EFLUENTE
T (días)
Figura 16. Evolución de la concentración de amonio, nitrito y nitrato en el licor mezcla al final de la etapa de reacción durante la primera semana del periodo experimental
0
2
4
6
8
10
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Con
cent
raci
ón d
e ac
étic
o en
el e
fluen
te (m
g D
QO
/L)
1
MATERIA ORGÁNICA EFLUENTE (ÁCIDO ACÉTICO)
T (días)
Figura 17. Evolución de la concentración de ácido acético durante la primera semana del período experimental al final de la etapa de reacción
En la Tabla 15 se muestran los resultados obtenidos en el estudio
microbiológico llevado a cabo sobre el inóculo. Como se observa, la práctica totalidad
de bacterias amonioxidantes estaba formada por organismos de la especie
Nitrosomonas oligotropha-lineage. En cuanto a las bacterias nitritoxidantes no se
detectaron microorganismos del género Nitrobacter pero si del género Nitrospira,
acerca del cual numerosos autores citan en investigaciones de los últimos años como
Resultados y Discusión
el de mayor abundancia en estaciones de depuración de aguas residuales (Wagner et
al., 1996; Princic et al., 1998; Juretschko et al., 1998; Schramm et al., 1998; Okabe et
al., 1999; Daims et al., 2000; Nogueira et al., 2002; Konrad et al., 2003, Carvalho et al.,
2006). Respecto a las bacterias desnitrificantes, con las sondas disponibles se han
identificado en el inóculo microorganismos de los géneros Azoarcus, Thauera,
Castellaniella, y Paracoccus en menor proporción.
Tabla 15. Porcentajes de bacterias amonioxidantes, nitritoxidantes y desnitrificantes en relación con la sonda EUBmix (dominio Eubacteria) en el inóculo empleado para sembrar el reactor SBR
AMONIOXIDANTES NITRITOXIDANTES DESNITRIFICANTES
Am
onio
xida
ntes
Nitr
osom
onas
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ropa
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N. e
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N
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Nitr
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osom
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N
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Nitr
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Nitr
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May
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A
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Thau
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Gén
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NEU
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8
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443
NIT
3
Nts
pa71
2
DEN
67
AT14
58
PAR
651
(%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
8 ± 2 0.2 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 7 ± 2 0 ± 0 0 ± 0 10 ± 3 0 ± 0 11 ± 2 3 ± 1
4.2 Seguimiento del proceso
Una vez transcurrido el periodo de puesta en marcha del reactor se pasó a
estudiar la evolución del sistema a lo largo 176 días de experimentación. Durante ese
tiempo el reactor SBR se mantuvo en funcionamiento alternando condiciones anóxicas
y aerobias con el objetivo de que los procesos de desnitrificación y nitrificación
ocurrieran de forma completa.
Para clarificar la evolución del sistema, el periodo de experimentación fue
dividido en 4 fases en base a modificaciones llevadas a cabo en dos parámetros, el pH
y la concentración de oxígeno disuelto (OD).
- Fase I: Incluye la puesta en marcha del sistema. Durante esta fase el sistema
fue operado con un pH de inicio de ciclo de 6.5 y una concentración de OD
de 2.5 mg O2/L.
71
Resultados y Discusión
- Fase II: Inicio de fase con una limitación puntual de oxígeno que tuvo una
duración de 12 horas. Se mantuvieron constantes tanto la concentración de
pH como el OD.
- Fase III: Inóculo de 2 L compuesto principalmente por bacterias heterótrofas
facultativas y una fracción de bacterias autótrofas amonioxidantes y
nitritoxidantes. Al inicio de esta fase se incrementó el oxígeno disuelto de 2.5
mg O2/L a 3.5 mg O2/L, y se mantuvo el pH al inicio de ciclo en 6.5.
- Fase IV: La concentración de oxígeno disuelto se mantuvo en 3.5 mg O2/L y
se incrementó el pH de 6.5 a 7.5.
4.2.1 Evolución de los parámetros físico-químicos
En la Figura 18 se presentan las concentraciones de sólidos suspendidos
totales (SST), sólidos suspendidos volátiles (SSV) y sólidos suspendidos no volátiles
(SSNV) a lo largo del periodo experimental. Se puede observar como la concentración
de sólidos suspendidos totales experimentó un descenso cercano al 70% durante los
25 primeros días de experimentación, pasando de un valor en torno a 2700 mg SST/L
de sólidos suspendidos en el fango activo original, a oscilar en torno a valores de 700
a 1000 mg SST/L. Esta concentración se mantuvo a lo largo de todo el periodo
experimental.
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
2500
2750
3000
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170
Con
cent
raci
ón d
e só
lidos
sus
pend
idos
(mg/
L)
SST SSV SSNV
T (días)
FASE I FASE II FASE III FASE IV
OD
Resiembra
OD 2.5 mg O2/L OD 3.5 mg O2/L
pHinicio ciclo 6.5 pHinicio ciclo 7.5
Figura 18. Evolución de la concentración de sólidos suspendidos en el licor mezcla al final de la etapa de reacción
72
Resultados y Discusión
Este hecho se debió al lavado de parte de la biomasa al reducir la carga de
carbono orgánico respecto a la concentración en el fango activado original y a que el
agua residual empleada como afluente no contenía sólidos suspendidos. No obstante,
aunque la concentración de SST en el reactor fue inferior a los valores de un reactor
SBR a escala industrial, que oscilan entre 2000 mg/L y 4000 mg/L, la biomasa
presente fue capaz de llevar a cabo la nitrificación desde los primeros días de
experimentación.
En cuanto a la concentración de sólidos suspendidos volátiles, a medida que la
biomasa se fue adaptando a las nuevas condiciones de operación, el porcentaje de
SSV respecto a los SST fue en aumento, alcanzando un valor cercano al 90% que se
mantuvo estable a lo largo de todo el periodo experimental. El incremento observado
en la concentración de SSV indica la capacidad de las poblaciones microbianas para
adaptarse a las nuevas condiciones de operación.
En la Figura 19 se presenta la evolución de la concentración de materia
orgánica (ácido acético) en el licor mezcla medida en la fase final de la etapa de
reacción a lo largo del periodo experimental. Se observa como la concentración de
ácido acético permaneció en la corriente efluente en valores inferiores a 10 mg DQO/L,
lo cual supone un porcentaje de eliminación de materia orgánica del orden del 95.2%.
Este hecho indica que no se produjo limitación por sustrato.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170
Con
cent
raci
ón d
e ác
ido
acét
ico
(mg
DQ
O/L
)
MATERIA ORGÁNICA (ÁCIDO ACÉTICO)
T (días)
FASE II FASE III FASE IVFASE I
OD 2.5 mg O2/L OD 3.5 mg O2/L
pHinicio ciclo 7.5 pHinicio ciclo 6.5
Figura 19. Evolución de la concentración de materia orgánica (ácido acético) en el licor mezcla al final de la etapa de reacción
73
Resultados y Discusión
Sin embargo, aunque el porcentaje de eliminación de materia orgánica como
ácido acético fue elevado, a partir del día 110 se observó una ligera acumulación que
se mantuvo hasta el final del periodo experimental.
En la Figura 20 se presenta la evolución de los compuestos nitrogenados
(amonio, nitrito y nitrato) en el licor mezcla en la fase final de la etapa de reacción a lo
largo del periodo experimental. Durante los 25 primeros días de operación se alcanzó
la nitrificación completa ya que la concentración de nitrato al final de la etapa de
reacción se mantuvo en torno a 8 mg N-NO3/L mientras que la concentración de nitrito
fue prácticamente despreciable durante este periodo de operación. Este hecho indica
que en el licor mezcla se desarrolló una población de bacterias amonioxidantes y
nitritoxidantes adecuada.
Figura 20. Evolución de la concentración de los compuestos nitrogenados (amonio, nitrito y nitrato) en el licor mezcla en el licor mezcla al final de la fase aerobia de la etapa
de reacción
Sin embargo a partir del día 43 comenzó a incrementarse la concentración de
nitrito en el licor mezcla hasta alcanzar el día 77 un valor de 5 mg N-NO2/L. Este hecho
fue indicativo de que la población de bacterias NOB estaba viéndose afectada,
posiblemente debido a la limitación previa de oxígeno disuelto en el licor mezcla
74
Resultados y Discusión
durante 12 horas. Con el objetivo de recuperar la actividad de las bacterias
nitritoxidantes se llevó a cabo una resiembra de 2 L de fango activo el día 83, lo cual
dio lugar a que el proceso de nitrificación se recuperase. Sin embargo 14 días después
de la resiembra se produjo de nuevo la acumulación de nitrito, que se mantuvo hasta
el final del periodo experimental alcanzando un valor máximo de en torno a 7 mg N-
NO2/L.
El incremento de la concentración de nitrito a partir del día 110 coincide con la
ligera acumulación de ácido acético observada (Figura 19) y puesto que en el proceso
de desnitrificación a partir de nitrito la toma de carbono orgánico es menor que en el
proceso de desnitrificación a partir de nitrato (Ciudad, 2007), este hecho podría ser
una de las causas de la menor toma de carbono orgánico por parte de la población
microbiana.
Por otro lado, en la Figura 21 se presenta la concentración de amonio, nitrito y
nitrato medidos en el licor mezcla al final de la fase anóxica. Como puede observarse
el proceso de desnitrificación se produjo de manera estable durante todo el periodo
experimental, tanto a partir de nitrato como de nitrito.
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170
Conc
entra
ción
de
com
pues
tos
nitro
gena
dos
(mg
N/L)
AMONIO NITRITO NITRATO
T(días)
FASE II FASE III FASE IVFASE I
OD Resiembra
ç
OD 2.5 mg O2/L OD 3.5 mg O2/L
pHinicio ciclo 6.5 pHinicio ciclo 7.5
Figura 21. Evolución de la concentración de los compuestos nitrogenados (amonio, nitrito y nitrato) en el licor mezcla al final de la fase anóxica de la etapa de reacción
75
Resultados y Discusión
4.2.2 Evolución de las poblaciones microbianas
A lo largo del periodo experimental se realizaron 18 muestreos del licor mezcla
en la fase aerobia de la etapa de reacción. A partir de las muestras obtenidas se
realizaron los procesos de hibridación con las sondas escogidas para el estudio de la
población microbiana, realizando réplicas para confirmar los resultados obtenidos.
A continuación se presentan los resultados de la evolución de las poblaciones
de bacterias amonioxidantes (AOB), nitritoxidantes (NOB) y desnitrificantes.
4.2.2.1 Análisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias amonioxidantes
La Figura 22 muestra la evolución de los organismos AOB en relación con la
concentración de nitrógeno amoniacal determinada al final de la fase aerobia de la
etapa de reacción.
Durante los 25 primeros días (Fase I) se observa que el porcentaje de
microorganismos amonioxidantes se mantuvo constante en torno a un valor del 7%.
Figura 22. Porcentaje de AOB en el licor mezcla detectado con la sonda NSO1225 en relación con la sonda EUBmix. Concentración de nitrógeno amoniacal en el licor mezcla
al final de la fase aerobia de la etapa de reacción
76
Resultados y Discusión
La población de bacterias amonioxidantes llevó a cabo la oxidación del amonio
mientras la concentración de oxígeno disuelo fue estable (valor medio de 2.5 mg O2/L).
Sin embargo, la limitación puntual de oxígeno el día 25 (2 ciclos sin suministro de
oxígeno durante la etapa aerobia, en total 12 horas bajo condiciones anóxicas
alcanzando la anerobiosis) produjo el cese de su actividad, así como una reducción
drástica de su población, que pasó de un 7% a un 1%. La concentración de amonio en
el licor mezcla se incrementó hasta alcanzar un valor máximo de 25 mg N-NH4/L al
final de la etapa aerobia, ya que continuó la adición de amonio en la corriente afluente.
Transcurridos 8 días de la limitación de oxígeno la población de AOB se había
recuperado alcanzado un valor del 4% y era capaz de oxidar todo el amonio del
sistema. El día 42 la concentración de bacterias amonioxidantes se había restablecido
hasta alcanzar los niveles iniciales (8%) aunque durante la segunda mitad de la fase II
el porcentaje de bacterias se situó en torno al 6% para el día 79.
Tal y como se ha comentado anteriormente, debido a la necesidad de
reestablecer la población de organismos NOB, el día 83 se realizó una resiembra de 2
L de fango activo procedente de la EDAR utilizada para inocular el reactor biológico
SBR inicialmente. El inóculo potenció el desarrollo de la población de bacterias AOB
que alcanzó un valor en torno al 14% el día 124 y cercano al 17% el último día del
periodo experimental.
La Figura 23 muestra ocho imágenes obtenidas con la técnica FISH
correspondientes a la sonda Nso1225 (β-proteobacterias amonioxidantes). Se puede
observar como las bacterias forman agregados compactos y ligeramente esféricos,
con células claramente visibles.
77
Resultados y Discusión
FASE I
FASE II
FASE III
FASE IV
Figura 23. Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias de dominio Eubacteria (sonda EUBmix)
y en rojo las β-proteobacterias AOB identificadas por la sonda NSO 1225. Imágenes tomadas a 63x.
La sonda Nso1225 hibrida para una elevada variedad taxonómica de bacterias
AOB y por tanto aporta información relevante acerca del potencial nitrificante de la
población microbiana presente en el licor mezcla.
Sin embargo, puesto que se trata de una sonda general, se realizó un estudio
más en profundidad de las especies que conformaban la población de bacterias
amonioxidantes. Para ello se llevó a cabo un análisis cualitativo y cuantitativo de las
78
Resultados y Discusión
principales especies de bacterias amonioxidantes, cuyos resultados se presentan en la
Tabla 16.
Tabla 16. Porcentajes de AOB en el licor mezcla en relación con la sonda EUBmix
A
OB
N
itros
omon
as
euro
paea
, N
. eut
roph
a,
N. h
alop
hila
N
itros
ococ
cus
mob
ilis
Nitr
osom
onas
eu
ropa
ea,
N. e
utro
pha,
N
. hal
ophi
la
Nitr
osoc
occu
s
mob
ilis
Nitr
osom
onas
ol
igot
roph
a-lin
eage
Nitr
osos
pira
spp
.
Nso1225 NEU Nse1472 Nmv Nmo218 Nsv443
Fase Día
(%) (%) (%) (%) (%) (%) 1 6 ± 1 <1 0 0 5 ± 1 0
12 7 ± 1 <1 0 0 5 ± 1 0 I
20 7 ± 1 <1 5 ± 1
29 <1 <1 0 0 <1 0
33 3 ± 1 <1 0 0 1 ± 1 0
42 6 ± 1 3 ± 1 1 ± 1
56 9 ± 1 4 ± 1 6 ± 2
61 8 ± 1 5 ± 1 4 ± 1
70 8 ± 1 5 ± 1 0 0 4 ± 1 0
II
79 6 ± 1 5 ± 1 5 ± 1
91 7 ± 1 3 ± 1 0 0 3 ± 1 0
104 8 ± 1 4 ± 1 0 0 <1 0
111 12 ± 1 6 ± 1 3 ± 1 III
124 14 ± 2 8 ± 1 5 ± 1
139 15 ± 2 7 ± 1 0 0 5 ± 1 0
154 15 ± 1 8 ± 1 0 0 4 ± 1 0
168 16 ± 1 12 ± 1 3 ± 1 IV
174 16 ± 1 12 ± 1 3 ± 1
Estos resultados (media ± error estándar) indican que prácticamente la
totalidad de bacterias amonioxidantes identificadas mediante la sonda general
Nso1225 correspondieron a las sondas específicas NEU y Nmo218, que hibridan
bacterias de las especies Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas eutropha,
Nitrosomonas halophila, Nitrosococcus mobilis y Nitrosomonas oligotropha-lineage,
respectivamente.
Las hibridaciones de las sondas que inicialmente dieron resultados negativos,
fueron hibridadas posteriormente para confirmar los resultados obtenidos.
79
Resultados y Discusión
Las sondas Nse1472 y Nmv dieron señal negativa a lo largo de todo el periodo
experimental. Sin embargo la sonda NEU, que engloba las sondas Nse1472 y Nmv,
dio resultados positivos con un valor que se fue incrementando progresivamente. Este
hecho podría deberse a varias causas:
En primer lugar es posible suponer una incorrecta hibridación de las sondas
Nse1472 y Nmv debido a fallos en el proceso o a la degradación de sus fluorocromos.
Sin embargo, para asegurar la fiabilidad de los resultados se introdujeron controles
positivos durante las hibridaciones que permitieron constatar que el procedimiento se
realizaba adecuadamente y que las sondas estaban en buen estado, por lo que se
descartó esta posibilidad.
También se pudo producir la hibridación de bacterias con la sonda NEU que
tienen coincidencias en su cadena de ácidos nucleicos con la sección de la cadena
para la que hibrida esta sonda específica, pero que sin embargo no son bacterias
amonioxidantes. Por este motivo, el protocolo establece el uso de una sonda
competidora (CTE) sin fluorescencia para descartar hibridaciones erróneas (Wagner et
al., 1995; Schleifer et al., 1992). Este tipo de sonda hibrida con bacterias que actúan
en el proceso de hibridación como competidoras del grupo de bacterias identificadas
con la sonda NEU, como Comamonas testosteroni, Brachymonas denitrificans,
Rhodocyclus purpureus y Leptothrix discophora (Schleifer et aI., 1992). De modo que
la sonda CTE sin fluorocromos hibrida sobre la secuencia de nucleótidos objetivo de
las bacterias competidoras, impidiendo que lo haga la sonda NEU.
Otra opción es la existencia de bacterias que hibridan para la sonda NEU pero
no para Nse1472 y Nmv. En relación a este tercer supuesto, Wagner et al., (1995)
identificaron una serie de bacterias que daban positivo para la sonda NEU pero no
para Nse1472 y Nmv: Nitrosomonas marina, Nitrosomonas aestuarii y Nitrosovibrio
tenuis. No obstante, estas bacterias suelen presentarse por lo general en ambientes
marinos (Nielsen et al., 2009) aunque se ha llegado a identificar Nitrosomonas marina
en un biofiltro asociado a un sistema de producción acuícola.
Existe constancia de otros autores (Gieseke et al., 2001; Persson et al., 2002)
que obtuvieron resultados positivos para la sonda de hibridación NEU mientras que
Nmv y Nse1472 aportaron resultados negativos en muestras de sistemas de
depuración de aguas residuales urbanas.
Teniendo en cuenta estos resultados, sería interesante llevar a cabo una
investigación más en profundidad en relación con las secuencias para las que hibrida
la sonda NEU y las especies de bacterias identificadas ya que se trata de una sonda
que al hibridar para bacterias halotolerantes o moderadamente halofílicas con afinidad
por medios con elevadas concentraciones de nutrientes, suele dar resultados positivos
80
Resultados y Discusión
en sistemas de tratamiento de aguas residuales (Seviour y Nielsen, 2010). Además de
que como numerosos estudios indican, el género Nitrosomonas tiene una presencia
mayoritaria en plantas de tratamiento de aguas residuales (Prosser, 1989; Dionisi et
al., 2002; Egli et al., 2003; Dong-Jin et al., 2006; Rodríguez et al., 2011).
Por otro lado, las bacterias pertenecientes a la especie N. mobilis (sonda Nmv)
suelen desarrollarse en medios que tienen elevadas concentraciones de amonio y
sales (Juretschko et al., 1998) que no es el caso del presente trabajo.
En cuanto a la sonda Nmo218, que hibirida para Nitrosomonas oligotropha-
lineage, durante los primeros días del periodo experimental supuso prácticamente la
totallidad de la población de bacterias AOB. Mientras que las bacterias identificadas
mediante la sonda NEU fueron detectadas en el fango pero con una concentración
inferior al 1%. Tras 25 días en los que el sistema permaneció estable se mantuvo esta
dinámica de población. Sin embargo, progresivamente las bacterias identificadas
mediante la sonda NEU fueron incrementando su concentración en el licor mezcla,
pasaron a situarse como la población microbiana amonioxidante mayoritaria.
En cuanto a la sonda restante, Nsv443, que hibrida para Nitrosospira spp., dio
resultados negativos y aunque ocasionalmente se han podido identificar en sistemas
de fangos activados, es un tipo de bacteria que generalmente va asociado a hábitats
terrestres (Nielsen et al., 2009; Seviour y Nielsen, 2010).
A continuación, en las Figuras 24 y 25 se presentan imágenes obtenidas
mediante la técnica FISH sobre muestreos realizados a lo largo del periodo
experimental empleando las dos sondas que dieron resultados positivos, NEU (Figura
24) y Nmo218 (Figura 25).
Se puede observar como las agrupaciones de bacterias identificadas mediante
la sonda NEU dieron lugar a formaciones globosas y con poca distancia entre ellas.
Mientras que las poblaciones microbianas correspondientes a la especie Nitrosomonas
oligotropha-lineage (Figura 25) dio lugar a formaciones de menor tamaño, más
dispersas y con células más claramente visibles.
81
Resultados y Discusión
FASE I
FASE II
FASE III
FASE IV
Figura 24. Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias totales del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las β-proteobacterias AOB identificadas por la sonda NEU. Imágenes
tomadas a 63x.
82
Resultados y Discusión
FASE I
FASE II
FASE III
FASE IV
Figura 25. Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las β-proteobacterias AOB identificadas por la sonda Nmo218.
Imágenes tomadas a 63x.
83
Resultados y Discusión
4.2.2.2 Influencia del pH y la concentración de oxígeno disuelto en la población de AOB
Desde el día 1 del periodo experimental y hasta el día 135, el pH al inicio de
ciclo se mantuvo en torno a un valor de 6.5. Existen estudios que indican que al pasar
de pH 7.0 (valor típico de una depuradora) a pH 6.6, el ratio de oxidación de amonio
puede verse afectado (Konrad et al., 2003). Sin embargo, desde el inicio del ensayo la
población de AOB fue capaz de adaptarse y llevar a cabo la oxidación de amonio tal y
como se observa en la Figura 26, en la que se muestran los porcentajes de bacterias
amonioxidantes identificadas en el licor mezcla respecto al dominio Eubacteria en
relación con la concentración de amonio al final de la fase aerobia de la etapa de
reacción.
Figura 26. Porcentaje de bacterias amonioxidantes en el licor mezcla detectadas con las sondas NSO1225, Nmo218 y NEu en relación con la sonda EUBmix. Concentración de
nitrógeno amoniacal en el licor mezcla al final de la fase aerobia de la etapa de reacción
El día 26, debido a la limitación de oxígeno en el reactor, todas las especies de
AOB detectadas se vieron seriamente afectadas. Sin embargo, existen estudios que
indican la capacidad de determinadas especies de bacterias nitrificantes para
mantener su actividad en condiciones de limitación de oxígeno. A este respecto, en la
Figura 26 puede observarse como las bacterias detectadas con las sondas específicas
NEU y Nmo218 fueron capaces de recuperar paulatinamente los porcentajes previos a
84
Resultados y Discusión
la reducción en la concentración de oxígeno, especialmente las especies detectadas
con la sonda NEU, que incrementaron su presencia hasta alcanzar un 5%.
Sin embargo, estos niveles no se mantuvieron y a partir del día 60 del periodo
experimental, la población de bacterias amonioxidantes fue reduciéndose
progresivamente, aunque este hecho no afectó el índice de oxidación de amonio.
Al tiempo que se realizó la resiembra de 2 L el día 83, se incrementó la
concentración de oxígeno disuelto en el reactor de 2.5 mg O2/L a 3.5 mg O2/L.
Probablemten debido tanto al inóculo como a la mayor concentración de oxígeno
disuelto en el licor mezcla, tuvo lugar un incremento progresivo en la población de
AOB identificadas con la sonda Nso125, que alcanzó un porcentaje en torno al 16%.
También se produjo un cambio en la población microbiana, ya que las bacterias
identificadas por la sonda NEU se duplicaron a partir del día 83, pasando de un 3% a
un 7%, superando los niveles de Nitrosomonas oligotropha-lineage y haciendo más
patente el cambio observado entre los día 25 y 83, en los que ambas poblaciones se
habían igualado. A este respecto, Park y Noguera (2004) hallaron que en un reactor
alimentado con agua residual artificial las bacterias predominantes inicialmente fueron
Nitrosomonas oligotropha. Sin embargo, progresivamente la población predominante
pasó a ser la especie Nitrosomonas europaea. Estos resultados coinciden con los
observados en cuanto al cambio de población en el presente trabajo, en el que se
observa que aunque inicialmente la población predominante fue claramente
Nitrosomonas oligotropha-lineage, progresivamente las bacterias identificadas por la
sonda NEU pasaron a ser mayoritarias.
Tras el incremento de pH el día 134, el porcentaje de Nitrosomonas
oligotropha-lineage se redujo pasando de un 5% a un 3%, mientras que las bacterias
identificadas por la sonda NEU alcanzaron un valor cercano al 13%, pasando a
suponer el 75% del total de bacterias AOB detectadas en el fango activo.
Bae et al., (2002) hallaron que con el incremento de pH de 6.5 a 7.5 el ratio de
oxidación de amonio por parte de las bacterias AOB se incrementó en un 67%. Y
Konrad et al., (2003) observaron que a pH 7.5 la población microbiana dominante fue
la detectada mediante la sonda NEU, aunque a pH inferior a 7, la población de
bacterias NEU decreció a favor de otras poblaciones detectadas mediante la sonda
Nso190 (sonda general para AOB). Por ello concluyeron que las variaciones de pH
tenían una mayor influencia en las poblaciones de Nitrosomonas eutropha y
Nitrosomonas europaea, siendo el pH 7.5 óptimo para el desarrollo de estas especies
en medio artificial, lo cual coincide con los resultados obtenidos en el presente trabajo.
En lo referente al efecto del incremento en la concentración de nitrito, Bock et
al., (1995) y Kuai et al., (1998) hallaron que N. europaea/eutropha podían emplear el
85
Resultados y Discusión
nitrito como aceptor de electrones en caso de limitación de oxígeno. Por tanto, es
posible que bacterias detectadas mediante la sonda NEU se viesen favorecidas ya que
se produjo acumulación de nitrito desde el día 97, pasando de una concentración en el
efluente de 1.5 mg N-NO2/L a alcanzar los 7 mg N-NO2/L como valor promedio a partir
del día 134 y hasta el final del periodo experimental.
Respecto a la reducción de la población de N. oligotropha en relación con la
concentración de nitrito, Bollmann et al., (2002) hallaron que la población de bacterias
amonioxidantes G5-7 (muy relacionada con Nitrosomonas oligotropha) se vio afectada
cuando en el reactor se incrementó la concentración de nitrito, de lo que dedujeron
una posible sensibilidad de estas bacterias a la presencia de este compuesto en el
medio, lo cual coincide con los resultados obtenidos en este trabajo.
La predominancia de bacterias detectadas por la sonda NEU viene
referenciada por otros estudios (Logemann et al., 1998; Egli et al., 2003). Fux et al.,
(2003) obtuvieron una modificación poblacional en un sistema SBR operado con
influente artificial, con un incremento de bacterias identificas con la sonda NEU
respecto al total de bacterias detectadas con la sonda Nso1225, lo cual coincide con
los resultados presentados en relación al cambio poblacional observado en este
trabajo.
4.2.2.3 Análisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias nitritoxidantes
Las sondas empleadas fueron Ntspa712 (hibrida para la mayor parte de
miembros del género Nitrospira) y NIT3 (género Nitrobacter spp.), aunque el total de
bacterias que dieron resultado positivo en la hibridación correspondieron a la sonda
Ntspa712 y por tanto al phylum Nitrospira. Para confirmar estos resultados se llevaron
a cabo 8 hibridaciones, 2 al inicio de cada fase mediante la sonda NIT3 y su
competidora sin obtenerse resultados positivos en ninguna fase.
Estudios llevados a cabo en plantas de tratamiento de aguas residuales
coinciden en que las bacterias pertenecientes al género Nitrospira son dominantes en
estos ambientes frente a las bacterias del género Nitrobacter (Wagner et al., 1996;
Juretschko et al., 1998; Schramm et al., 1998; Okabe et al., 1999; Daims et al., 2000;
Nogueira et al., 2002; Konrad et al., 2003, Carvalho et al., 2006).
La Figura 27 presenta la evolución de la población de bacterias nitritoxidantes y
de las concentraciones de nitrito y nitrato en la fase final de la etapa de reacción.
86
Resultados y Discusión
Figura 27. Porcentaje de bacterias nitritoxidantes en el licor mezcla detectadas con la sonda Ntspa712 en relación con la sonda EUBmix. Concentración de nitrito en el licor
mezcla al final de la fase aerobia de la etapa de reacción
Al inicio del ensayo el proceso fue estable con una población de NOB cercana
al 3% respecto al dominio Eubacteria. A pesar de que ésta se redujo durante los 25
primeros días de experimentación hasta un 1%, la concentración de nitrito no se
incrementó y la concentración de nitrato en el medio varió en un intervalo de entre 5 y
3 mg N-NO3/L.
Desde el día 25 (Fase II) la población de nitritoxidantes fue en aumento y
alcanzó un valor cercano al 8% hasta el día 56. Sin embargo, posteriormente la
población de NOB se fue reduciendo de forma progresiva hasta un valor cercano al
1% el día 79. Al mismo tiempo se observó un incremento progresivo de la
concentración de nitrito en el licor mezcla, hasta alcanzar un valor de 5.5 mg N-NO2/L.
Por tanto, es posible que las bacterias detectadas mediante el procedimiento de
hibridación fueran bacterias viables en torno al día 25 y no viables en torno al día 79,
lo cual explicaría la acumulación de nitrito con una misma concentración de NOB en el
licor mezcla.
El día 83 (inicio de la Fase III) se realizó la resiembra de 2 L, tras la cual el
sistema dio muestras de recuperación del proceso de oxidación de nitrito. Se observó
una rápida respuesta de la actividad de las bacterias nitritoxidantes, ya que su
población pasó de un 1% a un 10% tras un periodo de aproximadamente 10 días y se
87
Resultados y Discusión
logró la nitrificación completa. Sin embargo, hacia el día 97 del proceso experimental
se produjo de nuevo la acumulación de nitrito en el licor mezcla. Este hecho mostró
que la bioaumentación no es un método efectivo para la recuperación de determinadas
poblaciones bacterianas, como indican otros estudios (Bouchez et al., 2000; Seviour y
Nielsen, 2010)
En la Tabla 17 pueden observarse los resultados obtenidos para las dos
sondas estudiadas.
Tabla 17. Porcentajes de NOB en el reactor licor mezcla en relación con la sonda EUBmix (dominio Eubacteria)
Nitr
obac
ter s
pp.
Phy
lum
Nitr
ospi
rae
NIT3 Ntspa712
Fase Día
(%) (%) 1 0 2 ± 1
12 0 1 ± 1 I
20 1 ± 1
29 0 2 ± 1
33 0 3 ± 1
42 5 ± 1
56 8 ± 2
61 7 ± 2
70 5 ± 2
II
79 1 ± 1
91 0 10 ± 2
104 0 3 ± 1
111 2 ± 1 III
124 2 ± 1
139 0 1 ± 1
154 0 1 ± 1
168 1 ± 1 IV
174 1 ± 1
En sistemas que trabajan bajo condiciones variables se puede dar el caso de
que una restricción en determinada fase de la actividad de las bacterias pueda permitir
el desarrollo de poblaciones de NOB diversas (Gieseke et al., 2001). Sin embargo, en
este caso la población dominante ha sido la perteneciente al género Nitrospira.
88
Resultados y Discusión
A continuación, en la Figura 28 se presentan imágenes obtenidas mediante la
técnica FISH sobre muestreos realizados a lo largo del periodo experimental
empleando la sonda Ntspa712. Se puede observar como las agrupaciones de
bacterias Nitrospira dan lugar a formaciones irregulares de pequeño tamaño y por lo
general dispersas.
FASE I
FASE II
FASE III
FASE IV
Figura 28. Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda
EUBmix) y en rojo las β-proteobacterias NOB identificadas por la sonda Ntspa712. Imágenes tomadas a 63x.
89
Resultados y Discusión
4.2.2.4 Influencia del pH y la concentración de oxígeno disuelto en la población de NOB
La ausencia de oxígeno disuelto en el medio durante 12 horas el día 25
provocó una reducción importante en la actividad de las bacterias. A este respecto,
Daims et al., (2001a) hallaron que bajo condiciones anaerobias, bacterias del género
Nitrospira spp. no llevaron a cabo la toma de carbono, lo que indica que en ausencia
total de OD su actividad se reduce de forma significativa.
A partir del día 25 (Fase II), tras la limitación de oxígeno, la población de
bacterias NOB se recuperó con una concentración de OD en el medio de 2.5 mg O2/L,
aunque se produjo una acumulación progresiva de nitrito. Otros autores (Nogueira et
al., 2002) obtuvieron resultados semejantes, con valores crecientes en la población de
bacterias nitritoxidantes y acumulación simultánea de nitrito.
El día 83 (Fase III), tras incrementar el OD a 3.5 mg O2/L y realizar el inóculo
de 2 L, durante los 14 primeros días se produjo la nitrificación completa. Sin embargo,
como ya se ha comentado, posteriormente la población de bacterias NOB se redujo de
manera progresiva y comenzó a observarse de nuevo la acumulación de nitrito en el
licor mezcla.
Como posible solución para la recuperación del proceso de nitrificación, el día
134 (inicio de la Fase IV) se incrementó el pH pasando de un valor de inicio de ciclo de
6.5 a un valor de 7.5 ya que existen estudios que indican que el crecimiento y la
actividad de las bacterias NOB se ve incrementado a valores de pH en torno a 7.5 -
8.0 (Prosser, 1989; Gieseke et al., 2006; Gu et al., 2007) mientras que a valores
inferiores a 6.5 la velocidad de nitrificación se reduce de forma brusca (González et al.,
2010). Sin embargo, la modificación del pH no influyó en la recuperación de la
población de NOB y la acumulación de nitrito se mantuvo hasta el final del periodo
experimental.
En cuanto al efecto inhibitorio del nitrito, el auténtico inhibidor es el ácido
nitroso (HNO2) cuya concentración va en función del pH del medio. Varios autores
(Vadivelu et al., 2006; Sinha y Annachhatre, 2007) han observado que a un valor de
pH inferior a 6 se incrementa la concentración de ácido nitroso, afectando los procesos
de nitrificación. A este respecto existen trabajos (Anthonisen, 1976; Almeida, 1995)
que indican que el ácido nitroso tiene un impacto considerable sobre las bacterias
NOB. Estos trabajos indican que una concentración de HNO2 superior a 2.8 mg/L no
permite la nitrificación completa ya que inhiben la actividad de las bacterias
nitritoxidantes.
No obstante, Vadivelu et al., (2006) hallaron que una concentración de 0.02 mg
N-HNO2/L provocó un descenso del 15% en el ratio de toma de oxígeno en una
90
Resultados y Discusión
población de Nitrobacter. Y aunque las poblaciones pertenecientes al género
Nitrospira son predominantes en estaciones depuradoras de aguas residuales, podría
resultar interesante el estudio del efecto de la concentración de ácido nitroso en su
actividad nitrificante.
A partir de los cálculos de equilibrio químico (Ecuación 21 y 22) entre el nitrito y
el ácido nitroso se calculó la concentración de ácido nitroso correspondiente a 10 mg/L
de nitrito con un pH de 6.5 (menor pH a lo largo del periodo experimental) y una
temperatura de 20ºC.
pH
NOKeTNOHNO 2
2
101 +
= Ecuación 21
Siendo TNO2 = NO2 + HNO2
4273
2300
109.3 −+−
⋅== eTNOKe Ecuación 22
Donde KeNO (mol L-1) es la constante de equilibrio químico a 20ºC de
NO2¯/HNO2.
La concentración de ácido nitroso obtenida fue de 0.008 mg N-HNO2/L, valor
muy por debajo del umbral de inhibición propuesto por Anthonisen (1976). Por esta
razón se puede desestimar la hipótesis de que la inhibición de las NOB se produjo a
causa de la presencia de ácido nitroso en el sistema.
Kim et al., (2008) estudiaron la acumulación de nitrito a diferentes
temperaturas, y observaron que a 20ºC no se produjo acumulación de nitrito en el
reactor. Mientras que los resultados obtenidos por Gerardi (2002) indican que a pesar
de obtener la nitrificación completa a 20ºC, a menor temperatura (16 ºC) el porcentaje
de nitrificación obtenido fue un 50% inferior respecto al proceso a 30ºC. Por tanto,
ligeras variaciones en el rango de temperatura son de gran importancia cuando se
trabaja en valores de temperatura en torno a 20ºC.
Otro parámetro importante a tener en cuenta en el desarrollo de las
poblaciones bacterianas es la fuente de carbono (orgánico o inorgánico). Por lo
general, el contenido en materia orgánica de las aguas residuales suple las
necesidades de la población microbiana, sin embargo, en determinados sistemas de
tratamiento se emplean fuentes alternativas de carbono (principalmente en sistema
con desnitrificación).
91
Resultados y Discusión
En el presente trabajo se empleó ácido acético como fuente de carbono, que es
el ácido graso volátil dominante en los sistemas de aguas residuales, aunque también
se pueden emplear glucosa ometanol.
La relación del ácido acético con la acumulación de nitrito en sistemas de
nitrificación viene referenciada por diversos autores. Ge et al., (2012) no hallaron
diferencias notables en cuanto a la acumulación de nitrito al comparar como fuente de
carbono el acético con la glucosa y el metanol. Por otro lado, Carley y Mavinic (1991)
hallaron una acumulación de nitrito del orden del 21% al emplear acético como fuente
de carbono y del 23 y el 17% al emplear glucosa y metanol respectivamente. Mientras
que Sun et al., (2009) obtuvieron un incremento del 10% en la acumulación de nitrito al
emplear ácido acético con respecto al uso de metanol y Eilersen et al., (1994) hallaron
que diversos ácidos (fórmico, propiónico y acético) inhibieron por igual el proceso de
nitrificación.
A este posible efecto inhibitorio del ácido acético sobre la población de NOB,
Nogueira et al., (2002) hallaron que Nitrospira tenía cierta resistencia a desarrollarse
bajo esta fuente de carbono orgánico, recuperándose tras la interrupción de la adición
de ácido acético en el reactor. Y estudios llevados a cabo por Daims et al., (2001)
hallaron que bacterias relacionadas con el género Nitrospira no empleaban acetato
como fuente de carbono orgánico, sino piruvato.
Además de los factores indicados hasta ahora, la intensidad lumínica es
también un parámetro importante a tener en cuenta en la evolución de poblaciones
microbianas. En ensayos de laboratorio en los que se emplean reactores piloto de
materiales translúcidos se ha detectado que puede tener un cierto efecto negativo en
los procesos de nitrificación/desnitrificación que en el caso de reactores industriales
pasa desapercibido por tratarse de materiales opacos. Kaplan et al., (2000) y Vanzella
et al., (1989) hallaron que las bacterias NOB eran más sensibles a la luz solar que las
bacterias AOB. Por otro lado, Olson (1981) en un estudio llevado a cabo en un
depósito de aguas residuales observó cierto grado de inhibición de la actividad de
bacterias nitritoxidantes al incrementar la intensidad lumínica durante las épocas de
finales de primavera y verano, que dependió de la dosis de luz. Al comparar con un
estado de oscuridad total, un incremento en la luminosidad del 5% provocó una
inhibición del 15% y de un 67% al recibir plena intensidad lumínica.
Tal y como se observa en la Figura 8 correspiente al apartado de 3.1 de
Materiales y Métodos, el montaje experimental se realizó en un reactor
semitransparente sometido a luz directa. Por tanto, el incremento de la intensidad
lumínica durante las últimas fases del ensayo (correspondientes a los meses de abril y
mayo) podría haber afectado la capacidad de las bacterias NOB para desarrollarse.
92
Resultados y Discusión
Por tanto, sería interesante realizar un estudio más en profundidad a este respecto,
enfocado a la influencia de la intensidad lumínica en la realización de ensayos a
escala de laboratorio.
4.2.2.5 Análisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias desnitrificantes
La Tabla 18 presenta los porcentajes obtenidos para las tres sondas
empleadas.
Tabla 18. Porcentajes de desnitrificantes en el reactor licor mezcla en relación con sonda EUBmix (dominio Eubacteria)
Gén
eros
A
zoar
cus-
Thau
era-
Cas
tani
ella
Gén
eros
P
arac
cocu
s
Des
nitri
fican
tes
a p
artir
de
met
anol
AT1458 PAR651 DEN67
Fase Día
(%) (%) (%) 1 11 ± 2 2 ± 1 0
12 11 ± 2 2 ± 1 0 I
20 11 ± 2 2 ± 1
29 12 ± 2 2 ± 1 0
33 14 ± 2 2 ± 1 0
42 15 ± 2 2 ± 1
56 20 ± 6 2 ± 1
61 25 ± 6 2 ± 1
70 29 ± 7 2 ± 1
II
79 33 ± 8 1 ± 1
91 45 ± 5 1 ± 1 0
104 50 ± 6 4 ± 1 0
111 58 ± 7 7 ± 1 III
124 61 ± 7 10 ± 3
139 63 ± 8 8 ± 2 0
154 67 ± 8 7 ± 3 0
168 70 ± 9 7 ± 3 IV
174 72 ± 9 7 ± 3
Desde el primer día del ensayo y hasta el día 25 el porcentaje de ambas
poblaciones de bacterias se mantuvo estable. A partir del día 25, la población de
bacterias detectadas por sonda AT1458, que hibrida los géneros de bacterias
Azoarcus, Thauera y Castellaniella aumentó de forma progresiva hasta alcanzar un
93
Resultados y Discusión
valor en torno a un 70% en la fase final del periodo experimental. A este respecto,
diversos autores (Juretschko et al., 2002; Wagner et.al, 2002; Ginige et al., 2005;
Thomsen et al., 2007; Nielsen y Seviour, 2010) coinciden en situar los géneros
Thauera y Azoarcus como mayoritarios en estaciones depuradoras con etapa de
desnitrificación, coincidiendo con los resultados obtenidos en el presente trabajo.
En el caso del género Azoarcus los valores que suelen presentarse en
estaciones depuradoras de aguas residuales varían entre un 3% y un 16% pudiendo
alcanzar valores superiores a un 30% cuando se emplean fuentes de carbono
orgánico externas (Thomsen et al., 2007). Y en el caso de Thaurea los valores
hallados más comúnmente se encuentran entre un 2% y un 11%, por lo que en
conjunto pueden llegar a suponer un porcentaje relevante de la población de
desnitrificantes en una estación depuradora con suplemento de carbono orgánico.
Por otro lado, las bacterias del género Paracoccus, hibridadas mediante la
sonda PAR651, redujeron su concentranción en el licor mezcla de forma progresiva.
Sin embargo, 5 días después de la resiembra llevada a cabo para recuperar la
población de NOB, su concentración se incrementó hasta alcanzar una concentración
del 10%, que posteriormente se estabilizó en torno a un valor del 7% en la fase final
del periodo experimental.
Respecto a la sonda DEN67, que hibrida para bacterias que emplean metanol
como fuente principal de carbono orgánico, no dio resultados positivos.
A continuación se presentan imágenes tomadas a lo largo del periodo
experimental para las sondas AT1458 y PAR651. Se puede observar como las
agrupaciones de bacterias Azoarcus/Thaurea (Figura 29) dan lugar a colonias
agrupadas e irregulares y Paracoccus (Figura 30) dan lugar a colonias irregulares o
circulares en función del número de bacterias que la conforman, aunque por lo general
forman grupos dispersos.
94
Resultados y Discusión
FASE I
FASE II
FASE III
FASE IV
Figura 29. Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda
EUBmix) y en rojo las bacterias desnitrificantes identificadas por la sonda AT1458. Imágenes tomadas a 63x.
95
Resultados y Discusión
FASE I
FASE II
FASE III
FASE IV
Figura 30. Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda
EUBmix) y en rojo las bacterias desnitrificantes identificadas por la sonda PAR651. Imágenes tomadas a 63x.
96
Resultados y Discusión
4.2.2.6 Influencia del pH y la concentración de oxígeno disuelto en la población de desnitrificantes.
En la Figura 31 puede observarse la evolución de las poblaciones de bacterias
desnitrificantes hibridadas mediante las sondas AT1458 y PAR651 en relación con la
concentración de nitrito y nitrato en el licor mezcla al final de la fase anóxica de la
etapa de reacción.
Figura 31. Porcentaje de bacterias desnitrificantes (DES) en el licor mezcla detectadas con las sondas AT1458 y PAR651 en relación con la sonda EUBmix. Concentración de
nitrito y nitrato en el licor mezcla al final de la fase anóxica de la etapa de reacción
La reducción de los compuestos nitrogenados durante la fase de
desnitrificación no se vio afectada por la concentración de oxígeno ya que ésta se
mantuvo en valores en torno a 0 mg O2/L.
En cuanto al efecto del pH, los resultados obtenidos indicaron que tras
incrementar el pH de inicio de ciclo de 6.5 a 7.5, las bacterias hibridadas mediante la
sonda AT1458 (géneros Azoarcus, Thauera y Castellaniella) no se vieron afectadas,
manteniendo el ritmo de crecimiento a lo largo de todo el periodo experimental.
El porcentaje de bacterias detectadas por la sonda PAR651 se mantuvo en
torno a valores del 2% respecto al dominio Eubacteria hasta el día 91. Transcurridos 8
97
Resultados y Discusión
días de la resiembra, su concentración se incremento hasta alcanzar un porcentaje del
10% que tras el incremento de pH a 7.5 se estabilizó en valores en torno al 7%.
Esta reducción pudo deberse tanto al efecto del pH como a la competencia
generada por las bacterias de los géneros Azoarcus y Thauera.
Ginige et al., (2005) observaron en un reactor que tenía una elevada
concentración de los géneros Azoarcus y Thaurea, una reducción en la concentración
de nitrito de 107 mg N-NO2/L a 0.02 mg N-NO2/L durante la etapa anóxica con un pH
de 7.5 y ácido acético como fuente de carbono externa. De lo cual dedujeron que
estos géneros son capaces de llevar a cabo el proceso de desnitrificación de forma
óptima en presencia de nitrito y ácido acético, lo cual coincide con los resultados
obtenidos en el presente trabajo. A este respecto, Morgan-Sagatsume et al., (2008)
hallaron que bacterias del género Azoarcus se desarrollaron más en un medio rico en
nitrito y con ácido acético como fuente de carbono.
En cuanto al efecto de la concentración de nitrito en el licor mezcla, tras la
resiembra (día 83), la concentración de nitrito se redujo pasando de 10 mg N-NO2/L a
una concentración de prácticamente 0 mg N-NO2/L. No obstante, la población de
bacterias desnitrificantes no se vio afectada y durante los días posteriores incrementó
su concentración de un 45% (día 91) a un 60% (día 124) alcanzando un porcentaje en
torno al 70% en la etapa final de la Fase IV (día 174).
Existen numerosos estudios que relacionan el desarrollo de una determinada
población de bacterias heterótrofas desnitrificantes con el sustrato empleado como
fuente de carbono. Ginige et al., (2007) observaron que al emplear acético como
fuente de carbono se potenció una población determinada de bacterias en un sistema
de fangos activados. Otros autores (Hallin et al., 1995; Isaacs y Henze, 1995; Lee y
Weelander, 1996) indican que en sistemas de fangos activados en los que se añaden
fuentes de carbono externas se pueden provocar modificaciones en la población de
bacterias heterótrofas. Sin embargo, en este estudio se observó que durante lo
primeros días de experimentación las poblaciones de bacterias no se vieron
modificadas respecto a los valores del fango activo.
Según Ginige et al., (2005) y Osaka et al., (2006) el uso de ácido acético
promueve el desarrollo de miembros de Comamonadaceae y Rhodocyclaceae como
Comamonas, Acidovorax y Thaurea. Thomsen et al., (2007) hallaron que empleando
como fuente de carbono orgánico el ácido acético se obtuvo la mayor toma de carbono
por parte de los géneros Thaurea y Azoarcus, con un 50% y un 45% respectivamente
identificando Azoarcus como desnitrificantes a partir de nitrato y Thaurea y
Aquaspirillium a partir de nitrito.
98
Resultados y Discusión
Gu et al., (2007) trabajaron bajo condiciones similares a las empleadas en el
presente trabajo (23ºC y pH 6.5 - 8.3) y la desnitrificación en presencia de ácido
acético fue más favorable a partir de nitrito. Además, observaron una menor demanda
de materia orgánica, lo cual coincide con los resultados obtenidos, ya que en la etapa
final del periodo experimental se observó una ligera acumulación de acético en el
efluente.
99
CONCLUSIONES
Conclusiones
En este trabajo se ha estudiado el efecto de ciertos factores ambientales y de
operación sobre la evolución y el comportamiento de diversas especies de
microorganismos amonioxidantes, nitritoxidantes y desnitrificantes, presentes en un
proceso biológico de eliminación de materia orgánica y nitrógeno de una corriente de
agua residual típicamente urbana. A continuación se describen las conclusiones
obtenidas más importantes:
1. Mediante la aplicación de la técnica FISH se ha identificado que en el inóculo
los microorganismos amonioxidantes (AOB) dominantes correspondieron
mayoritariamente a la especie Nitrosomonas oligotropha-lineage. Asimismo, se
ha determinado que el género de bacterias nitritoxidantes presentes en el
inóculo ha correspondido prácticamente en su totalidad a microorganismos
pertenecientes al genero Nitrospira. Por otro lado, las sondas de hibridación
disponibles para identificar organismos desnitrificantes han mostrado en este
inóculo microorganismos pertenecientes principalmente a los géneros
Azoarcus, Thauera y Castellaniella, y en menor proporción organismos del
género Paracoccus.
2. Hibridaciones realizadas durante la evolución del proceso a lo largo del periodo
experimental, en las que se ha empleado la sonda general NSO1225
(organismos amonioxidantes β-proteobateria) y diversas sondas específicas
(NEU, Nse1472, Nmv, Nmo218 y Nsv443) para microorganismos
amonioxidantes, han indicado un cambio poblacional. El porcentaje de
microorganismos AOB identificados como más abundantes en el inóculo de
puesta en marcha (Nitrosomonas oligotropha-lineage) descendió ligeramente a
lo largo del periodo experimental, mientras que los microorganismos
identificados con la sonda NEU se incrementaron de forma considerable, ya
que fueron detectados en el inóculo de puesta en marcha en un porcentaje
inferior al 1% y alcanzaron unvalor del13%.
3. Dentro del grupo de microorganismos AOB identificados con la sonda NEU no
se ha logrado determinar las especies de AOB presentes en el licor mezcla.
Los resultados obtenidos empleando las sondas Nse1472 y Nsv443 han sido
negativos.
4. La concentración de oxígeno disuelto en un reactor biológico es un parámetro
fundamental para llevar a cabo el proceso de nitrificación. De los
100
Conclusiones
microorganismos involucrados en este proceso: microorganismos
amonioxidantes y nitritoxidantes, los microorganismos AOB han mostrado una
mayor capacidad de superar situaciones puntuales de baja concentración de
oxígeno disuelto en el licor mezcla. Los microorganismos NOB, pertenecientes
mayoritariamente al género Nitrospira, no lograron recuperarse de manera
satisfactoria y su población no alcanzó valores estables a lo largo del periodo
experimental, por lo que estos microorganismos son más sensibles a bajas
concentraciones de oxígeno disuelto en el medio.
5. El pH es un parámetro que influye de diversas formas en los procesos de
eliminación biológica de nitrógeno de las aguas residuales, tanto por su acción
intrínseca como inhibidor del proceso, como por su efecto en el equilibrio
químico entre sustrato e inhibidor (amoniaco - NH3 y ácido nitroso - HNO2) de
los organismos involucrados en el proceso de nitrificación. Valores puntuales
de pH 6.5 durante la operación del proceso (inicio de cada ciclo) pudieron
afectar la actividad de los organismos NOB, ocasionando que la nitrificación se
realizara sólo hasta nitrito. Debido a que la concentración de ácido nitroso en el
licor mezcla no ha sido suficientemente elevada, es importante destacar que
esta reducción de la actividad de NOB puede ser debida al propio efecto del pH
bajo. Por otro lado, a pesar de incrementar el pH a 7.5 al inicio del ciclo, no se
observó actividad de NOB y el nitrito continuó acumulándose en el licor mezcla.
6. Las bacterias desnitrificantes de los géneros Azoarcus y Thaurea no se han
visto afectadas por la modificación del pH (periodos a pH 6.5 y 7.5) al inicio de
cada ciclo de operación. Asimismo, se ha observado que el incremento en la
concentración de nitrito potencia su desarrollo, por tanto estos
microorganismos pueden emplear tanto el nitrato como el nitrito como aceptor
de electrones durante el proceso de desnitrificación.
7. Las bacterias desnitrificantes del género Paracoccus se han visto afectadas al
pasar el pH al inicio de cada ciclo de 6.5 a 7.5.
8. La técnica FISH puede ser empleada de manera satisfactoria en combinación
con otras técnicas microbiológicas y analíticas, para llevar a cabo el
seguimiento de poblaciones microbianas y diagnosticar el estado del proceso
biológico en una estación de depuración de agua residual.
101
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