Post on 03-Jan-2016
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DNA RECOMBINANTE E DNA RECOMBINANTE E INGIENIERINGIENIERÍAÍAGENÉTICAGENÉTICA
INGENIERÍA GENÉTICA
MANIPULACIÓN DEL DNA DE LOS ORGANISMOS VIVOS
1) INVESTIGACIÓN BÁSICA (ESTUDIO DE LA ORGANIZACIÓN, EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DE GENES EN LOS ORGANISMOS VIVOS).
2) APLICACIÓN DE ESTE CONOCIMIENTO EN LA MANIPULACIÓN CONSCIENTE DE LOS GENES EN SALUD, EN LA INDUSTRIA DE ALIMENTOS, EN LA AGRICULTURA, ETC.
PIEDRAS ANGULARES DE LA INGIENIERÍA GENÉTICA
1. CONSTRUCCIÓN DE LIBRERÍASDE cDNA Y GENÓMICAS
2. DESCUBRIMEINTO DE LAS ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN (ENZIMAS DE RESTRICCIÓN)
3. DESCUBRIMIENTO DE LA REACCIÓNDE POLIMERIZACIÓN DE CADENA OPCR (POLYMERASE CHAIN REACCTION)
Técnicas de DNA Recombinante
El problema: ¿Qué material genético vamosa manipular y cómo lo vamos a hacer?
• Aislar secuencias de DNA
• Obtener múltiples copias de ellos
TECNICAS
• Clonamiento Molecular
• PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
ANALISIS DE GENES
Se requiere:
CLONAMIENTO MOLECULAR HERRAMIENTAS BASICAS
• Enzimas de restricción
• Vectores
• DNA ligasa
• Células huésped
*
Enzimas de Restricción
DIGESTION DEL DNA POR ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Sitio de corte
ESENZIMAS de RESTRICCION Sitio de corte de enzimas de restricción Sitios de corte de endonucleasas de restricción
Las flechas indican los enlaces fosfodiester sobre los que actúa cada enzima
CLONAMIENTO MOLECULAR HERRAMIENTAS BASICAS
• Enzimas de restricción
• Vectores
• DNA ligasa
• Células huésped
Características básicas de un vector de clonamiento
• Origen de replicación autónomo
• Gen marcador de selección
• Sitios únicos de restricción
Componentes básicos de un vector de clonamiento plasmidial que puede replicar en una célula de E.coli
Caja de clonaje múltiple
codifica proteína de resistencia a
ampicilina
Origen de replicación
Región de inserción de DNAExógeno
CromosomaFragmento de
DNA libre
1» divisi—n celular
2» divisi—n celular
Fragmento de DNA insertado en un plasmidio
1ª división celular
2ª división celular
¿PORQUE EL USO DE UN VECTOR ?
TIPOS DE VECTORES
kpb
inserto
Plasmidios 3-5bacteriofagos 15BACS 300 YACS 2000
CLONAMIENTO EN PLASMIDIO
EcoRI PvuII
Sitio de corte Sitio de corte
Extremos cohesivos Extremos romos
Vector plasmidial cortado con EcoR1 y PvuII
DNA cromosomal cortado con EcoR1 y PvuII
CLONAMIENTO MOLECULAR HERRAMIENTAS BASICAS
• Enzimas de restricción • Vectores
• DNA ligasa
• Células huésped
Unión de fragmentosde restricción que poseen extremos cohesivos
Fragmentos de DNA genómico
b + c
CLONAMIENTO EN PLASMIDIO
EcoRI PvuII
Sitio de corte Sitio de corte
Extremos cohesivos Extremos romos
Vector plasmidial cortado con EcoR1 y PvuII
DNA cromosomal cortado con EcoR1 y PvuII
CLONAMIENTO MOLECULAR HERRAMIENTAS BASICAS
• Enzimas de restricción • Vectores
• DNA ligasa
• Células huésped
PROPAGACION EN CELULA HUESPED
RESUMEN DE CLONAMIENTO
Enzimas de restricción
DNA Ligasa
Vector
Célula huésped
CLONES que contienen diferentes fragmentos del genoma = GENOTECA
CONSTRUCCIÓN DE LIBRERÍAS DE cDNAY DE DNA GENÓMICO
USO DE VECTORES -PLASMIDIOS-DNAs DE FAGOS-OTROS (BACs, COSMIDIOS, YACs, ETC).
GENOTECAS O LIBRERÍAS
Genoteca de cDNA
Obtención :
Clonamiento de cDNA obtenido mediante transcripción reversa de mRNA total.
vectores
+
ligación
transformación
Genoteca de DNA genómico
Obtención :
1. Fragmentación de todo el genoma mediante enzimas de restricción
2. Clonamiento de fragmentos en vectores
¿Cómo aislar un fragmento de DNA
de interés?
Aislamiento de un clon
-Uso de sondas radiactivas
- PCR
Identificación de un fragmento de DNA específico en las colonias transformadas
mediante HIBRIDIZACION CON SONDAS
MARCADAS
Clonamiento por PCR
CLONAMIENTO DE UN PRODUCTO DE PCR
libreria
Combinación de la transcripción reversa con PCR
RT-PCR
Cloning by RT-PCR
TTTTTTT PCR
cDNA
Corte con enzimas de restricción y ligación a un plasmidio
CLONAMIENTO DE UN PRODUCTO DE PCR
libreria
SECUENCIACION DEL DNA
Estudio de la función de un gen
Vectores de expresión
Vector de expresión en bacteriasVector de expresión en bacterias
Vectores de expresión en eucariotes
FUNCIÓN DE UN GENFUNCIÓN DE UN GEN
Herramientas de Estudio:
1. Análisis computacional en banco de datos: homología de secuencia con un gen de otro organismo cuya función se conoce.
2. Animales transgénicos y knock out.