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Análisis por DGGE de mutaciones en el exón 11 del gen CFTR
© MJ Alonso
G542X
G551D S549X 1717-
1G→A
Laboratorio Pediatría IBGM/CSIC
Laboratorio Pediatría IBGM/CSIC
d
m
D
M
RecombinantesNo recombinantes
DM
50%
D
M
d
m
d
m
D
M
D dM m
dm
50%
Laboratorio Pediatría IBGM/CSIC
GENGCACTGAATTCCCTGA
CGTGACTTAAGGGACT
EcoRI
GEN
GCACTGCATTCCCTGA
CGTGACGTAAGGGACT
1,2Kb
0,4Kb 0,8Kb
1/11/22/2
DNADNA DigestiónDigestión
ElectroforesisElectroforesis
BlotBlot
ReveladoRevelado
Laboratorio Pediatría IBGM/CSIC
CA CA CA CA CA
CA CA CA CA CA CA CA CA
Laboratorio Pediatría IBGM/CSIC
MICROSATÉLITES (VNTR)
CA CA CA CA CA CA CA CACA CA CA CA CA CA CA CA
CA CA CA CA CA CA CA CACA CA CA CA CA CA CA CA
CA CA CA CA CA CA CA CA
CA CA CA CA CACA CA CA CA CA
CA CA CA CA CACA CA CA CA CA
CA CA CA CA CA
Composición de los cromosomas en metafase
• Patrón de bandas• Bandas G/Q
• Bandas R
• Características• ADN rico en AT (55-60%)• Replicación tardía en fase S• Contiene pocos genes (la mayor
parte específicos de tejido)• Abundantes miembros L1
• ADN rico en GC (50-60%)• Replicación precoz en fase S• Contiene la mayoría de los
genes• Rico en secuencias Alu• Abundantes islas CpG
Cuantificación de cromosomas mediante FISH rápido prenatal en interfase
•Las trisomías del 13, 18, 21 y la monosomía del X son las
aneuploidías más frecuentes relacionadas con la edad materna
y las anomalías fetales
•El cariotipado prenatal precisa de 8 a 14 días para llevarse a
cabo
•El FISH prenatal un screening rápido de aneuploidías en
células de líquido amniótico no cultivadas en 2-3 días
Indicaciones clínicas diagnóstico rápido prenatal mediante FISH
•Sospecha de anomalía cromosómica y/o embarazo avanzado
(20 semanas)
•Estudio ecográfico sugerente de aneuploidía
•Edad materna avanzada
•Indicación bioquímica de aneuploidía fetal
Transtornos monogénicos para los que existe detección selectiva
familiar y diagnóstico prenatal mediante estudio del ADN
•Neurofibromatosis Ligamto./mutación directa
•Distrofia miotónica Mutación directa
•A. Falciforme Mutación directa
•X frágil Mutación directa
•Hemofilia A Ligamto./mutación directa
•E. De Huntington Mutación directa
•D. M. Duchenne Ligamto./mutación directa
•Cáncer de mama familiar Rastreo/ ligamiento
•Hemocromatosis Mutación directa
•Fibrosis quística Ligamto./mutación directa
INDICACIONES PARA EL DIAGNÓSTICO PRENATAL MEDIANTE
AMNIOCENTESIS
•EDAD MATERNA>35 AÑOS
•UN HIJO ANTERIOR CON ANOMALÍA CROMOSÓMICA
•Hª DE ANOMALÍA CROMOSÓMICA EN UNO DE LOS PADRES
•Hª FAMILIAR DE DEFECTO GENÉTICO DIAGNOSTICABLE MEDIANTE
ANÁLISIS BIOQUÍMICO O DEL DNA
•RIESGO DE D.T.N.
ERRORES CONGÉNITOS DEL METABOLISMO DIAGNOSTICABLES
MEDIANTE AMNIOCENTESIS Y/O C.V.S
Aminoácidos•Orina de jarabe de arce•Acidemia metilmalónica
Hidratos de Carbono•Glucogenosis tipo 2•Galactosemia
Ezs. lisosómicas•Gangliosidosis•Mucopolisacaridosis•Enf. de Tay-Sachs
Met. De las purinas•Lesh Nyham
Met. Peroxisómico•Enf. de Zellweger
• Uso de técnicas moleculares o citogenéticas durante la Uso de técnicas moleculares o citogenéticas durante la fertilización in vitro (FIV) con el fin de seleccionar fertilización in vitro (FIV) con el fin de seleccionar embriones libres de una determinada característica embriones libres de una determinada característica genética antes de ser transferidos al útero. genética antes de ser transferidos al útero.
• Esta tecnología se desarrolló con el objeto de ofrecer Esta tecnología se desarrolló con el objeto de ofrecer una opción a las parejas con un riesgo significativo de una opción a las parejas con un riesgo significativo de una enfermedad genética severa, pero que se oponen al una enfermedad genética severa, pero que se oponen al aborto. aborto.
• El diagnóstico genético preimplantacioal se realiza a El diagnóstico genético preimplantacioal se realiza a partir de una sola célula de una blastómera de 6-10 partir de una sola célula de una blastómera de 6-10 células tras la FIV.células tras la FIV.
Diagnóstico genético preimplantacional
Reproducción asistidaFecundación in vitro
Cultivo embrionario in vitro
Diagnóstico genético preimplantacional
Día +1 Día +2 Día +3
Biopsias embrionariasAbertura parcial de la zona pelúcida
Diagnóstico genético preimplantacional
Disolución química/mecánica Láser
Biopsias embrionariasExtracción de blastómeros
Diagnóstico genético preimplantacional
•Células íntegras
•Células con núcleo
•Una/dos células
Margen de tiempo: 3 días post-inseminaciónMargen de tiempo: 3 días post-inseminación
Las células se analizan por FISH para las anomalías Las células se analizan por FISH para las anomalías cromosómicas o PCR para análisis mutacional. cromosómicas o PCR para análisis mutacional.
Los embriones seleccionados pueden implantarse al final Los embriones seleccionados pueden implantarse al final del día.del día.
Diagnóstico genético preimplantacional
• Ventajas:Ventajas:– Diagnóstico muy precozDiagnóstico muy precoz– Sólo se transfieren embriones no afectos (o Sólo se transfieren embriones no afectos (o
portadores)portadores)
• Desventajas:Desventajas:– El coste es muy elevado. El coste es muy elevado. – Baja tasa de éxito en la implantaciónBaja tasa de éxito en la implantación– Se descartan embriones afectados o no Se descartan embriones afectados o no
utilizados. Lo que puede plantear dilemas éticos.utilizados. Lo que puede plantear dilemas éticos.
Diagnóstico genético preimplantacional
aa Aa AA
Bajo Alto
Bajo Alto
aaBbAabb
AABBAaBBAABb
aaBBAaBbAAbb
aabb
Bajo Alto
Bajo Alto
♀
♂
Bajo Alto
Riesgo de recurrencia (%) en la estenosis pilórica
Familiares Probandos masculinos Probandos femeninos Londres Belfast Londres Belfast
Hermanos 3,8 5,6 9,2 12,5
Hermanas 2,7 3,0 3,8 3,8
Riesgo de recurrencia en las enfermedades poligénicas
1. Mayor si hay más de 1 afecto en la familia.
2. Mayor si el probando presenta una forma severa.
3. Mayor si el probando es del sexo menos frecuentemente afectado.
4. Disminución rápida del riesgo en familiares más lejanos.
5. El riesgo está relacionado con la prevalencia en la población
aa
Aa
AA
Algunas enfermedades se comportancomo monogénicas y multifactorialesal mismo tiempo
Causas genéticas y causas medioambientales en la enfermedad
1. Estudios en gemelos:gemelos MZ vs. DZ ----- concordancia vs. discordancia
Del mismo sexo
Para rasgos cuantitativos -------> coeficiente de correlación interclases
para un rasgo totalmente determinado por los genesgenes:CCI MZ=1,0CCI DZ=0,5
para un rasgo totalmente determinado por el ambienteambiente:CCI MZ=CCI DZ
Heredabilidad h=2(CMZ-CDZ)
h≈1,0 cuando CMZ ≈ 1,0 y CDZ ≈0,5
Algunas tasas de concordancia en gemelos MZ y DZ
Rasgo o enf. Concordancia HeredabilidadMZ DZ
Transtorno bipolar 0,79 0,24 1,0Alcoholismo >0,60 <0,30 0,60Autismo 0,92 0,0 >1,0Presión arterial (diast) 0,58 0,27 0,62Presión arterial (sist.) 0,55 0,25 0,60Labio leporino/P.H. 0,38 0,08 0,60Dermatoglifos 0,95 0,49 0,92Diabetes Mellitus (TI) 0,35-0,5 0,05-0,1 0,6-0,8Diabetes Mellitus (TII) 0,7-0,9 0,25-0,4 0,9-1,0Epilepsia (idiopática) 0,69 0,14 >1,0Estatura 0,94 0,44 1,0Sarampión 0,95 0,87 0,16Esclerosis múltiple 0,28 0,03 0,50Infarto (hombres) 0,39 0,26 0,26Infarto (mujeres) 0,44 0,14 0,60Esquizofrenia 0,47 0,12 0,70Espina bífida 0,72 0,33 0,78
Causas genéticas y causas medioambientales en la enfermedad
2. Estudios de adopción:
tasas de enfermedad en hijos de afectados vs. hijos de no afectados
Posibles sesgos:
- Factores ambientales prenatales
- Factores ambientales previos a la adopción