Post on 23-Jun-2015
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¿Embriones al freezer?
Universidad Ricardo PalmaFacultad de Ciencias Biológicas
Escuela Académico Profesional de BiologíaCurso: Taller de Biotecnología Animal
Ciclo 2010-I
Hidalgo Nicho, Eduardo Alejandro
¿Para qué nos sirve crio-preservar a los embriones?
Las ventajas se dan tanto desde el punto biológico como económico
En general, se tienen dos metodologías de
conservación de embriones
•Conservación in vitro (corto plazo)
•Conservación mediante criogenia (largo plazo)
Ventajas Desventajas
Cigotos
Máximo número de cigotos congelados
No permite la selección basada en la morfología
Se disminuye el trabajo de cultivo de embriones hasta etapas posteriores
La tasa de supervivencia es comparable a la de embriones clivados
Posible congelar cigotos a aquellas pacientes que presentan síndrome de hperestimulación
ovárica
Menos cuestionamiento ético
EmbrionesPermite selección embrionaria Con alta tasa de supervivencia
BlastocistosSelección de acuerdo con su desarrollo y
características morfológicasUn porcentaje menor de
embriones llega a la etapa de blastocistoCon alta tasa de implantación
Un poco de historia…
Smith A. V. (1953)ACP 15% de GlicerolEmbriones de conejo
Whittingham et al. (1973)Tº bajas de congelación y almacenamiento.
Protocolos de embrio-congelación
Congelación lenta
Descenso térmico lento Disminuye concentración de CPA (PROH, DMSO
y glicerol)Congeladores Programables
Supervivencia del 78%
Congelación ultrarápida o Vitrificación
Descenso térmico lento Disminuye concentración de CPA
(Etilenglicol)Congeladores Programables
Rev. Colombiana de Obstetricia y Ginecología Vol. 57 No. 4 • 2006 • (291-300)
Congelación lenta
1.5 M PrOH + 0.2 M sucrosa
Preparar 0.5 mL de PBS + 20 % de suero + 0.2 M de sucrosa
0.5 M PrOH
1.0 M PrOH
1.5 M PrOH
1. Colocar al embrión por 5 min.
2. Colocar al embrión por 5 min.
3. Colocar al embrión por 5 min.
Bajar la Tº 1Cº/min hasta los -7ºC (mantener por 10 min)
Bajar la Tº -0.3Cº/min hasta los -35ºC (Luego bajar rápidamente hasta los -50ºC – 150ºC)
Inmersión en N líquido
Para la descongelación se prepara PBSs + 0.2 M sucrosa, PBSs + 0.1 M sucrosa, y medio de cultivo + suplemento de suero. Preparar baño maría a 30ºC. Retirar embrión de N líquido, esperar 30s y someterlo al baño maría. Finalmente, cultivarlos a 37ºC.
Método Original de Whittingham
Roa N. et al. Revista científica FCV-LUZ. 1998. 40-52
Vitrificación
Seleccionar embriones
1. Mórula compacta
2. Blastocito temprano
3. Blastocisto extendido
Equilibración del embrión en la pajuela, en una solución crioprotectora del 50% (v/v) ó 4-6M aprox., durante 2-5 min., dependiendo del tipo de célula, concentración de crioprotector y temperatura durante el tratamiento.
Inmersión en Nitrógeno líquido y almacenamiento
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009;
cap
. 49
La vitrificación en algunos grupos
GrupoDesarrollo de blastocisto(%)
Referencia bibliográfica
Equino 88 Med Vet 2001; vol. 18 (9): 527-546.
Porcino33
Biology of Reproduction 2004; vol. 71: 432-437
Bovino35
Biology of Reproduction 1999; vol. 60: 534-539
Ratón 39,1 Arch. med. vet.2002; vol.34 (2)
Humano60,2
Fertilidad y Reproducción asistida 2009; cap. 49
Mukaida T, et al. Hum Reprod 2006; 21:3 246-52.: La vitrificación de balstocistos mejoran si se hace colapsar artificialmente la cavidad blastocélica antes de la vitrificación
Roa N. et al. Revista científica FCV-LUZ. 1998. 40-52
Método de Vitrificación
c
Tasa de embarazo in vivo producidas por diferentes protocolos de crio-preservación
c
c
c
c
c
c
F. Guignot et al. Theriogenology 66 (2006) 1004–1011
c
Estadio de Desarrollo Congelación lenta Vitrificación
Zigotos PROH40% de
EtilenglicolEstados divididos DMSO
Blastocisto PROH 1,5 M + 0,1 M de sucrosa
Protocolos de embrio-congelación
La congelación de embriones puede ser realizada en diferentes estadios de desarrollo, teniendo cada uno diferentes tasas de sobrevida, así como también
ventajas y desventajas. La eficiencia de un programa de congelación es evaluada por la observación de la integridad morfológica del embrión en descongelación,
la habilidad de clivar in vitro y su capacidad de implantación.
Rev. Colombiana de Obstetricia y Ginecología Vol. 57 No. 4 • 2006 • (291-300)
Los principales factores que afectan la congelación y
almacenamiento de los embriones
1. Tipo de concentración y los componentes crio-protectores
2. Formación de hielo
Fotografía criomicroscópica del oocito de ratón suspendido en 1 M MeSO4 y
enfriado a -32ºC/min.
3. Tasa de enfriamiento
4. Temperatura de almacenamiento
5. Tasa de descongelación
6. Tasa de dilución y temperatura
Exposición del embrión a los CPA
Existe una deshidratación parcial
Se trata de evitar la formación de los cristales de hielo
6% de solución de glicerol. (A) 0.1 8C/min,(B) 1 8C/min, (C) 10 8C/min, y (D) 100 8C/min y puesto en N líquido.
Leibo, SP: Theriogenology69 (2008) 37–47
Scherzer, J et al.: ReprodDomAnim43 (2008) 371–376
Leibo, SP: Theriogenology69 (2008) 37–47
Cálculo de la pérdida de agua en un oocito de ratón
suspendido en 1M de MeSO4 y enfriado a Tº bajo
cero.
Efecto de los crio-protectores permeables en el embrión de equino
Med Vet 2001; vol. 18 (9): 527-546.
Med Vet 2001; vol. 18 (9): 527-546.
Efecto de los crio-protectores permeables + no permeables en el embrión de equino
Luego de la crio-preservación viene la descongelación…
El tiempo de descongelación, varía según el método de congelación
Protocolo de Descongelación de la C.L.
La crio-preservación de diferentes especies
Bovinos: La tasa de preñez son del 80-90% ccon respecto a las obtenidas con embriones frescos control
Ovinos y caprinos: Los resultados son similares al anterior
Equinos: Experimentan una mejor respuesta a la vitrificación. Faltan más experimentos.
Seidel GE, Theriogenology, 65 (2006): 228-235.
Porcinos
Presentan una elevada sensibilidad a la Crio-preservación
Existe una remoción de lípido
Esakiet al, BiolReprod, 71: 432-437, 2004
Información adicional de la
Exposición