Post on 21-Sep-2018
“MARCADORES MOLECULARES COMO HERRAMIENTA PARA EL MEJORAMIENTO
GENÉTICO EN ANIMALES DE INTERÉS PECUARIO”
Cátedra Zootecnia General I Ing. Zoot. Andrea Longo
Que son los marcadores moleculares? Aplicaciones de Marcadores Moleculares en Mejoramiento genético animal
Diferentes tipos de Marcadores Moleculares y técnicas por las cuales se los evalua
Ejemplos de uso en animales de interés pecuario
Mejoramiento Genético Tradicional Programas de Selección y Cruzamientos: han incrementado notablemente los niveles productivos de la mayoría de las especies de interés pecuario. Esta basado principalmente en la selección fenotípica de individuos superiores. Muchos logros en importantes características.
Considerables dificultades en algunos casos debido principalmente a las interacciones genotipo-ambiente.
Hasta hace poco tiempo, todo lo que sabíamos acerca del potencial genético de un animal joven era el
promedio de sus padres.
No teníamos más alternativa a esperar 2 años para medir su desempeño, en el caso de las hembras, o
esperar 5 años para poder medir el desempeño de su progenie, en el caso de los machos.
Mejoramiento Genético Tradicional
Selección por caracteres Fenotípicos
Influencia del ambiente
Bajo número Caracteres de madurez Entrenamiento y
subjetividad
Mejoramiento Genético Marcadores Moleculares
Selección con Marcadores moleculares
Sin influencia ambiental Cantidad ilimitada Análisis en edades
tempranas Sencillos, rápidos y
objetivos
VS.
¿Cómo transmite la información genética?
Todos los seres vivos tienen su información hereditaria codificada en la molécula de ADN.
El juego completo de ADN de un ser vivo es
el GENOMA
GENÓMICA: Disciplina dentro de la biología molecular que caracteriza y estudia genomas completos de diferentes especies.
MOLÉCULA ADN (ácido desoxirribonucleico)
Función: transmitir la información genética.
Compuesto por miles de nucleótidos (adenina,
guanina, citosina y timina) que se agrupan en una
cadena.
Clave de la transmición genética:
“COMPLEMENTARIEDAD DE BASES”, donde adenina
y timina forman un par químico estable y citosina y
guanina forman otro par.
La molécula de ADN esta compuesta por 2
cadenas de ADN, complementarias una con la otra.
COMO PODEMOS APROVECHAR ESTA INFORMACIÓN?????
Esto es actualmente una importante herramienta que puede ser utilizada con el fin de mejorar genéticamente
los rodeos de animales de interés pecuario.
Es a partir de la segunda mitad del siglo XX que se desarrollan técnicas que permiten analizar y manipular
el ADN.
“La era genómica” aprovecha la información codificada en los genomas de los seres vivos.
ADN COMO FUENTE DE INFORMACIÓN
El ADN es duplicado mediante enzimas celulares especializadas: ADN polimerasas, que
realizan el correcto apareamiento de bases y síntesis de la nuevas cadenas de ADN
El desarrollo de tecnologías ha permitido llevar a cabo la replicación IN VITRO de fragmentos
de ADN específicos.
COMO ES LA REPLICACIÓN DEL ADN EN LAS CÉLULAS?
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Desarrollada por Kary Mullis en la década de los 80`
Lleva a cabo una síntesis enzimática IN VITRO de
millones de copias de un segmento específico de ADN
en presencia de una ADN polimerasa.
Permite estudiar los genomas de las especies e
identificar marcadores moleculares en estos.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Esta síntesis IN VITRO de fragmentos de ADN consta de 3 etapas:
Desnaturalización de la doble hebra de ADN, llevada a cabo a
una temperatura de 94º C que rompe los puentes H.
Hibridación de Primers con el ADN molde (donde encuentran
complementariedad de bases flanqueando la región de ADN de
interés). (Primers: pequeñas moléculas de ADN de hebra simple sintetizadas
artificialmente, de una longitud de 20 pares de bases que delimitan la
secuencia de ADN de interés)
Síntesis de la nueva cadena de ADN, llevada a cabo a 72º C por la enzima ADN polimerasa. Acá se produce la incorporación de los nuevos nucleótidos, utilizando como molde la secuencia de ADN original.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Estas 3 etapas se repiten 25 a 40 veces.
En cada ciclo se generan nuevos fragmentos de ADN y estos
sirven como molde para el siguiente ciclo, después de 25 ciclos
se producen más de 1 millón de copias de el fragmento de
ADN comprendido entre ambos primers (reacción con
crecimiento exponencial).
Podemos iniciar la reacción con cantidades mínimas de ADN
(del orden de nanogramos y picogramos) y terminar con
grandes cantidades de ADN de una secuencia específica.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Qué es necesario para amplificar ADN IN VITRO?
ADN polimerasa: Taq polimerasa recombinante
Buffer de enzima: contiene MgCl2,
dNTPs: dinucleotidos fosfatos: adenina, timina, guanina, citosina
Primers:
ADN molde: obtenido de diferentes tipos celulares
Agua estéril libre de ADNsas
Volumen de reacción: 15 a 25 ul
Termociclador
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Desarrollada por Kary Mullis en la década de los 80`
Lleva a cabo una síntesis enzimática IN VITRO de
millones de copias de un segmento específico de ADN
en presencia de una ADN polimerasa.
Nos permite estudiar los genomas de las especies e
identificar marcadores moleculares en estos.
¿QUE SON LOS MARCADORES MOLECULARES?
Posición específica en un genoma o sitio de referencia en el ADN de una especie que es posible identificar en
el laboratorio y que nos permite caracterizarlos genéticamente.
Herencia Mendeliana
Genética Molecular
Genética Cuantitativa
Genética de Poblaciones
Bioinformática
MEJORAMIENTO GENÉTICO CON MARCADORES MOLECULARES
Localizar e identificar variantes genéticas responsables
de la VARIANZA GENOTÍPICA de los CARACTERES de
INTERÉS ECONÓMICO
Baja Heredabilidad del carácter de interés
Difíciles de medir
La medida de esa variable está limitada a un
solo sexo
Medidos luego de dejar descendencia
Expresión tardía en la vida del animal
Medidos en estado Posmortem
CARACTERES DE IMPORTANCIA ECONÓMICA CON BENEFICIOS POTENCIALES:
TIPOS DE MARCADORES MOLECULARES
RFLP
RAPD
MICROSATÉLITES
SNPs
QTLs
Diferentes
características y
métodos de detección
y análisis.
Análisis de Parentescos e Identificación Individual
Identificación de Razas
Identificación de portadores de enfermedades
genéticas
Identificación de genes Favorables o No favorables
en los animales
Trazabilidad de Productos
Selección Asistida por Marcadores Moleculares
(SAM), incluida la Selección genómica
¿PARA QUE SIRVEN LOS MARCADORES MOLECULARES EN EL MEJORAMIENTO ANIMAL?
ADN EN LA IDENTIFICACIÓN INDIVIDUAL Y DE RAZAS Y LA DETERMINACIÓN DE PARENTESCO
Huellas de ADN o DNA Fingerprinting (1985 en
adelante)
Individuos de una misma especie comparten más
del 98% de su genoma. La fracción restante los hace
únicos
Una huella digital de ADN es un
conjunto de marcadores moleculares
cuya combinación resulta ser única e
irrepetible entre individuos de una población
ADN EN LA IDENTIFICACIÓN INDIVIDUAL Y DE RAZAS Y LA DETERMINACIÓN DE PARENTESCO
Actualmente se analizan paneles de marcadores
microsatélites para:
confirmación de parentesco, identificación de razas
y detección de mezclas,
implementación de protocolos de trazabilidad
incluso la resolución de
problemas legales como
el abigeato.
ADN EN LA IDENTIFICACIÓN INDIVIDUAL Y DE RAZAS Y LA DETERMINACIÓN DE PARENTESCO
A partir de 2005 incorpora Análisis de ADN: • verificación de identidad
• chequeo de parentesco en las especies inscriptas • identificación de enfermedades genéticas
ADN EN LA IDENTIFICACIÓN INDIVIDUAL Y DE RAZAS Y LA DETERMINACIÓN DE PARENTESCO
SERVICIOS OFRECIDOS: Bovinos/Equinos/Camélidos/Ovinos • Control de Genealogía en animales inscriptos. • Identificación de crías de transplante embrionario, tatuaje o identificación dudosa, cambios de crías, etc • Determinación de posible padre/madre de crías cuestionadas en su ascendencia. • Verificación de aptitud de trabajo de toros en servicio colectivo, determinando las crías producidas por cada uno de los toros utilizados.
MICROSATÉLITES
Secuencias cortas (de 1 a 6 bases nucleotídicas)
repetidas en tándem un alto número de veces
Utiliza poca cantidad de ADN
Son de un tamaño amplificable por PCR (100-350 pb)
Especie-específicos
Muy polimórficos, ideales para identificación de
individuos
HUELLAS DE ADN POR PCR
La región microsatélite se encuentra flanqueada por secuencias conservadas, a partir de las cuales se
diseñan cebadores específicos los que son utilizados durante la PCR.
ESTRUCTURA MICROSATÉLITE
A partir de distintos tipos celulares
OBTENCIÓN DE ADN
OBTENCIÓN
ADN
GENOTIPIFICACIÓN ALELOS
Geles de
Secuenciación
Secuenciador
Automático
AMPLIFICACIÓN
MICROSATÉLITES POR
PCR
ADN
Cebadores
Taq ADN
Polimerasa dNTPs
Buffer
PROCEDIMIENTO
• Objetivo: Asignación de paternidad en Charolais • Se analizaron muestras de sangre o semen de 108 vacas, 68 terneros y 7 toros. • Se analizaron 9 marcadores microsatelites bovinos • Análisis estadístico de los datos obtenidos • Los toros presentaron paternidad múltiple; sin embargo uno de ellos mostró mayor éxito reproductivo (mayor Nº de crías) • El panel de microsatélites fue capaz de asignar paternidad con 95 % de confianza en más del 75% de los animales analizados
TRAZABILIDAD POR MARCADORES MOLECULARES
La trazabilidad de la carne es de gran importancia para la seguridad
alimentaria, ya que garantiza su identidad y rastreabilidad desde el
origen hasta la comercialización.
Para esto es necesario IDENTIFICAR a los animales para asegurar el
seguimiento del producto en toda la cadena productiva, incluso
luego de la faena.
La Sociedad Internacional de Genética Animal (ISAG, por sus siglas
en ingles) recomienda ciertos marcadores microsatélites que sirven
como marcadores estándares para la comparación entre distintas
razas bovinas
TRAZABILIDAD POR MARCADORES MOLECULARES
Cada vez que un animal es faenado, se colecta una muestra
biológica del animal antes de que se pierda la identidad del mismo.
Se guarda con la identificación completa como muestra de
referencia.
En caso de que sea necesario establecer el origen del producto en
cualquier punto de la cadena, se toma la muestra (problema) para
obtener la huella genética del ADN, y este perfil se compara con la
muestra de referencia, y se determina si ambas huellas genéticas
son idénticas o no.
IDENTIFICACIÓN DE ENFERMEDADES GENÉTICAS
Identificación de portadores de ALELOS INDESEABLES que
predisponen a DEFECTOS y ENFERMEDADES.
Existe una Base de Datos que reúne información de defectos y
enfermedades que tengan un origen genético en más de 135
especies.
Mediante un test genético es posible identificar animales
portadores. El carácter de portador de un reproductor puede ser
asentado junto con el resto de la información del mismo.
EJEMPLO DE IDENTIFICACIÓN DE ENFERMEDADES GENÉTICAS
CITRULINEMIA (deficiencia de la enzima argininosuccinato sintetasa):
• Enfermedad recesiva letal metabólica en la cual la falta de esta enzima en
doble dosis (Homocigota recesivo) produce la muerte de los terneros
(durante la primer semana de vida), involucra un error en el metabolismo de
la urea.
• Dicha patología se genera por la presencia de una mutación puntual
permitiendo diseñar un diagnostico molecular directo por marcadores
moleculares PCR-RFLP.
• Uno de los toros portadores y diseminadores en la raza Holstein es Linmack
Kriss King, con amplia utilización como semental.
TÉCNICA EMPLEADA: MARCADORES RFLP
PROCEDIMIENTO:
• Se amplifica por PCR un fragmento específico
• Este fragmento es cortado con una la enzima de restricción
EJEMPLO DE IDENTIFICACIÓN DE ENFERMEDADES GENÉTICAS
CITRULINEMIA PROCEDIMIENTO:
• Se amplifica por PCR un fragmento específico de 176 pb del gen de la
enzima argininasuccinato sintetasa.
• Este fragmento es cortado con la enzima de restricción AvaII (RFLP)
Animal Sano
Animal Portador
EJEMPLO DE IDENTIFICACIÓN DE ENFERMEDADES GENÉTICAS
CITRULINEMIA
Una mutación en el codón 86 modifica el aminoácido y también
el lugar de reconocimiento de la enzima de restricción AvaII.
Animales sanos: se observan 2 fragmentos
Animales portadores: se observa un fragmento, ya que se
pierde un sitio de reconocimiento de la enzima
SELECCIÓN ASISTIDA POR MARCADORES MOLECULARES (SAM) y SELECCIÓN GENÓMICA
Utiliza información aportada por el ADN de un animal candidato
a ser seleccionado, juntamente con sus registros productivos y los
de individuos emparentados.
Utiliza esta información como un dato adicional para predecir sus
valores genéticos y basándose en esos valores genéticos
“mejorados” tomar las decisiones de selección.
La gran ventaja es que la información sobre el ADN se puede
tener al nacimiento del animal, a partir de una muestra de sangre.
Se identifican marcadores moleculares y se los correlaciona con
una característica productiva
SELECCIÓN ASISTIDA POR MARCADORES MOLECULARES (SAM) y SELECCIÓN GENÓMICA
En 2004 se obtuvo la secuencia de nucleótidos
completa del genoma bovino
A partir de esta información, en
2007 comenzó la comercialización
de un chip de ADN que permite
conocer la información sobre un
animal a partir del análisis de
54.000 marcadores SNP
MARCADORES SNP (Polimorfismos de un solo nucleótido)
Variación en el ADN debido a una
Mutación de una base nucleotídica por
otra en una posición específica de un
genoma
Di-alélicos
Abundantes y dispersos en el genoma
Muchos SNP están próximos a
regiones del ADN responsables de
caracteres de interés, es decir, estarán
asociados a genes
El manejo del ganado lechero (hembras en control
lechero, uso de la inseminación artificial, uso de toros con
evaluación genética) ha permitido una rápida
implementación de la tecnología genómica.
En bovinos de carne el progreso es más lento, dado que
hay diferencias entre las diferentes razas y no hay
información fenotípica tan precisa.
SELECCIÓN ASISTIDA POR MARCADORES MOLECULARES (SAM) y SELECCIÓN GENÓMICA
SELECCIÓN ASISTIDA POR MARCADORES MOLECULARES (SAM) y SELECCIÓN GENÓMICA
EVALUACIONES GENÓMICAS
A partir de la información sobre los miles de SNP de un animal, se
predice el Mérito genético del mismo para diferentes caracteres
productivos, aplicando “fórmulas” o “ecuaciones de predicción”.
Estas evaluaciones genómicas se incorporan luego en las
evaluaciones genéticas tradicionales aumentando su fiabilidad.
Varios países han empezado a incorporar la información del ADN
en las evaluaciones genéticas oficiales del vacuno de leche Holstein
(EEUU, España).
SELECCIÓN ASISTIDA POR MARCADORES MOLECULARES (SAM) y SELECCIÓN GENÓMICA
SELECCIÓN GENÓMICA EN GANADO LECHERO
Investigaciones realizadas muestran que, para un toro joven y una
vaquillona Holstein, podemos combinar el Promedio de los Padres
(PA) del animal con la información genómica para tener un “PTA
Genómico” con una confianza del 60 al 70% (mucho mejor que la
confianza de su PA por si sólo, que es sólo del 30 al 40%).
Ternera: la confianza de su PTA genómico es equivalente al que se
tendría al medir datos de varias lactancias del animal y de sus hijas.
Ternero: la confianza de su PTA genómico es equivalente al que se
tendría al medir datos de varias lactancias de sus hijas.
SELECCIÓN GENÓMICA EN GANADO LECHERO
Actualmente casi todos los toros jóvenes que entran a un centro de
I.A. de América del Norte son analizados genómicamente, y
muchas madres potenciales son analizadas también.
Los centros de I.A. han comenzado a comercializar semen de toros
genómicos jóvenes que tienen PTA genómicos, pero no hijas
propias.
Es necesario desarrollar sistemas de evaluaciones genómicas de
menor costo para que puedan ser utilizados en gran cantidad de
animales.
SELECCIÓN ASISTIDA POR MARCADORES MOLECULARES (SAM) y SELECCIÓN GENÓMICA
EJEMPLOS DE MARCADORES MOLECULARES ASOCIADOS A CARACTERÍSITCAS DE INTERÉS PRODUCTIVO
• Realizaron estudios en el genoma bovino en los genes de la Calpastatina (CAST) y de la Calpaína (CAPN1), dos enzimas que intervienen en los procesos de tiernizado post mortem de la carne. • Se identificaron marcadores SNP en dichos genes: 1 SNP en gen Calpastatina y 2 SNP en gen de Calpaína. • Se identificó una variante alélica favorable y otra no favorable para la terneza de la carne en la población de Angus, Hereford y Limousin. • Un reproductor puede ser evaluado con "tres marcadores moleculares" asociados a terneza, identificando en cada uno la presencia o ausencia de la variante más favorable, siendo una herramienta para seleccionar reproductores a una edad temprana.
"La genómica ofrece información adicional para integrarla a un programa de mejoramiento genético, pero la genómica no va a
reemplazar a la prueba de progenie".