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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN
BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEyNFCEyN--INTIINTI
Materia de Especialización CEBI_E11
RECUPERACIÓN Y PURIFICACIÓN DE MACROMOLÉCULAS
Docente a cargo: Mariano GRASSELLI
CEBI_E11_7 : CEM y CIH
Cromatógrafo de proteínas
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Size Exclusion Chromatography
(SEC)
Diferencias entre Cromatografías
adsortivas y NO adsortivas
• Volumen de separaciónen los métodos no adsortivos toda la separación de los
componentes de la muestra se efectúa en un volumen
que como máximo es igual al volumen total de la
columna.
• Dilución/concentración de la muestra:
los no adsortivos diluyen la muestra.
• Volumen de siembra
la cantidad de muestra en los no adsortivos siempre
es menor que el volumen de la columna.
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Nombre de la cromatografía de
exclusion molecular
Luego de su descubrimiento en los años '50,
esta técnica recibió distintos nombres
Cambió de nombre con los años
– Cromatografía de filtración en geles
(gel filtration-Nombre elegido por fabricantes)
– Cromatografía de permeación de geles.
– Cromatografía en tamices moleculares.
– Cromatografía de exclusión molecular.
(de acuerdo al principio cromatografico)
Características de la
cromatografía de exclusión
molecularLos factores (ventajas) que la hacen importante para la purificación de proteínas en gran escala son:1) Es el único método cromatográfico para el fraccionamiento
de proteínas basado únicamente en el tamaño molecular.
2) Las únicas limitaciones en cuanto a la concentración de soluto son su solubilidad y la viscosidad de la solución.
3) Es un proceso muy suave y las recuperaciones son altas.
4) La operación es isocrática.
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En los laboratorios de investigación(según 2 encuestas realizadas en 1968 y 1982)
Journal of Biological Chemistry
60% incluyen un paso de CEM.
En la industria hay cierta reticencia por los problemas (desventajas) siguientes:1) Bajas productividades por la escasa capacidad
de las columnas.
2) Bajas eficiencias de columna.
3) Provoca dilución del soluto.
4) Falta de información acerca de los costos de las operaciones en gran escala.
Estructura química y propiedades de
las matrices cromatográficas de CEM
En base a Dextrano• SEPHADEX (Dextrano + epiclorhidrina) Pharmacia.
• SEPHACRYL (alil-dextrano + bisacrilamida) Pharmacia.
En base a AgarosaSEPHAROSE (Agarosa sin entrecruzamiento) Pharmacia.
SEPHAROSE CL (Agarosa + 2,3 dibromopropanol) Pharmacia.
En base a CelulosaCELLUFINE (Celulosa sin entrecruzamiento) Amicon.
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De composición mixtaSUPERDEX (dextrano y agarosa entrecruzados) Pharmacia.
En base a polímeros sintéticosTRISACRYL (metacrilatos) IBF.
ULTROGEL AcA (Acrilamida + bisacrilamida) IBF.
FRACTOGEL (copolímero de oligoetilenglicol, glicidil
metacrilato y pentaeritol dimetacrilato) Merck.
BIOGEL (acrilamida-metilenbisacrilamida) Bio-Rad.
El volumen total de una columna (volumen de lecho o "bed volume") es la suma de 3 componentes: V0, Vi y Vm.
•V0 (volumen muerto)
es el volumen de líquido exterior a las partículas de la matriz cromatográfica.
•Vi (volumen de imbibición):
es el volumen de solvente que está dentro de los poros de las partículas de la matriz cromatográfica.
•Vm (volumen de matriz):
es el volumen ocupado por la matriz cromatográfica en sí.
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Representación gráfica
Me independizo del vol de la columna
Me independizo del vol de la columna
y empaque
Volumen de elucion (Ve)
Depende de las dimensiones de la columna y del empaque
(si las partículas de matriz cromatográfica están más o menos compactadas.
Ve/Vt, Ve/V0, y R
Son valores independientes de las dimensiones de la columna pero dependientes de cómo se la haya empacado.
Kd y Kav
Son expresiones del comportamiento de un soluto independientes de las dimensiones de la columna y del empaque.
Kd representa la fracción de la fase estacionaria a la que puede acceder por difusión una determinada sustancia.
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Compresibilidad de las matrices
Superosa 6
Superosa 12
> entrecruzamiento > rigidez pero < rango de fracc
Tipos de matrices de SEC
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Relación entre Tpo ret y peso molecular
Optimización del volumen de
muestraOperación: desalado
Aumento del
volumen de
muestra
Volumen óptimo
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Efecto de la viscosidad sobre la
Rs
Aumento de
la viscosidad
de muestra
Modo de funcionamiento
Siempre se trabaja en columna
•Batch
•Continuo
Columnas
• Verticales
• Radiales
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Columnas radiales
Entrada por centro Entrada por exterior
Operación de sistemas continuos
Columna anular con rotación
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Aplicaciones de la CEM
Hay 3 aplicaciones potenciales de la
CEM a nivel industrial:
– Separación de grupos
– Fraccionamiento
– Concentración de macromoléculas
Separación de grupos
Desalificación
Cambio de buffer
Se trabaja con dos sustancias (o grupos) de muy diferente Ve.
Kd = 1 (sal) y otra con Kd = 0 (macromolécula).
Se usan matrices cromatográficas de:
– Alto grado de entrecruzamiento
– Poros pequeños
– Alta resistencia mecánica.
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Condiciones de trabajo
(que atentan contra la resolución) – Flujos altos (2-3 volúmenes de columna/hora)
– Volúmenes de muestra grandes
(hasta 30% del volumen total de la columna)
– Columnas cortas
El largo de columna normal => 60-90 cm.
Para el escalado debe optimizarse la separación a escala de laboratorio
⇒se aumenta el tamaño de la columna en función del volumen de muestra
⇒Aumentar el diámetro
⇒Altura constante
⇒Flujo lineal constante
Diámetro = 5 cm Diámetro = 40
cm
Longitud de columna (cm) 60 60
Volumen total de columna
(l)
1,2 75
Volumen de muestra (l) 0,3 X=18,75
Flujo lineal (cm/h) 192 192
Flujo volumétrico (l/h) 3,8 240
Flujo volumétrico (Vt/h) 3,2 3,2
Ejemplo de escalado
columna para desalado
Constante
Constante
Constante
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Ejemplo: Eliminación de etanol de
la fracción V de Cohn
• Columna: 40cm (d) x 60 cm (h) => 75 L
• Relleno Sephadex G-25 coarse
• Flujo Lineal 240 cm/h
• Muestra: 12 L fracción V90mg/ml HSA + 9% etanol
• Factor de dil 1,5-1,9
• Vol buffer 56 L
• Tiempo del proceso 15 min
16 % muestra
• Sanitización
– 2% NaOH
– 1% formaldehido
• Nro de ciclos útiles
– > 7000 o dos años de producción
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Fraccionamiento
Hay que separar sustancias de tamaños no tan distintos, dentro del rango de fraccionamiento de la matriz cromatográfica.
Las macromoléculas deben entrar parcialmente en los poros, por lo que deben usarse matrices cromatográficas de poros más grandes que para la separación de grupos
(en gral. Matrices poco entrecruzadas, baja resistencia mecánica).
Columnas de laboratorio => efecto pared
Como debe discriminarse entre 2 ó más sustancias no tan distintas, los flujos a utilizar son menores y el volumen de muestra sembrada también menor que en la separación de grupos (no más del 10% del volumen total de la columna).
Soluciones a la compresibilidad
columnas modulares en pilas (stack). Los módulos son de 15 cm de alto y se unen por cañerías
delgadas, con lo que se llega a la altura deseada por suma de módulos sin que haya problemas con el gel.
Si en primer modulo se tapa, se la puede reemplazar fácilmente.
La CEM en modo fraccionamiento sólo se usa al final de un proceso de purificación como acondicionamiento final (polishing) para eliminar los agregados de una preparación de una macromolécula.
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Escalado
• Usar soluciones con una viscosidad <=
4 cP (aprox 40 mg/ml de proteínas)
• Ajustar el largo de la columna para
obtener la Rs necesaria
• Ajustar el flujo para satisfacer el tiempo
del ciclo
• Aumentar el volumen de muestra
Aumentar el diámetro de la columna
Manteniendo
el mismo flujo lineal
la misma relación Vmtra/Vcol
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Diámetro = 5 cm Diámetro = 37
cm
Longitud de columna (cm) 60 60 (4 x 15 cm)
Volumen total de columna
(l)
1,2 64
Volumen de muestra (l) 0,09 X= 5
Flujo lineal (cm/h) 16,2 11,25
Flujo volumétrico (l/h) 0,32 12
Flujo volumétrico (Vt/h) 0,27 0,18
Ejemplo de escalado
columna para fraccionamiento
Constante
Constante?
Constante?
Otros contaminantes de
bajo PM
Albúmina
Agregados
macromoleculares
Ejemplo industrial: último paso de la purificación de albúmina de plasma.
La muestra viene de CII y deben eliminarse los polímeros (agregados de albúmina) a
la vez que cambiarse el buffer para llevarlo al de la formulación de venta.
Previo al pasaje por columna la muestra se concentra por UF.
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Optimización del tiempo del
proceso
• El tiempo del proceso se puede reducir hasta en un 33%
– Estrategia 1: aplicar una nueva muestra después que 2/3 del volumen de la columna haya eluido.
(solo cuando los contaminantes eluyencerca)
– Estrategia 2: aumentar el flujo al máximo una vez que la proteína ha eluido.
Esta cromatografía explota las pequeñas
diferencias en parches hidrofóbicos
dispuestos en la superficie de las proteínas.
CIH se descubrió por casualidad durante el desarrollo de la
cromatografía de afinidad.
las proteínas se unían fuertemente a los brazos espaciadores
de hexametileno ( -(CH2)6-), aún sin extremos cargados (NH2
ó COOH).
Cromatografía de interacción
hidrofóbica (CIH)
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De la superficie de un proteína,
aproximadamente el 45 % corresponde a
residuos hidrofobicos y estos no están
distribuidos homogéneamente sino en
pequeños “parches hidrofobicos”.
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aumento de la entropía (∆S>0)
resultado de la eliminación de agua en estado ordenado a un
estado desordenado.
El objetivo que se persigue en esta
cromatografía es:
• Reducción de contaminantes críticos,
• Reducción de volumen de muestra
• Preparación para otra cromatografía de
alta resolución.
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Comparación de la resolución en la
separación de sustancias entre
cromatografías
Caf CII CIH CEM
Mayor resol. Menor resol.
Ligandos más comunes
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Incremento de la hidrofobicidad
fuerza de interacción
Metil < Etil < Propil < Butil < Fenil < Pentil < Hexil < Heptil < Octil
selectividad de adsorción
Tipo de ligando
También se ha encontrado que el hetero-átomo que une el ligando es importante en la selectividad.
Ej En la purificación de el antígeno de la Hepatitis B recombinante
la matriz S-butil > selectividad que el O-butil
Condiciones para la adsorción
Alta fuerza iónica
(p/mtra desconocida: Sulfato de amonio 1 M)
pH bajo para ligandos aromáticos y alto para ligandos alifáticos cargados positivamente.
(p/mtra desconocida: fosfato 50mM pH 7.0)
Alta temperatura.
Alto grado de sustitución.
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Sulfato de amonio
MAB de líquido ascítico
Efecto de la concentración
salina en la adsorción
% adsorcion
NaCl (M)
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Efecto de la temperatura en
el tpo de retención
Condiciones para la elución
Baja fuerza iónica.
Baja temperatura.
Solventes orgánicos.
Polioles (como el etilenglicol).
Detergentes no iónicos.
Iones caotrópicos (como el SCN)
pH alto para ligandos aromáticos y bajo para
los alifáticos cargados positivamente.
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Grado de sustitución
�Concentración de ligando
Es un parámetro a optimizar
Se pueden encontrar comercialmente matrices con
el mismo ligando y diferente grado de sustitución.
aumenta la fuerza de interacción
Matriz de base
Según la hidrofobicidad del soporte puede ser
necesario cambiar las condiciones de la HIC.
En gral. Las matrices tienen que ser muy
hidrofilicas para evitar una interacción
adicional (al ligando) y evitar la
desnaturalización proteica.
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Tipo de sal
Series de Hofmeister
> Efecto caotropico< Efecto salting out
Esquema de las superficies
de las matrices
Zona hidrofilicaZona hidrofóbica
RPRP HICHIC
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RP HIC
Grado de sustitución ciento µmoles/ml 10-50 µmoles/ml
Longitud de ligandos C3-C18 C3-C8
Soporte silica-polímeros Hidrogeles y polímeros
Eluyente Solvente / agua Soluciones acuosas
Estructura 3D proteica Se pierde parcialmente Se conserva
Resolución Alta Baja
Residuos que
interaccionan
Aa superficiales e
interiores
Aa superficiales
Aplicación Analítica Preparativa
Similitudes y diferencias
entre HIC y RP
Cromatografía de Fase
Reversa de proteínas
Se agrega al buffer de corrida TFA para neutralizar las cargas a
través del mecanismo de formación de pares iónicos
Se utilizan columnas de sílica-C18 de alta porosidad
(poros de 300 A)
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Ejemplo de cromatografía RP
Aplicaciones industriales: proteínas terapéuticas de bajo PM
estabilizadas por puentes disulfuro
Cambiar pH
Cambiar ligando
Cambiar densidad ligando
Ejemplo de cromatografía CIH
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Gradientes
Ligandos tiofílicos
• Interacción a través de Trp y Pheaccesibles al solvente
• Elución en condiciones suaves
• Regeneración
– NaOH 0,1 a 0,5 M
– 50% etilenglicol
– Etanol 20%
– Urea 6 M
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Tiofilico tipo 3-S
Muestra IgG humana
Matrices de interacción mixta
Mercapto etil piridina
Ligando para IgG
Adsorción en fuerza iónica fisiológica (0,1 – 0,20 M)
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Matrices para eliminar
detergentes