Caracterización de genes implicados en

enfermedades hereditarias

Genética y Genómica de EnfermedadesNeuromusculares y Neurodegenerativas

Novarino et al. Cell 2011; 147: 70-79

Mecanismos de Enfermedad

A. Pasado

Pedigrís informativos

Análisis de ligamiento

Cartografiado genómico

Secuenciación Sanger

Mutación identificada

Organismos modelos

Mecanismos de Enfermedad

y Tratamiento

B. Presente/Futuro

Secuenciación del genoma

Identificación de variantes

Modificadores, carga genética,…

Interactomas proteicos

Cribados de drogas terapéuticas

Células humanas

Approach Applies to Advantages Disadvantages

CANDIDATE GENE Anydisease

Easy to perform; Requires no mapping; Identifies directly themutation.

Relies heavily on current biologicalknowledge; Sucess rate very low

GENETIC MAPPING BY KARYOTYPING

Anydisease

Easy to perform; No familialcases required; Can detect (large)balanced events.

Low resolution, only detects largechromosomal aberrations; Mutationdetection requieres 2nd step.

GENETIC MAPPING BY LINKAGE ANALYSIS

Inheriteddisease

Easy to perform. Requires large families; Oftenidentifies large loci; Mutationdetection requieres 2nd step.

GENETIC MAPPING BY HOMOZYGOSITY MAPPING

Recessivemonogenicdisease

Small families can be used. Most useful for consanguineous fam;Often identifies large loci; Mutationdetection requieres 2nd step.

GENETIC MAPPING BY CNVANALYSIS

Monogenicdisease

High resolution CNV screening;No familial cases required; Can potentially identify small loci.

Only investigates CNVs; Cannotdetected balanced events; Mutationdetection requieres 2nd step.

WHOLE EXOME SEQUENCING (WES)

Anydisease

Detects most types of genomicvariation; Identifies directly themutation.

Unable to detect non-coding variants;Limited resolution for CNVs; Coveragevariability due to enrichment process; Relatively expensive.

WHOLE GENOMESEQUENCING (WGS)

Anydisease

Detects most types of genomicvariation; Identifies directly themutation.

Data analysis complex; even more expensive than WES.

Gilissen et al. Genome Biology 2011; 12:228

Approach Applies to Advantages Disadvantages

CANDIDATE GENE Anydisease

Easy to perform; Requires no mapping; Identifies directly themutation.

Relies heavily on current biologicalknowledge; Sucess rate very low

GENETIC MAPPING BY KARYOTYPING

Anydisease

Easy to perform; No familialcases required; Can detect (large)balanced events.

Low resolution, only detects largechromosomal aberrations; Mutationdetection requieres 2nd step.

GENETIC MAPPING BY LINKAGE ANALYSIS

Inheriteddisease

Easy to perform. Requires large families; Oftenidentifies large loci; Mutationdetection requieres 2nd step.

GENETIC MAPPING BY HOMOZYGOSITY MAPPING

Recessivemonogenicdisease

Small families can be used. Most useful for consanguineous fam;Often identifies large loci; Mutationdetection requieres 2nd step.

GENETIC MAPPING BY CNVANALYSIS

Monogenicdisease

High resolution CNV screening;No familial cases required; Can potentially identify small loci.

Only investigates CNVs; Cannotdetected balanced events; Mutationdetection requieres 2nd step.

WHOLE EXOME SEQUENCING (WES)

Anydisease

Detects most types of genomicvariation; Identifies directly themutation.

Unable to detect non-coding variants;Limited resolution for CNVs; Coveragevariability due to enrichment process; Relatively expensive.

WHOLE GENOMESEQUENCING (WGS)

Anydisease

Detects most types of genomicvariation; Identifies directly themutation.

Data analysis complex; even more expensive than WES.

Gilissen et al. Genome Biology 2011; 12:228

Actionablevariants

Actionablevariants

Modified by Newman et al., Genes (2014)

WESWGS

Screening of novel

candidate genes

Different approaches: WGS, WES & Gene panel

Los paneles de genes

permiten también el

descubrimiento de

genes→nuevos fenotipos

1.- Baja frecuencia

2.- Exónico o splicing

3- No sinónimo

4.- Predicho patológico

5.- Modo de herencia

6.- Estudios funcionales

Análisis de Segregación

70.000-90.000

variantes

~2000-5000

~500-700

~300-500

~110

Exoma (WES) Panel de Genes

1.- Baja frecuencia

2.- Exónico o splicing

3- No sinónimo

4.- Predicho patológico

5.- Modo de herencia

6.- Estudios funcionales

Análisis Multimuestra

300-600

variantes

~50-60

~10-20

~5-10

~0-2

Mutación patológica Mutación patológica

Las dos herramientas más utilizadas en el diagnóstico genético: WES y panel de genes

Different approaches: WGS, WES & Gene panel

Wright CF, FitzPatrick DR, Firth HV. Nat Rev Genet 2018

Diagnostic potential versus practicality and cost

Trio-based WGS

Highest yield (42%)

IT demand

Expensive Trio-based WES

Highest yield (40%)

IT demand~1,800-2,400€

Proband-only WES

Low yield (28%)

IT demand~600-800€

Gene panel NGS

Variable yield

Low IT demand~400-800€

Gene-to-GeneSlowEasy to analyseCheap: ~200€

ENFE

RM

EDA

D M

ON

OG

ÉNIC

A

ENFE

RM

EDA

D M

ON

OG

ÉNIC

A

ENFE

RM

EDA

D C

OM

PLE

JA

ENFE

RM

EDA

D M

ON

OG

ÉNIC

A

ENFE

RM

EDA

D C

OM

PLE

JA

MUTACIÓN PATOLÓGICA

VARIANTES DE SIGNIFICADO INCIERTO (VUS)

Whitcomb et al. Gastroenterology 2015

F1.III.2 Debilidad muscular leve de aparición tardía (debut: 44 años; edad: 77 años)

F1.IV.4 Cuadriparesia grave con compromiso respiratorio (debut: 3 años; edad: 44 años)

La expresión de las mutaciones en neuronas revela quelas mutaciones conducen a un incremento significativode muerte celular respecto al control wild-type.

TRPV4 c.805C>T (p.R269C)

1º. La variabilidad clínica, tanto intra como interfamiliar, asociada a una enfermedad Mendeliana omonogénica es extensa.

2º. La variabilidad clínica se debe en parte al fondo genético propio del individuo en el que coexistencambios con gran impacto en el fenotipo con otros de baja relevancia.

Key points

>80 genes!!

…distribuidos por todo el Genoma Humano

Charcot-Marie-Tooth y neuropatías relacionadas

Timmerman et al 2014 http://neuromuscular.wustl.edu

Funciones diversas

-Genes específicos del sistema nervioso

-Genes ubicuos

Charcot-Marie-Tooth disease

Hereditary Motor and Sensory Neuropathy (HMSN)Prevalence: 28 / 100 000

Main clinical features: - Onset in the first two decades of life- Progressive distal muscle weakness and atrophy- Distal sensory loss and foot deformities (pes cavus, hammer toes)- Involvement of the hands may follow as the disease progresses- Wide spectrum of additional symptoms (e.g. ataxia, hearing loss, optic atrophy, etc.)

DEMYELINATING CMT (CMT1, CMT4)Nerve Conduction Velocity (NCV) < 38 m/sNerve biopsy: demyelinating, onion bulbs.

CMT AXONAL (CMT2, AR-CMT2)Normal or slightly reduced NCV (> 42 m/s)Nerve biopsy: axonal neuropathy

INTERMEDIATE CMT (DI-CMT, RI-CMT)Intermediate NCV (30–45m/s)Pathological features of demyelinating and axonal forms

1009 patients evaluated

571 Excluded (not CMT)

275 Demyelinating 163 Axonal

34 Gypsy241 Caucasian • 42 GDAP1

- 18 AR

- 24 AD (CMT2K)

• 31 GJB1 (CMTX1)

• 10 MPZ (CMT2I/J)

• 7 HSPB1 (CMT2F)

• 4 MFN2 (CMT2A)

• 3 NEFL (CMT2E)

• 3 HSPB8 (CMT2L)

• 1 GARS (CMT2D)

• 1 KARS

CMT1

• 184 PMP22a (CMT1A)

• 25 GJB1 (CMTX1)

• 9 MPZ (CMT1B)

• 2 PMP22b (CMT1A)

• 1 NEFL (CMT1F)

CMT4

• 4 PRX (CMT4F)

• 2 SH3TC2 (CMT4C)

• 2 FGD4 (CMT4H)

12 Uncharacterized

61 Uncharacterized

• 26 SH3TC2 (CMT4C)

• 6 HK1 (CMT4G)

• 2 NDRG1 (CMT4D)

438 CMT

0 Uncharacterized

Sivera et al. Neurology 2013

Sigue habiendo un importante número de pacientes sin diagnóstico genético…

Series de CMT (Saporta et al., 2011, Murphy et al., 2012, Sivera et al., 2013)

En CMT2, diagnóstico genético en 60% de los casos

…Faltan genes implicados en CMT y neuropatías relacionadas por identificar

Dónde está la mutación/gen responsable?

Cómo distinguir entre mutación causal y variantes raras?

Cómo validar la mutación/gen?

Identificar la mutación

responsable de la enfermedad es

un gran reto…

Evidencias genéticas adicionales: otras familias → evidencia más potente

Identificar mutaciones en el gen candidato en otras familias con la misma enfermedad

Estudios celulares, moleculares y/o bioquímicos

WT vs. Mutante

Organismos modelo

Reproducir la enfermedad debido a mutaciones en el gen candidato

¿Alteraciones de la funcionalidad, estabilidad…?

Validación/caracterización de nuevos genes en NPH

Establecer correlación

genotipo-fenotipo

+

¡modificadores genéticos!

Variabilidad

clínica

Intra e Inter-familiarPenetrancia incompleta

Expresividad variable

Mutación causal

Asintomático

Más grave

1º. La variabilidad clínica, tanto intra como interfamiliar, asociada a una enfermedad Mendeliana omonogénica es extensa.

2º. La variabilidad clínica se debe en parte al fondo genético propio del individuo en el que coexistencambios con gran impacto en el fenotipo con otros de baja relevancia.

3º. En enfermedades con heterogeneidad genética suelen restar genes por descubrir.

4º. Genes con funciones muy diversas pueden conducir a fenotipos clínicos similares cuando estánmutados.

Key points

•Más rápido: Máquinas que secuencian con una velocidad de hasta 200 veces la secuenciación Sanger.•Más barato: El rendimiento tan alto abarata el coste de lectura/base. Objetivo: un genoma humano = 1000$

NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS)

Metodología Año Tiempo Coste económico

SecuenciaciónSanger

2001Proyecto Genoma Humano

13 años 2.7 billones de $

NGS 2008 5 meses 1.5 millones de $

NGS 2011 Unos días Menos de 10.000$

¿Cuánto cuesta secuenciar un genoma humano completo?

Chong et al. Am J Hum Genet 2015

NGS_Descubrimiento de genes

Study Design: Exome Sequencing

•Families are investigated independently

•Previous genetic analysis:

panel gene/common genes

•4 individuals / family

•At least two of them are affected subjects

•Distant relatives are preferred

I:2

II:2II:1

III:1 III:2

II:4II:3

III:3 III:4

II:5 II:6

III:7III:5 III:6

II:8II:7

III:8

II:10II:9

III:9 III:10

I:1

Selected candidate disease-causing mutations

1. Prioritize non synonymous SNVs

2. Changes segregating in heterozygosis/homozygosis

3. dbSNP variants excluded

Exome sequencing (CNAG)

Informatics analysis

How to determine a variant is a clinical mutation?

1.- Novel change?

•Database of DNA changes

•Database of pathological mutations

2.- Genetic analysis

•To confirm the change in the patient

•Segregation analysis

I:2

II:2II:1

III:1 III:2

II:4II:3

III:3 III:4

II:5 II:6

III:7III:5 III:6

II:8II:7

III:8

II:10II:9

III:9 III:10

I:1

3.- In silico analysis

•Study of the conservation of the variant

•Pathogenicity prediction

•Prediction of the protein structure PROBABLY DAMAGING

with a score of 1.000

4.- Functional approaches

•Biochemistry

•Cell analysis

•Animal models

1. El cambio detectado es novel?

2. El cambio cosegrega con la enfermedad

3. Los análisis in silico predicen que el cambio es probablemente deletéreo

4. La mutación altera la función de la proteína

OBJETIVOS

5. Investigar el nuevo cambio en familias pendientes de diagnóstico

• Heterogeneidad genética

• Consecuencias fenotípicas de las variantes noveles

* Relevancia del análisis de segregación

* Bases de datos

Dificultades

Diseño del Estudio

1º. La variabilidad clínica, tanto intra como interfamiliar, asociada a una enfermedad Mendeliana omonogénica es extensa.

2º. La variabilidad clínica se debe en parte al fondo genético propio del individuo en el que coexistencambios con gran impacto en el fenotipo con otros de baja relevancia.

5º. La tecnología actualmente disponible NGS nos permite conocer mejor el fondo genético de unindividuo: identificar cambios nucleotídicos que contribuyen al fenotipo (mutaciones clínicas ymodificadores genéticos).

3º. En enfermedades con heterogeneidad genética suelen restar genes por descubrir.

4º. Genes con funciones muy diversas pueden conducir a fenotipos clínicos similares cuando están mutados.

Key points

Secu

en

ciac

ión

de

Exo

ma

NO CAMBIOS CANDIDATOS

MUTACIONES CONOCIDAS

GENES CONOCIDOS

GEN NOVEL

Revisar información y reanalizar informáticamente los datos

Ensayo de patogenicidad

Diagnóstico logrado

FAMILY GENE CHANGE

412 New c.1627G>A, p. A543T Functional studies in progress

421 New c.613 C>A, p.P205T Functional studies in progress

423 AARS c.5delACTCT, p.T4NfX3 Functional studies in progress

424 BSCL2 c.455A>G, p.N152S Previously reported mutation

246 KIF1A c.31C>T, p.R11W 3D Structure of Protein

418 GARS c.794C>T, p.S265F Previously reported mutation

402 No candidate change

411 New c.1302G>T, p. Q434H Functional studies in progress

95 No candidate change

248 EGR2 c.1226G>A, p.R409Q Expression analysis & 3D Structure

237 MORC2 c.568C>T, p.R190W ATPase activiy

348 FIG4c.122T>C, p.I41T

c.446+5G>C

p.I41T : known mutation

Minigenes (exon skipping mutation)

83 DNAJB2 c.352+1G>A Previously reported mutation

Thirteen families investigated by exome sequencing

Two families with no candidate mutation

Once clinical data is revised,

informatics analysis… again

FAMILY GENE CHANGE

402 No candidate change

95 No candidate change

fHMN-95fCMT-402

Exome Sequencing

FAMILY GENE CHANGE

424 BSCL2 c.455A>G, p.N152S Previously reported mutation

418 GARS c.794C>T, p.S265F Previously reported mutation

83 DNAJB2 c.352+1G>A Previously reported mutation

Three families with known mutations

The DNAJB2 c.352+1G>A was first described in a family from Morocco

Mutational Screening

Gene Panel

Lupo et al. J Mol Diagn 2016

Frasquet et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2016

Four families with mutations in known genes

FAMILY GENE CHANGE

423 AARS c.5delACTCT, p.T4NfX3 Functional studies in progress

246 KIF1A c.31C>T, p.R11W 3D structure of the protein

248 EGR2 c.1226G>A, p.R409Q Expression analysis & 3D structure

348 FIG4 c.122T>C, p.I41T

c.446+5G>C

p.I41T : known mutation

Minigenes (exon skipping mutation)

c.31C>T (p.R11W) KIF1AfCMT-246p.Arg11

p.Trp11

The pocket where the ATP is placed is smallerand therefore, the ATP hydrolisis will not be

possible

Axonal CMT

fCMT-248

chr10:64573172 c.1226G>A p.R409Q EGR2

Four families with mutations in known genes: fCMT-248

0

20

40

60

80

100

120

EGR2 p.R409Q p.R409W p.R359W pcDNA3

perc

en

tag

e o

f acti

vati

on

Luc

*

* p value

<0.005

Cx32-Promoter LIGHT

EGR2

WT or Mutants

Luciferase

assay

DSS/CMT

1

CMT1CMT2

**

Expression analysis

p.R409Q mutation behavessimilarly to DBD mutations

Sevilla et al. Eur J Neurol 2015

FAMILY GENE CHANGE

412 New c.1627G>A, p. A543T

421 New c.613 C>A, p.P205T

411 New c.1302G>T, p. Q434H

237 MORC2 c.568C>T, p.R190W

Four families with mutations in new genes

The beginning of a new story…

Has the identified variant phenotypic effects?

Why does the novel gene lead to a neuropathy?

fCMT-237

c.568C>T p.R190W MORC2

•The mutation segregates in fCMT-237

•In silico analyses (SIFT and PolyPhen) predict that this change

could not be tolerated

•This is a novel change that is highly conserved

New axonal CMT gene: MORC2

fCMT-237

MORC2, a new gene involved in CMT

Sevilla, Lupo et al. Brain 2016

c.568C>T p.R190W c.74C>T p.S25L

Four families with mutations in new genes: fCMT-237

fCMT-440

fCMT-237

New axonal CMT gene: MORC2

Sevilla, Lupo et al. Brain 2016

fCMT-440

c.568C>T p.R190W

MORC2: clinical mutations

• ATPase domain

• Axonal CMT

• Predicted like damaging at the protein structure

• Healthy controls: No carried the change

•Position highly conserved in evolution

c.568C>T p.R190W c.74C>T p.S25L

• Exon 10•Symptoms 2nd decade•Severe incapacity in adulthood

• Exon 5•Congenital onset• SMA•Optic Atrophy

Sevilla, Lupo et al. Brain 2016

Microarchidia family: 5 human proteins

Shao et al.,2010

MORC2: Functions

PAK1

MORC2

Li et al.,2012

dsDNA breaks

AT

Pase

acti

vit

y

(Un

its

/mo

l)

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

***

WT R190W S25L D6A EMPTY

* p_valor < 0,05

MORC2 p.S25L shows a decreased of 50% in ATPase activity

MORC2: Functional Assay

Immunoblot of Morc2 on protein extracts from neural and non-neural mouse tissues RT-PCR using a primer pair in exons 20 and 21

Immunostaining of Morc2 (green channel) and MBP (red channel) on a sciatic nerve cross-section. DAPI staining (blue) shows the Schwann cell nuclei

MORC2: Expression analysis Sevilla, Lupo et al. Brain 2016

EX 5 EX 6 EX 7 EX 8 EX 10 EX 11EX 9

c.74 C>Tp.S25L

c.209 G>Tp.R70L c.521 A>G

p.E174G

c.568 C>Tp.R190W3 FAMILIES

7 FAMILIES1 FAMILY

1 FAMILY

CMT 2Z

MORC2: reported mutations/cases

MORC2 expression

in purified rat

sensory neurons

•The morphology of the

somas of infected neurons

was unaltered by

overexpression of WT or

mutated forms of

MORC2.

•The expression of

endogenous Morc2 and

overexpressed forms of

MORC2 were

predominantly detected in

the nuclei of the cells.

•All forms of MORC2 were

also detected in the axons

Sancho et al. Hum Mol Genet 2019

• Detailed analysis of axons

using SMI32 staining

revealed the presence of

axonal swellings in

neurons expressing the

p.S87L mutation.

• Further quantification

confirmed this observation

for the p.S87L mutation

while the p.R252W-

expressing neurons had

an axonal morphology

similar to the neurons

expressing WT-MORC2

Sancho et al. Hum Mol Genet 2019

MORC2 expression

in purified rat

sensory neurons

1 2 3

Climbing Assay

Gen silenciado en tubo 3

Afectación locomotora tras

el silenciamiento del gen

“New?”

En colaboración con Dr. Máximo Ibo Galindo

Filtrado de datos con un pipeline diferenteFBXO3, gen implicado en dHMN

1

2

3

NEW GENE??? c.1302G>T (p.Q434H)

DHTKD1 DNM2EGR2 FGD4FIG4 GANGDAP1 GJB1*GNB4 HARSHINT1 HK1**KARS KIF1BKIF5A LITAFLMNA LRSAM1MARS MED25**MFN2 MICAL1MPZ MTMR2NDRG1 NEFLPDK3 PMP22PRSP1 PRXRAB7A SBF1SBF2 SH3TC2SLC12A6 TDP1TFG TRIM2TUBA8 YARS

ATP7ABICD2BSCL2DCTN1HSPB3

PLEKHG5SETX

[9 genes]

AARSDNAJB2

DYNC1H1FBLN5GARSHSPB1HSPB8

IGHMBP2TRPV4

Genes CMT[40 genes]

Genes AED[7 genes]

*Incluida región promotora

**Sólo mutación fundadora

• Panel de 56 genes • 862 regiones• 186,34 kb• Cobertura 99,98%

Lupo et al J Mol Diagn 2016PANEL DE GENES

ID no.Clinical

formGene dbSNP/1000G

NucleotideChange

Amino acidchange

Pathogenic effect

DNA_1138 I-CMT HARS rs78741041/0.0055 c.14C>A p.Ala5Glu possibly damaging

SGT/018 dHMNPLEKHG5 rs140202670/0.0023 c.1225C>T p.Arg409Trp deleterious

SBF1 rs201776298/0.0045 c.868G>A p.Ala290Thr possibly damagingSGT/031 CMT2 MICAL1 rs201447051/0.0014 c.374T>C p.Leu125Pro deleterious

SGT/029 I-CMTPLEKHG5 Novel c.800G>A p.Arg267His deleterious

SETX rs151117904/0.0027 c.7727T>C p.Ile2576Thr possibly non-damagingSETX rs148568105 c.6013G>A p.Val2005Met deleterious

SGT/030 CMT2KIF1B rs121908162/0.0009 c.2480C>T p.Thr827Ile possibly non-damagingSETX rs61742937/0.0096 c.2975A>G p.Lys992Arg possibly non-damagingSETX rs79740039/0.0064 c.59G>A p.Arg20His possibly non-damaging

SGT/068 CMT2PRX Novel c.4077_4079delGGA p.Glu1360del possibly damaging

SLC12A6 Novel c.1421A>G p.His474Arg possibly non-damaging

SGT/072 CMT2 IGHMBP2 Novel c.1582G>A p.Ala528Thr possibly damaging

SGT/081 CMT2 DNM2 Novel c.2201A>G p.Asn734Ser possibly non-damaging

SGT/139 CMT2HARS Novel c.989A>G p.Tyr323Cys deleterious

HARS Novel c.679T>G p.Ser227Ala possibly damaging

SGT/142 CMT2MFN2 rs140234726 c.749G>A p.Arg250Gln possibly non-damaging

LRSAM1 Novel c.2136_2143delCATCGCCCinsC p.Ile713SerfsTer20 possibly damagingSGT/106 CMT2 LRSAM1 Novel c.2083_2095delTGCTGCCAGCAGTinsT p.Cys696_Cys699del possibly damaging

SGT/109 CMT2PLEKHG5 Novel c.718G>A p.Asp240Asn possibly non-damaging

SETX rs61742937/0.0096 c.2975A>G p.Lys992Arg possibly non-damagingSGT/114 I-CMT SETX Novel c.4289C>T p.Ser1430Phe possibly damaging

SGT/170 CMT2AARS rs138081804/0.0009 c.2185C>T p.Arg178Trp deleteriousKARS Novel c.1603C>T p.Arg535Trp possibly damaging

PANEL DE GENES14 CAMBIOS NOVELES Y/O VARIANTES CON MAF<1%

Lupo et al J Mol Diagn 2016

•En un panel de genes, se pueden identificar variantes candidatas a ser la

mutación causal en varios genes siendo muy complejo establecer si

realmente alguna de ellas es la mutación responsable de la enfermedad.

•Los paneles de genes permiten también el descubrimiento de genes

porque genes conocidos se pueden asociar a fenotipos nuevos, ampliando

el espectro clínico de las enfermedades relacionadas con un gen.

HUMAN GENOMES“Recent human genomic projects have revealed an unexpectedly high amount of deleterious variability in apparently normal, healthy individuals”

(Xue et al. Am J Hum Genet. 2012)

Ojo con las bases de datos de mutaciones patológicas

Heterozygous Homozygous

Missense substitutions predicted to be highly damaging

Disease-causing mutations (HGMD)

“Hasta el 27% de las variantes publicadas como patológicas, se ha demostrado más tarde que son realmente polimorfismos benignos”

(Pang et al. Transl Neurodegener 2017)

1º. La variabilidad clínica, tanto intra como interfamiliar, asociada a una enfermedad Mendeliana omonogénica es extensa.

2º. La variabilidad clínica se debe en parte al fondo genético propio del individuo en el que coexistencambios con gran impacto en el fenotipo con otros de baja relevancia.

5º. La tecnología actualmente disponible NGS nos permite conocer mejor el fondo genético de un individuo:identificar cambios nucleotídicos que contribuyen al fenotipo (mutaciones clínicas y modificadoresgenéticos).

3º. En enfermedades con heterogeneidad genética suelen restar genes por descubrir.

4º. Genes con funciones muy diversas pueden conducir a fenotipos clínicos similares cuando están mutados.

8º. Establecer qué cambios son causa primaria es complicado y cuáles son modificadores genéticos esmucho más complejo.

Key points

7º. La gran mayoría de enfermedades genéticas son raras y por tanto, la casuística es escasa.

6º. La forma fehaciente de demostrar que una mutación conduce a una enfermedad es con la descripciónde muchos casos con mutaciones en el mismo gen y un cuadro clínico similar.

9º. Los paneles de genes permiten el descubrimiento de genes en tanto que genes conocidos se puedenasociar a fenotipos nuevos, ampliando el espectro clínico de las enfermedades relacionadas con un gen.

NATURE | Vol 456 | 6 November 2008

An analysis using a larger number of markers requires a larger sample size. Testing 1 SNPmarker requires 248 cases, while testing 500,000 SNPs and 1 million markers requires 1,206cases and 1,255 cases, respectively, under the assumption of an odds ratio of 2, 5% diseaseprevalence, 5% minor allele frequency, complete linkage disequilibrium (LD), 1:1 case/controlratio, and a 5% error rate in an allelic test

EP Hong & JW Park Genomics Inf 2012; 10: 117-122

Genome Wide Association Studies (GWAS)

✓ Tasa de portadores: 1/40-1/60. Casos de novo: 1-2%

✓ Alrededor del 95% de los casos son debidos a la deleción de los exones 7 y 8 del gen SMN1

(Survival Motor Neuron 1)

✓ Fenotipo: Poliomielitis mucho más agresiva y generalizada; degeneración de motoneuronas del

asta anterior de la médula espinal; debilidad proximal y simétrica y atrofia progresiva de los

músculos esqueléticos.

✓ Tres tipos: - AME tipo I o aguda: aparición antes de los 6 meses.

- AME tipo II o intermedia: aparición antes de los 18-24 meses

- AME tipo III o crónica: aparición posterior 18-24 meses

7

c.840C>T

Modificadores Genéticos: Atrofia Muscular Espinal

SMN2 modificador genético de AME.

El nº de copias de SMN2 afecta a la

gravedad de la enfermedad: (i) AME

tipo I, 1 ó 2 copias de SMN2; y (ii)

AME tipo II y tipo III, 3 – 5 copias de

SMN2.

La deleción de SMN2 no causa AME:

10% población deleción homozigota

SMN2

Modificadores Genéticos: Atrofia Muscular Espinal

Locus AME. Contiene duplicaciones e inversiones de 500 kb que comprende 4 genes en la mayoría deindividuos sanos. Esta unidad de repetición puede variar de 0-4 copias por cromosoma lo que le confieregran inestabilidad al gen. La alta tasa de nuevas mutaciones encontradas en el 2% de pacientes con AME sedebe a un desigual entrecruzamiento de las unidades repetidas durante la meiosis.

CONVERSIÓN

CEN TEL

SMN1 NAIPψNAIP SMN2

Un modificador genético puede afectar diferentes aspectos de una enfermedad:

• Debut • Gravedad de la enfermedad• Duración de la enfermedad• …

Modificador genético

Locus genético que aumenta o disminuye/suprime el resultado de la mutación

causal primaria

¡modificadores genéticos!

AD-CMT2K Gran variabilidad clínica intrafamiliar

¿Identificar modificadores?

Mutaciones dominantes en GDAP1

Penetrancia incompleta

Expresividad variable

Estrategia:

Búsqueda candidatos → Funcionalmente relacionados con GDAP1

GDAP1 p.R120W

Asintomático

Más grave

Sivera et al., J Peripher Nerv Syst. 2010

Zimon et al., Neurology 2011

Papel en dinámica mitocondrial

Procesos Redox

Relación retículo-mitocondria

Homeostasis de calcio

Funciones GDAP1

Papel en dinámica mitocondrial

Procesos Redox

Relación retículo-mitocondria

Homeostasis de calcio

Vaciado de Ca2+ de los depósitos Activación del mecanismo del SOCE para rellenar de Ca2+ los depósitos

SOCE (Store-Operated Calcium Entry)

Funciones GDAP1

Pla-Martín et al. Neurobiol Dis. 2013SOCEGDAP1

JPH1:

Buen candidato a

ser modificador

funcional de GDAP1

SOCE

JPH1

GDAP1

Store-Operated Calcium Entry (SOCE)

homeostasis del Ca+2

→ cluster conservado en vertebrados

Pla-Martín et al. Neurobiol Dis. 2013

Hirata et al. Biophys J. 2006

- JPH1GDAP1

JPH1GDAP1

Homeostasis de Ca2+

(genes implicados en SOCE)consideramos…

JPH1: candidato a modificador de GDAP1

JPH1

Merged

Pla-Martín*, Calpena* et al. HMG 2015

→ JPH1 está presente en sistema nervioso

RT-PCR WB

→En tejido…

→A nivel subcelular…

…participar en

homeostasis Ca2+

→ MAMs (Mitochondrial-Associated Membranes)

JPH1 y GDAP1 coinciden en SNP (a nivel tisular) y en las MAMs (a nivel subcelular)

SOCEGDAP1

SOCE (rescate)GDAP1+GDAP1

¿es JPH1 modificador de GDAP1?

En colaboración con Dr. David Pla Martín

Modelo celular: Células SH-SY5Y GDAP1 KD

Pla-Martín et al. Neurobiol Dis. 2013

Experimentos de rescate

(homeostasis de calcio)

JPH1 es un modificador funcional de

GDAP1SOCEGDAP1

SOCE (rescate)GDAP1+JPH1

JPH1 rescata los defectos del SOCE de las células GDAP1 KD

GDAP1 p.R120W/+

JPH1 p.R213P/+

+/+

JPH1 p.R213P/+

GDAP1 p.R120W/+

+/+

+/+

JPH1 p.R213P/+GDAP1 p.R120W/+

+/+

+/+

+/+

Cuadro clínico

más grave

Dr. C. Márquez

Biopsia nervio sural

-Importante depleción de fibras mielinizadas

-Bulbos de cebolla

MRI

Infiltración grasa

Rastreo mutacional en JPH1 en familias CMT2K (GDAP1 p.R120W)

29 pacientes con mutación GDAP1 p.R120W

10 familias españolas no relacionadas

Secuenciación exones codificantes JPH1

JPH1 p.R213P

Posibilidad:

¿JPH1 p.R213P

modificador negativo?

GDAP1 p.R120W/+

JPH1 p.R213P/+

+/+

JPH1 p.R213P/+

GDAP1 p.R120W/+

+/+

+/+

JPH1 p.R213P/+GDAP1 p.R120W/+

+/+

+/+

+/+

GDAP1 p.R120W + JPH1 p.R213P

-Reducción en SOCE

CMT2K

GDAP1 p.R120W

GDAP1

p.R120WJPH1

p.R213P

-Incremento niveles basales Ca2+

JPH1 p.R213P →modificador negativo

GDAP1 p.R120W

Participa en la variabilidad

1º. La variabilidad clínica, tanto intra como interfamiliar, asociada a una enfermedad Mendeliana omonogénica es extensa.

2º. La variabilidad clínica se debe en parte al fondo genético propio del individuo en el que coexistencambios con gran impacto en el fenotipo con otros de baja relevancia.

5º. La tecnología actualmente disponible NGS nos permite conocer mejor el fondo genético de un individuo:identificar cambios nucleotídicos que contribuyen al fenotipo (mutaciones clínicas y modificadoresgenéticos).

3º. En enfermedades con heterogeneidad genética suelen restar genes por descubrir.

4º. Genes con funciones muy diversas pueden conducir a fenotipos clínicos similares cuando están mutados.

8º. Establecer qué cambios son causa primaria es complicado y cuáles son modificadores genéticos es muchomás complejo.

Key points

7º. La gran mayoría de enfermedades genéticas son raras y por tanto, la casuística es escasa.

6º. La forma fehaciente de demostrar que una mutación conduce a una enfermedad es con la descripción demuchos casos con mutaciones en el mismo gen y un cuadro clínico similar.

10º. La baja prevalencia de las enfermedades monogénicas hace que para la identificación demodificadores genéticos se recurra a aproximaciones relacionadas con su fisiopatología.

9º. Los paneles de genes permiten el descubrimiento de genes en tanto que genes conocidos se puedenasociar a fenotipos nuevos, ampliando el espectro clínico de las enfermedades relacionadas a un gen.

Genética y Genómica de EnfermedadesNeuromusculares y Neurodegenerativas

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