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CAMPYLOBACTERACEAE
Bacteriología
Curso de Bacteriología
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HISTORIA
Curso de Bacteriología
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THEODOR ESCHERICH 1886
Bacilos Gram negativos curvos en
DESCRIBE
OBSERVA
deposiciones de 16/17 niñosfallecidos por diarrea
Bacilos semejantes en gatosjóvenes con diarrea Vibrio felinus
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Sir McFadyean John (1853-1941)Royal Veterinary College LondonVeterinary pathology
Sir Stockman Stewart (1869-1926)Royal Veterinary College London
Los primeros aislamientos de especies del género Campylobacter fueronrealizados en el área de la microbiología veterinaria, en 1909 y 1913.
1918 Mac Fadyean y Stockmann y posteriormente Smith establecieron laparticipación de una bacteria microaerófila en el aborto del ganado bovino yovino, de morfología similar al género Vibrio, por lo que se lo llamó Vibrio fetus.
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En 1931, Jones y Little aislaron a partir de bovinos condisturbios intestinales “un vibrión” microaerófilo, al quedenominaron Vibrio jejuni.En 1944 Doyle describió “un vibrión” aislado del intestino decerdos con diarrea y lo denominó Vibrio coli.
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†
Elizabeth King 1966
“related Vibrio”
En 1957 E. King
Estudia las características deVibrios aislados de diferentesfuentes.
Estableció que no todoscorrespondían a Vibrio fetus .
Determinó dos grupos concaracterísticas serológicas ybioquímicas diferentes
Algunos eran capaces de crecer a25 y 37°C
Otros lo hacían a 42°C, a estoslos consideró como “Vibriosrelacionados” y se comprobó queeran agentes causantes de diarreaaguda.
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Prof. J.-P. ButzlerSt. Pierre Hospital - VUB
En 1972 Dekeyser y Butzler aislaronlos microorganismos de las heces depacientes con enteritis aguda usandouna técnica de filtración que permitíael pasaje de pequeños bastonescurvos a través de una membrana,pero retenía microorganismos fecalesmás grandes.
Butzler y Skirrow, Bolton y Robertson,Blaser y col, desarrollaron mediosselectivos que permitieron aislar estosmicroorganismos con relativa facilidady establecer su participación endiferentes cuadros infecciosos en elhombre.
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La primera asociación entre “vibriones” microaerófilosy diarrea en el hombre fue sugerida por Levy en 1946,el que realizó un estudio en un brote de gastroenteritissobre 357 pacientes en un penal en Illinois,observando en exámenes directos la presencia devibrios en el 20% de las muestras.
del géneroEn 1963, Sébald y Veron proponen la creaciónCampylobacter.
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Taxonomía
REINODIVISIONCLASEFAMILIAGENEROS
ESPECIE
ProcaryotaeGracillicutesProteobacteriaCampylobacteraceaeCampylobacterArcobacterSulfospirillumBacteroides ureolyticus
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PFEIFFER 1987
Describe:
- hallazgos clínicos post-mortem enintestino grueso compatibles conenteritis por Campylobacter
- bacterias espiraladas, de 2 a 3 vueltasregulares, móviles, no cultivables
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1909 -1919193119441957195819631971 –197219771992
fetos bovinos yovinosbovinos con diarrreacerdos con diarreagastroenteritis?vibriosis hepáticaDNAdiarrea en humanosmedio selectivotaxonomía
Vibrio fetusVibrio jejuniVibrio colirelated vibriosVibrio hepaticusGén. CampylobacterC. fetus subsp. jejuni
Fam. Campylobacteraceae
Los primeros aislamientos de especies del género Campylobacter fueronrealizados en el área de la microbiología veterinaria, en 1909 y 1913.
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CAMPYLOBACTER : taxonomía y nomenclatura
V. jejuni
V. coli
V. hepaticus
C. fetussubsp. jejuni
C. jejuni
C. coli
V. fetus
C. fetus subsp.intestinalis
C. fetus subsp.fetus
RelatedVibrios
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Metabolismo
No Fermentativo
Fermentativo
Género
Campylobacter
Vibrio
% G-C
29-35
44-50
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Vandamme y col. 1992
TAXONOMÍA DE BACILOS GRAM NEGATIVOS CURVOS
Helicobacter, Campylobacter, Arcobacter yWolinella
pertenecen a un grupo distinto de bacterias
Superfamilia VI del rARN
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Vandamme y col. 1992
Superfamilia VI del rARN
Campylobacter
Bacteroides ureolyticusCampylobacteraceae
Arcobacter
Flexispira
WolinellarRNA superfamilias I a V
Helicobacter
Organismos “Campylobacter-like” de vida libre
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Vandamme y col. 1992
Cambios de Nomenclatura
Campylobacter cinaedi
C. fenneliae
C. nitrofrigilis
C. cryaerophila
Wolinella recta
W. curva
Helicobacter cinaedi
H. feneliae
Arcobacter nitrofrigilis
A. cryaerophilus
Campylobacter rectus
C. curvus
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GÉNEROCAMPYLOBACTER
19especiesy
GÉNEROARCOBACTER
4especies
GÉNEROSULFUROSPIRILLUM
4especies
BACTEROIDESUREOLYTICUS
Vandamme y col.
FAMILIA CAMPYLOBACTERACEAE
1992
subespecies
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• A. nitrofrigilis*
• A. cryaerophilus
• A. butzleri
• A. skirrowii
ESPECIES DEL GÉNERO ARCOBACTER
CARACTERÍSTICAS
• bacilos gram negativos curvos
• cultivos viejos: formas cocoides yfilamentos largos
• monotricos: bipolar o monopolar
• oxidasa positivos
• crecen entre 15 y 37ºC (24ºC)
• aerobiosis y anaerobiosis
• G + C 27 a 31 mol%
• menaquinona - 6
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ESPECIES DEL GÉNEROSULFUROSPIRILLUM
• S. deleyianum*
• S. archaconense
• S. arsenophilum
• S. barnesii
CARACTERÍSTICAS
• bacilos gram negativos curvos
• oxidasa positivos
• crecen entre 8 y 36ºC
• de difícil cultivo ¿fastidiosos?
• G + C 32 a 42 mol%
• de vida libre
• asociados a presencia de metales
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ESPECIE
BACTEROIDES UREOLYTICUS
• bacilo gram negativo curvo
• inmóvil
• crece a 36ºC
• microaerófilo + hidrógeno
• metabolismo proteolítico
• asociados a infecciones de:
- tejidos blandos,uretritis,- enfermedad periodontal
• > número de cepas para clasificación definitiva
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Especies de Campylobacter
con patogenicidad conocida
• C. jejuni ssp. jejuni
• C. coli
• C. fetus subsp. fetus
• C. upsaliensis
• C. lari
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ESPECIES DE CAMPYLOBACTER
Campylobacter lari
• ssp. lari (cepas clásicas NARTC)
• ssp. ureasum (variedades atípicas -urea neg, AN S)
• ssp. subantaricum (animales subantárticos)
11th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and related organisms,Freiburg, 2001
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Especies de Campylobacter emergentes o
con patogenicidad no bien establecida
• C. jejuni ssp. doylei
•C. hyointestinalis (hyointestinalis, lawsonii)
• C. sputorum (sputorum, fecalis, ureolyticus)
• C. concisus
• C. mucosalis
• C. gracilis
• C. rectus
• C. curvus
• C. lenienae
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Especies de Campylobacter no patógenospara el hombre
• C. fetus subsp. venerealis
• C. showae
• C. helveticus
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CEPA CONTROL POSITIVO: C. jejuni
CEPA CONTROL NEGATIVO (DÉBIL): C. upsaliensis ATCC 43954
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CEPA CONTROL POSITIVO: Campylobacter jejuni ssp jejuni
CEPA CONTROL NEGATIVO: Escherichia coli
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OXIDASA (+)
IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA
CARACTERÍSTICAS DE CRECIMIENTO• 42ºC – 48 h de incubación• Microaerofilia
MORFOLOGÍA DE LA COLONIA(Colonia invasora)
MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA• Gram (bacilo Gram – curvo)
• Contraste de fase (bacilo curvo, móvil)
CATALASA (+)
Nuestro aislamiento corresponde aCampylobacter sp.
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Nuestro aislamiento corresponde a alguna delas especies del género Campylobacter
PRUEBAS BIOQUÍMICAS• hidrólisis del hipurato
• hidrólisis del indoxil acetato
• producción de H2S
• reducción de NO3y otras
TEMPERATURAS DE CRECIMIENTO• crecimiento a 26 – 37 y 42ºC
IDENTIFICACIÓN DEFINITIVA (determina especie)
SUSCEPTIBILIDAD A CEFALOTINA YÁCIDO NALIDÍXICO
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ESPECIE
C. jejuni ssp. jejuni
C. jejuni ssp. doylei
C. coli
C. lari
C. upsaliensis
C. fetus ssp. fetus
C. fetus ssp. venerealis
C. hyointestinalis
37 C
+
+
+
+
+
+
+
+
42 C
+
-
+
+
+
v
-
v
V = variable
CAMPYLOBACTER: TEMPERATURAS DE CRECIMIENTO
26 C
-
-
-
-
-
+
+
-
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fetus jejuni doylei liensis
Catalasa
Red. NO3
H2S
Hipurato
Indoxilacet.
Crecim. 25ºC
Crecim. 37ºC
Crecim. 42ºC
Sens. Ác. Nal.
Sens. Cefalot.
+
+
-
-
-
+
+
-
R
S
+
+
+/-
+
+
-
+
+
S
R
+
-
-
-
+
-
+
-
S
S
+
+
-
-
+
-
+
+
S
R
+
+
+
-
-
-
+
+
R
R
d/-
+
-
-
+
-
+
V
R
V
ALGUNAS PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN DE CAMPYLOBACTERC. fetus C. jejuni C. jejuni C. coli C. lari C. upsa-
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Patogenicidad de Campylobacter
Más frecuente en pacientescon diarrea
Hemocultivos positivos
Altos títulos de Ac.homólogos
Eritromicina
Monos- perros- pollos-
Países desarrollados:
Diarrea c/septicemia:
Pacientes c/diarrea:
Tratamiento antibiótico:
Inoculación Experimental:
cerdos- becerros
Diarrea experimental en humanos
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Infección Intestinal
• Trasmisión: oral-fecal
• Dosis infectante 5x102 a 106
• Mecanismos defensivos del huésped
• Factores de virulencia
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Mecanismos de virulencia
• ADHERENCIA
• INVASIÓN
• ENTEROTOXINA
• CITOTOXINAS
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Adhesinas
• Proteínas de membrana externa
• Lipopolisacárido
• Flagelo
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Campylobacter: producción deenterotoxina
Demostrada utilizando:
• Perfusión intestinal en ratas
transporte de electrolitos al intestino
• Asa ligada en intestino de rata
aumento de fluido intestinal
• Cultivos celulares (CHO)
efecto citotónico (aumento de AMPc)
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PERFUSIÓN EN ASA INTESTINAL DE RATA
Dr. Heriberto FernándezUniversidadAustral de Chile / Facultad de Medicina / Instituto De Microbiologia Clinica
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ASA LIGADA DE RATA
Dr. Heriberto FernándezUniversidadAustral de Chile / Facultad de Medicina / Instituto De Microbiologia Clinica
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Célula CHO normales
Célula CHO elongadas porefecto de la enterotoxina
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Célula VERO normales
CDT +C. jejuni
C. coli
74.2%
64.7%
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BIOTIPIA Y SEROTIPIA DE
Campylobacter
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BIOTIPIA DE Campylobacter
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Esquemas propuestos parabiotipia de Campylobacter
Hidrólisis del Hipurato y la Prueba Rápida para H2S.M.B. Skirrow and J. Benjamin. 1980. Differenciation of enteropathogenic campylobacter. J. Clin. Path.33:1122
Hidrólisis del Hipurato, Hidrólisis del DNA y Crecimiento en AgarExtracto de Levadura y Carbón. G.A. Hebert,
D.H. Hollis, R.E. Weaver, M.A. Lambert, M.J. Blaser and C.W.Moss 1982. 30 years of campylobacters:biochemical characteristics and a biotyping proposal for Campylobacter jejuni. J. Clin. Microbiol, 15: 1065– 1073.
Prueba Rápida de Hidrólisis del Hipurato, Prueba Rápida de H2Sy la Prueba de Hidrólisis del DNA.Lior, H. 1984. New extended Biotyping Scheme for Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, and“Campylobacter laridis”. J. Clin. Microbiol. 20:636-640
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Esquema de Biotipia del Dr. Hermy Lior
Lior, H. 1984. New extended Biotyping Scheme for Campylobacter jejuni,Campylobacter coli, and “Campylobacter laridis”. J. Clin. Microbiol. 20:636-640
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BIOTIPIA DE Campylobacter
Para todas las pruebas de debe tener encuenta: Utilizar cultivos que hayan crecido en Agar
Mueller Hinton Sangre.
Incubadas a 37°C o a 43°C y Bajo condicionesde microaerofilia o con mezcla de gasesrecomendado para Campylobacters.
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BIOTIPIA DE CampylobacterEsquema del Dr. H. Lior
PRUEBA RAPIDA DE HIDROLISIS DEL HIPURATO
PRUEBA RAPIDA DE H2S
PRUEBA DE HIDROLISIS DEL DNA
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PRUEBA RAPIDA DEHIDRÓLISIS DEL HURATO
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Hidrólisis del Hipurato
H2OÁcido hipúrico Benzoato de sodio + Glicina
Hipuricasa(hidrolasa)
Hidrólisis del ácido Hipúrico: Detección del benzoato
Detección de glicina
cloruro férrico al 7%
ninhidrina (oxidante)
Color púrpura CO2ninhidrina residual + NH3
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PRUEBA RAPIDA DEHIDROLISIS DEL HIPURATO
MATERIAL NECESARIO
Hipurato de sodio al 1% en H2ONinhydrina al 3.5% en butanol acetona (1:1)preparación fresca, cada semana.
Hipurato de sodio (0.1%)
Dispensar 0.4 mL de la solución de hippuratode sodio en tubos de 10 x 75 mm
Mantener los tubos tapados y congelados(-20°C) hasta su uso.
Los tubos Antes de ser usados, deben serdescongelados y puestos a temperaturaambiente.
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PRUEBA RAPIDA DEHIDROLISIS DEL HIPURATO
PROCEDIMIENTO
Colocar una pequeña asada de cultivo de 24 a 48 Hrs. en el tubo conla solución de hipurato de sodio.
Mezclar bien e incubar por 2 horas a 37°C en baño maría.
Luego, lentamente se agrega 0.2 mL del reactivo nynhidrina.NO SE DEBE MEZCLAR, reincubar por otros 10 minutos y leer.
Un color púrpura intenso (similar al cristal violeta) representa unareacción positiva y la ausencia de color o un color púrpura tenue indicauna prueba de hidrólisis del hipurato negativa.
Controles : + C. jejuni LIO 6;- C. coli LIO 8
•Lior, H. 1984. New extended Biotyping Scheme for Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, and “Campylobacter laridis” J. Clin. Microbiol. 20:636-640•H. wang, M.N. 1975. Rapid hippurate hydrolysis method for presumptive identification of Group B Streptococci. J. Clin. Microbiol. 1:114-115
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PRUEBARAPIDA DEHIDROLISISDELHIPURATO
Hidrólisis del Hipurato positivo Hidrólisis del Hipurato negativo
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54Curso de Bacteriología
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PRUEBA RÁPIDA DE H2S
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Prueba Rápida de H2S
MATERIAL NECESARIOEl medio FBP Agar ha sido modificado como sigue
A : Caldo Brucella (GIBCO) 2.9 gNa2HPO4 (anhidro) 0.118 gK H2PO4 (Anhidro) 0.023 gAgar (L28-Oxoid) 0.2 g
H2O 97 mLEsterilizar en autoclave por 15 minutos a 15 lb y dejar enfriar a 45°C.
Prepare separadamente las siguientes soluciones en agua destilada yesterilice con filtro:
B Sulfato ferroso 7H2O 10%C Metabisulfito de sodio 10%D Piruvato de sodio 10%
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1 mLsol B
+
1 mLsol C
MedioBase
A
1 mLsol B
+
1 mLsol C
+
1 mLsol D
1 mLsol C
1 mLsol B
Mezclarbien
1 mLsol B
Preparación del Medio FBP Agarmodificado
Mezcla B+C+D1 mL sol B
+1 mL sol C
1 mL sol B
A Medio baseCaldo Brucella (GIBCO) 2.9 g
Na2HPO4 (anhidro) 0.118 gK H2PO4 (Anhidro) 0.023 gAgar (L28-Oxoid) 0.2 gH2O 97 mL
B Sulfato ferroso 7H2OC Metabisulfito de sodio
10%10%
D Piruvato de sodio 10%
1 mLsol D
Ajustar el pH a 7.3, dispensar asepticamente 3 mL en tubos estériles 13x100 con taparosca. Preparar medios frescos cada dos semanas.
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Prueba Rápida de H2S
PROCEDIMIENTO
Coloque un inóculo grande semejante a una bolilla (con un asa de 5mm de diámetro) de un cultivo de 24 horas en el tercio superior delmedio de cultivo. NO MEZCLE.
Incube en bañomaría a 37°C por 2 horas.
El ennegrecimiento alrededor de la masa bacteriana representa unareacción positiva, usualmente comienza aparecer entre los 30-45minutos.
USE SOLO CULTIVOS DE 24 HORAS. La reproducividad con cultivosde 48 horas es muy pobre.
Controles : + C. jejuni LIO 6;- C. jejuni LIO 1
Lior, H. 1984. New extended Biotyping Scheme for Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, and “Campylobacter laridis”. J. Clin. Microbiol. 20:636-640
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H2S negativo H2S positivo
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HIDRÓLISIS DEL DNA
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DNasaÁcido Desoxyrribonucleico DNA depolimerizado
zonas claras alrededor
de la siembra
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Prueba de Hidrólisis del DNA
MATERIAL NECESARIO Agar DNA Azul de toluidina Modificado
Ácido Desoxyrribonucleico (DIFCO DNA Cat#3321-12-1) 0.3 g0.01 M Cloruro de CalcioCloruro de sodioAgar Oxoid L 28
1 mL10.0 g
6.5 mL0.05M Buffer TRIS pH 9.0 * 1000 Ml
Coloque todos los ingredientes en un matraz y caliente hasta que elDNA y el agar estén completamente disueltosEnfríe a 50°C y agregue
Azul de toluidina "O" al 3% 2.5 mL(Fisher Scientific Certified Stain CAT# T-161)
Mezcle bien y distribuya en placas Petri 25 mL en cada unaNO REQUIERE ESTERILIZACION.
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Prueba de Hidrólisis del DNA
PROCEDIMIENTO En la placa de Agar DNA- Azul de Toluidina modificado* Se inocula con un asa de 3 mm de diámetro y en un área circular
pequeña, a partir de cultivos de 24 - 48 horas. Incubar 43°C bajo condiciones de atmósfera de mezcla de gases
recomendado para Campylobacters por 24 a 48 horas. Una zona clara incolora o algo rosada alrededor del inoculo es
considerado una reacción positiva. En una placa se pueden probar varios cultivos y se debe incluir
controles, positivo y negativo. Control Positivo = C. jejuni LIO 36
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SEROTIPIA DECampylobacter
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Esquemas de Serotipia deCampylobacter Sistema Penner y Hennessy: detecta antígenos somáticos
termoestables; puede identificar 60 serotipos de C. jejuni y C.coli.
Penner, J.L., Hennessy, J.N. 1980. Passive hemagglutination technique for serotyping Campylobacter fetus subsp.jejuni on the basis of soluble heat-stable antigens. J. Clin. Microbiol. 12: 732-737
Sistema Lauwers S., Vlaes L. and Butzler J.P.: detecta antígenossomáticos termoestables; puede identificar 42 serotipos de C.jejuni y C. coli.
Lauwers S., Vlaes L. and Butzler J.P. 1981 Campylobacter serotyping and epidemiology, Lancet, 1,158
Sistema Lyor: detecta antígenos flagelares termolábiles; puedeidentificar más de 100 serotipos de C. jejuni, C. coli y C. lari.
factors.
Lior, H.D. et al. 1982. Serotyping of Campylobacter jejuni by slide agglutination based on a heat-labile antigenic
J. Clin. Microbiol. 15: 761-768.
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68Curso de Bacteriología
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SEROTIPIA DE Campylobacter jejuni yCampylobacter coli
MATERIAL NECESARIO DNasa (10 mg /vial DNasa Bovina pancreática Grade II N° de Catalogo 104 159
(EC3.1.21.1)
Boehringer Mannheim, Alemania)
Solución Stock DNasa – PBS 0.1% Agregar asépticamente 10 mL de PBS al vial, mezclar bien y
dispensar en tubos de tapa rosca alícuotas de 1 mL,mantener congelado a -20°C.
Solución de trabajo DNasa -PBS Diluir 1 mL de la solución stock con 4 mL de PBS Dispensar alícuotas de 0.5 mL en tubos con tapa rosca Los tubos que no están en uso se deben mantener
congelados a -20°C
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MATERIAL NECESARIOBuffer Fosfato Saline 0.01M , pH 7.2 (PBS).PBS-Merthiolate 1:10,000NaCl al 2%Láminas de vidrio (300 mm x 150 mm x 3 mm)Placas de Petri 90 x 15 mmAsas de siembra de 2 mm de diámetroMezcla de gases 5% O2, 10% CO2, 85 % N2
(Skirrow) Medio de cultivo: Mueller Hinton con 5% de sangre
de carnero en placas de Petri
Curso de Bacteriología
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PROCEDIMIENTO Previamente antes de realizar la serotipia:
Los cultivos deberán ser sembrados en placas deMueller Hinton sangre (frescas y húmedas) e incubadasa 37°C por 48 horas en atmósfera de mezcla de gasesrecomendado para Campylobacters.
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Campylobacter en Mueller Hinton sangre 5%
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Campylobacter en Mueller Hinton sangre 5%
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SEROTIPIA DE Campylobacter jejuni y C. coliPOR AGLUTINACIÓN EN LÁMINA
1. Verificar que el cultivo no este rugosoEn una lámina colocar una gota pequeña (10-20 mL) de DNasa y hacer unasuspensión bacteriana con el cultivo. Agregar 1 gota (50 ml) de ClNa al 2% ychequear si autoaglutina o no.
Si el cultivo esta rugoso, resembrar y volver a probar.
2. Si el cultivo esta liso se procede de la siguiente manera: Colocar una gota pequeña (10-20 ml) de DNasa-PBS en cada uno de 5
rectángulos en la lámina.
Emulsificar una pequeña asada del cultivo con DNasa-PBS.Agregar (50 ml) de cada pool (1-4) de antisueros y con un mondadiente ocon el asa mezclar bien en sentido longitudinal.Mover lámina con movimientos de vaivén por 45 segundos.LEER LA PRUEBA DE INMEDIATOLos resultados obtenidos después de 1 minuto o las reacciones débiles,podrían representar reacciones cruzadas.Si no se observa aglutinación con los pools 1 a 4, repetir el procedimientocon los pools remanentes (5 a 16)
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3. Lectura de ResultadosUtilizando iluminación indirecta sobre un fondo negro, registre el grado de aglutinación comosigue:
± = ligera aglutinación y el fluido turbio1+ = cerca del 25% de células aglutinadas y el fluido turbio.2+ = cerca del 50% de células aglutinadas y el fluido es moderadamente turbio.3+ = aproximadamente el 75% de las células aglutinadas y el fluido es ligeramente turbio.4+ = todas las células están aglutinadas y el fluido es claro.
El título del antisuero en los pools es usualmente definido como una dilución menor que ladilución más alta que muestre 3+ o una aglutinación más fuerte en 1 minuto.
4. INTERPRETACION DE RESULTADOS
Los antisueros no absorbidos en los pools, contienen aglutininas para antígenos heterólogos deCampylobacter jejuni y C. coli.Podrían producir reacciones de aglutinación en más de un pool.Los pools estan diseñados solo para screening.Los serogrupos son identificados con antisueros monovalentes y confirmados por antisuerosabsorbidos.Los antisueros han sido agrupados en lo posible para reducir la ocurrencia de reacciones en variospools.A veces las reacciones en más de un pool podría deberse a la presencia de más de un serotipo enel mismo cultivo. Esto se puede resolver haciendo la serotipia a partir de una clona de coloniasindividuales.
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DNasa- PBS
DNasa- PBS
DNasa- PBS - PBS
DNasa DNasa- PBS
Esquema de la Serotipia deCampylobacter
Serotipo LIO 36
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