Instrumentales de laboratorio

Introducción:

Todo laboratorio de Micropropagación debe constar con diferentes áreas de trabajo que aseguren condiciones de asepsia y esterilidad dependiendo de las tareas que se realicen. En la sala específica de micropropagación, se debe contar con un flujo laminar de tipo horizontal con un filtro HEPA de al menos 0.22 uM de tamaño de poro. El espacio destinado a tal fin debería poseer pisos, paredes y techos realizado con materiales de fácil limpieza.

Con el fin de evitar flujos de aire turbulento que perjudiquen el buen funcionamiento de los flujos laminares e incrementen la contaminación por agentes externos se deben crear salas de doble entrada (pre-cámaras) tanto en la/s salas donde se encuentran ubicados dichos equipos, como así también en las cámaras de plantas. Dichas salas deberán contar con presión positiva mediante la entrega de aire estéril forzado.

Objetivos:

Tener el conocimiento de los materiales de laboratorio para un correcto empleoReconocer los dipositivos a disposición dentro del laboratorio.

Revisión bibliográfica:

La biotecnología tiene sus fundamentos en la tecnología que estudia y aprovecha los mecanismos e interacciones biológicas de los seres vivos, en especial los unicelulares, mediante un amplio campo multidisciplinario. La biología y la microbiología son las ciencias básicas de la biotecnología, ya que aportan las herramientas fundamentales para la comprensión de la mecánica microbiana en primera instancia. La biotecnología se usa ampliamente en agricultura, farmacia, ciencia de los alimentos, medio ambiente y medicina. La biotecnología se desarrolló desde un enfoque multidisciplinario involucrando varias disciplinas y ciencias como biología, bioquímica,genética, virología, agronomía, ecología, ingeniería, física, química, medicina y veterinaria entre otras. Tiene gran repercusión en la farmacia, la medicina, la ciencia de los alimentos, el tratamiento de residuos sólidos, líquidos, gaseosos y la agricultura. La Organización para la Cooperación y Desarrollo Económico (OCDE) define la biotecnología como la "aplicación de principios de la ciencia y la ingeniería para tratamientos de materiales orgánicos e inorgánicos por sistemas biológicos para producir bienes y servicios".

Establecimiento de un laboratorio:

Un laboratorio de cultivo de tejidos se puede dividir esquemáticamente en áreas separas

para las diferentes funciones que se desarrollan en él. Sin embrago en la para algunas

funciones pueden desarrollarse en un mismo ambiente. Las áreas principales son (CIAT,

1993):

a) Área de preparación. Utilizado para la preparación de medios de cultivo, así como

para proveer un espacio de almacenamiento de los materiales de vidrio y de

plástico, b) Área de lavado y de esterilización. Pueden ser dos áreas conectadas entre sí, o un

solo ambiente, y puede estar localizada dentro del área general de preparación. Debe incluir un lavadero grande con agua caliente y fría, y una fuente de agua de alto grado de pureza, preferiblemente agua doblemente destilada

c) Área de transferencia. Es donde se realiza el trabajo de escisión, inoculación y trasferencia de los explantes a los medios de cultivo. Dado que este trabajo demanda los más altos niveles de limpieza, se recomienda la instalación de cámaras de flujo laminar, horizontal o vertical, de aire filtrado bajo presiónÁrea de incubación. Los cultivos se incuban en un cuarto apropiado o en un gabinete o en cámaras de crecimiento; estas pueden ser más eficientes en cuanto al control ambiental, pero son más costosas. El área de incubación o crecimiento in vitro Esa área debe incluir además, un espacio para cultivos en agitación y para cultivos estáticos en oscuridad (si son necesarios).

d) Área de observación y examen. Opcionalmente, los microscopios pueden estar en un área separada, para realizar observaciones periódicas de los cultivos, tanto en medios semisólidos como en líquidos.

Las áreas descritas hasta ahora se consideran el núcleo de todo laboratorio de cultivo de tejidos. Un laboratorio de producción comercial debería de tener además, lo siguiente:

e) Área de crecimiento. Lugar donde se acondicionara o aclimatarán las plantas salidas del área de incubación, para luego ser trasplantadas en macetas, camas, bandejas, etc. Esto se puedefitosanitarias.

Luego del trasplante, las plantas necesitan de un acondicionamiento gradual al campo, que puede hacerse usando nebulizadores, cámaras húmedas de plástico, etc.

Equipo de Laboratorio:

Para un laboratorio de tamaño medio se necesitan las siguientes piezas y equipo estándar (CIAT, 1993):

a) En el área de preparación: Refrigerador, balanzas (una macro balanza y una de precisión), potenciómetro (medidor de pH), plancha eléctrica con agitador eléctrico, frascos Erlenmeyer (120, 250y 500ml), botellas y material de vidrio o plástico.

b) En el área de lavado y esterilización: Autoclave manual o automático (grande o de mesa), destilador de vidrio, gradillas para secado, bandejas de aluminio y plástico de varios tamaños, recipientes de plástico grandes, estufas para esterilización y secado.

Conclusiones:

Hace posible establecer bancos de germoplasmas en pequeños espacios. Un clon mantenido in vitro puede ser propagado en cualquier época del año. Por medio de esta técnica es posible cultivar polen y anteras mediante las cuales

se producen plantas haploides.

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES STOCK (PRÁCTICA 02)

INTRODUCCIÓN

OBJETIVOS:

- Aprender a realizar el cálculo y pesado de sales, para la preparación de la solución stock.- Aprender a identificar los reactivos.- Aprender a preparar (dilución) las soluciones Stock.- Aprender a formular las distintas soluciones Stock, deacuerdo a los requerimientos según

la especie.

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA:

Solución Madre o Stock

Una solución es una mezcla homogénea cuyas partículas son menores a 10 angstrom. Estas soluciones están conformadas por soluto y por solvente. El soluto es el que está en menor proporción y por el contrario el solvente está en mayor proporción. Para diluir una solución es preciso agregar más % de disolvente a dicha solución y éste procedimiento nos da por resultado la dilución de la solución, y por lo tanto el volumen y concentración cambian, aunque el soluto no. Una solución madre o stock es una concentración de algún macro o micro nutriente necesario para el desarrollo adecuado de explantes vegetales.

Macronutrientes

Son los que se requieren en cantidades de milimoles y son los elementos requeridos en mayor cantidad, (carbono C), oxígeno (O) e hidrógeno (N), aminoácidos, Vitaminas, proteínas y ácidos nucleicos. Comúnmente se adicionan como nitrato o amonio y menos usual como nitrito. El nitrito se añade en concentraciones de 25-40 milimoles y el amonio de 2 a 20 milimoles (Gamborg y Jerry, 1981) fósforo (P) empleado casi universalmente en forma de fosfatos; sin embargo, la alta concentración de fosfato en solución puede detener el crecimiento, azufre (S) como sulfato y con la posibilidad que se agregue en forma de sulfito o como sulfuro, pero con menos efectividad (Nitsch y Nitsch, 1969). Como fuente de azufre, además de los sulfatos, sulfitos, se encuentran la cisteína, metionina o glutation. La deficiencia de azufre da por resultado una etiolación; magnesio (Mg) es componente fundamental de la molécula de clorofila; el calcio (Ca) es parte importante integral de la membrana celular, además confiere protección a la membrana contra los efectos deletéreos de los metales pesados, salinidad y pH muy bajos; usualmente se adiciona como cloruro de calcio (CaCl2 2H2O)m nitrato de calcio (Ca (NO3)2) y menos comúnmente como fosfato tricálcico (Ca 3 PO4); fósforo y el potasio como el catión mayor y se adiciona en la forma de KNO3, KI, KCI Y K2 PO4. En términos general fósforo, calcio, magnesio y azufre son requeridos en concentraciones de 1 a 3 milimoles para un buen crecimiento. Sin embargo, existe un antagonismo entre el Ca² y el Mg². Cuando la concentración de Mg²+ es alta, se requiere también alta Ca²+. La concentración comparativa es a menudo más importante que la concentración absoluta de iones.

MicronutrientesEquipo automático de preparación y dosificación de medio de cultivo.

Los micronutrientes o elementos menores se añaden en concentración micromolar. Los elementos menores son seis, a saber: Fierro (Fe), zinc (Zn), manganeso (Mn), cobre (Cu), cobalto (Co), boro (B) y molibdeno (Mo) que forman parte de la estructura de algunas proteínas vegetales, o vitaminas de interés bioquímico-fisiológico. De los 6 elementos, el Zn, Mn, Fe, Cu y Mo intervienen en la síntesis de la clorofila y en la estructura del cloroplasto (Sundqvist et al, 1980). El manganeso es considerado como uno de los más esenciales, junto con el boro y el fierro; además tiene importancia de la fotosíntesis en donde interviene en la conservación de la ultraestructura de los cloroplastos. De acuerdo a Galston y Hillman (1961), el Mn es un cofactor de las enzimas peroxidasa que permiten la oxidación del ácido indolacético en las células vegetales. Doershug y Miller (1967) mencionan que la omisión reduce el número de brotes en cotiledones de lechuga. Asimismo su adición en alta concentración puede compensar la carencia del Mo en raíz de jitomate (Hannay y Street, 1954). En ocasiones el manganeso puede remplazar al magnesio, en algunos sistemas enzimáticos (Hewitt, 1948).

RECOMENDACIÓN:

- Tener cuidado con la cantidad de un compuesto a añadir, en peso, puesto que está en función de su grado de hidratación. Lo relevante es mantener la molaridad del nutriente; a igual peso del compuesto, cuanto mayor grado de hidratación menor molaridad del

- La preparación correcta de las soluciones madres es muy importante, ya que van a ser estas los componentes del medio de cultivo final, donde va estar y desarrollarse el explante, un error en esta labor puede propiciar el total fracaso de la micropropagación, puesto que los explantes son muy susceptibles a variaciones (pH, sobredosis de un elemento) en el medio de cultivo.

- La calidad del agua es importante si es que va ser el solvente utilizado, debe ser destilada. Para evitar reacciones con los compuestos.

- Es importante contar con compuestos de calidad (que la pureza indicada en el envase sea la correcta), para realizar buenas dosificaciones, ya que cualquier error afecta el proceso en general. Tener proveedores de confianza.

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO (PRÁCTICA 03)

INTRODUCCIÓN

Una parte importante del cultivo in vitro son los Medios de Cultivo ya que en ellos se encuentran las sustancias necesarias para el crecimiento y desarrollo de los tejidos vegetales. Antes de realizar la asepsia del material vegetal que se va a introducir in vitro, es necesario disponer de Medios de Cultivo esterilizados y dosificados en recipientes adecuados.

OBJETIVOS:

- Conocer la clasificación, preparación, esterilización y distribución de los medios de cultivo.- Adquirir conciencia de la importancia que tiene la correcta preparación del medio de

cultivo en la micropropagación.- Adquirir práctica en el preparado de algunos medios de cultivo a partir de sus

componentes individuales.- Reconocer la necesidad de evitar la contaminación tanto de los medios de cultivo como de

los demás elementos utilizados en el laboratorio de microbiología.

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA:

Según su origen:

a) NATURALES: Son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente.

b) SINTÉTICOS: Son los medios que contienen una composición química definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.

c) SEMISINTÉTICOS: Son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.

Según su consistencia:

a) LÍQUIDOS: se denominan caldos y contienen los nutrientes en solución acuosa.

b) SÓLIDOS: se preparan añadiendo un agar a un medio líquido (caldo) a razón de 15g/litro. El agar es una sustancia inerte polisacárida (hidrato de carbono) que se extrae de las algas. Como esta sustancia no es digerida por las bacterias no constituye ningún elemento nutritivo. Este conjunto convenientemente esterilizado puede ser vertido en placas de Petri o en tubos de ensayo y presentan la posibilidad de aislar y diferenciar bacterias, "procesos que antes no eran posibles en medio líquido".

c) SEMISÓLIDOS: contienen 7,5 g de agar /litro de caldo. Se utilizan para determinar la motilidad de las especies en estudio. Actualmente se encuentran disponibles comercialmente con el agregado de agar.

Pasos para la preparación de medio de cultivo:

1. Mezclar las soluciones Stock.2. Homogenizar el medio de cultivo.3. Enrazar.4. Medir el pH.5. Adicionar el agar.6. Diluir el agar.7. Distribuir en los recipientes.8. Esterilizar en el autoclave.9. Guardar en anaquel durante 7 días.

CONCLUSIÓN:

- Para las distintas especies vegetales existen distintos medios de cultivo, debido a que cada especie tiene distintos requerimientos de nutrientes.

- Cada paso en el proceso de la preparación es muy importante para obtener un buen medio de cultivo.

- El medio de cultivo debe ser totalmente estéril para tener éxito en la micropropagación.

- Para hallar el medio de cultivo más óptimo se deben realizar ensayos debido a que las plantas tienen diferentes requerimientos ya sea por ser de distintas especies o por perteneces a distintos medio ambientes.