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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUIMICA
EFECTO IN VITRO DEL EXTRACTO HIDROALCOHOLICO DE
LAS INFLORESCENCIAS DE BEJARIA AESTUANS L. PURUM
ROSA FRENTE A STAPHYLOCOCCUS AUREUS,
ESCHERICHIA COLI Y CANDIDA ALBICANS
TESIS II
PARA OPTAR EL GRADO DE BACHILLER EN FARMACIA Y
BIOQUIMICA
AUTORES: RUIZ NORIEGA LUCIA DEL PILAR
REYES AVALOS ELDER MILER
TRUJILLO - PERU
2012
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DEDICATORIA
A mi familia, ese bastión de fuerza y
amor, siempre impulsándome, a mi
lado en cada decisión tomada. A
pesar de las dificultades, creyendo en
mi. Son los que siempre estarán y a
quienes les debo todo.
LUCÍA DEL PILAR RUIZ NORIEGA
Para mis padres, por su
comprensión y ayuda en los
momentos buenos y malos. Me
han enseñado a encarar las
adversidades sin perder nunca la
dignidad ni desfallecer en el
intento. Me han dado todo lo que
soy como persona, mis valores,
mis principios, mi perseverancia y
mi empeño, y todo ello con una
gran dosis de amor y sin pedir
nunca nada a cambio.
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ELDER MILER REYES AVALOS
AGRADECIMIENTO
Agradecemos a Dios, que nos ha
conservado con vida, salud y ha
puesto en nuestras vidas, personas,
sucesos, pruebas, virtudes e
inteligencia que nos ha llevado
hasta aquí.
A nuestra querida profesora asesora
Mg. Marilú Roxana Soto Vásquez y
co asesor Miguel Muñoz Ríos, por su
inteligencia y conocimientos, a
quienes les debemos que este trabajo
tenga los menores errores posibles.
Gracias por su dedicación.
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JURADO DICTAMINADOR
Dr. Vigo Alcántara Valdemar --------------------- PRESIDENTE
Dr. Ruiz Reyes Segundo Guillermo --------------------- MIEMBRO
Mg Soto Vásquez Marilú Roxana --------------------- MIEMBRO
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PRESENTACIÓN
Señores Miembros del Jurado:
En cumplimiento con las disposiciones vigentes emanadas del reglamento
de Grados y Títulos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la
Universidad Nacional de Trujillo, sometemos a vuestra consideración y
elevado criterio, el presente informe de tesis II titulado "Efecto in vitro del
extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria aestuans L.
“Purum rosa” frente a Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida
albicans”. Esperando que el jurado se sirva a calificar este trabajo según su
criterio establecido, a pesar de la existencia de alguna deficiencia
encontrada durante el desarrollo del presente trabajo de investigación.
Trujillo, Junio 2012
Reyes Avalos, Elder Miler Ruiz Noriega, Lucía del Pilar
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ÍNDICE
DEDICATORIA………………………………………………………………… i
AGRADECIMIENTO………………………………………………………….. ii
JURADO DICTAMINADOR…………………………………………..... iii
PRESENTACIÓN.……………………………..………………………. iv
RESUMEN……………………………………………………………….. vi
ABSTRACT…………………………………………………..………… vii
I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………… 1
II. MATERIAL Y MÉTODO……………………………………… 11
III. RESULTADOS…………………………………………………. 22
IV. DISCUSIÓN………………………………………………...….. 25
V. CONCLUSIONES……………………………………………… 31
VI. RECOMENDACIONES………………………………………….. 32
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………. 33
VIII. ANEXOS…………………………………………………...… 40
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RESUMEN
Gran parte de la terapéutica actual se basa en productos obtenidos a partir
de fuentes naturales, y en especial la fuente vegetal. Dentro de ella encontramos
una amplísima variedad de plantas, sobre todo en Perú, con metabolitos
secundarios importantes para la farmacología, que son utilizadas por gran parte de
la población de países en desarrollo, se calcula que es un 80% de esta población.
En Perú, Bejaria aestuans L. crece en la sierra del departamento de La Libertad y
es usada tradicionalmente en el tratamiento de algunos tipos de infecciones, como
las infecciones de tracto urinario e infecciones micóticas.
En este trabajo se plantea el siguiente problema: ¿Cuál es el efecto in vitro
del extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria aestuans L. “Purum
rosa” frente a cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida
albicans?
Como resultados, se identificaron los siguientes metabolitos secundarios
en el extracto hidroalcohólico de Bejaria aestuans L., obtenido por extracción
continua soxhlet: catequinas, cumarinas, polifenoles, flavonoides, saponinas,
antocianinas, triterpenos, esteroides, taninos y alcaloides; algunos de los cuales se
presume posee actividad antibacteriana y/o antimicótica, y se comprobó, mediante
el método de difusión en agar de Kirby Bauer, que el extracto hidroalcohólico de
Bejaria aestuans L., a concentraciones de 25 mg/mL, 50 mg/mL, 100 mg/mL y
200 mg/mL, posee actividad antibacteriana in vitro frente a Staphylococcus
aureus pero no muestra actividad frente a Escherichia coli y Candida albicans.
Palabras Claves: Bejaria aestuans L., efecto in vitro, extracto
hidroalcohólico, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans.
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ABSTRACT
Much of the current therapy is based on products obtained from natural sources,
particularly the plant source. Within it we find a wide variety of plants, especially
in Peru, with important secondary metabolites for pharmaceuticals, which are
used by much of the population of developing countries, is estimated to be 80% of
this population. In Peru, Bejaria aestuans L. grows in the highlands of the
department of La Libertad and is traditionally used to treat some types of
infections such as urinary tract infections and fungal infections.
This paper poses the following problem: What is the in vitro effect of
hydroalcoholic extract of the inflorescences of Bejaria aestuans L. "Purum rosa"
against strains of Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Candida albicans?
As a result, we identified the following secondary metabolites in the
hydroalcoholic extract of Bejaria aestuans L. obtained by Soxhlet continuous
extraction: catechins, coumarins, polyphenols, flavonoids, saponins, anthocyanins,
triterpenes, steroids, tannins and alkaloids, some of which are presumed to possess
antibacterial activity and / or antifungal, and found by the agar diffusion method
of Kirby Bauer, the hydroalcoholic extract of Bejaria aestuans L. at
concentrations of 25 mg / mL, 50 mg / mL, 100 mg / mL and 200 mg / mL, have
in vitro antibacterial activity against Staphylococcus aureus but shows no activity
against Escherichia coli and Candida albicans.
Keywords: Bejaria aestuans L., in vitro effects, hydroalcoholic extract,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans.
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I. INTRODUCCIÓN
En épocas en que el hombre sólo tenía a su disposición los recursos que
el planeta le otorgaba, buscó en éstos las herramientas para disminuir el dolor
físico y evitar la muerte. Entre los recursos más aprovechados por distintas
culturas a través de la historia, se encuentran los recursos minerales, animales y
vegetales. Éstos constituyeron hasta mediados del siglo XX los recursos
terapéuticos por excelencia 1.
Dentro de los reinos de la naturaleza que contribuyen hasta hoy en
disminuir síntomas y prevenir enfermedades, destaca el reino vegetal. Las
plantas, gracias a su maravilloso y complejo metabolismo, constituyen un
verdadero arsenal químico, del cual sólo se conoce con éxito un tercio,
considerando la variedad de especies existentes a nivel mundial y aquellas
inexploradas hasta hoy, sin considerar aquellas especies ya extintas 1,2.
Fue así como cada región del mundo desarrolló su forma de curar a
partir de plantas medicinales, que es única y característica, puesto que se
utilizaban especies endémicas de las regiones en cuestión. Con el tiempo estas
terapias características locales pasaron a conformar la llamada medicina
tradicional y al ser preservada por los pueblos originarios fue llamada medicina
aborigen o autóctona, existiendo estos términos hasta nuestros días, al igual que
las recetas tradicionales o autóctonas que agrupan tanto usos, formas de
preparación, administración, dosis, entre otros parámetros farmacológicos
modernos 1.
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Paracelso, el padre de la Farmacología Química, médico y químico suizo
en pleno Renacimiento, fue el primero en señalar que las propiedades medicinales
de las plantas radican en sus principios activos aislables por técnicas alquímicas.
Esta observación constituye la base de la Farmacología Moderna. Luego y gracias
al desarrollo de la síntesis química, hombres de ciencia lograron copiar núcleos
básicos de moléculas exitosas de la naturaleza para mejorarlas haciéndolas más
selectivas y seguras 2,3.
Es así como nuestra realidad terapéutica hoy en día, está regida por la
química sintética, pero lo que pocos saben es que estas exitosas moléculas que
curan no son sino copias mejoradas de sustancias químicas que la naturaleza en
forma espontánea creó, llamadas metabolitos secundarios 2.
Las plantas, organismos autótrofos, además del metabolismo primario
presente en todos los seres vivos, poseen un metabolismo secundario que les
permite producir y acumular compuestos de naturaleza química diversa. Estos
compuestos derivados del metabolismo primario se denominan metabolitos
secundarios, se distribuyen diferencialmente entre grupos taxonómicos, presentan
propiedades biológicas, muchos desempeñan funciones ecológicas y se
caracterizan por sus diferentes usos y aplicaciones como medicamentos,
insecticidas, herbicidas, perfumes o colorantes, entre otros 4.
Es importante destacar que los metabolitos secundarios también reciben
la denominación de productos naturales y tienen un importante y significativo
valor medicinal y económico, derivado éste último de su uso en la industria
cosmética, alimentaria y claro en la farmacéutica. Un gran número de estos
productos naturales, que ya se usaban en la medicina antigua como remedios para
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combatir enfermedades, se utilizan en la actualidad como medicamentos, resinas,
gomas, potenciadores de sabor, aromas, colorantes, etc. 4.
La fitoterapia, entonces, es un pilar para la farmacoterapia, es una
ciencia que estudia la utilización de productos de origen vegetal con finalidad
terapéutica, ya sea para prevenir, para atenuar o para curar un estado patológico.
La fitoterapia es la técnica médica que se sirve de las plantas para combatir las
enfermedades y restablecer los equilibrios de la salud. En otros países a esta
técnica se la denomina herbalismo 5.
Aproximadamente, el 60% de la población mundial utiliza plantas y
productos derivados de ellas en su medicación. Estos productos naturales hoy en
día son considerados como una de las “medicinas” de gran importancia por su
efectividad terapéutica. De las 520 nuevas drogas aprobadas entre 1983 y 1984, el
39% fueron productos naturales o derivados de productos naturales, y el 60 a
80% de drogas antibacterianas y de anticancerígenos son derivados de productos
naturales. Por ejemplo, del desarrollo de drogas no proteicas se han obtenido
derivados generados de productos naturales como la sinvastatina, lovastatina,
enalapril, ciprofloxacina y ciclosporina, entre otros, y agentes anticancerígenos
como el taxol y docetaxol (Harvey, 2000). Sin embargo, la actividad terapéutica
no sólo se puede conseguir luego de procesos de extracción y purificación de
principios activos, sino directamente de la planta misma o de algunos extractos
relativamente simples de obtener 6.
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Aproximadamente el 80 % de la población de la mayor parte de los
países en desarrollo todavía usan la medicina tradicional derivada de plantas para
tratar enfermedades en humanos. Países como China, Cuba, Sri-Lanka, Tailandia
y otros han inscrito oficialmente en sus programas de salud el uso de la medicina
tradicional, por ejemplo, la homeopatía que depende de material vegetal o sus
derivados para tratar dolencias en humanos 7.
La fitoterapia ha resultado ser más útil que la medicina moderna para el
tratamiento de ciertas enfermedades crónicas, con menos efecto secundario y más
económica 7.
Las plantas aromáticas y medicinales son fuente exclusiva de algunas
drogas que se emplean en tratamientos médicos nuevos, puede decirse que
alrededor del 25 % de las drogas en la farmacopea moderna son derivadas de
plantas y muchas otras son sintéticos análogos construidos de componentes
prototipos aislados de plantas; se emplean, además, como suplementos
nutricionales y en la industria de cosméticos y perfumes, lo que ha aumentado su
valor en años recientes 7.
En muchas ocasiones para curar determinadas patologías que afectan la
salud se ha tenido que recurrir a ciertos procedimientos terapéuticos que se
apartan de la medicina convencional. En la actualidad, esta alternativa médica
experimenta un auge. Muchos países se han involucrado en la obtención de
medicamentos a partir de plantas, esto se debe a una serie de factores, entre los
cuales debemos destacar en muchos casos el conocimiento preciso de su
composición química, y el hecho de que en la actualidad la utilización de estas
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plantas se fundamenta en numerosos ensayos farmacológicos in vivo e in vitro.
De esta forma, el uso de las especies vegetales medicinales que se ha venido
haciendo en forma empírica y basada en la tradición busca tener hoy una base
científica 6.8.
El Perú, considerado el tercer país más mega diverso del planeta, ha
efectuado importantes aportes de especies y variedades para el mundo gracias a
los diversos pisos ecológicos y microclimas que presenta, contando con 84 zonas
de vida de las 103 conocidas donde habría 50 mil especies vegetales (20% de las
existentes en la Tierra) de las que 2,000 han sido utilizadas con fines curativos.
Es así como el uso de las plantas con fines terapéuticos es de gran utilidad, ya que
de ellas son obtenidas innumerables sustancias químicas. La investigación, brinda
la oportunidad de encontrar nuevos principios activos a partir de una materia
prima más económica y natural 9.
Dentro de las plantas medicinales, que forman parte de esa gran
megadiversidad nuestra, se encuentra una especie conocida comúnmente como
“Purum rosa”, cuyo nombre es Bejaria aestuans L.; esta especie pertenece a la
familia Ericaceae, dicha familia presenta una amplia distribución geográfica;
está presente en todos los continentes desde las zonas templadas y frías (excepto
en la Antártica) hasta las regiones montañosas neotropicales, donde alcanzan su
mayor diversidad. Las ericáceas constituyen una familia diversa, con 110 géneros
y aproximadamente 4000 especies 10.
Para el Perú, habían sido reportadas 135 especies, a las que Ulloa et al.
(2004) añadieron dos, con lo cual actualmente se consideran que crecen en la
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flora peruana 137 especies de Ericaceae en 22 géneros. De estas, Bejaria
aestuans L., es una de las especies de las que se tiene referencia de su crecimiento
en la sierra del departamento de La Libertad y es usada popularmente en el
tratamiento de algunos tipos de infecciones 11.
Bejaria aestuans L. es un arbusto o árbol de 1-1.5 m de altura, de corteza
lisa o con fisuras, glabras, tomentoso, híspido, de color gris o marrón oscuro
Hojas coriáceas, planas, rara vez de revolución o longitudinal encorvada, elíptica
(estrechamente ovadas u ovales), base cuneada (obtuso), ápice obtuso o agudo, a
menudo mucronado, margen entero, ciliado, o glandular-ciliado, ambas
superficies glabras, híspido, o glandular híspida; peciolo ligeramente achatado en
la sección transversal, Inflorescencia terminal, axilar, racemosa, de color rosa a
blanco, a veces rojas, pétalos obovados estrecho (elíptica), estambres incluidos o
ligeramente exentos 11.
Bejaria aestuans L. es una especie arbustiva que frecuentan en
quebradas boscosas, terrenos pedregosos; laderas abiertas, pedregosas y
boscosas ubicadas entre los 2050 – 3400 m.s.n.m. en los departamentos de la
mayor parte del Perú 12.
En cuanto a trabajos de investigación del género y la especie
encontramos que Yon (1977) manifestó que las hojas e inflorescencias de
Bejaria glauca presentan glicósidos saponínicos del tipo saponinas triterpénicas,
encontrándose éstas, en mayor proporción en las hojas. Cabe decir que este
tipo de saponinas se le atribuyen posibles propiedades expectorantes 13.
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Sabemos del uso local de las inflorescencias de Bejaria aestuans L. en
casos de infecciones del tracto urinario e infecciones micóticas vaginales. En más
del 95% de los casos, un único microorganismo es el responsable de la ITU. El
agente etiológico más frecuente de ITU en ambos sexos es la Escherichia coli,
responsable del 75% a 80% de casos; de allí que eligiéramos esta cepa en el
estudio 14.
Staphylococcus aureus fue elegida por ser agente etiológico de diversas
patologías, incluyendo infecciones de piel y tejidos blandos, bacteremia,
endocarditis, infección del SNC y del tracto genitourinario. Por su ubicuidad y en
función de los procedimientos médicos y uso de antimicrobianos, se confiere
especial énfasis al aislamiento y estudio epidemiológico de S. aureus,
considerando su rol primordial en las infecciones nosocomiales 15.
En el caso Las infecciones vaginales, la candidiasis suele encontrarse
disputando el primer o segundo lugar en el diagnóstico diferencial de las
diferentes causas de molestias vulvo vaginales y flujo. Las especies comúnmente
asociadas a la infección vaginal por cándida son Candida albicans, Candida
glabrata, Candida tropicalis, Candida krusei y Candida guillermond. Pero
aproximadamente, 85% a 90% de las Candidiasis vulvo vaginales son debidas a
Candida albicans 16.
La actividad antimicrobiana y antifúngica de extractos de plantas usadas
en medicina popular contra diversas bacterias y hongos, los cuales causan
infecciones frecuentes en humanos, ha sido ampliamente estudiada (Quiroga et
al., 2001; Navarro García et al., 2003; Carpinella et al., 1999; Zhu et al., 2005;
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Somchit et al., 2003; Dabur et al., 2004). Debido a los efectos adversos de
algunas de las drogas antibacterianas y antifúngicas utilizadas actualmente
(Girois et al., 2005; Song and Deresinski, 2005; The Merck Manual of Medical
Information, 2003), a que son poco efectivas e inducen frecuentemente
resistencia (Escalante et al.,2002; Zhang et al., 2005), numerosos investigadores
han encaminado sus trabajos hacia la búsqueda y aplicación de nuevos
compuestos biológicamente activos que exhiban efectos secundarios mínimos
(Fenner et al.; 2005; Bisignano et al., 2000; Jones et al.,2000; Ali-Shtayehant Abu
Ghdeib, 1999; Kandil et al., 1994) 17.
Los metabolitos secundarios responsables de las posibles actividades
antibacterianas y antifúngicas de algunas plantas podrían ser flavonoides, fenoles,
glicósidos de fenoles, saponinas, según manifiesta Grayer y Harborne, 1994;
Osbourn, 1996 17.
Referente a su posible efecto antibacteriano y antifúngico encontramos
algunos trabajos de investigación como el de Bussmann R, Glenn A. & Sharon D.
(2010) que refiere que las flores y hojas de Bejaria aestuans L. presentan
actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus 18.
Núñez (1989) que menciona que la especie Bejaria glauca presenta un
tallo con cutícula y colénquima laminar; mientras que las hojas presentan
parénquima lagunoso, células claviformes típicas y cutícula muy desarrollada.
Asimismo expresa que esta especie es usada tradicionalmente para el tratamiento
de descensos vaginales por la presencia de mucílagos 19.
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Bussmann R. and Sharon D. (2006) manifiestan que las hojas e
inflorescencias de Bejaria aestuans L., se usan en medicina tradicional, en forma
de decocto (1.5 g/1Litro de agua), mezclándola con otras plantas, tomándose 3
veces al día para la diabetes, próstata, regulación menstrual, inflamaciones del
útero, riñones, hígado, vejiga, ovarios, dolores menstruales y quistes 20.
En el Perú, la medicina tradicional es un pilar fundamental en materia de
salud, tanto por lo económico como por las tradiciones de cada comunidad en
cuanto a “remedios caseros”. Sin embargo, es importante que se realicen estudios
científicos que respalden la eficacia de dichos productos para otorgarles mayor
seguridad y eficacia a la presumible actividad terapéutica de las plantas.
Dadas las luces y evidencia sobre el posible efecto positivo
antibacteriano y antimicótico y considerando lo anteriormente expuesto sobre el
auge de la medicina en base a plantas medicinales y la gran dependencia de
nuestra comunidad al uso tradicional de las mismas por ser una alternativa
económica y por muchos percibida como segura, consideramos más que necesaria
la realización de este trabajo de investigación que busca demostrar el efecto in
vitro del extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria aestuans L.
“Purum rosa” frente a cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli y
Candida albicans.
Frente a lo expuesto nos planteamos la siguiente interrogante, ¿Cuál es
el efecto in vitro del extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria
aestuans L. “Purum rosa” frente a cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia
coli y Candida albicans?
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Ante esta pregunta nos planteamos la siguiente hipótesis, El extracto
hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria aestuans L. “Purum rosa”
presenta efecto antibacteriano y antimicótico in vitro frente a cepas de
Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans.
Durante la realización de este trabajo pretendemos cumplir el siguiente
objetivo:
- Evaluar el efecto in vitro del extracto hidroalcohólico de las
inflorescencias de Bejaria aestuans L. “Purum rosa” frente a cepas de
Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans.
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II. MATERIAL Y MÉTODO
2.1. MATERIALES
a) Material biológico
Material vegetal: 500 g de inflorescencias de Bejaria
aestuans L. “Purum rosa” que se recolectaron del caserío de
Capachique, distrito de Usquil, provincia de Otuzco,
departamento La Libertad en el mes de Marzo del año 2012.
Material microbiológico: cepas clínicas de Staphylococcus
aureus, Escherichia coli y Candida albicans proporcionados
por los Laboratorios de Bacteriología y Micología del
Departamento Académico de Microbiología y Parasitología
de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad
Nacional de Trujillo.
b) Material de laboratorio
Material de vidrio
Pipetas de 1, 2, 5 y 10 mL
Vasos de precipitación de 100 y 250 mL.
Probetas de 100mL.
Tubos de ensayos
Matraces de 500 y 1000 mL.
Fiolas de 10, 25, 50 y 100 mL.
Frasco de vidrio de color ámbar de boca ancha
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Mortero
Viales
Equipos
Balanza analítica OHAUS GA 200
Balanza de triple brazo OHAUS 700/800 series
Tamices
Alcoholímetro
Cocina eléctrica Finely
Equipo de Soxhlet
Estufa Memmert
Autoclave Airshoft
Baño María Memert
Reactivos y Solventes
Agua destilada
Solución salina fisiológica
Etanol 30° G.L.
Etanol 95 ° G.L.
Metanol
Carbonato de sodio
Acido pícrico
Cloroformo
Anhídrido acético
Ácido sulfúrico concentrado
Tricloruro férrico al 5%
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Hidróxido de sodio
Hidróxido de potasio
Magnesio metálico
Alcohol amílico
Acido 3,5-dinitrobenzoico
Ácido clorhídrico concentrado
Subnitrato de bismuto
Yoduro de potasio
Cloruro de sodio en polvo
Bicloruro de mercurio
Yodo resublimado
Reactivo de Wagner
Reactivo de Hager
Medicamentos
Discos de Amikacina
Discos de Fluconazol
Medios de cultivo
Agar Mueller Hinton
Agar nutritivo
Agar Sabouraud
Otros
Caja de guantes estériles
Gradilla.
Mechero
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Papel filtro
Puntas estériles
Papel kraft
Asa de bacteriológica
Pinzas punta roma
Placas de petri descartables
Sacabocados
Calibrador de Vernier
2.2. MÉTODOS
2.2.1. RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA21,22.
Se recolectaron 500g de inflorescencias de Bejaria aestuans L. del caserío
de Capachique, distrito de Usquil, provincia de Otuzco, departamento La
Libertad en el mes de Marzo del año 2012.
La recolección de la especie se realizó por el método convencional o clásico
de herborización, seleccionando el material en el campo y verificando que
esté en buenas condiciones, de preferencia por la mañana.
2.2.2. IDENTIFICACIÓN Y DETERMINACIÓN TAXONÓMICA DE
LA ESPECIE21,22.
Se llevó un ejemplar completo de la planta al Herbarium Truxillensis de la
Universidad Nacional de Trujillo para su identificación y posterior
verificación taxonómica según el sistema filogenético de la especie.
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2.2.3. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA21,22.
Selección de la muestra: El material recolectado se trasportó al laboratorio
de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la
Universidad Nacional de Trujillo, donde se eliminaron las sustancias
extrañas del material vegetal.
Lavado de la droga: Luego de la separación de las sustancias extrañas, se
procedió a lavar el material vegetal con agua destilada.
Secado: Una vez lavado, se procedió a adecuar la droga en bolsas de papel
Kraft con orificios, las que se colocaron en estufa a una temperatura de
40°C, realizando la posterior determinación de peso cada 24 horas hasta
valores constantes.
Pulverización: Una vez seco se pulverizó en mortero.
Tamizaje: Se hizo pasar el material obtenido de la pulverización, a través
de los tamices Nº 2, 1.2, 0.7, la muestra de trabajo correspondió al tamiz 0.7
Almacenamiento: El polvo obtenido, se guardó en frascos de vidrio de
color ámbar de boca ancha a una temperatura de 40°C.
2.2.4. PREPARACIÓN DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO22.
- Se pesaron dos muestras de 10g de droga pulverizada cada una, se
colocaron en cápsulas de porcelana para ser humectadas con etanol de 30°
G.L. por 24 horas, luego se mezcló con c. s. de arena lavada.
- Para la extracción se preparó un cartucho de papel de filtro que se colocó
en la cámara soxhlet, y se extrajo con 150 mL de etanol de 30° G.L. hasta
agotamiento.
- El producto se filtró con papel filtro Whatman N° 4.
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- La solución resultante se llevó a concentrar en rotavapor a una presión
reducida y a una temperatura de 50 °C; luego se pesó el residuo seco y se
guardó en refrigeración entre 2 y 8°C en frasco de vidrio de color ámbar
estéril, hasta su dilución con etanol de 30° G.L. para su posterior uso en los
ensayos microbiológicos.
2.2.5. ANÁLISIS FITOQUÍMICO PRELIMINAR DEL EXTRACTO
HIDROETANÓLICO21
Ensayo de Catequinas: Se tomó I gota de la solución alcohólica, con la
ayuda de un capilar y se aplicó sobre papel filtro. Sobre la mancha se aplicó
una solución de carbonato de sodio. La aparición de una mancha verde
carmelita a luz UV indica un ensayo positivo.
Ensayo de Resinas: se añadió a 2mL de la solución alcohólica y 10mL de
agua destilada. La aparición de un precipitado indica un ensayo positivo.
Ensayo de Baljet: Permitió reconocer la presencia de compuestos con
grupo lactónico, en particular Cumarinas, aunque otros compuestos
lactónicos pueden dar positivo al ensayo.
Para ello se tomó una alícuota del extracto etanólico y se adicionó 1mL del
reactivo, considerándose un ensayo positivo la aparición de coloración o
precipitado rojo.
Ensayo de Liebermann-Burchard: Permitió reconocer la presencia de
triterpenos y/o esteroides, por poseer un núcleo del androstano,
generalmente insaturado en el anillo B y la posición 5-6.
Para ello, se tomó una alícuota del extracto etanólico y se llevó a evaporar
en baño maría, el residuo se redisolvió en 1mL de cloroformo, se adicionó
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1mL de anhídrido acético y se mezcló bien; por la pared del tubo de ensayo
se dejó caer de II a III gotas de ácido sulfúrico concentrado sin agitar. Un
ensayo positivo se reconoce por un cambio rápido de coloración:
1. Rosado-azul muy rápido.
2. Verde intenso visible aunque rápido.
3. Verde oscuro-negro, final de la reacción.
Muy pocas veces puede observarse el primer cambio. El tercer cambio
generalmente ocurre cuando el material evaluado tiene cantidades
importantes de estos compuestos. Para realizar este ensayo no debe existir
agua en el medio de reacción, pues ésta con el ácido sulfúrico reacciona de
forma violenta.
Ensayo de la Espuma: Permitió reconocer la presencia de saponinas, tanto
del tipo esteroidal como triterpénica. Se tomó una alícuota y se diluyó con
cinco veces su volumen en agua, se agitó fuertemente durante 5 a 10 min.
El ensayo se considera positivo si aparece espuma en la superficie del
líquido de más de 2 mm de altura y persiste por más de 2 min.
Ensayo de Cloruro Férrico: Permitió reconocer la presencia de
compuestos fenólicos. A una alícuota del extracto etanólico se añadió III
gotas de tricloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica, un ensayo
positivo da la siguiente información general:
-Desarrollo de una coloración rojo-vino: compuestos fenólicos en general.
-Desarrollo de una coloración verde intensa: taninos del tipo pirocatecólicos.
-Desarrollo de una coloración azul, taninos del tipo pirogalotánicos.
Ensayo de Bornträger: Permitió reconocer la presencia de quinonas. Se
agregó 1mL de hidróxido de sodio, se agitó mezclando las fases y se dejó
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reposar hasta su separación. El ensayo se consideró positivo cuando la fase
acuosa alcalina (superior) se coloreó de rosado o rojo.
Ensayo de Shinoda: Permitió reconocer la presencia de flavonoides. Se
diluyó con 1 mL de ácido clorhídrico concentrado y un pedacito de cinta de
magnesio metálico. Después de la reacción se esperó 5 min, se añadió 1mL
de alcohol amílico, se mezclaron las fases y se dejó reposar hasta que se
separaron.
El ensayo se considera positivo cuando el alcohol amílico se colorea de
amarillo, naranja, carmelita o rojo; intenso en todos los casos.
Ensayo de Kedde: Permitió reconocer la presencia de glucósidos
cardiotónicos. Una alícuota del extracto en etanol se mezcló con 1mL del
reactivo y se dejó reposar durante 5 a 10 min. En un ensayo positivo se
desarrolla una coloración violácea, persistente durante 1 a 2 h.
Ensayo de Antocianidinas: Permitió reconocer la presencia de estructuras
de secuencia C6-C3-C6 del grupo de los flavonoides. Se calentó 2 mL del
extracto etanólico por 10 min. con 1 mL de HCl concentrado, se dejó enfriar
y se añadió 1 mL de agua y 2 mL de alcohol amílico, se agitó y se dejó
separar las fases. La aparición de color rojo a marrón en la fase amílica
indica un ensayo positivo.
Ensayo de Dragendorff: Permitió reconocer la presencia de alcaloides;
para ello, se tomó una alícuota y se añadió I gota de ácido clorhídrico
concentrado, (calentamos suavemente y dejamos enfriar). Con la solución
ácida se realizó el ensayo, se añadió III gotas del reactivo de Dragendorff,
Se considera (+) cuando presenta opalescencia, (++) cuando presenta
turbidez definida, y (+++) cuando presenta precipitado.
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Ensayo de Mayer: Se realizó según la forma descrita anteriormente, hasta
obtener una solución ácida, luego se añadió una pizca de cloruro de sodio en
polvo, se agitó y filtró, se añadió III gotas de la solución reactiva de Mayer
y se observó. Se considera (+) opalescencia, (++) turbidez definida, (+++)
precipitado coposo.
Ensayo de Wagner: Se realizó según la forma descrita anteriormente, hasta
obtener una solución ácida, luego se añadió III gotas del reactivo de Wagner
y los resultados se clasificaron de la misma forma.
Ensayo de Hager: Se realizó según la forma descrita anteriormente, hasta
obtener una solución ácida, luego se añadieron III gotas del reactivo de
Hager y los resultados se clasificaron de la misma forma.
2.2.6. ENSAYO MICROBIOLOGICO23,24,25,26.
PREPARACIÓN DE LAS CEPAS BACTERIANAS
Las cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans
fueron proporcionadas por los Laboratorios de Bacteriología y Micología
del Departamento Académico de Microbiología y Parasitología de la
Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo.
Reactivación de los cultivos de Staphylococcus aureus, Escherichia coli y
Candida albicans
A partir de los cultivos puros de S. aureus, E. coli se hicieron los sembrados
en tubos de ensayo conteniendo Agar Nutritivo y se incubaron a 37º C por 24
horas, para C. albicans se sembró en tubos de ensayo conteniendo Agar
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Sabouraud y se incubó a 37º C por 48 horas. Luego se evaluó la pureza de los
cultivos mediante coloración Gram para S. aureus, E. coli.
Preparación y estandarización de los inóculos de Staphylococcus aureus,
Escherichia coli y Candida albicans
A partir de los cultivos reactivados de cada bacteria y hongo se realizaron
suspensiones en solución salina fisiológica estéril hasta alcanzar la densidad
microbiana similar a la turbidez del tubo Nº 0,5 del Nefelómetro de Mc
Farland (1,5x108 cél/mL).
PRUEBA PARA LA DETERMINACIÓN DE LA SENSIBILIDAD
ANTIBACTERIANA POR EL METODO DE DIFUSION EN AGAR –
METODO DE KIRBY BAUER
Se llevó a cabo mediante el método de Kirby Bauer modificado, para lo cual a
partir de la suspensión de S. aureus, se sembró por superficie en placas con Agar
Mueller Hinton, luego se secó a temperatura ambiente por 15 minutos
aproximadamente. Posteriormente se realizaron 4 pozos de 6mm de diámetro
en la superficie del Agar Mueller Hinton, a una distancia no menor de 15 mm
entre ellos y a 1.5 cm del borde de la placa, se añadió en ellos 80 uL de cada
concentración del extracto hidroalcoholico previamente preparado (25 mg/mL,
50 mg/mL, 100 mg/mL, 200 mg/mL) y se dejó reposar por 30 minutos y
luego se incubaron a 37º C por 24 horas. Para E. coli se procedió de la misma
manera que para S. aureus y en el caso de C. albicans se incubó por 48 horas.
Se realizaron cuatro ensayos por cada bacteria y hongo.
Finalmente se midió el halo de inhibición de crecimiento de S. aureus, E. coli
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y C. albicans y los resultados fueron expresados como diámetro (mm) de
halo de inhibición.
Evaluación del efecto del etanol (solvente)
Para evaluar el efecto del etanol de 30° G.L. sobre el crecimiento de S. aureus
E. coli y C. albicans, se procedió de manera similar que en el caso de la
evaluación del efecto del extracto, a diferencia de que en los pozos se añadió
80 uL de etanol de 30° G.L.
Prueba de sensibilidad a antibióticos patrón
Se realizó mediante el método de Kirby Bauer, para lo cual se utilizó discos de
amikacina para S. aureus, y E. coli y fluconazol para C. albicans.
2.3. ANALISIS ESTADÍSTICO
Los resultados obtenidos se analizaron mediante las siguientes pruebas:
media aritmética, desviación estándar y coeficiente de variación.
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III. RESULTADOS
Tabla 1
Metabolitos secundarios en el extracto hidroalcohólico de las
inflorescencias de Bejaria aestuans “Purum rosa”.
Metabolito secundario Ensayos Identificación
Catequinas Catequinas +
Resinas Resinas -
Cumarinas Baljet +++
Fenoles Cloruro férrico ++
flavonoides shinoda +
Saponinas Espuma +
Cardenolidos Kedde -
Antocianidinas Antocianidinas +
Triterpenos y
Esteroides Lieberman-burchard +
Quinonas Borntrager -
Taninos Gelatina +
Alcaloides
Dragendorff ++
Mayer +
Wagner ++
Hager +
Leyenda:
IDENTIFICACION: - Negativo
+ Baja
++ Moderada
+++ Alta
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Tabla 2
Efecto in vitro del extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria aestuans L. “Purum rosa” frente a Staphylococcus
aureus, Escherichia coli y Candida albicans
Leyenda:
*: Promedio del
diámetro de Inhibición
expresado en mm
N: Negativo
Microorganismo
Concentraciones del Extracto
hidroalcohólico (mg/mL)
Solvente
(control
negativo)
antimicrobiano
(Control positivo)
25 50 100 200 Etanol
30°G.L.
Amikacina
(10 µg)
Fluconazol (25
µg)
S. aureus 14.3* 14.5* 15.5* 18* N 30* ---
E. coli N N N N N 30* ---
C. albicans N N N N N --- 29*
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Tabla 3
Efecto in vitro del extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de
Bejaria aestuans L. “Purum rosa” frente a Staphylococcus aureus
Concentraciones
(mg/mL)
PROMEDIO D.E. C.V.
25 14.25 0.9574 6.7188
50 14.5 0.5774 3.9817
100 15.5 1.0000 6.4516
200 18 1.1547 6.4150
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IV. DISCUSIÓN
Los metabolitos secundarios, a menudo, desempeñan un papel importante en
la planta, tales como defensa contra predadores, microorganismos, estrés, etc.;
estos componentes han sido utilizados como drogas durante milenios. Por lo tanto,
la detección de fitoquímicos sirve como primer paso en la predicción de tipos de
potenciales compuestos activos de plantas 36.
La tabla 1 muestra las pruebas fitoquímicas de identificación de metabolitos
secundarios del extracto hidroetanólico de las inflorescencias de Bejaria aestuans
L., con lo que identificamos, cualitativamente, la presencia de catequinas,
cumarinas, flavonoides, polifenoles, antocianidinas, triterpenos, esteroides,
saponinas, taninos y alcaloides.
En el tamizaje fitoquímico que reportó el trabajo “Antibacterial activity of
Tabernaemontana stapfiana britten (Apocynaceae) extracts” evidenció la
presencia de alcaloides, flavonoides, cumarinas, taninos y saponinas, como
nuestro extracto, y los asoció con la actividad antimicrobiana que presentaron sus
extractos metanólicos. Estos mostraron una buena actividad contra las cepas
bacterianas utilizadas, incluyendo cepas de Staphylococcus aureus resistentes33.
Muchos de los metabolitos secundarios identificados tienen efecto
antibiótico comprobado, en el caso de la acción de los fenoles y polifenoles, se
debe, presumiblemente, a la inhibición enzimática por acción sobre los grupos
sulfihidrilos de los aminoácidos de cisteína, o por medio de reacciones más
inespecíficas con proteínas bacterianas 28.
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Los flavonoides, estas estructuras fenólicas que contienen un solo grupo
carbonilo, son sintetizados por las plantas en respuesta a la infección
antimicrobiana, y su actividad sobre las bacterias probablemente se deba a su
capacidad de generar complejos con proteínas extracelulares y proteínas solubles,
así como una actividad sobre la pared celular muy similar a la de las quinonas.
Los flavonoides lipofílicos pueden perturbar la integridad estructural de la
membrana celular 28.
Gran numero de flavononoides naturales como quercetina, kaempferol,
naringenina, rutina y glicosido de naringenina son reportados por Rochchin et al.;
(1973) como inhibidores de infecciones y antiinflamatorios 30.
Otro mecanismo propuesto por el que los flavonoides muestran actividad
antibacteriana, es que provocan la muerte bacteriana al inhibir la síntesis de ADN
o ARN debido a que tienen una estructura plana similar a la de las bases púricas y
pirimídicas, por lo tanto se pueden intercalar formando puentes de hidrógeno con
las bases de la doble hélice y de esta forma las flavonas alteran la estructura
tridimensional de los ácidos nucleícos, impidiendo su adecuada síntesis de novo,
además de provocar errores de lectura durante la transcripción 31.
Los taninos, son otro grupo de metabolitos secundarios importante. Estos
conforman un grupo de sustancias fenólicas poliméricas capaces de precipitar
gelatina en solución, una propiedad conocida como astringente. Están divididas en
dos grupos: hidrolizables y condensados. Los taninos hidrolizables están basados
en el ácido gálico, usualmente como ésteres múltiples con la D-glucosa, mientras
que los taninos condensados más importantes (a veces llamadas
proantocianidinas) son derivados de monómeros flavonoides. Se cree que la
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actividad antimicrobiana de estos compuestos se debe a su interacción sobre las
adhesinas, proteínas de la pared celular, y a su capacidad de unirse a
polisacáridos. Los taninos condensados llamados proantocianidinas son
compuestos fenólicos estables que pueden prevenir la expresión de las fimbrias P
de E. coli como parte de su actividad antibacteriana, y además tienen actividades
antioxidantes 28.
En el trabajo “Antimicrobial properties of tannins” se menciona que los
diferentes mecanismos propuestos hasta ahora para explicar la actividad
antimicrobiana de los taninos incluyen la inhibición de las enzimas microbianas
extracelulares, la privación de los sustratos necesarios para el crecimiento
microbiano o la acción directa sobre el metabolismo microbiano mediante la
inhibición de la fosforilación oxidativa, y por último se sabe de un mecanismo de
privación de hierro; pero muchos microorganismos pueden superar las defensas de
las plantas sobre la base de taninos ya a través de la síntesis de complejos tanino-
polímeros, oxidación, biodegradación de taninos o de síntesis de sideróforos 37.
Por otro lado se ha demostrado que las lactonas, cumarinas por ejemplo,
inhiben enzimas bacterianas como la DNA polimerasa y la timidilato sintetasa 31.
Los terpenos o terpenoides son activos contra bacterias, virus, hongos y
protozoarios. Se cree que esta actividad antimicrobiana se debe a una perturbación
de la estructura de la membrana celular por su naturaleza lipofílica, dejando a
merced de un choque osmótico 27.
Uno de los principales mecanismos de acción como antibiótico propuestos
para los terpenoides, consiste en la disrupción de la membrana celular bacteriana
mediante tres posibles vías: aumentando la permeabilidad de la membrana a iones
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pequeños, afectando la estabilidad estructural de la membrana y desestabilizando
el empaquetamiento de la bicapa lipídica, cualquiera de estos tres efectos produce
la muerte en la célula bacteriana 32.
En el trabajo titulado “Assessment of the medicinal potentials of the
methanol extracts of the leaves and stems of Buddleja saligna” se demostró que
los extractos de plantas eran activas contra las bacterias Gram-positivas y algunas
cepas de bacterias Gram-negativas. Esta observación apoya por tanto el hecho de
que, en general, las bacterias Gram-negativas son más resistentes que las bacterias
Gram-positivas 34.
Podríamos considerar el hecho de que las bacterias gram-negativas
presentan mayor sensibilidad, puesto que su pared celular es menos compleja por
tener una capa simple (red de mureína delgada), mientras que en las bacterias
gram-positivas, poseen una estructura de multicapa (red de mureína muy
desarrollada y llega a tener hasta 40 capas). Un ejemplo lo presenta el aceite
esencial de Melaleuca alternifolia (Tea tree) que se ha encontrado causa la
filtración de iones K+ en la membrana de la Escherichia coli con lo cual estimula
su autolisis 32.
En el trabajo “Assessment of phytochemical content, polyphenolic
composition, antioxidant and antibacterial activities of Leguminosae medicinal
plants in Peninsular Malaysia”, se evidenció que todos los extractos probados, no
eran activos contra bacterias Gram-negativas. Explica que esto podría ser debido a
la presencia de la membrana externa que poseen y que actúa como una barrera de
permeabilidad. La presencia de canales porina en la membrana externa de
bacterias Gram-negativas también restringiría la difusión de muchos antibióticos y
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las bombas de eflujo en la transmembrana bombean los agentes antibacterianos a
través de los procesos de eflujo activos y por lo tanto, daría lugar a una mayor
resistencia intrínseca en caso de bacterias gram-negativas 36.
Demostró además que los agentes antibacterianos son principalmente de
naturaleza hidrófila. Además de constatar que la fracción de alcaloides exhiben
actividad antibacteriana bastante fuerte 36.
Asimismo existen otros factores que influyen sobre los resultados, tales
como: el volumen y tipo de medio de cultivo, la concentración y edad del inóculo,
las condiciones de incubación, etc. 32.
La tabla 2 muestra el efecto antibiótico in vitro del extracto hidroetanólico
de las inflorescencias de Bejaria aestuans L., en el que se comprueba el efecto
antibacteriano en cepas de Staphylococcus aureus, posiblemente por alguno de los
mecanismos antes mencionados de alguno o varios metabolitos secundarios que
posee el extracto hidroetanólico de Bejaria aestuans L.
Según el trabajo titulado “Antibacterial and phytochemical screening of
Anethum graveolens, Foeniculum vulgare and Trachyspermum ammi” las
bacterias con una zona clara de inhibición de más de 12 mm se consideran
sensibles 35. Nuestro extracto, mostró un diámetro de halo de inhibición, en
promedio, que fue desde 14.3 mm, en su concentración más baja de 25 mg/mL,
hasta 18 mm, en su concentración más alta de 200 mg/mL, frente a S. aureus, lo
que la hace considerarse sensible.
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Se encontró que el extracto hidroetanolico no posee efecto antibacteriano
frente a Escherichia coli, pudiendo ser por poseer una membrana más compleja, lo
que le confiere mayor grado de resistencia a los agentes antimicrobianos 31, y/o
por la razones mencionadas anteriormente. Para Candida albicans tampoco se
observó efecto antimicótico del extracto.
El uso tradicional que se le da a esta especie, es como tratamiento de
infecciones urinarias, y es sabido que las infecciones urinarias generalmente son
causadas por bacterias gram-negativas, como Escherichia coli. Puede que el
efecto antibacteriano in vivo se dé, ya que como se mostró, el extracto de Bejaria
aestuans L. posee fitoconstituyentes como taninos, los que previenen la expresión
de las fimbrias P de E. coli, lo que puede hacer que mejore el cuadro de infección,
así como otros metabolitos, como flavonoides, saponinas, alcaloides, terpenoides
y polifenoles en general, que a mayores concentraciones, por los mecanismos
mencionados, posiblemente, manifieste actividad antibacteriana.
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V. CONCLUSIONES
1. El extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria aestuans L.
“Purum rosa”, presenta los siguientes metabolitos secundarios, catequinas,
cumarinas, polifenoles, flavonoides, saponinas, antocianinas, triterpenos,
esteroides, taninos y alcaloides.
2. El extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria aestuans L.
“Purum rosa”, a concentraciones de 25 mg/mL, 50 mg/mL, 100 mg/mL y 200
mg/mL, posee efecto antibacteriano in vitro frente a Staphylococcus aureus.
3. El extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria aestuans L.
“Purum rosa” a concentraciones de 25 mg/mL, 50 mg/mL, 100 mg/mL y 200
mg/mL, no posee efecto antibacteriano in vitro frente a Escherichia coli.
4. El extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria aestuans L.
“Purum rosa” a concentraciones de 25 mg/mL, 50 mg/mL, 100 mg/mL y 200
mg/mL, no posee efecto antimicótico in vitro frente a Candida albicans.
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VI. RECOMENDACIONES
1. Se recomienda aislar los diferentes metabolitos secundarios encontrados y
comprobar cuál es el metabolito responsable de la acción antibacteriana
que se ha podido comprobar.
2. Se recomienda cuantificar los metabolitos secundarios identificados para
tener un adecuado estudio de la especie.
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ANEXOS
ANEXO 1
EJEMPLAR DE LA ESPECIE Bejaria aestuans L. “purum rosa”
IDENTIFICADA EN EL HERBARIUM TRUXILLENSIS DE LA UNT
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ANEXO 2
Identificación taxonómica de Bejaria aestuans L. “purum rosa”
CLASIFICACIÓN CIENTÍFICA
(HUT – Nº 52835)
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Ericales
Familia Ericaceae
Género Bejaria
Especie Bejaria aestuans L.
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ANEXO 3
Medidas de los diámetros de los halos de inhibicion del extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria aestuans L. frente
a Staphylococcus aureus
Concentraciones
(mg/mL)
Diámetro del halo de inhibición (mm) PROMEDIO D.E. C.V.
I II III IV
25 14 13 15 15 14.25 0.9574 6.7188
50 14 14 15 15 14.5 0.5774 3.9817
100 15 15 17 15 15.5 1.0000 6.4516
200 17 17 19 19 18 1.1547 6.4150
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ANEXO 4
Gráfico 1
Efecto in vitro del extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria
aestuans L. “Purum rosa” frente a Staphylococcus aureus
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ANEXO 5
ENSAYO MICROBIOLOGICO in vitro
Escherichia coli (efecto antibacteriano in vitro negativo)
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Staphylococcus aureus (efecto antibacteriano in vitro positivo)
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Candida albicans (efecto antibacteriano in vitro negativo)
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