M.V.MSc. Datty Rosales-Zambrano

Mérida, Julio de 2010

ESQUEMA

INTRODUCCION

ANTECEDENTES

ETIOLOGIA:

Taxonomía y relaciones filogenéticas de Brucella sp.

Características estructurales y antigénicas de Brucella sp.

EPIDEMIOLOGÍA

PATOGENIA

MANIFESTACIONES CLINICAS

RESPUESTA INMUNE EN BRUCELOSIS ANIMAL

METODOLOGÍA DE DIAGNÓSTICO:

Examen microscópico

Aislamiento y cultivo bacteriano

Serología

Diagnóstico molecular.

INTRODUCCION

Una las zoonosis bacterianas más importantes a nivel mundial, con

implicaciones de salud pública y económicas en la producción animal

( Godfroid y col, 2005; Smits y Kadri, 2005; Franco y col, 2007).

Brucella sp., es bacteria intracelular facultativa, gram negativa.

Descrita por:

Bruce, 1884. Micrococcus melitensis.

Dr. Bernard Bang. Bacillus abortus,1895. (Nielsen ,2002).

Animales es una patología reproductiva, en ocasiones asintomática

dependiendo de la especie afectada.

Humanos es una enfermedad sistémica, con implicaciones

importantes en la calidad de vida del paciente.

INTRODUCCION

En Venezuela se considera una enfermedad con

importantes implicaciones económicas en ganadería.

Descrita desde principios del siglo XX.

Hoy día debido al auge en la producción lechera con

búfalos de agua en la zona del Sur del Lago de

Maracaibo, es importante detectar la presencia de esta

enfermedad.

Empleando técnicas clásicas y moleculares para el

diagnóstico de Brucella sp.

Marston, 1859.

Bruce, 1884. Micrococcus melitensis.

Dr. Bernard Bang. Bacillus abortus,1895.

Comisión de Fiebre Mediterránea, 1905.

B. suis .Traum. 1914.

B. ovis .1953. Buddles y Boyes.

B. canis. Carmichael (Nicoletti,2002).

Brucelosis en el Mundo

ANTECEDENTES

En Venezuela:

Se reconoce por primera en 1926, entro con

importaciones de ganado lechero (Valera y

col,1995).

Dr. Kubes 1935, reporta en la región zuliana

(Briceño.1974).

M.A.C. en 1941, inicia producción de cepa 19

I.I.V, y establece Programa de Control y

Erradicación.

ETIOLOGÍA: Taxonomía y relaciones

filogenéticas de Brucella sp.

Phylum: Proteobacteria (16S r)*

Clase: Alphaproteobacteria

○ Orden: Rhizobiales

Familia: Brucellaceae

- Género: Brucella

- Especie: melitensis, abortus, suis, ovis,

canis,neotomae,cetaceae, pinnipediae

(NCBI,2009). B. microti

*: Rickettsias, Agrobacterium,Rhizobium.

Cocobacilos, gram negativas, inmóviles, no

esporulados, aeróbicos y carboxifílicos, en

cadenas o pares (Contreras,1992; López y

col,1991 y García,1999).

Intracelular facultativa (Schuring,1999).

Colonias pequeñas, húmedas y brillantes, pueden

se L,R o M.

Requerimientos complejos: CO2, medios ricos,

temp. 37 C°, minimo 5 días incubación.

Afecta animales y hombre (López y col,1991).

ETIOLOGÍA: Taxonomía y relaciones

filogenéticas de Brucella sp.

Las brucelas clásicas, se dividen en biotipos: características BQ y reacción a suero A (abortus) y M (melitensis).

Tienen predilección por un hospedero.

Genoma 3.2 Kpb: Cromosoma I : 2.1 Kpb

Cromosoma II: 1.1 Kpb

Proporción G+C 59%

Carece de plásmidos (Castro,2005).

ETIOLOGÍA: Taxonomía y relaciones

filogenéticas de Brucella sp.

ÁRBOL FILOGENÉTICO DE SEIS ESPECIES

DE BRUCELAS

Michaux-Charachon y col,1997

ESPECIE VIABILIDAD

B. abortus

114 días

TEMPERATURA FUENTE

Agua -4°C 24 horas 18 meses 6 semanas

<4 días

Leche Leche Crema Suero de leche

25-35°C 0°C 4°C

17-24°C

4 semanas Crema 4°C

B. melitensis

15-100 días

48-72 horas 11 semanas

15-24 horas 18 meses

1-8 semanas

142 días

Quesos varios

Queso fresco de cabra

Leche

Queso blanco Mantequilla

Helado

- - -

37°C 4°C

37°C 4°C

- - -

4°C

0°C 30 días

Supervivencia de Brucella en alimentos

ETIOLOGÍA: Características estructurales y

antigénicas de B. abortus.

Membrana externa rica en: FL,

LPS,y proteínas, FDC y lípidos

de ornitina con AG largos (Joklik

y col,1994).

Algo permeable a agentes

hidrófobos.

Similar a las enterobacterias

(López y col,1991).

Tomado de Castro.2005.

ETIOLOGÍA: Características estructurales y

antigénicas de B. abortus.

Lipopolisacárido (LPS-S):

2.5-3% peso seco.

Constituido por:

○ Porción glicolípido (Lípido A), endotoxina.

○ Polisacárido (Núcleo + Cadena O)

CO*: homopolímero de N-formilperosamina (α1-

2 [A]α 1-3[M]).

Difiere de las EB:

No activa vía alterna del complemento

Baja endotoxicidad

Alta resistencia a degradación macrofágica

Capacidad de inducir RI (Lapaque y col,2005).

* Reacción cruzada

ETIOLOGÍA: Características estructurales y

antigénicas de B. abortus.

Proteínas de Membrana Externa (OMP´s):

Grupo 1 (94-88 KDa)

Grupo 2 (36-38 KDa porinas)

Grupo 3 (31-34 y 25-27 KDa) Gupta y col,2007.

Lipoproteínas: bajo PM, omp 10,16 y

19..respuesta proinflamatoria (Giambartolomci y

col,2010).

ETIOLOGÍA: Características estructurales y

antigénicas de B. abortus.

EPIDEMIOLOGIA: Distribución

Mundial.

B. canis es universal y B.ovis donde

la cría es importante.

Países libres: Canadá, Australia,

Nueva Zelanda, Noruega, Suiza,

Suecia, Reino Unido, Bahamas,

Bermuda, Islas Vírgenes, Curazao,

Martinica, Guyana, Trinidad y Tobago

(Seleen y col,2010).

Pérdidas en LA por brucelosis bovina

600 $ anuales.

Tomado de: Pappas,2005

Considerada hoy día una zoonosis re-emergente.

Cada país posee un Programa de Control y

Erradicación de la Brucelosis Animal.

Hoy día la vacuna más ampliamente usada es la B.

abortus RB51, también B. abortus S19 y B. melitensis

Rev1.

En rumiantes 1-9 % novillas nacidas de madres

infectadas son Portadores Latentes (Bishop y col,1994).

Rebaño bufalinos endémicos a B. abortus 20%

seronegativo a pruebas de rutina (Borriello y col,2006)

EPIDEMIOLOGIA

PREVALENCIA EN VENEZUELA DE LA

BRUCELOSIS BOVINA

Valores reportados oscilan entre 0.8 y 1.2% y se ha mantenido estable en el tiempo (González,1999).

Otros autores empleando diferentes técnicas serológicas describen valores de 10.5% con ELISA, 8% con FC y 5% con RB (Rivera y Curiel,1993).

Importante en estados ganaderos destacando: Zulia, Monagas y Apure.

Brucelosis en Venezuela

AÑO # SEROAGLUTINACIONES # POSITIVOS % POSITIVIDAD

# VACUNACIONES

1997 565.297 4.633 0.82

231.604

1998 496.138 3.374 0.68

162.326

1999 464.025 3.135 0.68

206.130

2000 571.195 5.003 0.88

232.640

2001 413.690 3.717 0.90

424.811

2002 412.393 3.447 0.84

142.280

2003 439.463 4.208

0.95 204.982

2004 642.207 7.136

1.11 271.204

2006 2.258.385 34.033

1.51 478.342

BOVINOS SEROPOSITIVOS A BRUCELOSIS

BOVINA EN VENEZUELA AÑOS 1991-2006

61754149 4467 4442

6357 60455072 4172

31355003

3717 3447 4208

7136

34033

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

2004

2006

Años

No

.Se

rore

ac

tore

s

PROGRAMA CONTROL Y ERRADICACION (2003)

Vigilancia Epidemiológica

Diagnóstico Sistemático con criterios epidemiológicos, clínicos y de laboratorio.

Identificación, aislamiento, seguimiento y remisión al matadero.

Sacrificio animales positivos.

Medidas de control de movilización.

Caracterizar la enfermedad en cada entidad.

Vacunación antibrucélica obligatoria a sps. Susceptibles.

Elaboración de manuales de procedimientos para Centros de diagnósticos veterinarios.

Producción y abastecimiento oportuno de Antígenos.

Programa de Formación y Acreditación de Veterinarios en general.

Bacteria intracelular facultativa.

Infección crónica persistente

Desarrolla una respuesta inflamatoria granulomatosa

(TL y SRE).

Ubicación en tracto reproductivo (Sxs.,clínicos), y

susceptibilidad por edad.

Patogenicidad de las cepas asociadas a diferencias

estructurales y BQ.

Cepas con preferencia por hospederos pero pueden

darse en distintas especies animales.

PATOGENIA Y PATOLOGIA EN BRUCELOSIS

ANIMAL

Corbel,2006

PATOGENIA Y PATOLOGIA EN BRUCELOSIS

ANIMAL

La difusión de la brucelosis se realiza por

la eliminación de brucelas por vía

vaginal/mamaria luego de abortos o partos de

animales infectados.

La cantidad de brucelas excretadas es variable y

puede alcanzar hasta 1x1014/gramo de placenta

(rumiantes).

La eliminación de brucelas por vía mamaria es

intermitente pero se puede extender a lo largo de

la lactancia.

La eliminación de brucelas por vía vaginal puede

comenzar una semana antes del parto/aborto

hasta 45-60 días posteriores al mismo.

PATOGENIA Y PATOLOGIA EN BRUCELOSIS

ANIMAL

Brucella sp.

Mucosa oral o nasal Fagocitos

infectados por

Brucella sp. Circulando libre

GANGLIOS REGIONALES

(Linfoadenitis/

Adenomegalia)

PROCESO PUEDE DURAR MESES

UBICACIÓN SECUNDARIA

Brucella sp.

Destruida por MO o PMN Coloniza SRE

Animal Gestante Vía hematógena

Útero

Trofoblasto eritofagocítico del placentoma

Infección contigua

Trofoblasto de la membrana corioalantoidea

(Ulceración y ruptura de la membrana)

Vía hematógena Feto y placentoma

A diferencia de otras bacterias Brucella

posee determinantes moleculares que le

permiten:

Invadir

Resistir la muerte intracelular y

Alcanzar su nicho de replicación en

células fagocíticas no profesionales y

profesionales.

FACTORES DE VIRULENCIA DE Brucella

Genes requeridos de B. abortus 2308 para

expresión optima de HF-1 durante la fase

estacionaria

Roop y col, 2008.

Signos Clínicos:

Abortos

SMP

Disminución de la producción de leche (<20%)

Placentitis

Retención de Placenta

Epididimitis

Orquitis

Seminovesiculitis

Equinos: inflamaciones bursatiles crónicas en

cuello y cruz (Nielsen,1990)

RESPUESTA INMUNE CONTRA Brucella sp.

Tomado de Pappas,2005

RESPUESTA INMUNE HUMORAL

Ig M:

Detectable 8-15 días

post-inoculación o

vacunación.

Declina luego de 12

meses.

Reacciones

inespecíficas o

cruzadas con otros

Ag´s (Nielsen, 1996).

IgG:

Detectables 15 días post-

inoculación o vacunación.

IgG1: es abundante y

persistente.

IgG2: no valor Dx.

Efecto gestacional.

A pH´s acidos o muy

básicos bloquean las

aglutinaciones

inespecíficas de otros

isotipos (FAO/OMS,1986)

DIAGNOSTICO

1897 Wrigth-Smith, describió la primera

técnica de aglutinación.

1909, diseño de fijación de complemento.

Década 70´s ELISA.

En los 90´s FPA y PCR (Nielsen,1999).

Métodos Directos: Aislamiento-Cultivo y PCR.

Métodos Indirectos: RB, FC, SAT, ELISA-I y

ELISA-C,PAL,FPA (Nielsen,2002).

A partir de muestras biológicas, órganos y

tejidos.

Gold Standard para comparativo entre pruebas Dxs.

Largo y complejo procedimiento.

Muchas veces infructuoso por baja [bact].

Medios aislamiento 1rio: Ruiz Castañeda, SDA, TSA.

Medios Selectivos: Farell (SDA+Suplemento

brucella, TSA + antibioticos+ 5% suero equino, 2%

glucosa y 1% NaCl) (FAO/OMS,1986;Mayfield y

col,1990).

CULTIVO BACTERIANO

Diferenciación Brucella

Además de las pruebas antes descritas, es recomendable realizar

las siguientes pruebas especiales:

- Fagotipia con los brucellafagos de referencia: Tbilisi, Weybridge, y

Berkeley cuando menos.

- Aglutinación con sueros monoespecíficos anti-A y anti-M

- Crecimiento en colorantes especiales (Tionina y Fucsina)

TECNICAS SERÓLOGICAS CLASICAS

SAT: lentas en tubo con fenol, 2-ME y modificación en microplaca.

Aglutinación rápida: Huddlesson, Rosa de Bengala (RB), Ag buferado (BAP).

Fijación de Complemento.

Ensayos Inmunoenzimáticos: ELISA-Indirecto

ELISA-Competitivo

FPA (OIE,2004).

TECNICA FENOL 2-ME RIVANOL RB FC PAL ELISA-I ELISA-C FPA

Antígeno

(% C.C.)

B.abortus S99

o 1119-3

12 12 11 8 2 4 sLPS sLPS OPS 22

Kda

Igs M,G y A G y A:

G1

G M,G G1 A, M,G G1 G1

Sens.(%) 29.1-100 56.2-100 50.5-100 21.0-

98.3

23.1-97 92.5-100 97.5-100 99.0-99-3

Espec. (%) 99.2-100 99.8-100 21.9-100 68.8-100 30.6-100 90.6-100 99-7-99.8 96.9-100

Uso Complem

entaria

Comple

mentaria

Complementa

ria

VE Comple

mentaria

VE Complemen

taria

Complementa

ria diferencial

Compleme

ntaria

diferencial

DIAGNOSTICO MOLECULAR

Kary Mullis. Cetus Co. Calfornia. USA.1986.

PCR en Brucelosis

Alta sensibilidad, especificidad, rápido y

económico.

Secuencias usadas:

IS711 (Bricker y Halling,1994)

16sRNA (Romero y col,1995)

OMP31(Baily y col,1992; Streevatsan y

col,2000).

BCSP-31 (Guarino y col,2000)

Se pueden usar muestras clínicas: sangre

completa,suero, leche, semen, tejidos.

AUTOR PRIMERS AMPLIFICADO LIMITE

DETECCION

Romero et

al,1995

F4-R2. 16sRNA

B.abortus

905 pb 170 UFC/ml

B.abortus 2308.

1700 UFC/ml

B.melitensis 115

Leal-Klevesas et

al,1995

JPF-JPR. Omp-2

B.abortus

B.abortus

1,2,3,4,5,6,7,9

B.melitensis

1,2,3

B.suis 1 y5

193 pb 10 cel/ml

Baily et al, 1992 B4-B5. BSCP-31

B.abortus

223 pb

PCR en Brucelosis

Técnicas para caracterización de cepas

y biovares:

AMOS-PCR (Bricker y Halling,1994).

Multiplex (García-Yoldi y col,2006)

RFLP-PCR con IS711 (Halling y col,1993)

Genotipificación: SNP’s (Scott y col,2008)

PCR-Multiplex (García-Yoldi,2006).

Bruc

elas

mar

inas

B. m

elite

nsis

B. m

elite

nsis

REV1

B. o

vis

B.ab

ortu

s

B. a

bortu

s RB

51

B. a

bortu

s S1

9

B. su

is

B. ca

nis

B. n

eoto

mae

Amplificado

Regulador transcripcional de la familia CRP152

rpsL que codifica a una proteína ribosomal

S12218

Proteína transportadora que pertenece a la

familia ABC272

eryC que codifica para una D-eritrulosa-1-

fosfato deshidrogenasa587

Polisacárido desacetilasa794

omp31 que codifica a una proteína de

membrana externa1071

bp26 que codifica para un antígeno

dominante450

Blanco

Tam

año

del

ampl

ifica

do (b

p)Especies que amplifican

wboA que codifica para una

glicosiltransferasa1682

1. Brucelas marinas

2. B. melitensis

3. B. melitensis Rev1

4. B. ovis

5. B. abortus

6. B. abortus RB51

7. B. abortus S19

8. B. suis

9. B. canis

10. B. neotomae

PCR-Multiplex (García-Yoldi,2006).