Post on 08-Aug-2015
Para Francesca
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Tema 1: Introducción a las técnicas de manipulación genética
animal
Los animales transgénicos sirven para entender aspectos de la biología ya que permiten
conocer las funciones, hasta entonces desconocidas, de muchos genes. Así, las diferentes
secuencias de los genes tendrán una función que se detectara mediante modelos animales.
La idea es crear 20.000 ratones (tantos como número de genes humanos), cada uno con una
mutación en un gen diferente de manera que se cubran todos. Después, se observaría que les
pasa a los ratones en ausencia del gen concreto y se podría, entonces, determinar la función
del gen. En la actualidad se tienen 8.000 stem cells con una mutación en un gen diferente.
Para determinar el fenotipo del ratón mutado, este tendrá que pasar por una serie de pruebas
que evalúan diferentes capacidades, para así determinar con exactitud que parte se ve
alterada por la ausencia del gen.
Estos ratones se denominan mouse clinics.
En el mundo existe un gran número de enfermedades raras en las que no se sabe que genes se
encuentran alterados. Mediante esta tecnología se podrían estudiar estos genes, como afecta
su alteración a los pacientes y, finalmente, establecer una terapia adecuada para su cura.
La sustitución génica, nos permite crear estos modelos animales. Otra manera es hacer
animales transgénicos en los que se aumenta la dotación génica.
Microinyección de DNA
Los animales transgénicos se pueden obtener por microinyección de óvulos fecundados. Para
microinyectar a un animal se necesitan meses de entrenamiento.
Los óvulos fecundados se deben microinyectar en estadio de una célula con los dos pronúcleos
formados. Se puede inyectar el DNA de interés directamente en el núcleo. Para ello, la pipeta
debe entrar dentro del núcleo pero sin tocar el nucléolo.
Durante este proceso el embrión está sujeto mediante una pipeta más grande que crea el
vacío. La pipeta de microinyección tiene extremos romos que sirven para sujetar el embrión
sin dañarlo.
El sistema en si es muy complejo. Un paso clave en él es la obtención de micropipetas, deben
estar bien hechas ya que es imprescindible inyectar muy rápido. Hay modelos de máquinas
que hacen micropipetas con un tamaño determinado. En estas máquinas el diámetro de las
pipetas se puede especificar por ordenador.
Con el uso las micropipetas se obturan. Se deben hacer muchas. Una microforja permite dar
un ángulo determinado a las micropipetas, esta curvatura permite pinchar bien los embriones.
En el proceso de microinyección se usa el microscopio invertido. Tiene un sistema lleno de
parafina, también hay un microinyector que se puede regular.
Dentro del núcleo, se microinyecta una cantidad de DNA muy pequeña, es un sistema muy
artesanal.
Los embriones se obtienen fecundando un macho con una hembra que se ha estimulado. De
este modo se obtienen muchos embriones.
Cuando los embriones están listos se ponen en un receptáculo del microscopio invertido. Estos
receptáculos son portas perforados en los que se engancha un cubre:
La parafina sirve para que las gotas
que contienen el DNA y los
embriones no se unan.
Las micropipetas se unen a una
barra metálica. Como el espacio
entre el porta y el cubre están
llenos de parafina se consigue ejercer una presión. Entonces la pipeta ya se puede cargar de
DNA y se van pinchando los embriones desde arriba.
La gestación tiene lugar en hembras pseudogestantes. Estas hembras han sido previamente
cruzadas con machos vasectomizados para inducir la producción de hormonas. Esta monta le
provoca a la hembra un paro en su ciclo estral cosa que las prepara hormonalmente para
gestar. Se sabe las hembras pseudogestantes que hay por el tapón vaginal
Por lo tanto se han dado dos cruces, uno entre una hembra y un macho para obtener los
embriones en los que se les inyecta el DNA, y el otro que se realiza entre la hembra a la que
transferiremos los embriones y un macho vasectomizado.
Se debe tener en cuenta que para este proceso es muy importante utilizar hembras de una
cepa pacífica para que gesten los embriones. El motivo es que las cepas normales tienden a
comerse a las crías si estas son muchas o tienen alguna anomalía.
La transferencia a hembras receptoras se hace por detrás mediante cirugia, metiendo la pipeta
por el infundibulum. Se hacen dos operaciones, una en cada lado; de modo que se inyectan 20
Imagen: Punta de micropipeta curvada
embriones por lado. De este número, no todos se implantan, pero así se garantiza que el
número de implantados sea elevado.
Los blastocistos se transfieren preferentemente al útero de la hembra. La transferencia a útero
se hace 2,5 dpc (días post coitum, que se cuentan a partir del tapón vaginal), en cambio si la
transferencia es en oviducto se hace 0,5 dpc.
La microinyección del DNA se ha realizado en el pronúcleo masculino.
Se debe tener en cuenta que la incorporación del DNA es al azar en el genoma y en un mismo
embrión el DNA se puede incorporar en varios puntos. Solo se microinyecta el gen que, cuando
se incorpora, normalmente lo hace cabeza-cola:
De todos los ratones que nazcan no todos serán transgénicos. Habrá algunos que no habrán
incorporado el transgen. Los que lo hayan incorporado serán o mosaicos o transgénicos.
El animal transgénico se caracterizará por tener el gen incorporado en todas sus células, esto
es porque la incorporación se ha dado en estadio de una cél·lula.
Se puede saber si una cría tiene el transgen o no, o si es mosaico o transgénica a las tres
semanas de vida. Es el momento en que los ratones se destetan. Entonces, se corta una parte
de la cola y se hace un Southern-Blot.
A continuación se muestra un ejemplo de Southern-Blot para este fin:
Para saber si los animales que han incorporado el transgen son transgénicos o no, se cruzan
con un wild type. Es más beneficioso que los ratones sean machos porque se va más rápido. Un
un transgénico verdadero y un wild type dará en la F1 el 50% de las crías transgénicas y el otro
50 no transgénicas.
Si es mosaico la proporción será distinta y, aproximadamente un 10% será transgénico y un
90% no transgénico.
Este cruce se debe hacer con tres líneas de transgénicos para comprobar que el fenotipo es el
esperado y que no presenta variaciones. Los ratones que componen la F1 obtenida del cruce
se utilizan de sementales y se van cruzando con hembras.
Todo este proceso es muy caro. Se debe tener en cuenta los animales que se necesitan para el
experimento. Los ratones tienen que mantenerse, controlar los que nazcan…
Lo más importante es el diseño del animal que debe expresar el gen en el sitio que queremos.
Además de eso el gen ha de funcionar in vivo. Queremos que el gen se exprese dando lugar a
la actividad que queremos, al crear animales transgénicos es muy posible que el fenotipo sea
inesperado.
Ejemplo de animal transgénico con fenotipo inesperado:
Ratones que sobreexpresan la hormona del crecimiento (IGF-1, factor de crecimiento
insulínico), tienen tamaño más grande del normal. Se utilizó el promotor de la insulina.
Se quiso poner la hormona de crecimiento en el páncreas, pero la insulina además de
expresarse en el páncreas lo hace en el ojo. El resultado son animales con retinopatía
similar a la que padecen los diabéticos humanos. El fenotipo inesperado sirvió como
modelo de ceguera y así se pudo avanzar en el intento de crear tratamientos que les
devolvieran la visión a los pacientes.
Los animales transgénicos son herramientas para mejorar la medicina. Si se manipula un gen
de un embrión y este tiene una gran expresión en el desarrollo embrionario, la alteración
puede llegar a ser letal, de manera que no nazcan transgénicos sin ese gen. Para estos casos es
interesante inducir la expresión del transgen cuando interese.
Se necesita un vector para introducir el DNA de interés en el DNA del huésped. Muchas veces
es un plásmido en el que se han eliminado las secuencias bacterianas y se ha puesto el gen de
interés.
El proceso de creación de un transgénico es largo, de al menos un año. Una equivocación
implica una gran pérdida de tiempo y dinero.
El diseño y la construcción del gen quimérico es la parte más importante del diseño. Esta parte
dependerá de la pericia de los trabajadores teniendo en cuenta que, a veces, se ha de hacer
subclonaciones.
Antes de colocarlo en un animal, el constructo se ha de probar en células in vitro, de esta
manera se garantiza su funcionamiento. Si no funciona in vitro, se debe diseñar otro
constructo. Si funciona es muy buena señal para continuar con el proyecto.
Para probar el constructo se debe utilizar las células en las que in vivo se expresaría. Por
ejemplo, si se va a trabajar con hígado, probar en hepatocitos.
Del primer al segundo paso se tardan unos seis meses. Luego va la etapa de microinyección,
nacerá la Fo y se determinarán los transgénicos y los no transgénicos. La microinyección tarda,
como mínimo, tres meses. Contando todo el proceso, entre unas cosas y otras se tarda un año
en obtener el animal transgénico.
Economicamente, el proceso desde que se diseña hasta que se obtienen el animal cuesta
12000 euros.
Es importante tener en cuenta que la mayoría de transgénicos no se distinguen de los
controles. Se deberá hacer, pues, un Southern-Blot con un trozo de la cola.
Fenotipo buscado
Se debe tener claro la naturaleza del gen que se va a introducir o truncar (si se trata de un
receptor, de una hormona del cerebro, de un oncogen…).
Otra cosa importante es determinar el tamaño del gen ya que influenciará en la elección del
vector a utilizar. En principio, interesa que el gen sea pequeño. De todos modos, si es muy
grande se puede utilizar un YAC o un BAC. En caso de usar BAC o YAC, estos no se integran en
el genoma sino que quedan sueltos como si de un cromosoma más se trataran. Otra opción es
realizar un minigen:
Esta posibilidad quita tiempo.
También se puede obtener el cDNA del gen, que no tiene intrones. El problema es que los
cDNA in vivo no funcionan bien. Se tiene que crear un gen artificial.
El vector de expresión se realiza poniendo colas poliA, fragmentos de otro gen (como
promotores…) al lado de nuestro gen de interés. Si este es pequeño se puede enganchar
directamente al promotor sin necesidad de crear un gen artificial.
Un ejemplo de gen artificial es el que se crea uniendo el segundo y el tercer exón de la -
globina. Este gen da lugar a un mRNA muy estable. Así pues, el gen de la -globina solo sirve
para estabilizar el mRNA mensajero. En cambio, la región promotora será la de nuestro gen de
interés u otra que interese.
El fenotipo buscado vendrá determinado en gran medida por el promotor que utilicemos:
Cuando: en qué momento del desarrollo queremos que se exprese.
PROMOTOR Cómo: si se quiere de manera regulada o no…
Dónde: específico de un lugar o no…
Codones optimizados
En la célula hay tRNAs más comunes que otros. Lo ideal es ajustar las bases de manera que den
el mismo aa pero para el tRNA mayoritario de la especie que utilicemos. Esto permite obtener
más proteína ya que el sistema no se colapsa.
Tema 2: Transgénesis sustitutiva, Knock-out/ in
Transgénesis por Adición: se añaden nuevos genes al genoma. El constructo se insertará al
azar. Permitió descubrir múltiples genes con función desconocida.
Transgénesis Sustitutiva: se introduce una mutación en un lugar concreto del genoma, no al
azar. Si esta mutación corresponde a la supresión del gen hablaremos de animales knock-out.
Si se elimina la secuencia interesante del genoma podemos ver la función que falta. Si no se
elimina el gen hablaremos de knock-in.
La modificación específica se hace por un proceso de recombinación homóloga. La
recombinación se dará entre el targeting vector i el genoma.
No se puede hacer directamente inyectando el vector en el genoma.
Primero se debe modificar el genoma de unas células madre embrionarias. Se aprovecha para
generar un animal que lleve la mutación genética en todas sus células. La invención de este
proceso supuso que tres investigadores recibieran el premio Nobel.
El Dr. Evans descubrió como cultivar células madre y como obtenerlas de un blastocisto sin que
perdieran pluripotencialidad. La pluripotencialidad define a las células que pueden
diferenciarse dando lugar a todos los tipos celulares. Una vez en las placas de Petri, se podían
reintroducir en otro blastocisto sin que perdieran la función generando animales quimera.
Otro investigador descubrió que a través de la recombinación homóloga se podía crear
variabilidad y mutaciones en células de mamífero.
En el año 1981 se demostró que podía existir recombinación homóloga entre un DNA exógeno
y el genoma de una célula de mamífero. Hasta entonces se desconocía su existencia en
mamíferos.
Las investigaciones de unos investigadores que se pusieron de acuerdo permitieron el
surgimiento de los animales knock-out (KO).
La modificación que se hace del genoma puede estar presente en todas las células del animal,
desde que este se genera.
Si se escoge en que tejido específico i en que momento de la vida se hace la mutación, se habla
de knock-out y knock-in condicionales. La metodología para obtener knock-out y knock-in
totales o condicionales es diferente, pero se da siempre mediante mutaciones dirigidas.
Knock-out/ -in total
Primero se modifica el gen en el genoma de las células madre embrionarias. Después se utiliza
estas células para generar un animal en el que todas sus células presenten la mutación. Se
hace mediante un vector llamado targeting vector. Hay dos tipos de targeting vector: los
vectores de inserción y los de sustitución.
Los vectores de inserción tienen las siguientes características:
En nuestro gen de interés, pues, se introduce todo el vector. De esta manera, el gen queda
roto. También se puede dar el caso de duplicaciones del gen de interés y perderse el knock-
out. Normalmente esto no pasa y da como resultado proteínas no funcionales (lo que
queríamos al truncar el gen). De todos modos se ha dejado de usar por la posibilidad de
reversión del knock-out.
El vector de sustitución se caracteriza por tener la siguiente estructura:
En este caso, el targeting vector se usa para sustituir una parte esencial del gen o el gen de
interés entero por secuencias del vector. El vector de sustitución ahora se utiliza más. Consiste
en:
Dos brazos homólogos (es decir, con dos secuencias homólogas al gen que queremos
introducir. Las secuencias de vector y DNA han de ser, pues, isogénicas)
La longitud de los brazos de homología es crítica para el mayor grado de
recombinación homóloga. Deben ser de como mínimo 2kb. Si son más cortos se
producirá menos recombinación homóloga.
Un casete de selección positiva (normalmente resistencia a neomicina, neo).
El gen de resistencia a neomicina está situado entre los brazos de homología, de
manera que si se sustituye el gen por el vector, se pueda detectar mediante este
antibiótico.
Un casete de selección negativa (TK).
El gen de selección negativa normalmente se añade en un extremo del vector, fuera de
las secuencias de homología. Se suele utilizar el gen de la Timidina Kinasa.
Se debe tener en cuenta que el fragmento a delecionar es mejor que sea pequeño para
obtener una frecuencia de éxito mayor pero siempre asegurándonos que se pierde totalmente
la función de la proteína que codifica ni se toca ninguna secuencia reguladora. Así pues, el
fragmento a delecionar mejor que sean unos cuantos exones en lugar del gen entero.
Para conseguir que las stem cells en las que se quiere introducir el gen recombinante estén
receptivas se utiliza la electroporación. La electroporación consiste en inducir la formación de
poros en la membrana de las células mediante choques que se dan por la aplicación de un
campo magnético externo. Así se consigue introducir el gen recombinante de forma lineal y, en
algunos casos, se producirá la recombinación homóloga en el núcleo.
Entonces se sembrará en placas de Petri. Ahora interesa seleccionar los casos en los que el
targeting vector reconozca el gen de la célula madre y se dé la recombinación homóloga entre
el vector y el gen de interés. El resultado de la recombinación será la sustitución de exones por
secuencias de nuestro vector (normalmente un gen de resistencia). En el genoma de la célula
madre el gen queda roto ya que se han introducido secuencias externas.
En el momento de seleccionar las stem cells de interés, se debe tener en cuenta que al
introducir el vector de recombinación pueden pasar varias cosas:
Degradación del vector (no hay modificación)
Inserción en cualquier punto del genoma no homólogo. Si esto ocurre, se suele
introducir todo el vector.
Integración del vector en el gen de interés (lo que interesa)
En la placa de cultivo hay, pues, estos tres tipos de células. Para seleccionar las que han
integrado el vector en el gen de interés se debe añadir neomicina y danciclovir al cultivo. Así,
las células con resistencia a neomicina vivirán en presencia de este antibiótico y las células con
actividad timidina-quinasa (TK) morirán en presencia de danciclovir. Solo quedaran las células
con resistencia a neomicina pero sin actividad TK:
Cuando no hay inserción las células no resistirán la neomicina y si esta ha sido al azar tendrán
actividad TK. Las únicas que sobrevivirán serán las que hayan hecho recombinación homóloga
ya que resisten a los dos antibióticos. Esta prueba se debe realizar siempre para obtener los
clones recombinantes.
Después de la selección se usan estas células para microinyectar. Las colonias interesantes se
pescan de las placas de Petri. La microinyección es en blastocisto (en KO condicionales).
Las células de la masa celular interna son células madre embrionarias o embrionic stem cells.
Las células madre se introducen en la
cavidad. Aquí se encontraran con otras
células madre no recombinantes. Después de fomar la cavidad el blastocisto eclosiona.
Al desarrollarse el ratón, los dos tipos de células participaran. Los embriones microinyectados
se transferirán a una hembra receptora. Estos ratones son llamados quimera.
Un animal quimera es aquel que está formado por dos tipos de células madre.
Un ejemplo de animal quimera seria el obtenido a partir de unos blastocitos de una cepa de
color blanco en los que se ha introducido el gen recombinante mediante blastocitos de una
cepa negra. Podremos ver en función del color del pelaje si el animal es quimérico o no.
Tal como se observa en la imagen inferior, para obtener animales quimera se puede utilizar la
microinyección de stem cells a blastocisto, la agregación o inyección a mórula, o la
agregación o microinyección a embriones tetraploides.
La mórula es una fase embrionaria compacta y sin cavidad en el interior. También se puede
utilizar para obtener animales quimera. En la microinyección en mórula se dejan entre 5 y 6
stem cells.
La zona pelúcida protege el embrión durante periodos preimplantacionales. Se tendrá que
tratar para poder microinyectar en estos estadios. Podemos trabajar con una agregación, esto
se realiza cultivando embriones sin ZP con cúmulos de stem cells durante un over-night. Al día
siguiente el cúmulo se habrá convertido en blastocisto con una masa molecular interna que
contendrá las stem cells inyectadas. Con la agregación algunas veces no se obtienen quimeras
sino un animal que proviene totalmente de la inyección de stem cells.
Otra manera de obtener animales que derivan únicamente de las stem cells es partiendo de
dos células 2n. Se induce la fusión de las dos membranas plasmáticas y, así, se obtiene un
embrión de una célula tetraploide. Se pueden mantener en cultivo hasta es estadio de mórula
o blastocisto.
De esta manera se pueden obtener mórulas tetraploides y agregar stem cells diploides.
Entonces el trofoectodermo será tetraploide pero la massa molecular interna será diplode. El
animal deriva completamente de las células 2n recombinantes. Las células tetraploides darán
lugar a tejidos extracelulares como la placenta. Con esta técnica se pueden llegar a obtener
knock-out totales.
Mórula oviducto
Localización de los embriones
Blastocisto útero
Al inyectar DNA en blastocisto se produce un colapso (colapso en blastocisto). Este colapso es
imprescindible para que haya contacto íntimo para que se forme el animal quimera. Después
el blastocisto comenzará a cavitar.
Interesará que un animal quimérico haya incorporado la mutación sobretodo en células
germinales ya que se conseguiría que pasaran a la descendencia. El blastocito que se utiliza es
de macho.
Entonces se coge el macho quimera y se cruza con una hembra control. Para ello, se utiliza una
hembra de color blanco (recesivo). Si obtenemos en la primera generación ratones negros es
que han heredado la mutación. Es decir, pueden llevar el knock-out. En cambio, si fueran
blancos provendrían del genoma no mutado.
Se debe tener en cuenta que los knock-out obtenidos serán heterocigóticos ya que la hembra
es blanca (recessiva). Así pues, siempre se procura que domine el gen que nos interesa. Estos
knock-out no serán totales.
Para obtener knock-out totales, se debe cruzar 2 heterocigóticos para el knock-out:
De esta manera se obtendrían los animales en la siguiente proporción:
- 25% homocigóticos
(knock-out totales)
- 50% heterocigóticos.
- 25% wild type (control)
Un knock-out total es un
animal knockeado en
todos los sentidos desde
que se genera y en todas
sus células.
Las células madre
embrionarias provienen de
la masa celular interna de
un blastocito. Son células pluripotentes ya que pueden dar lugar a cualquier tipo celular. Es
importante mantener la pluripotencialidad in vitro. Así que se deben cultivar, modificar,
hacerles inserciones… sin que hayan perdido esta característica.
Para este fin se utilizan cepas: 129Sv Agutí (Ag)
C57B16 Blanco (Bl)
Las madres receptoras pacíficas son de las cepas CD-1 y ICR.
Las quimeras que se obtienen con la cepa Agutí (cepa negra), tendrán manchas marrones
sobre un fondo negro. Las stem cells marrones tendrán la recombinación homóloga en
heterozigosi (el otro alelo no está recombinado).
Podemos encontrar muchos fenotipos: negros, marrón con modificación genética, marrón sin
modificación genética…
De la F1 se tendrán que fenotipar los marrones para saber cuáles son knock-outs
heterozigóticos. Después se cruzan dos heterocigóticos para el knock-out y así se obtendrán,
aproximadamente, el 25% de knock-out totales. El código de color solo se utiliza para la F1.
Otra cosa a tener en cuenta es que cuando se trata de fibroblastos embrionarios murinos la
mayoría de stem cells tienen que ser cultivadas encima de una monocapa de MEF. Las capas
de MEF confieren un contacto entre células. Además, los MEF secretan factores que impiden la
diferenciación (p.ej. LIF, leukemia inhibitory factor). Es importante que los clones no lleguen a
tocarse. Demasiada confluencia puede hacer que se diferencien.
La única prueba para saber si la stem cell se ha diferenciado o no es mirando la morfología. Las
stem cells se ven muy delimitadas. En cambio, si la diferenciación se ha dado el clon pierde la
delimitación y se aplana.
Si no nos damos cuenta de que se han empezado a diferenciar, al introducirlas en un
blastocisto no darán lugar a todos los tipos celulares. Muchas veces en los animales quimera
falla la línea germinal. Esto supone una pérdida tanto de tiempo como de dinero.
Las stem cells que se utilizan para microinyectar son normalmente de macho, pero al inyectar
no se sabe si el blastocisto será macho o hembra. Así pues se pueden dar varias opciones:
Machos quimera fértiles: si se inyectan a un blastocisto macho.
Conversión de sexo
Hermafroditismo si se inyectan a un bastocisto hembra.
Hembra quimera
Conversión de sexo: se da cuando las células XY colonizan muchas porciones de tejido.
Siempre puede quedar algunas células XX. Estos machos tienen la gran ventaja que solo darán
espermatogénesi sus células XY. Así solo se transmitirá a la descendencia el genotipo XY
(células recombinantes).
Conversión de sexo incompleta: obtenemos animales hermafroditas infértiles, no sirven.
Hembra quimera: estas hembras no transmitirán a la descendencia el genotipo XY. Hay células
XY inestables que pierden el cromosoma Y. Serán XO. Estas células pueden dar ovogénesis.
Induced Pluripotencial Stem Cells (iPS)
Antes no se sabía el camino para obtener células embrionarias de una célula normal. Las iPS
son parecidas a las células madre y provienen de células ya diferenciadas. Por ejemplo, a partir
de fibroblastos y añadiendo diversos factores se pudo obtener células madre iPS. Los factores
utilizados en este caso fueron: Oct4, Sox2, Mye, Klf4.
Las células iPS se parecen mucho a las células madre embrionarias pero hacía falta ver si eran
pluripotentes. Para ello se microinyectaron en embriones y se obtuvieron animales quimera.
Se vio que las iPS se pueden diferenciar en cualquier célula así que, efectivamente, son
pluripotentes. Ahora se pueden aplicar las iPS en terapia génica o en transplantes para evitar el
rechazo.
Limitaciones de los animales KO
Al sustituir la secuencia de interés por el gen neo podemos afectar a locus cercanos. Lo que se
quiere es estudiar la función del gen que falta, no las alteraciones que se producen en genes
cercanos por su ausencia.
Si se elimina un gen endógeno puede que el animal no llegue a superar la fase embrionaria.
En este caso, no se puede estudiar ni sus acciones ni su función.
También puede haber problemas de adaptación y compensación. Por ejemplo, se muta un gen
y el resto de genes (background genético) compensan su ausencia. Por tanto, al no notarse su
ausencia no se puede estudiar la función. Si la compensación se da en fase embrionaria,
además, no se puede realizar un seguimiento.
Si se knockean todas las células y la expresión se da en varios tejidos, puede que tengamos un
efecto global difícil de estudiar. Por ejemplo, el gen se expresa en hígado, riñón y tejido
adiposo. En hígado y riñón tiene la misma función pero en tejido adiposo esta es distinta. De
esta manera, al observar el fenotipo global no se puede discernir que tejido expresa cada
función.
Ventajas de los animales KO totales
Animales KO/KI condicionales o inducibles
En este caso se modifica un gen concreto del genoma en un tejido concreto y/o en un
momento concreto. Hablaremos de KO y KI condicionales o inducibles. Se utilizaran
tecnologías como el sistema de recombinasa específico de secuencia y técnicas de gene
targeting para hacer KO/KI.
Sistema de la CRE-loxP
Se parte de una secuencia de DNA específica que reconoce la CRE y otra que reconoce el loxP.
La CRE cataliza la recombinasa conservativa (sin pérdida de nt) entre dos loxP.
LoxP: son dos fragmentos de 13 pb invertidos, en su centro hay un core que define su
orientación. La orientación de los loxP vendrá definida por un triángulo:
Dependiendo de la orientación de los loxP, CRE hará una función u otra.
Las dos secuencias loxP junto con las dos moléculas de CRE que se unen a loxP forman un
tetrámero.
Cuando los dos loxP están en la misma orientación se da una deleción del ADN que se lleva los
dos loxP. Esta reacción de recombinación suele ser unidireccional, es decir no se puede
recuperar. Normalmente se utiliza este sistema.
Si los loxP se encuentran en la dirección opuesta, las secuencias que se encontraban entre los
loxP se invertirán produciéndose una inversión.
DELECIÓN
INVERSIÓN
Hay otro mecanismo de recombinación llamado Flp-FRT que procede del plásmido 2m de
Saccharomyces Cerevisiae. Es similar al sistema Cre-LoxP, pero presenta una baja eficiencia en
células animales (37ºC). Por ello, se utiliza preferentemente el sistema Cre-LoxP. Se debe tener
en cuenta que recientemente se han obtenido otras variantes (Flpe, FlpL) que aumentan su
actividad in vitro e in vivo.
Propiedades que hacen útiles estos sistemas para la transgénesis animal
No se encuentran normalmente en el genoma
Se puede transmitir a la descendencia
Aplicaciones de las recombinasas
- La CRE se puede utilizar para eliminar el gen neo del genoma.
- En transgénesi por adición se puede hacer que el gen de interés no se exprese hasta
que se quiera. Se ponen secuencias STOP que después se delecionan con CRE (gene
repair).
- Poner un gen marcador que solo se expresará cuando se delecione un STOP (indicator
mice).
- En alteraciones cromosómicas los dos loxP pueden estar muy separados, incluso estar
en cromosomas diferentes. Por ello se pueden dar translocaciones.
- Knock out específico de tejido.
Knock out específico de tejido
Si se quiere hacer un KO con mutación específica de tejido (por ejemplo solo en hígado), se
hacen dos tipos de transgénicos para, después, cruzarlos:
- Un ratón floxado que por recombinación homóloga en stem cells tiene introducido
dos loxP en zonas intrónicas rodeando secuencias importantes del gen del que se
quiere producir el KO. Será pues un KI ya que el gen seguirá siendo activo porque los
loxP están en intrones.
- Un transgénico convencional generado por adición. Expresará la recombinasa CRE
junto a un promotor específico de hígado. Así, aunque el gen esté en todas las células
se expresará solo en hígado.
Al cruzar los dos animales se obtiene un doble transgénico con el gen que se quiere integrar
floxado en todo el organismo, pero la recombinasa CRE solo se expresará en hígado. De esta
forma el gen floxado se expresará en el resto de tejidos. Se deben hacer suficientes cruces
para obtener el gen floxado en homocigosis y la recombinasa CRE, al menos, en heterocigosi.
Una vez se tiene el gen floxado, se cruza el transgénico con animales que expresan la CRE en
diferentes tejidos. Así se obtienen KO específicos del tejido donde se expresa CRE.
El targeting vector que se utiliza para obtener un animal floxado (conditional gene targeting)
es:
Se ha diseñado para que después de la recombinación homóloga se introduzcan los
loxP en intrones.
Tiene dos brazos de homología con la secuencia que se quiere floxar.
A menudo se añade un tercer loxP (también en una región intrónica), con un gen de
resistencia a neomicina rodeado de dos loxP.
En uno de los extremos se introduce un gen de selección negativa (por ejemplo TK).
Cuando se da la recombinación se sustituye el intrón por el vector. Como se ha mencionado
anteriormente, la mutación se ha introducido en secuencias intrónicas. Se pueden inyectar
estas células directamente a un animal o hacer una transfección transitoria con CRE en las
células in vitro. Hay tres tipos de deleción:
- Recombinasa 1 y 3: se obtiene el KO total sin neo (gen de resistencia a neomicina).
- Recombinasa 2 y 3: se obtiene el KO equivalente al de antes, no sirve.
- Recombinasa 1 y 2: se obtiene el gen de interés floxado en las stem cells. Se deben
seleccionar estas. La selección se puede hacer mediante PCR y por Southern-blot
(biología molecular).
KO/KI inducible
El sistema inducible sirve para determinar el lugar y el momento de la activación de la
recombinasa CRE.
Como ya se ha mencionado se debe producir un animal transgénico floxado rodeando los
genes que se quieren floxar. El gen debe ser activo en todas las células.
También hace falta generar un animal transgénico con un constructo que exprese la
recombinasa CRE en un sistema inducible. Así, CRE se expresará en presencia de la droga.
Al cruzar ambos transgénicos se obtiene un doble transgénico que solo expresará CRE con la
droga. Si el KO se expresa solo en un tejido será específico de tejido. Si no, se expresará en
todas las células.
Control de la actividad de CRE
A. Nivel transcripcional: bajo promotores inducibles (por ejemplo, metalotioneina con metales
pesados; ecdisoma que es una hormona de Drosophila…). El que más se utiliza es la
tetraciclina:
- Clásico o Tet-Off
- Reverso o Tet-On
Sistema Tetraciclina Clásico o Tet-Off:
En ausencia de tetraciclina, el transactivador queda libre y se une al operador que está junto al
promotor que dirigirá la expresión de CRE.
Se puede usar el mismo sistema con doxiciclina (Dox) dando el mismo resultado.
En estos casos, el inductor inhibe la transcripción de CRE y se debe administrar el antibiótico
durante las fases embrionarias si no se quiere que se exprese CRE. Esto tiene efectos
secundarios.
Por estos inconvenientes se desarrolló el sistema reverso o Tet-On.
Sistema Tetraciclina reverso o Tet-On:
En este sistema al administrar tetraciclina se activa la recombinasa CRE.
Aquí, el transactivador está modificado (reverso) de manera que es incapaz de unirse al
operador si no hay antibiótico. Si se quiere expresar el KO, tan solo debe administrarse el
antibiótico. El sistema Tet-On también se puede utilizar con doxiciclina.
B. Nivel post-transcripcional: Se utiliza una CRE como proteína quimérica (CRE ER-LBD). El
resultado es una proteína quimérica que en ausencia de promotor se une a HS protein.
Así, cuando se administra el inductor este compite con las hit-shot proteins por la proteína
quimérica. El complejo con el inductor es capaz de activar el KO llegando al núcleo.
Limitaciones de los KO condicionales
Además, se generan dos tipos de transgénicos y se debe obtener un elevado número de
transgénicos que expresan la recombinasa CRE de tejidos específicos y con promotor inducible.
Aun así se tienen que hacer muchos cruces.
Otro inconveniente es que el producto génico de la proteína que se quiere knockear, a veces,
tiene una vida media muy larga. Entonces se tarda mucho en ver los efectos. Cuando se
knockea un gen aún se puede encontrar actividad suya al cabo de un tiempo de expresión.
Se han hecho variantes de la proteína quimérica que con poco inductor funcionan.
En los animales con mosaicismo, CRE no siempre se expresa o se expresa de la misma manera.
Esto implica que no en todas las células se da la recombinación y, por tanto, el knock-out. Si es
el caso se podría enmascarar el fenotipo ya que se debe tener en cuenta que, a veces, con
poco tanto por ciento de proteína de interés el fenotipo original se puede mantener.
Se pueden hacer dos cosas:
Hibridación in situ: para ver qué tanto por ciento de células tienen el mensajero
mutado. Para ello es mejor hacer deleciones grandes.
Poner un gen marcador que se active cuando CRE recombine. Se activa cuando el gen
se escinde.
El inconveniente es que estos estudios se realizan básicamente en ratón. Las stem cells de
ratón son las únicas que superan las gene targeting. Hay un estudio con stem cells de rata pero
no es muy eficiente. Actualmente se estudia la manera de cultivar stem cells para que sean
más estables en cultivo. Hay inhibidores como el fibroblast grouth factor (FGF), ERK, GSK3…
Tecnología KO/KI. Aplicaciones en estudio de la función génica, estudio de
enfermedades y xenotransplantes.
Básicamente los KO se utilizan para analizar la función génica. Una vez se sabe qué gen está
relacionado con una enfermedad, se puede crear animales modelos en los que probar terapias
que inhiben la enfermedad. Por ejemplo, las enfermedades de base monogénica serian más
fáciles de estudiar.
En xenotransplantes básicamente se utilizan transgénicos con un gen concreto inyectado.
También se intenta alterar genéticamente un animal modificando sus antígenos de superficie.
Los estudios más avanzados son del corazón, riñones…
Transgénesis en stem cells dirigida
Se conoce a priori el gen que se quiere modificar.
Transgénesis en stem cells al azar. Se producen animales Gene-Trap.
Cuando se habla de gen endógeno se hace referencia al gen mutado.
La primera parte del vector no tiene promotor, la segunda sí. Así, el primer gen no lleva
promotor y el segundo gen (gen de resistencia) sí.
Esto da lugar a dos posibilidades:
- Condiciones normales (1): el gen endógeno se expresa y da una proteína funcional.
- Gene-Trap (2): se inserta en el gen. El gen deja de producir el mensajero y se hace el
KO. LacZ se producirá solo en los tejidos en los que se produce el gen de interés,
tejidos en los que lacZ estará activo.
Para introducir el Gene-Trap se utiliza la electroporación en células madre embrionarias. Las
células con el Gene-Trap serán resistentes a neomicina y expresarán lacZ. Se puede hacer
clonación y secuenciación y así saber el gen que se ha mutado (a priori no se sabe). De esta
manera se puede obtener un animal quimera y saber en qué tejido expresará el gen.
Consorcios
Todas las tecnologías de KO que se están haciendo aquí siguen consorcios europeos (por
ejemplo EUCOM).
EUCOM utiliza un vector para hacer el KO que es un híbrido entre el KO y el Gene-Trap. El
vector tiene dos brazos de homología con el gen de interés, que queda floxado. El vector tiene
el gen marcador con el de resistencia a neomicina.
Cuando se da la recombinación homóloga se obtiene un KI. El gen está knockeado porque se
ha activado el aceptor de splicing y el gen -gal. Si además lleva CRE, se puede lograr una
expresión específica de tejido. En un solo casete se tiene todo.
Tema 3: Métodos de transferencia genética en animales grandes
La obtención de animales grandes es, inicialmente, como en ratón. Es decir, por
microinyección de DNA. Este sistema no es muy eficaz, es complicado y caro.
Se intentó mejorar el sistema usando esperma como vector, pero ninguno de los dos sistemas
era perfecto.
Más tarde se realizó la transferencia de núcleos para crear animales clónicos. Antes era lo que
se utilizaba.
Por último, también está la introducción de vectores virales (retrovirus RV o lentirus LV). Esto
nos permite formar cualquier animal.
Hay por tanto cuatro métodos que seguidamente se explicaran.
Microinyección de DNA
El ratón tiene madurez sexual muy
pronto (a las seis semanas ya se
puede trabajar). Al superovular, se
puede obtener de 20 a 30
embriones. Además el periodo de
gestación de los embriones es corto.
Solían nacer entre 15-10 ratones de
los embriones transferidos. Esto
disminuye en animales grandes.
Por ejemplo, con cerdo es bastante complicado aunque al superovular se puede obtener de 15
a 20 embriones (números similares a ratones). El inconveniente, en parte, viene dado porque
se necesita mucho más tiempo para gestar (15 semanas). Se puede saber si los cerdos recién
nacidos son transgénicos cogiendo una muestra y haciendo un transfer.
En las ovejas, la madurez sexual es alrededor de las 35 semanas y al superovular se puede
obtener de 4 a 10 embriones. Al transferir no se pueden transferir los 10 embriones, tendrá
que ser uno o dos. Por ello, el rendimiento baja mucho (1%). Para obtener un animal
transgénico será necesario transferir a alrededor de 100 ovejas. La obtención de animales
grandes transgénicos requiere pues de grandes granjas, mantener los animales… Es un proceso
muy caro. En Australia y Nueva Zelanda se hacen ovejas transgénicas para optimizar el
comercio de la lana.
En las vacas la madurez sexual es de 52 a 65 semanas. Las vacas se fecundaran in vitro. El
periodo de gestación son 39 semanas y solo se puede gestar un animal. La obtención de vacas
transgénicas se hacía en Alemania y Canadá, pero ahora la producción está bastante parada. El
rendimiento es también del 1%.
El proceso de microinyección es el mismo:
Los embriones de ratón son muy transparentes. Los de conejo, por ejemplo, son muy elásticos.
Los embriones de animales más grandes son opacos debido a que tienen una capa de mucina a
un lado. Esto baja mucho el rendimiento.
La microinyección, en sí, es relativamente simple. Ahora se fecunda in vitro o se inseminan las
hembras. Se necesita un equipo de gente muy grande y la transferencia a hembras receptoras
se debe realizar en hospital (esto es mucho más complicado en cuanto a equipamiento).
El número de transgénicos que nacerán será muy bajo. Para obtener una cabra transgénica
tendrían que nacer 100 animales y, de ellos, uno será transgénico (rendimiento del 1%). Para
microinyectar, además, se necesita mucha práctica.
Se introduce en el embrión un gen quimérico que lleva un vector con un promotor. Los
animales ya nacen con este gen. En terapia génica, el gen debe ser de la misma especie (el
animal ya tiene SI). Así, en transgénicos el gen ya se detecta como propio. El constructo se
prueba en ratón o en animales pequeños, para estar seguros de que funcionarán in vivo. Si el
transgénico sale mal, dado al bajo rendimiento de la técnica, aún se pierde más dinero.
Por ejemplo, se hicieron cerdos con menos grasa que dieran mejores hamburguesas (años 90)
o mejores costillas. La empresa quebró porque los cerdos tuvieron muchos problemas de salud
(más hormona del crecimiento, acromegalia). Ahora la gente no quiere comer animales
transgénicos.
También se hacían animales resistentes a plagas. En una granja cuando el animal tiene una
enfermedad lo puede pasar a toda la granja y morir todos.
Aplicaciones de la ingeniería genética
Para la ciencia biomédica
Actualmente se hacen animales transgénicos como modelos de enfermedades humanas. Los
ensayos se hacen en animales grandes (por ejemplo, la diabetes se puede inducir en perro).
Aun así, no hay modelos animales de todas las enfermedades humanas. Faltan modelos
animales que se tienen que crear. Los animales grandes de granja también se han utilizado
para la producción de biofármacos. Hay proteínas que para ser activadas necesitan
determinadas glicosilaciones. Han de producirlas células eucariotas.
Los animales transgénicos también se utilizan para desarrollar nuevas terapias y
xenotransplantes. Los transgénicos para xenotransplantes trabajan mucho con el sistema
immunológico.
La FDA no aprobaba muchos protocolos ya que transferir un órgano de cerdo a humano puede
ser un vehículo de zoonosis (transfección de enfermedades de animal a humanos). Ahora las
las investigaciones se están desplazando al mundo de las stem cells.
Para diabéticos se están transfiriendo islotes de cerdo. Los transplantes duran un año y se
tienen que renovar. Los restos provocan fibrosis en el estómago. Cada vez se hacen menos
xenotransplantes.
Para mejorar la lana se modifican las proteínas de esta. Otra cosa es aumentar la eficiencia de
las ligninas (productos más baratos para alimentar). También se puede augmentar la calidad
de las carnes (con menos colesterol, mejor leche…).
Se hicieron conejos transgénicos que crecían más rápido. Uno de ellos se convirtió en un
modelo de acromegalia (cabeza muy grande y patas largas). El problema es que los ovarios
eran inmaduros y como consecuencia los animales eran estériles. El animal no sirvió como
modelo de estudio. No hay modelos animales de acromegalia. Estos animales no se pueden
reproducir.
Otros ejemplos:
Animales clónicos
Los animales que provienen de una misma célula animal (por ejemplo, de vaca) provienen de
un mismo embrión y, por tanto, son idénticos genéticamente. Las manchas que tendrán sí que
serán diferentes.
Obtención a partir de la manipulación del esperma
Todo el mundo probó esta técnica pero no funcionó bien. En realidad el gen no entra en el
espermatozoide sino que se engancha a él y el esperma actúa como vehículo (al entrar dentro
del óvulo). El medio se ha de tratar para eliminar la membrana externa del espermatozoide
(congelando o descongelando, con detergentes…). Luego se ponen en un medio con la
solución y se hace inseminación artificial o FIV. No es la técnica más utilizada ya que se suelen
obtener mosaicos.
Vectores lentivirales
Es una técnica sencilla que permite manipular cualquier especie animal. Se debe tener en
cuenta que hay una capa que cubre el óvulo (ZP).
Resumen de vectores virales:
Vectores retrovirales (infectan células murinas, no afectan a humanos). Solo infectan
cuando el embrión se está dividiendo. Es muy fácil que se obtengan mosaicos. Los
retrovirus son vectores integrativos que pueden entrar e incorporarse en el
cromosoma. Cuando las células se dividen, las dos contendrán el transgen. Son virus
de RNA pero al insertarse en el genoma lo hacen en DNA. Su cápside está envuelta de
una capa lipídica, infecta muy bien las células en división.
Vectores lentivirales. Derivan del virus del SIDA, se ha eliminado la parte patogénica.
Tienen la ventaja de que pueden infectar células que no se dividen. Antes que el
ovocito sea fecundado, el lentivirus lo podrá infectar (ya tenemos transgénico). En el
vector podemos poner genes grandes, al haber eliminado la parte patogénica.
MLV: murinos
HIV-1: muchos más genes,
pero se eliminan todos y se
introduce el gen de interés.
Ciclo normal del lentivirus
La cápside está envuelta de fosfolípidos con moléculas que reconocen la membrana
plasmática. Al salir de la célula el virus se lleva parte de la membrana plasmática.
El RNA entra dentro de la célula y la retrotranscriptasa inversa lo transforma en dsDNA y ya se
puede insertar en el cromosoma. Luego el material del virus se replica en la célula y sale
encapsidado (en un ciclo normal). En nuestro vector hay que mantener unas secuencias que
son importantes para la transferencia del gen (secuencias en cys). También se tiene que
mantener el gen de la retrotranscriptasa inversa.
Replicación:
Un ejemplo de animal transgénico es el que utiliza un vector FUGW:
Se caracteriza por tener:
- 5’LTR-CMV Enhancer/Promotor.
- El elemento flap del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1) insertado entre la
repetición terminal larga (LTR, long terminal repeat) del extremo 5’ y el promotor
interno de la ubiquitina-C humana.
- Un promotor interno que lleva el gen reporter de la GFP (Green Fluorescent Protein). El
promotor de la ubiquitina-C humana hace que la expresión sea en diferentes tipos
celulares.
- Enhanced GFP (EGFP)
- Augmento de transcripción ya que el elemento regulador post-transcripcional del virus
woodchuck de la hepatitis (WRE) está en downstream a GFP.
Así, el transgénico tendrá en todas las células el gen, pero solo se expresará allá donde indique
el promotor. También se pueden inyectar secuencias que estabilizan el mRNA.
Metodos de infección
Normalmente se inyecta en el espacio perivitelino:
El problema es que este espacio tiene un volumen reducido y, además, la zona pelúcida
protege el embrión.
Después de inyectar en el espacio perivitelino los embriones se dejan en cultivo 72 horas. La
expresión de la GFP es evidente en blástula y mórula en los cigotos infectados. Después, los
embriones se implantan en el útero de hembras pseudogestantes.
También se puede destruir la ZP de manera que el óvulo queda limpio.
Entonces, los embriones desnudos se ponen en contacto con una suspensión de
lentivirus. El problema es que los embriones son más lábiles.
Los embriones desnudos se dejan en cultivo 3 días hasta el estadio de mórula o blastocisto.
Cuando se elimina la ZP los embriones se arrugan. Después del cultivo los embriones se
implantan en el útero de hembras pseudogestantes. Hay que decir que los embriones
desnudos tienen un desarrollo retrasado in vitro y una menor tasa de implantación que los que
mantienen la zona pelúcida intacta.
Se vio que el 82% de los animales incorporaba el transgen con almenos una copia (rendimiento
muy alto).El 76% mostraba fluorescencia en patas, cola y cara. Los animales GFP positivos
llevaban un provirus integrado. Los que tenían más de dos copias expresaban el transgen en
niveles detectables por la visualización directa de la fluorescencia emitida por la GFP. Los
animales tenían tejido verde fluorescente en los tejidos donde se había incorporado el
transgen. El problema del método es que no se sabe las copias que se insertan.
En estas imagenes se puede ver la fluorescencia verde en un ratón, detectable con luz UVA:
Se ha comprobado que pesé al alto rendimiento de la inyección de lentivirus en espacio
perivitelino el número de copias integradas podía variar de 0 a 20. La fuente de esta variación
viene dada por la dificultad de controlar el volumen de los virus que se dejan en el espacio
perivitelino durante la inyección. Esto es algo a tener en cuenta.
También se han realizado monos transgénicos que se obtuvieron por inyección en espacio
perivitelino. El problema del mono verde que se obtuvo es que no se sabía si era mosaico. Para
averiguarlo se tuvo que cruzar.
Posibilidades de los lentivirus
Resuelven muchas de las limitaciones de la inyección pronuclear:
Mayor eficiencia
Menos invasiva para los embriones
Menor relación coste-efectividad
Requiere menos técnica
La incubación de embriones desnudos facilita la manipulación posterior
Se puede extender a otras especies animales
La proteína VSVG media la entrada viral: encuentra receptores en células de todos los
vertebrados incluyendo primates e incluso pájaros (animales sin métodos
satisfactorios para crear transgénicos).
Limitaciones
Hay secuencias que pueden disminuir el título viral. Por ejemplo, secuencias de
splicing o de polyadenilación en el transgen. También disminuye el título la inserción
de transgenes de más de 10 kilobases entre las LTRs.
En los casos en que son necesarias inserciones virales múltiples para obtener un gran
nivel de expresión puede ser complicado establecer líneas puras de transgénicos
debido a la segregación independiente de los provirus.
La rutina utilizada debe pasar el Comité de Bioética.
Utilizando lentivirus se pueden infectar stem cells pero no es un método tan eficiente
como la electroporación.
Para hacer terapia génica se necesita modelos animales. El hecho de pasar de ratón a hombre
es un gran paso. La UE pide probar la terapia en un animal grande. En muchos casos sería
interesante obtener animales grandes modelos de enfermedad.
Por ejemplo, se consiguió crear un mono con la enfermedad de Huntington pero el animal no
era transgénico al no pasar el fenotipo a la descendencia.
Transferencia de genes a stem cells de ratón utilizando vectores lentivirales
Tema 4: Transgénesis en pez
En los años ochenta hubo resultados en diferentes familias. Las piscifactorías estaban muy
interesadas en estos hallazgos. Se intentaron mejorar factores que aumentan la producción
(mejor crecimiento, mayor resistencia…). Por ejemplo, se hicieron estudios con salmón y
hormona del crecimiento.
En Canadá, por ejemplo, las aguas de los mares son muy frías. Interesa que los salmones
superen esta temperatura.
Las mejoras obtenidas en la carne aún no se aceptan para el consumo humano.
Se hacen plantas transgénicas para cultivar en el tercer mundo. El problema es que se ha de
comprar la semilla cada vez que se siembra ya que las plantas no son fértiles. Aquí aparece un
gran negocio para las productoras de plantas transgénicas.
Si se busca un mayor crecimiento se puede utilizar hormona de crecimiento o anticongelantes.
También se pueden modificar para que crezcan en agua con pocos niveles de oxígeno.
Los peces transgénicos también se utilizan para ciencia (estudio de promotores, localización
con proteínas fluorescentes…). Tiene una importancia económica muy grande.
Las proteínas fluorescentes permiten hacer estudios de expresión in vivo (con la GFP). Así se
puede hacer un seguimiento sin la necesidad de sacrificar.
Liposomas
Se utilizaron para intentar introducir DNA en huevos. Consistía en el bombeo de las pequeñas
partículas de metal en el huevo.
Microinyección
El DNA inyectado puede llegar a entrar en contacto con el DNA del embrión. Se ha de atravesar
la cáscara y el corion del huevo. Aquí se obtienen mucho más mosaicos que en ratón. A
menudo se integra en estadio de 2-4 células aunque el punto de integración también es
diferente.
La aguja que microinyecta rompe las cáscaras.
Se hacen servir placas de Petri con silicona donde se inyectan nanolitros de la concentración
de DNA. En ratones se inyecta entre 2-4 ng/l en peces entre 4-500ng/l. Para ello se utilizan
pipetas de orden superior a las de ratón que son de 1m.
En peces se puede inyectar DNA circular aún con poca eficiencia. En ratones esto no se puede
hacer.
Se intenta que tanto el promotor como la secuencia codificante vengan del pez:
Electroporación
La microinyección es muy lenta (1 por uno). Funciona bien con huevos fertilizados ya que sino
el ovocito se podría activar con el pulso y no podrían fecundarse.
Lo que se hace es sumergir los huevos con el DNA y se aplica un campo eléctrico que hace que
se agujereen. Lo más importante es que el DNA se integre. Así, se detecta el DNA, se expresa y
se transmite a la descendencia. Es una buena técnica.
Según la especie se necesita más o menos pulso. Normalmente se electroporan huevos de una
célula para reducir el mosaicismo.
Se incubaba DNA y esperma y, después, se electroporaba. El DNA se enganchaba al esperma y
servía de vehículo para después fecundar y obtener transgénicos.
No se han conseguido buenos resultados.
Integración
El DNA se integra en forma de tándem. En ratones se integra en tándem cabeza-cola
(promotor + zona codificante):
En peces se integra al azar:
En Southern-blot se puede detectar estructuras secundárias.
Se ha intentado la recombinación homóloga pero hasta ahora no se han obtenido resultados.
Transmisión a la descendencia
Hasta la F2 no se puede tener las líneas bien establecidas debido al mosaicismo. El mosaico al
tener descendencia puede dar F1 heterocigotos. Estos F1 de la descendencia normalmente son
diferentes (no como pasaba en ratón). Se han de seleccionar animales de la F1 para tener un
animal en F2 con un transgen determinado.
Constructos y vectores:
A lo largo de los estudios de transgénesis en peces es esencial la integración. En los peces
dependen mucho de los constructos utilizados.
Se puede utilizar promotor y cDNA de la especie, de otra especie de pez o de otro animal. Se
han utilizado promotores víricos, de mamífero, de pez…
Funciona mucho mejor utilizando secuencias de la propia especie ya que sino a menudo se
inactiva el transgen.
Administrando hormona del crecimiento al salmón se puede obtener animales más grandes.
Se hizo el experimento y los salmones que expresaban hormona del crecimiento de mamífero
morían. El problema era que el gen de la GH era de humano.
Constructo all fish
Era el que funcionaba mejor. El resultado era un incremento normal del tamaño.
El problema fue que además de obtener un incremento del tamaño afectaba otras cosas como
a la pigmentación del salmón, acromegalias (cráneo y mandíbula más grande). Esto daba
problemas de viabilidad. Los salmones, además, se adaptaban más precozmente al agua del
mar (abaratamiento del coste).
En mamíferos, el crecimiento para cuando el animal ha madurado. En salmones, en cambio, los
animales van creciendo.
Comparación con otras especies
Debido al mosaicismo la selección de líneas lleva mucha faena. Se deben controlar las
piscifactorías para que no se expanda el animal. Si se hace en el mar, se debe asegurar la
esterilización de los peces; por ello es mejor hacerlo en tierra.
Tema 5: Clonación por transferencia de núcleos
En Marzo del 1997 se publica que es posible clonar un mamífero a partir de una célulasomática
diferenciada. No hay ninguna barrera biológica que lo impida. Sería posible clonar una
persona.
Problemas a superar
Bajos porcentajes de desarrollo y gestación.
Anormalidades físicas en los animales que sobreviven.
Alta mortalidad perinatal y pérdida de embriones. Los problemas surgían sobretodo en
pulmones y riñones, y eran incompatibles con la vida.
Estos problemas son debidos a una reprogramación insuficiente.
Manipulación mecánica del embrión:
Enucleación del recipiente y transferencia del núcleo.
Activación del recipiente.
El embrión es fijado con una pipeta de fijación. Se microinyecta con una pipeta de
microinyección. El orificio de contacto entre el ovocito y la pipeta de fijación tiene unas 15-20
micras. Al aspirar se sujeta el ovocito y con la otra pipeta se manipula.
En el año 1984 se descubrió que era mejor usar ovocitos como recipientes. El defecto que esto
tiene es la incapacidad de ver el núcleo ya que está en meiosis. La ovulación se produce poco
antes de la extrusión del primer corpúsculo polar (excepto los perros, en los que la ovulación
es en vesícula germinal).
Más tarde se describió un método para ver los cromosomas en metafase. Se tratan los
ovocitos con host y se miran con luz UVA. Así se aprecia dónde están los cromosomas. Esto
tiene dos inconvenientes: la luz UVA, en sí, destruye el DNA y los cromosomas; además, con
este método también se tiñe el DNA mitocondrial. Si se estropea el DNA nuclear no importa ya
que lo que se quiere es enuclear el ovocito. El problema viene si se estropea el DNA
mitocondrial, en cuyo caso el óvocito ya no serviría. Para evitar esto la exposición con luz
ultravioleta debe ser mínima (un minuto).
Enucleación
La ZP es elástica pero más rígida que la membrana nuclear. A parte tendríamos el citoplasma
rodeado de la membrana. Esta membrana en mamíferos es muy frágil. La punción aquí
provoca en un 95% lisis. Entonces, se inventó una técnica para solucionar esto que consistía en
desestructurar el citoesqueleto.
Se cultivan los ovocitos con inhibidores del huso mitótico y los microtúbulos. Entonces la
membrana es más elástica. Igualmente, no se penetra al citoplasma, se aspira antes. Una vez
dentro se aspira una parte del citoplasma del ovocito llevándose los cromosomas. Hay que ir
con cuidado porque siempre se aspira una parte de ovocito junto con los cromosomas.
Interacciones entre el citoplasma recipiente y el núcleo transferido.
Reprogramación del núcleo transferido.
Se debe tener en cuenta que en una célula no manda el núcleo. El núcleo es tan solo una base
de datos, información. Quien manda es el citoplasma, es el que decide qué información se
necesita.
Ahora que se ha sacado la base de datos se debe poner una nueva. Este trabajo lo hará el
citoplasma.
Por ejemplo, están los núcleos de células de ratón que se utilizaban para clonar. Tienen unos
cuatro nucléolos. Al transferirse el núcleo, es muy difícil que con él no se transfiera una parte
más. De hecho, es tan difícil aislar núcleos viables, que en la mayoría de casos hay que
llevárselo junto con el retículo endoplasmático (casi media célula). Así, lo que se transfiere es
el núcleo, una parte de citoplasma y la membrana de la célula.
Si se trabaja con células somáticas se transfiere la célula entera (15-20 micras de diámetro).
Los núcleos se rebozan en una solución viral. Al cabo de 10-15 minutos de contacto con
solución viral se produce la fusión de la membrana. Luego se aspiran todos los núcleos y se
mantienen en la pipeta. Entonces se atraviesa la ZP (capa externa) y se deja el núcleo en el
espacio perivitelino. Ahora se obtienen dos células cada una de ellas envuelta en su membrana
citoplasmática rodeada de la ZP.
Esta técnica es buena en ratones pero no en otros animales. En estos animales (ovejas…) se
hace electroporación. De modo que en una placa de Petri se pone el óvulo entre dos barras
que se pasan corriente (dos polos). Esto produce una desestabilización.
Se debe tener en cuenta que si el corriente es demasiado leve no se producirá la fusión. Si por
el contrario el corriente es muy elevado, tampoco funcionará. Lo ideal es aplicar el corriente
suficiente para que se fusionen membrana celular y membrana del núcleo.
Ahora falta activar el programa de desarrollo. Este papel lo realiza in vivo el espermatozoide
que al fecundar deja carga 2n y activa el programa de desarrollo. Cuando se da esta activación
ya no se tiene un ovocito sino un nuevo individuo. Dicha activación la produce, más
concretamente, una proteína del esperma.
Para reproducir la activación si no hay fecundación se puede poner alcohol al 7% y realizar
electroporación (campo eléctrico en un medio con calcio y magnesio, o poner iones como el
estroncio). Lo más utilizado, sin embargo, es la electroactivación, de este modo se incrementa
la concentración de calcio.
En ratones (94-95) se utilizaba el medio rico en estroncio (Sn) ya que hacía que el óvulo
liberase sus reservas internas de Ca 2+.
Cuando se manipula el ovocito este está en metafase (se está dividiendo). Luego se mete en el
ovocito (que está en mitosis) un núcleo en interfase. En el citoplasma, pues, hay factores
promotores de la mitosis activos. Estos factores pasaran la membrana nuclear y activaran la
condensación de los cromosomas. El problema es que estos cromosomas no están preparados
para dividirse. Hay un núcleo, cromatinas y cromosomas que se han obligado a condensar.
Pérdida de genes
Diferenciación celular
Modulación de la expresión génica
Se han paralizado muchas investigaciones porque se tenía una verdad como dogma. En 1938
aún no se había conectado las idease discutía como se producía la diferenciación celular.
Teorías que se barajaban:
La célula va perdiendo genes y se diferencia
Solo se expresan los genes necesarios en cada situación (modulación génica)
Para descubrir la realidad Spemann realizó el experimento de transferencia de núcleos. El
experimento permitía evaluar la totipotencia del núcleo.
El hecho de que el embrión se desarrolle indica que todos los genes del zigoto están en la
célula del adulto.
En 1952 se hacen experimentos con amfíbios. Se consiguen individuos adultos fértiles a partir
de renacuajos (1982).
En 1992 con células sanguíneas como eritrocitos y transfiriendo queratinocitos a anfibios se
consiguió el desarrollo hasta renacuajo.
Al no conseguir desarrollo de adulto a adulto se concluye que no es posible conseguir
individuos fértiles a partir de células somáticas de un individuo adulto. Sin embargo, se
observa que utilizando ovocitos los resultados son mejores.
Briggs y King en 1952 trabajaron con ratones. Los embriones de mamífero son más frágiles y
más pequeños (unas mil veces más pequeños que los anfibios). Al atravesar la membrana
citoplasmática se provocaba la lisis del ovocito.
Con inhibidores del citoesqueleto y con un método que no atraviesa la membrana plasmática
se consiguieron mejores resultados.
Avances metodológicos de los experimentos con amfíbios:
En 1986 se descubrió que aunque es mejor usar ovocitos como recipientes en lugar de cigotos,
es más difícil enuclearlos. Por suerte, más tarde se describió el método de visualización de
cromosomas.
El problema del Imprinting se descubrió incubando dos pronúcleos que derivaban de
espermatozoides y asimismo dos pronúcleos que derivaban de ovocitos. Ninguno de los dos
llega a término, acaban muriendo. Se debe recibir la mitad de la carga por vía materna y la otra
por vía paterna. Se recibe lo mismo pero en algunos casos se expresará el gen de la vía
materna y por otro el de la vía paterna. Esto es una barrera biológica de primer orden.
En realidad existía una barrera metodológica.
El núcleo es información debe contener toda la información. La información tiene que ser
accesible.
Reprogramación del núcleo
Al realizar la transferencia del núcleo, si debido a la manipulación se lisa el ovocito no se podrá
obtener un embrión. Se deben evitar los daños por transferencia de núcleos. Al transferir se
provoca la condensación prematura de los cromosomas.
La reprogramación del núcleo consiste en colocarlo en el estadio de desarrollo que se necesita.
Se deben silenciar los genes característicos de la célula de origen. También hay que
caracterizar los genes de la célula que se usa como recipiente. Por último, es importante
mantener la capacidad de progresar, silenciando y activando genes, en el desarrollo a un
individuo adulto fértil.
“Rebobinar” el programa de diferenciación
La barrera biológica del Imprinting condicionó mucho estos experimentos.
Hay que saber que en el mundo de la clonación entró un grupo de gente que estaba interesado
en ella desde el punto de vista animal. Esta gente quería clonar los animales con mejores
características. Así, se podría incrementar la eficacia de obtener animales transgénicos (2-5%
de rendimiento). La transferencia de núcleos era una posibilidad de reducir costes.
La barrera biológica quedaba invalidada utilizando ovocitos como recipientes, ya que se podía
reprogramar el núcleo. Había factores en el ovocito que permitían la reprogramación del
núcleo.
La fase del ciclo celular en que se hacía la transferencia tenía que ver con el futuro desarrollo
del núcleo. Lo que se hace es coger un núcleo en plena fase de síntesis (condensado) y
transferirlo a un citoplasma que se está dividiendo. Esto es un cambio muy brusco.
Se ha visto que según el estado del ciclo celular en el que se encuentra el núcleo, habrá más o
menos éxito:
Célula en G1 desarrollo a blastocisto 45%
Célula en síntesis o G2 desarrollo a blastocisto 0%
La durada en un embrión de cuatro células es de 10 minutos para G1, 4 horas la síntesis y
menos de 1 hora G2.
Se puede evitar la condensación prematura de los cromosomas, activando el citoplasma y así
transferir un núcleo en interfase a un citoplasma en interfase. Las estadísticas entonces son
mejores:
Célula en G1 desarrollo a blastocisto 60%
Célula en síntesis o G2 desarrollo a blastocisto 15%
G1 se define como el tiempo que tarda desde la división celular hasta que se condensan los
cromosomas (los núcleos aún no están del todo condensados). Abarca el tiempo desde que se
forma la membrana nuclear y el núcleo crece (vuelven los factores de transcripción que
durante la mitosis “saltan” de la cromatina).
Así, el núcleo se divide, se vuelve a formar la membrana nuclear y entonces estos factores
vuelven al núcleo y se pegan donde les toca. De una célula pasamos a dos, también
pluripotentes.
En G1 los factores de transcripción aún no se han pegado totalmente. El ovocito tiene los
factores de reprogramación. Se puede formar algo parecido a dos PN.
Es difícil sincronizar un cultivo celular en G1 ya que si se bloquea una parte del proceso el otro
avanza (descompensaciones). Una alternativa mejor, es provocar la quiescencia.
La quiescencia se consigue quitando el suero de los cultivos de las células. Las células entran
en stand-by y se elimina todo aquello que no es necesario.
De esta manera se consiguió clonar la oveja Dolly.
Se vio entonces que la clonación por transferencia de núcleos puede llegar
a generar un nuevo individuo. Dolly era fértil.
En este momento aumentaron los intereses para obtener animales
clonados.
Los investigadores que estudian el ciclo celular creen que se ha llegado a un callejón sin salida.
Los que están interesados en obtener animales clónicos, en cambio, no se rinden.
Después de Dolly se clonan ratas, conejos, cerdos…
El embrión en el ratón se activa en el estadio de ocho células. Esto da ventaja a los rumiantes
(2 o 3 ciclos de más). Esto permitía un tiempo muerto para reparar los daños obtenidos.
El perro se consigue clonar en 2005 con problemas. El problema de los cánidos surgió porque
los medios de cultivo eran subóptimos. Se sacaban ovocitos de ovarios de perros de
mataderos.
La rata también da problemas (se clona sobre el 2004). Sólo un laboratorio lo ha conseguido. El
problema también está en los medios de cultivo de los ovocitos.
Más tarde un veterinario sudcoreano publicó un artículo sobre obtención de stem cells de
embriones humanos. Resultó ser falso.
Aplicaciones de la clonación.
La clonación permite investigar los mecanismos moleculares profundos que rigen la
transferencia celular que permiten la reprogramación.
También permite incrementar la eficiencia de las técnicas de clonación en estas especies.
La transferencia de núcleos permite la recombinación homóloga. También permite una
mejora en xenotransplantes y abre un camino hacia la clonación humana.
Investigación
Intentar saber el porqué de las cosas. Si se entiende la reprogramación se pueden entender
muchos mecanismos moleculares. Lo que provoca la muerte mayoritariamente es el cáncer y
la degeneración neurológica. Este grupo de enfermedades se rigen por la diferenciación
celular, si se entiende se pueden mejorar las terapias.
La longitud de los telómeros es algo a tener en cuenta. Cuando Dolly nace, sus telómeros
corresponden a una oveja de seis años (la edad que tenía la oveja original).
En ratones es a partir de la quinta generación de animales sin telomerasa cuando se empieza a
tener problemas, los ratones suelen ser infértiles.
En ratones con telomerasa no se han observado problemas de acortamiento de telómeros,
incluso hasta la sexta generación. Se cree que los ratones tienen más actividad telomerasa.
Animales de granja transgénicos
Se creó una empresa que quebró al año siguiente (1991- 1992) para obtener animales
transgénicos en granjas. Había una serie de personas que utilizaban los animales como
bioreactores (obtención de leche con proteínas…). El problema es que el método de
microinyección en embriones era muy poco eficiente.
Por ejemplo, si se pinchan 200 embriones vacunos. Se transfieren 3 embriones por vaca y
nacen al final 50 terneros de los cuales 1 o 2 son transgénicos. Los terneros no transgénicos se
matan y se incineran. Es un coste económico muy elevado.
En el mismo año que nace Dolly nace el primer cordero obtenido de células manipuladas
genéticamente in vitro por transferencia de núcleo. Así, todos los terneros que nazcan serán
transgénicos. Si se ha hecho caracterización previa ya se sabe que esa proteína va a ser
funcional. Una vez se tiene la proteína funcional se puede tener un rebaño con 200-300
animales en menos de un año (utilizando transferencia de núcleos).
Así se consigue:
Recombinación homóloga
En ratones se obtuvieron stem cells con una cepa que se seleccionó por su capacidad de
producir teratomas (cáncer de ovarios). Esta cepa se genera para estudiar esta patología
humana.
La recombinación homóloga se daba solo en ratones, pero con transferencia nuclear y
fibroblastos se puede conseguir en otros animales. Así, se pueden obtener células en cultivo
con la recombinación, allí donde se quiere. A partir de aquí se puede obtener KO sin pasar por
quimeras. Cupido y Diana fueron los dos primeros corderos.
Clonación terapéutica
La clonación es biológicamente posible y puede ser un método reproductivo (conseguir de una
célula un individuo con la misma carga genética).
Aquí hay que mencionar una carga ética: la mayoría de los animales clonados no llegan a nacer
y los que nacen mueren a las 48 horas.
La clonación también puede ser terapéutica. Por ejemplo, cuando un paciente necesita un
trasplante se puede realizar un embrión clónico al cual se le extraen stem cells que se
diferencian hacia el tejido que interesa.
Problemas de la clonación: Aspectos técnicos y éticos
Algunas de las preguntas que surgen al hablar de clonación son:
¿Es bueno clonar humanos?
El embrión clónico es un nuevo individuo, ¿se está matando?
La transferencia de núcleos utiliza herramientas parecidas al joystick.
Se desconoce gran parte de la reprogramación nuclear. No se sabe gran cosa sobre las bases
moleculares de la reprogramación.
Los factores de reprogramación son las moléculas responsables de la formación de los PN
masculino y femenino. Se investiga la relación con el silenciamiento del DNA (metilaciones…).
En la cepa 129 (estudio de queritocarcinomas) de 100 embriones entre un 10 y un 30 % darán
stem cells. Otras cepas, solo el 5%. Las gónadas de los embriones se están formando en
blastocisto.
En el resto de especies no hay stem cells, sino stem-cells like. Se han conseguido quimeras en
muchas especies pero no se han conseguido descendencia que dé estas stem cells.
Para conseguir stem cells se tienen que conseguir sobre 100 embriones. Cuando no se
consigue descendencia directa desde quimera es porque no llegan a colonizar del todo la línea
germinal.
Se transformaron las células diferenciadas en stem cells like (iPS). Así, se provoca una
reprogramación nuclear rápida. Con un solo gen era posible reactivar el sistema de desarrollo.
La célula tiene mucha plasticidad.
Líneas prioritarias de la investigación
Para terminar:
Dolly fue un hito científico, marcó un antes y un después.
La investigación de la reprogramación ha dado lugar a las iPS.
La clonación facilita la manipulación en animales de granjas y el avance en técnicas de
xenotransplantes.
En la clonación humana no hay barrera biológica, esto abre las puertas.
Tema 6: Manipulación génica animal. Impacto social. Legislación
y patentes
Aspectos que tienen que ver con el impacto de los animales para experimentación. Legislación
del tratamiento de la manipulación genética.
La percepción social de la experimentación animal le da mala fama.
Además, la sociedad es contradictoria, quiere la ciencia pero no es una sociedad científica (va a
astrólogos…)
Por ejemplo, un medicamento que cura una enfermedad pero que mata a uno de cada 10000
personas recibe muchas críticas de la gente. Los herbolarios, en cambio, no están controlados
pero la gente se fía más.
La sociedad pide a los científicos que cada vez sean más eficientes pero la sociedad se opone
cada vez más a que se experimente con animales, cosa que es necesaria para el progreso.
En la actualidad, la vivencia con los animales se ha perdido, se ha dejado de matarlos
personalmente. Existe un conflicto moral: rechazo al sufrimiento animal vs. ganas de saber
más.
El estudio de los animales KO ha permitido avanzar mucho en la genética.
En Catalunya
Es competencia del Parlament de Catalunya. Está la ley del 1995 y un decreto del 97. La
legislación cambiará pronto.
El Real Decreto de Madrid cierra un agujero que había en Catalunya.
En España
Depende del Parlamento de Madrid. La ley del 2003 y el Real Decreto del 2004. La legislación
está muy enfocada a lo que es plantas transgénicas.
Ley 5/1995, de 21 de junio
Ley de protección de los animales utilizados para la experimentación y para otras finalidades
científicas.
Define que se considera un animal de experimentación.
Prohíbe la utilización de ciertos animales como los perros y gatos recogidos en la calle.
Establece las condiciones generales de mantenimiento y transporte de los animales, así como
las condiciones generales del centro.
Obliga a realizar un registro de los centros y de control de los animales.
Se deba indicar el procedimiento de la experimentación: porque, para que, como… luego se
tiene que enviar al comité de ética que decide que hacer. Hay tanto una Comisión de
Experimentación Animal como Comités éticos de experimentación animal.
Se debe eliminar el dolor.
Se establece un régimen disciplinario con penas de multa, cárcel…
Decreto 214/1997, de 30 de julio
Por el que se regula la utilización de animales para experimentación y para otras finalidades
científicas.
Esto se realiza para minimizar el sufrimiento animal y que no se hagan experimentos que no
sean absolutamente necesarios.
Real decreto 178/2004, de 30 de enero
Por el que se aprueba el Reglamento general para el desarrollo y ejecución de la Ley 9/2003,
de 25 de abril.
Algunas cosas han cambiado a peor.
La evaluación del riesgo se hace según el daño que puede producir un organismo si este se
escapa al medio.
1. Leve
2. Curable
3. Grave (por ejemplo, genera una peste. Hay uno en la UAB, otro en Madrid)
4. Muy grave (hay uno en Francia, otro en Estados Unidos)
Los animales de los que se habla son de tipo 1 o algún vector viral de tipo 2. Hay que trabajar
bajo el Comité de Ética, el apartado de Seguridad de la UAB.
Valoración del dolor
El animal sufre. Se knockea un gen y en una determinada edad se eutanasian para ver los
órganos.
Hay modelos dolorosos, como el estudio del cáncer que provoca el desplazamiento de tejidos
y dolor. También son dolorosos los estudios de analgesia, en los que se provoca dolor a los
animales para ver si este se va al subministrar el fármaco.
En el resto de procedimientos se debe minimizar o eliminar el dolor.
Los animales sienten, la diferencia está en la manera de expresar el dolor. Los humanos al
sentir dolor gritan, los perros también. La oveja en cambio no ya que si chillara un depredador
se la podría comer.
Se debe conocer la especie animal con que se trabaja. Lo que duele a los humanos, asumir (a
priori) que también les dolerá al resto de animales.
Así, las presas normalmente disimulan el dolor. Los predadores se quejan más. La expresión
del dolor no es igual.
Predecible: se puede evitar con analgesia o, como mínimo, aliviar. Después de una
gran operación se puede dar un régimen analgésico.
Inesperado: se puede intentar detectar sobretodo conociendo la especie con que se
trabaja (conociendo su normalidad). Entonces se puede evitar o aliviar.
Limpieza: cuando se ve a un animal sucio o se está criando en un sitio sucio, algo no va bien
(estrés…).
Lo primero que afecta es a la reproducción.
Fijarse en la interacción del animal con nosotros. Si es agresivo normalmente y luego es dócil,
o viceversa.
En los procedimientos quirúrgicos se puede eliminar el dolor. En una enfermedad inducida se
puede intentar aliviar.
Tipos de dolor:
El dolor agudo es bueno. Por ejemplo, si apoyas la mano en un sitio caliente, te duele y te
apartas.
El dolor crónico es patológico y una fuente de estrés. Lo primero que se notan son problemas
reproductivos, disminución del apetito y letargia (disminución de la actividad).
Por ejemplo, en un estudio de supervivencia se puede considerar que un tratamiento ha
fallado cuando el tumor tiene una cierta medida. Entonces el animal se retira (criterio de
punto y final). Esto ya se contempla en el protocolo inicial.
Se debe presentar el procedimiento de experimentación en el Comité de Ética.
La justificación averigua si la experimentación es realmente necesaria. El Comité se asegura de
lo que les va a pasar a los animales.
Si no se saben todos estos términos se hace un pequeño experimento para saberlo (con 2 o 3
animales).
- ¿Cuándo termina el proyecto?
- ¿Quién es el responsable?
- ¿Qué síntomas inesperados pueden surgir?
Patentes
Tema 7: Estabulación y manipulación de animales transgénicos
La utilización de animales en experimentación debe cumplir unas condiciones. Primero, se ha
de evitar que la experimentación que se hace no sirva para nada. Así, se minimizan los
trastornos.
Hay veces en las que los resultados se pueden ver alterados, por ejemplo, si se tiene estrés o
una enfermedad subclínica.
La legislación se deriva de la directiva del 86. Está a punto de entrar en vigor una nueva ley en
junio del 12/13.
La legislación sobre estabulación nos indica varios parámetros como por ejemplo el espacio del
que pueden disponer los animales que deben poder hacer todo lo que fisiológicamente harían.
Todo esto, en una jaula es complicado.
Cuanto más pequeños son los animales que se tienen, más se pueden tener en un mismo
espacio. En ratones y ratas, los animales se deben poder poner en pie. Además hay que pensar
que los ratones tienen una vida de experimentación muy corta.
Al subir de escala y tener animales en grupo su vida suele ser más larga (por ejemplo en
perros). Con estos animales se pueden hacer experimentos. Normalmente se les da un
medicamento y se observa cómo se elimina. Interesa que los animales estén acostumbrados al
manejo. Contra mejor estén los animales (hábitat sin estrés, condiciones similares a la
naturaleza…) más reales serán los resultados obtenidos.
Por ejemplo cuando se pincha en el brazo a monos si se les acostumbra a estirar el brazo justo
en el momento previo a pinchar, verán minimizado su estrés. Otro ejemplo que reduce el
estrés, sería acostumbrar a los ratones a ser cogidos.
La legislación pone las dimensiones mínimas para tener animales (en jaulas, recintos…). La
directiva, además, regula la temperatura (en ratones 22ºC ±2). En Barcelona, por ejemplo, el
principal problema es el calor del verano. Esto implica instalaciones más caras. En vacas el
rango se amplía (y en animales grandes) siendo de entre 15 y 26 º.
Otra cosa que se regula es la humedad relativa. En ratón es del 54% ±10. Si cae por debajo del
20% se pueden tener problemas en las crías (son más sensibles a ambientes secos).
La orina, al evaporarse produce vapores de amoníaco que son irritantes. Se debe hacer 20
cambios de aire por hora.
También se regula la intensidad de la luz. Los roedores son animales nocturnos. Un exceso de
luz es dañino, no les gusta. Así pues, se debe llegar a un compromiso entre la intensidad de luz
que necesitan los trabajadores y los ratones.
Es interesante controlar los ciclos circadianos. Es más fácil hacerlo con animales en un sitio
cerrado. Los animales grandes lo tienen más complicado al tener una época de reproducción.
En ratones es más fácil de controlar.
Otras cosas que pueden interferir son las fuentes de alimentación y las de agua.
Las fuentes de alimentación pueden contener residuos tóxicos, metales pesados, restos de
insecticidas, citoesteroides… La soja es una fuente muy barata de proteína vegetal, tiene
moléculas parecidas a los citoesteroides que pueden reducir la fertilidad de los animales.
El agua puede contener posibles contaminantes físico-químicos.
Se debe controlar el estado sanitario de los animales. Es decir, si hay animales con alguna
enfermedad contagiosa (por ejemplo gripe) se pueden ver alterados los resultados. Se ha
encontrado el caso de una cepa de ratón en que las hembras al cabo de nueve semanas
desarrollan diabetes tipo 1. Si esta cepa tiene el virus de la hepatitis murina (que en ratones
normales se elimina a las dos semanas) el porcentaje de diabéticos pasa del 90% al 10%. El
virus hace que la diabetes en proceso se cure y desaparece el fenotipo de estudio.
Otro ejemplo es la colitis ulcerosa en un modelo de ratón. Si se ponía al animal en un
estabulario se obtenían muchos idénticos y estos no desarrollaban la enfermedad. Esto era
porque la flora bacteriana era diferente. Entonces, se volvió a sacar a los ratones al exterior
(donde habían patógenos) y muchos de ellos desarrollaban la enfermedad.
Federación Europea de Asociaciones Científicas de Animales de Laboratorio
Se listan unos 15 virus (enfermedades peligrosas para el hombre y para los ratones). Se
incluyen virus que pueden infectar al hombre, letales para ratones y que puedan interferir en
los resultados (por ejemplo el virus de la hepatitis murina).
Se obliga a hacer controles una vez al año, normalmente se hacen una vez al mes.
En un estabulario hay una barrera que lo mantiene alejado de todas las fuentes de patógeno.
El aire externo que estará en contacto con el animal se tiene que filtrar. Además se tiene que
esterilizar el pienso, el agua, las jaulas, el serrín… Esto implica barreras arquitectónicas
potentes y medios de esterilización (autoclave, gases tóxicos para superficie e irradiación). Es
más fácil la esterilización en sitios pequeños que es grandes, pero se realiza también en caso
de animales grandes (cerdos, ovejas…).
Dependiendo de cómo sea esta barrera estaríamos hablando de cuatro situaciones:
- Estabulación convencional: no se tiene control sobre los microorganismos que están
en contacto con los animales ni sobre el estado sanitario de estos.
- Animales libres de patógenos específicos (SPF): existe una barrera sanitaria en
funcionamiento y se puede garantizar que los animales no están en contacto con una
lista determinada de patógenos.
- Se conoce la microflora que está en contacto con nuestros animales. Es muy
importante conocer la flora bacteriana (como se digiere, que nutrientes se
absorben…).
- Animales sin microflora: carecen de cualquier microbio. Son muy delicados y la
alimentación es potente.
Hay que pensar que un estabulario con animales SFS ya tiene una barrera muy bien montada.
Si se conoce la flora, además, se deben introducir procedimientos que impidan la
contaminación de los animales. Cuando se trata de animales sin microflora, los procedimientos
deben ser de aislamiento total (trabajar con guantes…).
Esto se puede aplicar en todas las especies pero se hace más en ratón. Aun así, el proceso se
está expandiendo. Se hacen estudios en los que se inocula un microorganismo y se ven los
efectos. Se mira cómo reacciona un animal frente al ataque del patógeno. En cerdos, por
ejemplo, se estudia la adsorción de nutrientes.
Además de controlar las variables externas, la legislación tiene por objetivo mantener al
mínimo el sufrimiento animal. Se intenta mantener a los animales entretenidos.
Se intenta imitar a la naturaleza con cosas como poner trozos de madera para roer (para
ratones), balones de fútbol atados (para cerdos).
Los estudios de neurología se hacen en jaulas vacías. Se introduce una variable. Al hacer los
estudios de fobia al exterior, por ejemplo, no se podía evaluar su validez. A parte de eso, se
deben fenotipar todos los animales. Si se tienen 20000 ratones y se tienen que fenotipar se
necesita mucho tiempo y paciencia.
Por esto es importante armonizar todas estas cosas para no alterar los resultados y que los
experimentos salgan bien. Esto vino de un estudio Europeo.
Por ejemplo, el número de ratones por jaula afecta al nivel de glucosa.
La estabulación de los animales en experimentación está regulada por la ley, también las
condiciones ambientales (temperatura, humedad relativa, luz, niveles de ruido…).
Existe una barrera sanitaria, arquitectónica, de filtros y de control de lo que introducimos.
Todo esto es muy costoso, por ello, es muy importante velar por el buen estado de los
animales, controlar enfermedades, microorganismos…
Tema 8: Utilización de animales transgénicos. Estudio de
enfermedades. Cáncer.
Un animal transgénico es una herramienta de investigación. Este tema trata básicamente de
ratones en el estudio del cáncer.
El cáncer es un conjunto de enfermedades de las cuales no se conocen todas las causas.
Asimismo, tiene un componente de enfermedad social ya que la tasa de cáncer es más elevada
en la clase baja que en la alta. Los ambientes industrializados también aumentan la frecuencia
comparados con los países en vías de desarrollo. Esto es comprensible si se tiene en cuenta
que en los ambientes industrializados hay más carcinógenos. La ingesta rica en grasas también
favorece su aparición.
En los animales transgénicos se intenta acortar el periodo de latencia.
Un ejemplo de afectación de las radiaciones ionizantes sería las observaciones de los
supervivientes de las radiaciones.
El carcinoma más potente es la luz solar. Las personas blancas son más débiles frente a la
radiación solar.
A pesar de estar en un ambiente carcinogénico no se desarrollan tantos cánceres. Esto es
porque la célula tiene sus mecanismos de defensa, adquiridos por selección natural. Se debe
hacer énfasis en que los cánceres normalmente se desarrollan después de tener descendencia.
La aparición de tumores implica que algo ha fallado en el crecimiento y reparación celular.
Estos fallos son mayoritariamente adquiridos a lo largo de la vida.
Si alguna de estas relaciones se altera aparecerá un tumor. La proteína p53, por ejemplo, está
ausente en el 50% de los tumores humanos.
Si hay familiares afectados, algunos de estos cambios ya se habrán producido genéticamente,
harán falta menos para padecer la enfermedad.
En los ratones transgénicos se puede hacer cualquier manipulación genética ya que tienen una
vida muy corta.
Casi la mitad
Un ejemplo de estudio de la patogenia es descubrir las causas de que el virus de la hepatitis B
de cáncer. Ahora ya se sabe la transformación que hace el virus en las células.
Una prueba de conceptos podría ser realizar una selección de manera que las células sanas
sean más resistentes a quimioterapia o radioterapia. Así, se puede incrementar la dosis del
tratamiento.
Pruebas de agentes carcinogénicos
Los animales a los que se ha introducido una mutación implicada en el proceso de
carcinogénesis desarrollaran la enfermedad antes. En menos tiempo sabemos si un producto
es carcinogénico o no. Ahorramos tiempo.
Hay un virus murino que provoca tumor mamario en ratón y no se sabía por qué. Ahora ya se
ha podido descubrir qué causa la transformación maligna.
P53 es una de las proteínas de control celular más importante que tenemos. Es un paso de
control que está ausente (o mutado) en el 50% de los cánceres. En el proceso de síntesis de
DNA hay una serie de moléculas que detectan errores y reparan o activan la apoptosis de la
célula.
Un knock-out de la p53n permite estudiar qué pasa sin ella. Los ratones nacen, así que la
proteína no tiene un papel importante en la embriogénesis. Han aparecido muchos mutantes.
Se observaban diversas situaciones en los knock-out:
Homocigotos: a los 4-5 meses desarrollaban tumores.
Heterocigotos: a los 18 meses desarrollaban tumores (equivaldría en los humanos a 80
años).
Un animal tan sensible también es sensible a los anticancerígenos. Se pueden utilizar
productos para ver si tienen efecto terapéutico.
Se debe tener cuidado con las manipulaciones genéticas.
Los biólogos moleculares piensan que la molécula que estudian es la clave de todo. Esta
afirmación es falsa ya que el cuerpo se regula.
La falta de p53 predispone a la aparición del tumor. Apareció un KO de la p53 con la proteína
mutada, pero funcional. La mutación disminuía la producción de cáncer frente a las no
mutadas, pero los animales tenían envejecimiento prematuro.
Otro KO que se consiguió sobreexpresaba la forma normal de la p53 sin acelerar el proceso de
envejecimiento.
El resultado final es similar (más p53). En el primer caso produce una aceleración del proceso
de envejecimiento y en el segundo no.
La causa de esto podría ser que la forma mutada hubiera perdido alguna zona de control de
actividad. No afectaría a su regulación en la forma sobreexpresada ya que esta tiene una
buena regulación.
Se ha de tener en cuenta las diferencias entre humanos y ratones (diferentes tumores…). Los
ratones tienen los telómeros más largos y disponen de cierta actividad telomerasa. Los
humanos, en cambio, tienen actividad telomerasa solo en la línea germinal. La vida del ratón
es más corta.
La actividad metabólica es mucho más grande en el ratón. Se dan menos divisiones celulares
en ratones (1011) que en humanos (1016).
Hay que tener en cuenta que las cepas que se utilizan tienen poca variabilidad, son cepas con
consanguinidad.
Síndrome Peutz-Jeghers
En homocigosis produce pólipos benignos, en heterocigosis produce carcinomas.
La pregunta es si los pólipos benignos son precursores de los carcinomas. Parece ser que la
respuesta es sí.
Para estudiar este síndrome no se puede trabajar con homocigotos ya que mueren. Lo que se
hace es realizar un ratón heterocigótico para LKb1 que lleve el otro alelo floxado
condicionalmente (que se pueda quitar cuando se quiera).
Una vez en cultivo se hace saltar la copia floxada. Así se tienen cepas con las que se puede
estudiar. Sin embargo, los resultados no cuadran actualmente con pacientes humanos. Las
preguntas que se deben resolver son:
¿Qué pasa si la actividad del LKd1 se produce después de que se active el oncogen?
¿LKd1 está protegiendo otros genes?
Tema 9: Modelos animales de enfermedades metabólicas
hereditarias
Se verán ejemplos del uso de la transgénesis para obtener modelos de enfermedades
animales.
Glucogenólisis
La idea era encontrar una terapia para la glicogenosis de tipo 7 (es una gran familia de
enfermedades). Implica el mal metabolismo del glicógeno. Hay una enfermedad para cada
enzima que participa en la síntesis del glicógeno.
PFK-1 (6 fosfofructoquinasa 1): enzima clave para metabolizar la glucosa por la vía citosólica.
Humanos Modelo Animal PFKM-KO
PFKM Pfkm
PFKM PFKM
Glucogenosis tipo VII Fenotipo mutante (¿enfermedad?)
Si se toca el gen de la PFKM se esperaría un fenotipo mutado. Normalmente no es tan fácil.
PFK-1
Fructosa-6P Fructosa-1,6P2
ATP ADP
PFK está codificada por tres genes (muscular, hepático y plaquetario).
El gen de la isoforma muscular (PFK-1M) se expresa en músculo esquelético, diafragma,
corazón, cerebro, eritrocito, testículo y célula
La isoforma hepática (PFK-1L) se expresa en hígado, eritrocitos, riñones, adipocitos, cerebro,
corazón, testículo, pulmón, bazo, musculatura uterina y célula .
La plaquetaria (PFK-1P) en cerebro, plaquetas, fibroblastos, linfocitos, bazo, testículo y células
.
La forma activa es un tetrámero que depende del tejido donde se encuentre. Si se expresa en
hígado, por ejemplo, tiene cuatro formas (formas hepáticas). En músculo también hay cuatro
formas. En el resto de tejidos suele haber combinaciones (híbridos). Por ejemplo en los
eritrocitos una de las formas está compuesta por dos formas musculares y dos hepáticas.
Regulación de la PFK-1
La PFK-1 está en el inicio de la glucólisis. Necesitará energía en niveles bajos (es decir, altos
niveles de AMPc y de ADP). Al tener mucho ATP se inhibe. Así, pequeños cambios en la [ATP]
pueden causar cambios rápidos y notorios en la vía.
Glucogenosis tipo VII
Es una enfermedad genética de carácter autosómico recesivo causada por un déficit en la
actividad PFK-1 muscular (PFK-1M).
Para realizar un modelo animal de la enfermedad se ha de tener en cuenta que en un mismo
gen hay muchas mutaciones. Por tanto, existe una heterogeneidad en la enfermedad. Además
de que la mayoría de estas enfermedades son heterogéneas, estas presentan variantes.
Si se eliminan los exones en ratón puede que no se obtenga las diferencias que en humanos se
obtendrían (por ejemplo, generar un codón stop).
Lo que se hizo es intentar cargarse la función del gen.
Existen tres formas de la glucogenosis de tipo VII:
- Forma clásica
- Forma hemolítica
- Forma tardía: se manifiesta a partir de los
60 años.
- Forma infantil letal: los niños no
sobrepasan el segundo año de vida.
Forma clásica
Ausencia de actividad PFK-1 en el músculo esquelético, que implica:
- Acúmulo de glicógeno en el músculo esquelético. Las hexosas se encuentran
incrementadas (azúcares de seis).
- Hiperuricemia miogénica: aumenta el ácido cítrico circulante.
- Alteraciones es la bioenergética muscular.
Déficit parcial de eritrocitos: hemólisis y reducción del 2,3DPG.
Cuadro clínico: intolerancia al ejercicio. Al empezar a correr dan rampas musculares.
Terapia: limitación del ejercicio físico. Dieta pobre en carbohidratos. Se hizo un modelo con la
esperanza de realizar terapia génica pero el modelo no daba mucho de sí. Igualmente, sería
una buena opción a investigar.
Creación de un ratón deficiente en PFK-1M
Se necesita mucha información. Ahora hay consorcios de mutagénesis que mutan todos los
genes del genoma humano. Se pueden ir a buscar aquí.
Hace unos años, cuando el genoma no se había secuenciado era mucho más complicado. Con
la secuenciación se puede clonar el gen por PCR.
Lo primero que se debe hacer es buscar toda la información disponible, vale la pena perder un
mes. Si hay un error aquí, al diseñar el vector, nos daríamos cuenta al cabo de tres años.
Hace unos años cuando no se tenían secuenciadores. Se tenía que ir plaqueando fagos y ver
los que tenían el gen que interesaba. Después se tenía que mapear. Se realizaban muchas
digestiones.
Así se consiguió identificar el exón 3, que es donde está el ATG (inicio de la proteína). Se pensó
que si se eliminaba este ATG la proteína no sería funcional. También se quiso cambiar el frame
(marco de lectura), pero no se podía.
Uno de los promotores estaba muy cercano al exón 3. Así que se intentó eliminar la región
promotora y el exón 3. Para ello, se hizo un vector con una región homóloga al promotor y otra
al final del exón 3 con resistencia a neomicina.
Se ha de tener en cuenta que un pequeño grado de cambio en la selección puede dar que la
línea germinal no quede afectada y no se transmita la mutación. Se han de hacer muchos
cambios de medio.
Ahora se pueden mirar clones y clones de células (de las células que han pasado la selección +
y -.
MEF
Se hace un Southern (con 200-400 clones) y se va mirando cual tiene la mutación correcta. La
selección negativa te ayuda a enriquecer. Al realizar el Southern se controla que un lado del
exón está correctamente en 5’. Después se hace un segundo Southern con las que tienen en 5’
correcto para mirar cuales tienen también el 3’ correcto. Por último, se realiza un tercer
Southern para ver cuantas tienen el gen neo, para comprobar que la mutación está donde le
toca y en todas las células.
Ahora es el momento de inyectar en blastocisto. Las stem cells son de color agutí para poder
identificar rápido los quimera.
Los quimera tienen manchas agutíes y negras, al seleccionarlos por color se ahorra la mitad del
trabajo. Estos animales han de transmitir a la descendencia el carácter. Si al cruzar el animal
con otro animal se obtienen agutíes, estos agutíes serán 100% homocigotos para la mutación.
Las madres que se utilizan son hembras blancas para que no se coman las crías. Además, las
blancas adoptan crías de otras madres.
La célula muscular necesita la glicólisis para hacer ejercicio. Se hizo un análisis de la PFK-1M al
animal homocigoto para la mutación
- Homocigoto: no presentaba la mutación en células musculares. Como en
- Heterocigoto: 50% respecto al normal. Humanos
Bloqueo de la glucólisis en el músculo esquelético
Las hexosas en el mutante también estaban elevadas. El lactato era bajo.
En músculo se vio incrementado el nivel de glicógeno y las fibras también estaban muy
elevadas. Entonces, se detectó una mutación en la ultraestructura.
Contenido de glicógeno en el músculo esquelético:
Ultraestructura del músculo esquelético:
En los animales se reprodujo la intolerancia al ejercicio. Para comprobarlo se puso una cinta y
el ratón mutado tan solo aguantaba un par de minutos y acababa con las extremidades
enrampadas. Un ratón normal aguanta mucho y al hacer ejercicio incrementa sus niveles de
lactato.
Niveles de lactato sérico:
Metabolismo en ejercicio:
El fenotipo real de este animal es una letalidad muy elevada (duraban de 1 a 3 meses). Si se
generaban 50 homocigotos, nacían 25, morían 15, al empezar el experimento eran 7 y
quedaban 3 o 4. Esto es un problema.
Los animales en reposo tienen ya el 50% de niveles de ATP (de promedio, en las células del
músculo esquelético). El nivel de ATP caracteriza la viabilidad de las células.
Nucleótidos de adenina:
Además, presentan un incremento de glucosa en el diafragma:
La musculatura intercostal también resulta alterada:
De igual manera la musculatura cardíaca, donde se apreciaba una hipertrofia con el tiempo:
La PFKM también se expresa en eritrocitos. El eritrocito vive exclusivamente de glucosa. Si se
quita la PFK-1, la glicólisis no funciona y cae el metabolito que regula la afinidad de la
hemoglobina por el oxígeno. Por esto las células son hemolíticas y hay tanta letalidad. Para
compensar esto se producen más eritrocitos.
Cae pues el 2-3-BFG y el oxígeno se queda retenido en los pocos eritrocitos viables cosa que da
hipoxia.
Hemólisis:
Fragilidad eritrocitaria:
Para quemar ácidos grasos se necesita oxígeno. Si los eritrocitos no ceden oxígeno el músculo
en sí es poco viable.
La enfermedad no es solo severa, sino que el déficit eritrocitario la agrava. Se puede intentar
acceder a las células de la medula ósea. Por esta vía, quizá en un futuro se logre una mejora.
Tema 10: Análisis de los mecanismos epigenéticos implicados en
el silenciamiento y activación de transgenes in vivo
Cada vez está más de moda la epigenética.
Ejemplo de transgen:
Después de microinyectar en ovocitos el transgen se puede integrar (una o más copias) en más
de una zona y que no se exprese.
Utilizando un marcador se puede ver la expresión. Curiosamente contra más copias se
observaba más expresión. Las copias no deben implicar cambios en el marco de lectura.
Epigenetic reprograming
La epigenética no son cambios en la secuencia de DNA. Son modificaciones de las bases, de la
cromatina o de las histonas. No alteran la secuencia, son reversibles y muchos de estos
cambios son regulables por factores ambientales.
Mecanismos epigenéticos
Ejemplos de estos mecanismos son microRNA, RNA de cadena larga no codificante,
metilaciones, modificación de histonas…
Metilación del DNA
Añadir grupos metilo a citosinas. La metilación del DNA es la única modificación del genoma
que siempre pasa en la parte de la citosina por donde se une la guanina.
La metilación es imprescindible para la vida del organismo. Se da por la metiltransferasa.
En las islas CpG la hipermetilación de C está asociada al silenciamiento. Las proteínas
antitumorales presentan una hipermetilación y los oncogenes hipometilación.
La metilación del DNA impide la unión del factor de transcripción. También atrae otras
proteínas implicadas en otros complejos, estas proteínas silencian la expresión del gen.
Cromatina
Hay dos metros de DNA/célula. La cromatina está compuesta por proteínas, aparte de por
DNA. Estas proteínas son muy pequeñas y su masa iguala a la del DNA.
El DNA se organiza en el collar de perlas, el solenoide, los loops… Esto lleva a la formación de
heterocromatina.
El DNA envuelve las histonas. En el extremo C-terminal hay residuos de lisina o de otros
aminoácidos. Modificaciones en estos residuos dan lugar a alteraciones en la expresión
genética. Las modificaciones son acetilaciones, metilaciones, ribosilaciones…).
Existen una serie de modificaciones de histonas. Hay un código de histonas que actúan de
manera combinatorial. Esto lleva a un estado de activación o de represión. Es un concepto
nuevo.
Ejemplos: histona 3 y 4.
Un metil en la histona 3 genera un STOP. Si está acetilada da activación.
Hay una serie de combinaciones que marcan que un transgen se exprese o no.
Puede haber residuos mono, di o trimetilados. Esto implica diferentes grados de acivación o
silenciamiento.
Heterocromatina: inactiva, compactada.
Eucromatina: activa, tiene cierta plasticidad (para pasar de una a la otra).
Al tener heterocromatina abierta se puede realizar modificaciones en residuos específicos que
pueden hacer que esta pase a eucromatina. La acetilación permite el paso de heterocromatina
a eucromatina.
A continuación se muestra una tabla con proteínas que modifican las histonas. Hay metilantes,
desmetilantes… (histonas metilasas y demetilasas)
La función de las enzimas se intenta descubrir mediante la invención de transgénicos, KO… Se
encuentran con que la mayoría de transgénicos son letales y no se puede ver su función.
Alguno se ha hecho no letal pero no viven mucho tiempo.
HAT, HDAC, HMT determinan el paisaje epigenético del genoma.
Las proteínas de unión al DNA pueden atraer metilasas, acetilasas… pueden tener una activi
dad metiltransferasa.
Se une la demetilasa y demetila la histona 3 o 4, una vez demetilada atrae otras proteínas que
demetilan el DNA adyacente. Después se produce deacetilación y se impide la unión de
factores de transcripción. Se silencia el gen.
Se han encontrado metilaciones en proteínas antitumorales e hipometilaciones en oncogenes
(MIC…).
Hay estudios de cáncer, asma… Existen muchas enfermedades donde hay evidencia de que los
fenómenos de metilación afectan.
Por ejemplo, SIRT1 puede llevar al desarrollo de cáncer. Por un lado deacetila, realiza cambios
en la función de la proteína que provocan senescencia o apoptosis. También deacetila las
histonas. Esto da lugar a la proliferación celular y al bloqueo de la senescencia y la apoptosis.
Del mismo modo, atrae la DNA metil transferasa a los promotores, cosa que provoca más
proliferación. Con el paso del tiempo esto implica cáncer.
Para evitarlo se están inventando fármacos que alteren estas funciones. Se han encontrado
inhibidores de histonas acetilasas. Los fármacos se aplican en casos extremos y no se suelen
observar mejoras.
El problema de los fármacos es que no se puede dirigir su acción solo a las células que interesa.
Su efecto se encuentra en todas las células. Inhibir la acetilación de histonas en una célula sana
también comporta problemas.
Para introducir genes se tienen varias maneras: microinyección, con vectores de DNA…
Inactivación de transgenes
¿Qué pasa cuando se administra un gen a un vector?
Tiene lógica que el transgen se active y se inactive de forma endógena (ya que el vector se
integra. Cuando se utilizan vectores que no se integran (vectores no virales), san niveles bajos
de expresión y la expresión es transitoria.
Los plásmidos perduran al cabo de un año de estar en un organismo. Aun así, no se encontraba
expresión. Esto hizo pensar que el plásmido se encontraba silenciado (como si fuera
endógeno).
Se utilizaron dos vectores. Uno era el plásmido que aunque se tuviera en mucha cantidad su
expresión era cero.
Hay otra manera de obtener plásmidos modificados. En el plásmido había una parte no
eucariota, bacteriana que parecía la responsable de la silenciación. Del plásmido se eliminó la
parte bacteriana y solo quedó el transgen (parte eucariota). Después se pueden aislar estos
minicírculos con nuestro transgen. La parte bacteriana tiene muchas CpGs, más que la
eucariota.
Se pensó que los plásmidos se metilaban y por esto se silenciaban. Se metió el minicírculo (con
solo el transgen), el plásmido normal y un plásmido normal pero sin CpGs.
El resultado fue que los plásmidos sin CpGs mejoraban pero no tenían nada que ver con los
minicírculos. Como las islas CpGs son inmunogénicas se pensó que quizás desencadenaban una
respuesta inmune. Se hicieron pruebas y no se encontró evidencia de ello.
Entonces se pensó que quizás eran las metilaciones de histonas. Para analizarlo se hicieron
inmunoprecipitaciones de cromatinas (ChIP). Se hace la inmunoprecipitación contra el
anticuerpo que sospechamos que tiene que ver con el silenciamiento. Una vez aislado se
puede mirar de secuenciar el DNA, encontraríamos el DNA causante de la silenciación.
Ejemplo de inmunoprecipitación en ratones.
El minicírculo tenía altos niveles de expresión, en cambio el plásmido poco nivel.
Al hacer un ChIP se esperaría en los minicírculos un incremento de eucromatina (activa). En los
plásmidos se esperaría un incremento de heterocromatina. Esto indicaría que las histonas
tienen un papel en la silenciación.
Análisis de las modificaciones de histonas por ChIP:
En un experimento se observó un incremento en marcadores de heterocromatina en el
plásmido y de eucromatina en el minicírculo.
En otro, había diferencia aunque no tan evidente.
Se probaron 19 plásmidos. En uno el promotor de la ubiquitina no se vio silenciado ni en el
plásmido ni en el minicírculo al cabo del tiempo.
La explicación es que a lo largo del tiempo la expresión del plásmido activo se va perdiendo.
Las señales que inactivan el plásmido se desconocen del todo, pueden ser: una señal de
localización nuclear (no se integra en el núcleo, queda episomal), la modificación de histonas,
anticuerpos intracelulares que detectan el DNA exógeno…
Esto lleva a la deacetilación de las histonas, la histona metiltransferasa va metilando las
histonas.
Al llegar al día 35 todo el plásmido está prácticamente silenciado.
Conclusiones:
Vectores plasmídicos: incrementan los marcadores de heterocromatina.
Minicírculos: incrementan los marcadores de eucromatina.
Tema 11: Mouse clinics
En el genoma hay unos 20000 genes. En Europa y en Estados Unidos se han iniciado proyectos
de hacer el genoma a escala.
En el mundo se va rápido, ahora todo es high-throughput. Hoy en día se saben todos los
genes.
Los proyectos de high-throughput solo mutan el gen. Se debe hacer todas las mutaciones de
cada gen del genoma. Después hay que generar un animal y por último fenotiparlos.
El fenotipaje no es algo trivial, debe haber centros especializados en fenotipaje de high-
throughput.
Para solucionar esto, mouse-genetics tuvo una iniciativa. Se financió un proyecto en Europa
(EUCOMM). EUCOMM ha generado muchos genes knockeados, además, dispone de una
página web donde por 1500€ o 2000€ facilitará algo que costaría 40000€ si se hiciera en una
empresa particular. Proyectos similares se hicieron en EEUU (NorCOM) y Canadá (KOMP). Al
final decidieron unirse (IMMC).
Si da la casualidad que el gen que se necesita no lo tiene el consorcio, se puede encargar.
EUCOMM se encarga de realizar mutagénesis a gran escala.
Interesa elegir la cepa del ratón, todos trabajan con la misma: C57BL/6N (una cepa negra). Esta
cepa lleva un constructo que puede dar a la vez un KO total y un transgénico específico de
tejido.
Los consorcios solo te proporcionan la stem cell. Esta se debe inyectar en blastocisto para
obtener quimeras y seguir con los cruces habituales para obtener KO.
Hay proyectos más pequeños agrupados en IMMC (por ejemplo el español).
Puede que al implantar el quimera haya muerte embrionaria. Hay centros que estudian esta
posibilidad.
Para fenotipar bien se deben saber todas las características del organismo (cardíacas,
pulmonares…).
Por esto, los centros de fenotipado a gran escala tienen que fenotipar con unos estándares.
Hay un proyecto para estandarizar la manera de fenotipar un ratón en Europa, llamado
EUMORPHIA.
Aquí se estableció como fenotipar la función cardíaca, respiratoria, immune… todo. De esta
manera se puede comparar resultados entre centros.
Se establecieron las mismas pruebas (EMPReSSslim).
Se hacen dos pipelines en las que se utilizan 10 machos y 10 hembras (mínimo número de
ratones). Se empieza cuando el ratón está en 9 semanas. El proyecto busca el mínimo trabajo
de fenotipaje que permita establecer la caracterización de los ratones por tal de ahorrar
tiempo y dinero.
En el pipeline se pasa por diferentes pruebas (tensión, immunológica…). No responde igual un
macho que una hembra. Las hormonas cambian en fenotipar actividades.
Esto va unido a un equipo de bioinformáticos. En Europa hay cuatro grandes centros que
hacen fenotipado a gran escala:
EUMODIC surgió para fenotipar animales que provenían del proyecto EUCOMM. Lo coordina
Steve Brown, la idea es fenotipar 650 ratones.
EUCOMM (genera las stem cells)
Ratones (mouse clinics)
EMMA (aquí se guardan los ratones)
Mouse clinics
EMPReSSslim (análisis básico)
Centro especializado de fenotipaje (si interesa un fenotipado más concreto).
Si se quiere fenotipar todos los genes se debe hacer más rápido. Se amplió el proyecto con
más países, entre ellos España.
Infrafrontier
Para crear estructuras legales, todo está muy interaccionado (como deben ser los
estabularios…). El objetivo del proyecto es relizar una empresa de la vida.
Se creó el IMPC, un mouse clinic a nivel mundial. Cuesta varios billones de euros. En estados
unidos se hacen tres mouse clinics. También se decide hacer mouse clinics en Australia, en
Taiwán, en China…
Se tienen que organizar. En octubre de 2008 se ponen en marcha.
Las determinaciones son dar la máxima información con el menor coste.
Fase 1: fenotipar 5000 ratones (5 años)
Fase 2: analizar 10000 ratones (a partir del 2016)
Genoma de ratón stem cells fenotipado (EUMODIC, ARRA) IMPC (ya están
fenotipados a gran escala, para ver algo más concreto hacer un
fenotipado más específico en otro centro).
Para curar enfermedades genéticas si no hay modelos animales nunca llegará a la clínica.
Los consorcios son muy importantes para trabajar a gran escala, sobre todo para tratar
enfermedades raras. En cinco años se pretende tener todo el genoma mutado.
CBATEG, Spanish Mouse clinic
Es un mouse clinic. Se presentó a final de año del 2005.
ICTS: infraestructuras singulares.
Catalunya presentó cuatro proyectos y se escogieron dos. Uno de ellos fue el mouse clinic
(febrero de 2007). Se tuvo que hacer otra gran memoria.
Desde 2007 se han ido modificando planes… Se evaluó el proyecto muchas veces. A parte de
ICTS, también era parte de un proyecto europeo.
El proyecto se definió como very high priority in Spain. El problema es que el proyecto se debe
firmar por España, Europa y Catalunya. Con la crisis España no lo firma.
En los consorcios europeos siempre se está al día de la tecnología.
Las empresas que hacen mouse clinics necesitan que otras empresas las prueben (aplicación
de fármacos…). Hay empresas que están interesadas en utilizar mouse clinics para probar sus
productos.
Se están desarrollando más los métodos de fenotipado. Estan surgiendo tecnologías que lo
permiten hacer más rápido. Se debe tener en cuenta que mantener animales transgénicos es
caro, pero que mantener colonias lo es más.
Basándose en el diseño, se necesita que alguien haga el fenotipado. Se debe externalizar,
buscar una empresa que haga el fenotipado (por ejemplo, universidades, centros de
investigación…). El mundo se ha globalizado.
Al lado de una mouse clinic ha de haber investigadores. Se ponen a punto tecnologías que se
pueden ofrecer cómo plataformas tecnológicas. Se va innovando.
El personal técnico de las plataformas también ha de ser investigadores, normalmente
doctores. Esto es una fuente de sitios de trabajo.
Los patólogos están muy buscados (en patología del ratón…). Los morfólogos también.
Una mouse clinic puede hacer todo. Hay tres grandes plataformas.
Modificación genética en animales
Capacidad de analizar los animales
Evaluación preclínica (de fármacos, drogas…)
Muchas no prevén evaluación preclínica pero cada vez se hace más.
Una plataforma se divide en varias subunidades. Una vez se tienen los ratones habrá que
fenotiparlos.
La primera unidad nutre toda una unidad de animales transgénicos, hace fertilización in vitro,
criopreservación…
Habrá también una segunda unidad que se dedicará a vectores virales. Se puede manipular un
órgano inyectando un vector.
La tercera unidad es de vectores no virales.
Con estas tres unidades se consigue animales modificados genéticamente.
Hay subplataformas divididas en subunidades (plataformas de fenotipado). Después de pasar
al animal por las diferentes plataformas se consigue el fenotipado (por ejemplo, plataforma
que se encarga del metabolismo: unidad de endocrinología, análisis metabólico, hematología,
estudios de expresión génica, inmunología (que podría convertirse en sí en una plataforma)).
Con los diferentes análisis se pueden hacer muchas cosas. Se tiende a utilizar el mínimo
número de animales. Las plataformas de imagen dicen como es el animal. El mismo grupo de
animales se va incluyendo en estos equipos (in vivo, morfología, patología, análisis
microscópico…).
Hay también un área de medicina interna (parte cardiovascular, neurología, sensorial (pruebas
acústicas…), pneumología, gastroenterología, nefrología, reproducción…).
Por último, también hay un área de comportamiento.
Pasar a los animales por todas las baterías es muy caro. Cada vez hay más pruebas.
Imagen: tags para ratones, equipos de resonancia magnética, ultrasonido…
Todo esto no se puede tener a punto en un centro. Las técnicas necesitan muchos especialistas
de diferentes áreas.
Behaviour: actividad locomotora (cintas donde corren…), circuitos, pruebas de atención…
Si se tiene una mouse clinic interesa que el animal sea fenotipado a diferentes tiempos. Al
mismo lote de animales se le hace un seguimiento. Se utilizan estabularios libres de
patógenos. Esto interfiere en las investigaciones
En el estabulario han de caber todas las máquinas, sino no puede ser una mouse clinic (hace
seguimiento), sino que ha de ser de punto y final (como el de la UAB).
Hay diferentes zonas en el estabulario. La complejidad no es hacer el animal sino fenotiparlo.
Las plataformas han de estar muy internamente organizadas. A veces un animal tiene un
fenotipo primario esperado pero al pasar por las baterías se encuentran diferentes fenotipos
no esperados que pueden ayudar a entender una enfermedad.
Medicina translacional
En el proceso de Drug Discovery entra en pie una mouse clinic o centro de fenotipado. Se
empieza a nivel de ratón y va evolucionando. Se ensaya en los pequeños animales, cuando
funciona se ha de ir a animales más grandes.
Además, no debe olvidarse que se requiere de una regulación para que se acepten los
medicamentos… Para ello son necesarias las empresas de regulación que se encargan de
preparar la documentación.
Evaluación preclínica
Se ha de tener en cuenta muchas cosas: efectos secundarios del medicamento (por ejemplo
aparición de tumores, toxicología…)…
Generación del KO
Fenotipado
Modelos animales de Terapia génica (medicinas innovadoras)
enfermedades humanas Terapia de Drug Discovery
Nuevo tratamiento de cura
El fenotipado es muy importante para el establecimiento de modelos animales y así poder
encontrar nuevos tratamientos.
Las empresas farmacéuticas piden ratones humanizados (con el gen humano que provoca una
enfermedad…).
Los centros pueden participar en muchos tipos de proyectos (pequeños, medianos y grandes).
Se diseña el estudio. Como el mundo es global, también se pueden hacer proyectos online.
Actividades de training
Se hacen cursos de entrenamiento, estancias cortas de estudiantes…
Siempre va la investigación ayudada por las plataformas y las actividades de training.