Actualización en nuevas

técnicas de diagnóstico

genético molecular

disponibles en Chile

Dra. Teresa Aravena

Clínica INDISA

Hospital Clínico de la Universidad de Chile

Hospital Dr. Sótero del Río

Exámenes genéticos

• Indicaciones específicas.

• Consecuencias en la familia.

• Consideraciones sobres los efectos del

resultado.

• Consentimiento informado.

• Beneficios en el manejo del paciente

prevención de complicaciones.

• Beneficios para la familia: opciones

reproductivas.

Cariotipo normal

Metafase

Certificación de síndromes

cromosómicos clásicos:

Trisomía 21

Consideraciones sobre el

cariograma

• Sólo permiten diagnosticar anomalías cromosómicas.

• Anomalías estructurales pueden requerir de estudios adicionales.

• Demora en resultados por necesidades del cultivo.

• Fallas del cultivo.

• Convencional: detecta anormalidades en los cromosomas de 5Mb

• Alta resolución: (700-850 bandas), detecta hasta 3Mb.

Hibridación in situ con fluorescencia FISH

Ventajas : 1)puede realizarse en núcleos interfásicos 2)permite un diagnóstico preciso y rápido Limitaciones : 1)pueden no diagnosticarse alteraciones cromosómicas adicionales 2)se requiere tener una noción de las regiones cromosómicas comprometidas

XX

XY

Cromosomas Sexuales

Síndrome Di George/VCF

22q11.2 TUPLE 1 Orange

22q13 ARSA Green

Normal Deletado

• Segundos en frecuencia después

del Síndrome de Down

• FISH, aumenta sensibilidad.

Deleciones crípticas no detectados

por cariograma habitual

• Otros de mayor tamaño, en

general producen síndromes

característicos como por ej: cri-du-

chat

• 7,4% de niños con RM moderado

a severo, con cariograma normal.

• 0,5% de los RM menores

• Puede haber variaciones

familiares benignas, aunque poco

frecuentes

FISH para rearreglos subteloméricos

MLPA: Amplificación de múltiples sondas ligadas

• Método de cuantificación relativa de número de

copias de ADN.

• Aplicaciones:

Identificación de aneupoidías (monosomías,

trisomías, etc).

Detección de deleciones y duplicaciones en uno y

varios exones.

Cambios en el patrón de Metilaciones.

Identificación de SNPs.

Variaciones de expresión génica en cáncer.

características

• Puede detectar aberraciones en el número de copias

de 40 secuencias de ADN en una única reacción

basada en PCR.

• Requiere de un mínimo de 20ng de muestra de ADN.

• Discrimina secuencias que difieren en un nucleótido.

• MLPA puede usarse en muestras con ADN

parcialmente degradado, como tejido fijados en

parafina o formalina.

MLPA: Amplificación de múltiples sondas ligadas

•Cada sonda de MLPA está compuesta por

un par de oligonucleotidos

•Si cada sonda se encuentra con su secuencia

blanco en la muestra los oligonucleotidos

hibridan uno al lado del otro

•Cada sonda hibridada luego se conecta

ligándola

•Las sondas ligadas son amplificadas todas

en un PCR múltiple con solo un par de

primer

•Cada sonda genera un único producto

de amplificación de tamaño determinado

entre 130-490 nt

•Los productos amplificados son luego

analizados por electroforesis capilar

Ventajas

• Puede identificar el número de copias de mas de 40 secuencias de ADN en una única reacción.

• Técnica rápida y económica.

• Alto rendimiento.

• Reproducible y fácil de realizar.

• Alta sensibilidad.

• Sólo requiere de un termociclador y un equipo de electroforesis capilar.

• Identifica secuencias que presentan un cambio de un sólo nucleótido (SNP).

• Requiere poca cantidad de ADN.

limitaciones

• Reacciones de MLPA son más sensibles a

contaminantes.

• No se puede realizar en una única célula, se

requieren de al menos 3000 células.

• No pude detectar translocaciones balanceadas.

• Limitación en la disponibilidad de Sondas (kit

comerciales).

PCR: Reacción en cadena de polimerasa

PCR: reacción en cadena de

polimerasa

• Amplifica el DNA varios millones de veces en pocas horas.

• Permite el análisis de un gen de secuencia única.

• Permite estudiar incluso el ADN de una célula única.

• No requiere conocer la secuencia del gen a estudiar.

• Requiere conocer la secuencia del DNA que flanquea a la zona en estudio.

Estudios moleculares

disponibles en Chile

• Secuencias del Y • Duchenne y Becker • BRCA 1 y 2 • Metilación Prader Willi y

Angelman • Xq frágil • MTHFR • McCune Albright • Atrofia muscular espinal

tipo I • acondroplasia e

hipoacondroplasia

• 21 hidroxilasa • fibrosis quística • Hemofilia • HIV • HLA • alpha 1 anti-tripsina • Hemocromatosis • Conexina 26 y 30 • Mala absorción de lactosa • translocaciones en

cánceres hematológicos.

Microarray

Microarray

• Una de las técnicas más usadas en biología molecular.

• Permite observar en forma simultánea el genoma completo o genes de interés en relación con una patología.

• Permite comparar el DNA de células sanas con el DNA del paciente.

• Permite comparar DNA con mutaciones conocidas con el DNA del paciente

Microarray de hibridación genómica

comparada (aCGH)

Permite al clínico e investigador testear hipótesis a nivel

genómico a una resolución nunca antes vista.

Disponible en Chile, alto costo.

Microarray: aumenta la tasa de diagnóstico

a 15-20%

Cariograma: Tasa de diagnóstico 3.7-9.5%

CGH MICROARRAYS

Síndromes de microduplicación /

microdeleción emergentes

• Síndrome de

microdeleción 1p36, se

detecta con FISH

subtelomérico o con

a-CGH

• Síndrome de

microdeleción 2q23.1

• Síndrome de

microdeleción 2q37

• Síndrome de

microduplicación7q11.3

• Síndrome de

microdeleción 15q13.3

• Síndrome de

microdeleción16p11.2

• Síndrome de deleción

17q21.31

• Microduplicación22q11.2

Del ADN a la proteína

Estructura del gen: promotores, potenciadores, silenciadores.

coactivador

Promotor mínimo Promotor proximal

Factores de transcripción específicos

Factores de transcripción específicos

Unidad transcripcional

Genome wide associaton study:

Secuenciación masiva

Genome wide associaton study:

Secuenciación masiva

• Analiza asociación entre genes y patologías

específicas o factores de riesgo.

• Confirmación del diagnóstico

• Información sobre el riesgo de enfermar

• Programas de prevención individual de

complicaciones

• Selección de tratamiento específicos, evitar

efectos adversos

Técnicas de captura del ADN

Sobreposición de segmentos

secuenciados

Disponibles en Chile

• PANELES

Síndromes de Cánceres Hereditarios, Cáncer de Colon

Hereditario, Cánceres Hereditarios de las Mujeres,

Ciliopatías, Síndrome de Noonan y trastornos relacionados

• GENES

Genes con utilidad clínica conocida, selecciona un gen o

varios o todos.

Incluye exones codificantes, + 10 pares de bases de

secuencias de intrones adyacentes y secuencias no

codificantes con variantes patológicas conocidas.

Limitaciones

• Capaz de identificar aquellas variantes

que se encuentran en la región de

codificación de los genes.

• Queda 99% del genoma humano que

no está cubierto usando secuenciación

exoma.

• Gran cantidad de datos generados

Gracias!