Tecnología Enzimática

INDICE

1. Introducción2. Producción de Enzimas3. Extracción de Enzimas4. Purificación de Enzimas5. Aplicaciones de los Enzimas

1. Aplicaciones en la Industria Alimentaria2. Aplicaciones en la Industria no Alimentaria

6. Problemas de la Tecnología Enzimática

1.- INTRODUCCIÓN

1.1 CONCEPTO DE ENZIMA

1.2 CONCEPTO DE CATALIZADOR

1.3 NOMENCLATURA

1.4 CLASIFICACIÓN DE ENZIMAS

Los enzimas son proteínas que catalizan reacciones químicas en los seres vivos . Como catalizadores, los enzimas actúan en pequeña cantidad y se recuperan indefinidamente.

No llevan a cabo reacciones que sean energé-ticamente desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino que aceleran su consecución.

1.1 COCEPTO DE ENZIMA

Un catalizador es una sustancia que

acelera una reacción química, hasta hacerla instantánea o casi instantánea. Un catalizador acelera la reacción al disminuir la energía de activación.

1.2 CATALIZADOR

Los enzimas son catalizadores específicos.

En una reacción catalizada por un enzima:

1.La sustancia sobre la que actúa el enzima se llama sustrato

2. El sustrato se une a una región concreta del enzima, llamada centro activo

3. Se forman los productos y el enzima ya puede comenzar un nuevo ciclo de reacción

ASPECTOS GENERALES SOBRE LOS ENZIMAS

1.- El enzima y su sustrato

2.- Unión al centro activo

3.- Formación de productos

REACCIÓN CATALIZADA

1.3 NOMENCLATURA

Hay varias formas mediante las cuales se asigna un nombre a un enzima:

•nombres particulares

•nombre sistemático

•código de la comisión enzimática (enzyme comission)

1.4 CLASIFICACIÓN DE LOS ENZIMAS

En función de su acción catalítica específica, dintiguimos 6 grandes grupos o clases:

•Clase 1: OXIDORREDUCTASAS

•Clase 2: TRANSFERASAS

•Clase 3: HIDROLASAS

•Clase 4: LIASAS

•Clase 5: ISOMERASAS

• Clase 6: LIGASAS

Clase 1: OXIDORREDUCTASAS

Catalizan reacciones de oxidorreducción, es decir, transferencia de hidrógeno (H) o

electrones (e-) de un sustrato a otro, según la reacción general:

AH2 + B A + BH2

Ared + Box Aox + Bred

Ejemplos son la succinato deshidrogenasa o la citocromo c oxidasa.

Esquema de oxidorreductasas

Clase 2: TRANSFERASAS

Catalizan la transferencia de un grupo químico (distinto del hidrógeno) de un sustrato a otro, según la reacción:

A-B + C A + C-B

Un ejemplo es la glucoquinasa, que cataliza la reacción siguiente:

glucosa + ATP ADP + glucosa-6-fosfato

Ejemplo de la glucoquinasa

Clase 3: HIDROLASAS

Catalizan las reacciones de hidrólisis:

A-B + H2O AH + B-OH

Un ejemplo es la lactasa, que cataliza la reacción:

lactosa + agua glucosa + galactosa

Clase 4: LIASAS

Catalizan reacciones de ruptura o soldadura de sustratos:

A-B A + B

Un ejemplo es la acetacetato descarboxilasa, que cataliza la reacción:

ácido acetacético CO2 + acetona

Clase 5: ISOMERASAS

Catalizan la interconversión de isómeros:

A B

Un ejemplo, la fosfotriosa isomerasa que cataliza las reacción representada:

gliceraldehído-3-fosfato dihidroxiacetona-fosfato

Representación

Clase 6: LIGASAS

Catalizan la unión de dos sustratos con hidrólisis simultánea de un nucleótido trifosfato (ATP, GTP, etc.):

A + B + XTP A-B + XDP + Pi

Un ejemplo es la piruvato carboxilasa

2.- PRODUCCIÓN DE ENZIMAS2.0 Uso de enzimas

2.1 Características de la acción enzimática

2.2 Factores que influyen en las reacciones enzimáticas

2.0 USO DE ENZIMASLa aplicación de la catálisis enzimática es un negocio de grandes proporciones.

Los enzimas se utilizan en cuatro campos bien diferenciados:

como agentes terapéuticos,

como herramienta para la manipulación de materiales biológicos,

como reactivos analíticos

y como catalizadores industriales.

2.1 CARACTERÍSTICAS DE LA ACCIÓN ENZIMÁTICA

La acción enzimática se caracteriza por la formación de un complejo que representa el estado de transición del sustrato al producto.

E + S ES E + P El sustrato se une al enzima a través de numerosas interacciones débiles como son: puentes de hidrógeno, electrostáticas, hidrófobas, etc, en un lugar específico , el centro activo.

Animación sobre la acción enzimática

Algunas enzimas actúan con la ayuda de estructuras no proteícas. En función de su naturaleza se denominan:

1.Cofactor. Cuando se trata de iones o moléculas inorgánicas.

2.Coenzima. Cuando es una molécula orgánica. Se puede señalar, que muchas vitaminas funcionan como coenzimas.

Continuación...

COFACTOR

COENZIMA

2.2 FACTORES QUE INFLUYEN EN REACCIONES ENZIMATICAS

2.2.1 Cambios en el pH

2.2.2 Cambios en la temperatura

2.2.3 Presencia de cofactores

2.2.4 Las concentraciones del sustrato y de los productos finales

2.2.1 EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Este es el llamado pH óptimo.

Representación del efecto del pH

2.2.2 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Los aumentos de temperatura por lo general aceleran las reacciones químicas. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley, solo que al ser proteínas a partir de cierta temperatura se empiezan a desnaturalizar.

Esa temperatura se llama temperatura óptima y es aquella en la que la velocidad enzimática es máxima.

2.2.3 EFECTO DE LOS COFACTORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Los cofactores son sustancias no proteícas que colaboran en la catálisis con la enzima para realizar su función.

Los cofactores pueden ser:

Iones inorgánicos: Fe++, Mg++, Mn++, Zn+

+ ,etc...

Moléculas orgánicos: que son las coenzimas

Muchos de estos coenzimas se sintetizan a partir de vitaminas. En la siguiente figura podemos observar una molécula de hemoglobina (proteína que transporta oxígeno) y su coenzima (el grupo hemo).

Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente al enzima se llaman grupos prostéticos. La forma catalíticamente activa del enzima, es decir, el enzima unida a su grupo prostético, se llama holoenzima. La parte proteica de un holoenzima (inactiva) se llama apoenzima, de forma que:

2.2.4 EFECTO DE LAS CONCENTRACIONES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

La velocidad de una reacción enzimática depende de la concentración de sustrato.

En la siguiente figura observamos la velocidad de una reacción enzimática a 6 concentraciones distintas de sustrato.

Además, la presencia de los productos finales puede hacer que la reacción sea más lenta, o incluso invertir su sentido.

Continuación...

2.2.5 EFECTO DE LOS INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Ciertas moléculas pueden inhibir la acción catalítica de un enzima: estos son los inhibidores. Estos inhibidores bien pueden ocupar temporalmente el centro activo por semejanza estructural con el sustrato original (inhibidor competitivo) o bien alteran la conformación espacial del enzima, impidiendo su unión al sustrato (inhibidor no competitivo)

Inhibidor competitivo

Inhibidor no competitivo

COSTE

La consideración dominante en el contexto del procesado industrial es la del coste.

De poco sirve dar con un enzima que es teóricamente mejor, si su coste es prohibitivo.

Hay q tener en cuenta el coste tanto por unidad de conversión como en porcentaje respecto al coste total del procesado.

DISPONIBILIDAD

La abundante disponibilidad del enzima y, por lo tanto, de su fuente, es de importancia fundamental.

No sólo debe el enzima ser fácilmente disponible, sino que tanto él como su fuente han de ser aceptables desde el punto de vista de la inocuidad. Esto es de vital importancia cuando se vayan a destinar al procesado de alimentos o puedan entrar en contacto con las personas.

3. EXTRACCIÓN DE ENZIMAS

3. EXTRACCIÓN DE ENZIMAS.

• 3.1. ETAPAS EN LA OBTENCIÓN DE ENZIMAS.• 3.2. TIPOS DE ENZIMAS.• 3.3. MÉTODOS DE ROTURA.• 3.4. ELECCIÓN DEL MÉTODO DE ROTURA.

3.1. ETAPAS EN LA OBTENCIÓN DE ENZIMAS INDUSTRIALES

• Selección de la fuente de enzimas.• Rotura celular (enzimas intracelulares)• Eliminación de los restos celulares (enzimas

intracelulares)• Concentración y enriquecimiento• Purificación con alta resolución (dependiendo de su

uso final)• Concentración y terminado

3.2.TIPOS DE ENZIMAS.

• ENZIMAS INTRACELULARES:• Glucosa isomerasa, glucosa oxidasa, penicilin acetilasa,

asparraginasa

• ENZIMAS EXTRACELULARES:• Dado que la molécula es segregada fuera de la célula, no se

requieren técnicas de ruptura celular • El número de proteínas que se segregan es limitado y por eso es

relativamente fácil aislar una enzima concreta a partir de una mezcla

• Estructura más compacta y menos susceptibles a la desnaturalización que las correspondientes intracelulares.

4. PURIFICACIÓN DE ENZIMAS.

4. PURIFICACIÓN DE ENZIMAS

• 4.1. PROCESOS.• 4.2.ELIMINACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS.• 4.3.ELIMINACIÓN DE PARTÍCULAS SÓLIDAS.• 4.4.PURIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓN.• 4.5.CONCENTRACIÓN Y ENVASADOS.

4.1 PROCESOS

CONCENTRACIÓN Y ENVASADO

PURIFICACIÓN FINAL

CONCENTRACIÓN

PURIFICACIÓN PRELIM INAR

ELIM INACIÓN DE RESTOS CELULARES

ELIM INACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

4.2 ELIMINACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

• Los métodos de extracción rompen la célula, liberando al medio los ácidos nucleicos.

• Los ácidos nucléicos aumentan la viscosidad de la solución.• SOLUCIÓN:

• Adición de policationes de alto peso molecular (caros, poco frecuente). Precipitación de los ácidos.

• Nucleasas (acorta los ácidos nucléicos) Digestión enzimática.

4.3 ELIMINACIÓN DE PARTÍCULAS SÓLIDAS

• Restos: ácidos nucleicos precipitados, paredes celulares, fragmentos de membranas, células parcialmente rotas...

• Métodos:• Centrifugación.(Eliminar material viscoso o gelatinoso)• Filtración.( Grandes volúmenes de precipitados floculados)

• Elección del método:• Escala de uso• Naturaleza de los sólidos presentes.

4.3 ELIMINACIÓN DE PARTÍCULAS SÓLIDAS

TIPOS DE CENTRÍFUGAS:

• Centrífugas discontinuas • Centrífugas continuas

• De cestillo• De taza• Cilíndrica• Sharples Super

4.4 PURIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓN

• Eliminación de los contaminantes no deseados, moléculas pequeñas , orgánicas e inorgánicas, otras proteínas y la mayor parte del agua, si no toda.

• Métodos:• Precipitación.• Adsorción.• Separación en dos fases líquidas.• Cromatrografía en columna

4.4 PURIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓN• 1. Precipitación.

• Para la purificación inicial.• Tipos:• Negativo (precipito la impureza).• Positiva( precipito el enzima, también concentro).

• Muy usado ( simple y barato, consigo altos grados de purificación y concentración).

• Inconvenientes: Realizarlos por tandas, difícil de integrar en procesos continuos.

• Sustancias:• Sulfato amónico, sulfato sódico, disolventes orgánicos.

4.4 PURIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓN• 2. Adsorción.• Muy usada la adsorción sobre materiales insolubles, por tandas.

• Se añaden al extracto los adsorbentes , se remueve.• Se sedimenta en una centrífuga basculante• Se resuspende el adsorbente.• Se centrifuga de nuevo.

• Tres tipos de materiales: resinas, dextranos sustituidos o agarosa y celulosas sustituidas.

4.4 PURIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓN

• 3. Separación en dos fases líquidas.• Método actual.• Proteína + dos polímeros inmiscibles = Fases distintas• Ventajas :

• Separación de proteínas por un lado y paredes celulares y residuos semisolubles por otro

• Posibilidad de funcionar en continuo

4.4 PURIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓN

• 4. Cromatografía en columna:• Para las fases finales del procesado ( poco volumen a tratar).• Tipos:

• Filtración en geles.• Intercambio iónico.• Cromatografía de afinidad.

4.4 PURIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓN

• 5.Electroforesis en continuo.• Aplicación de un potencial eléctrico a través de un caudal continuo de

solución de proteínas.• Técnica en desarrollo (caros).• En la actualidad para el fraccionamiento de las proteínas de sangre.

4.4 PURIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓN• 6. Ultrafiltración y diálisis.• Aplicación de membranas semipermeables.• Para las últimas fases del proceso :

• Eliminación de sales y concentración.• Separación por tamaños.

• Filtros: ultrafiltros de fibra hueca o de lecho plano.( bajo coste y facilidad para mantener la esterilidad)

4.5 CONCENTRACIÓN Y ENVASADO

• Grado de concentración final

• Características

• Presentación de un enzima

• Transporte de enzimas a grandes distancias.

5. Aplicación de enzimas

5.1 Aplicaciones en la Industria Alimentaria

Enzimas en la Industria Alimentaria• Son muy antiguas sus aplicaciones• Se usaron enzimas de un modo inconsciente

hasta finales del siglo XIX en que se descubrieron los artífices de las reacciones• Es un gran activo económico, y la investigación

va encaminada a la purificación y la obtención de enzimas concretos para funciones concretas

Industrias LácteasFabricación del Queso

• Es una de las mas antiguas aplicaciones enzimáticas en la industria alimentaria

• Para la producción de queso se usaban cuajos, estómagos enteros de vacas y otros rumiantes

• En otras culturas, el queso se conseguía con vegetales como la papaya, que contienen otra clase de enzimas

Industrias LácteasFabricación del Queso• La operación mas importante es la coagulación

de la caseina• Para ello utilizamos una serie de enzimas que

podemos encontrar en vegetales o animales• La pepsina y la quimosina son las enzimas mas

importantes en esto• Se encuentran en el cuajo de varios animales,

entre ellos los rumiantes

Industrias LácteasFabricación del Queso

• Otras enzimas como papaina o rennina• Estos producen coágulos elásticos• La utilización de unas u otras enzimas repercute activamente en el

sabor y en la naturaleza del queso

Industrias Lácteas

• La lactasa es el enzima que consigue romper la lactosa, que es el azúcar que contiene la leche• Mucha gente es intolerante a la lactosa• Existen en el mercado leches que vienen con

lactasa

Industria Panadera• La mas comúnmente utilizada es la lipoxidasa, que

conjuntamente con el blanqueante, le da a la masa un carácter mas manejable

• Esta contenida en la harina de soja y de otras leguminosas

Industria Panadera• Para aumentar la acción de la levadura se añade amilasa, en

forma de harina de malta• Se usan para ello también algunos mohos que contienen la

enzima• La harina de malta, tiene un inconveniente, y es que cambia el

color del pan

Industria Panadera• La proteasa rompe el gluten, una proteína contenida en

algunos cereales• La rotura del gluten conlleva una mayor plasticidad de la masa• Es un aditivo importante en la fabricación de bizcochos

Industria Cervecera• La papaina se usa para romper algunas proteínas de la cerveza

para evitar que se enturbie cuando se almacena o se refrigera• Se pueden conseguir estos enzimas y otros parecidos, de

similares funciones de algunas frutas tropicales como la piña

Industria Cervecera

• El proceso fundamental es la rotura del almidón• Los azucares simples formados son fermentados

por las levaduras• Esto se lleva a cabo con las amilasas,

provenientes de la malta• A veces se añaden otros almidones como de

arroz o patata para aprovechar al máximo la actividad de las enzimas

Fabricación de Zumo• Las peptinas provocan que los zumos sean demasiado

viscosos y turbios.• Esto se elimina con enzimas, amilasas, contenidos en el propio

zumo o que se pueden añadir• En el proceso, como subproducto tenemos metanol, que

aparece en muy baja concentración

Obtención de Glucosa y Fructosa a a partir de Maíz

• Con la harina del maíz, ayudados por las enzimas alfa-amilasas y amiloglucosidasas conseguiremos jarabes de gran calidad• Antes se conseguía por la hidrólisis del almidón por

parte de un ácido• Posteriormente, la glucosa se puede transformar a

fructosa (mas dulce) por la acción de la glucosa-somerasa

Obtención de Glucosa y Fructosa a a partir de Maíz• Estos jarabes se usan como edulcorantes en bebidas

refrescantes• Se han conseguido producir a un precio muy competitivo• La UE ha pasado a proteger a la industria azucarera

convencional (remolacha y caña) para evitar su hundimiento por esta nueva forma de conseguir azucares

Refinado de Azúcar• La rafinosa puede complicar la extracción de la sacarosa• El enzima raffinosutilizer, producido por el hongo morteirella

vinaceae se encarga de degradar la rafinosa, facilitando la cristalización y produciendo además sacarosa

Más Aplicaciones Alimentarias

• En productos derivados del huevo, se añade glucosa-oxidasa y catalasa para evitar que se oscurezcan

• Bromelaína y papaína se usan para ablandar la carne, ya que rompen proteínas

• La lactoperóxidasa ayuda a conservar productos lácteos

5.2 Otras Aplicaciones no Alimentarias

Otras AplicacionesNo Alimentarias:Detergentes

• Estos llevan enzimas que ayudan a limpiar• Las proteasas facilitan la eliminación de manchas de origen proteico• Las lipasas eliminan las manchas de grasa y otros compuestos

orgánicos• Estos detergentes que llevan enzimas se denominan detergentes

biológicos

Otras AplicacionesNo Alimentarias:Tratamiento de Residuos I

• El principal objetivo es reducir materiales poliméricos que puedan suponer un peligro medioambiental o un estorbo en determinados procesos industriales

• Existen enzimas que hidrolizan materiales poliméricos para su posterior degradación microbiológica

Otras AplicacionesNo Alimentarias:Tratamiento de Residuos II

• Las proteinasas y amilasas son degradantes de polímeros grasos muy complejos

• Limpian tuberías de plantas dedicadas a diferentes procesos• Forman parte de los detergentes comerciales

Otras AplicacionesNo Alimentarias:Tratamiento de Residuos III

• Existen enzimas capaces de degradar elementos altamente tóxicos• Por ejemplo, se usa la peroxidasa para degradar productos como

fenoles o aminas aromáticas• Son de un gran interés medioambiental en el tratamiento de aguas

residuales

Otras AplicacionesNo Alimentarias:Curtición• Se lleva a cabo una acción enzimática para que se produzca la

“hinchazón” de las pieles• La enzima protealitinasa es la encargada de llevar a cabo esta

función• Esta actividad representa la segunda industria en uso de

enzimas después de la alimentaria

Otras AplicacionesNo Alimentarias:Medicina y Farmacia

• El uso de enzimas en el sector médico y farmacéutico es potencialmente inmensa

• A pesar de ello, su utilización es mínima• Se usan en puntos en los que se tiene una seguridad absoluta de su

aprovechamiento y de su eficacia

Otras AplicacionesNo Alimentarias:Medicina y Farmacia II

• Podemos dividir esa utilización en tres campos• Terapia enzimática• Uso analítico• Productos farmacéuticos

• Para cada una de estas áreas necesitamos enzimas muy purificadas, para que no se produzcan efectos secundarios

6. Problemas en la Tecnología Enzimática

Problemas de la Tecnología Enzimática

• A pesar de ser muy útiles, los enzimas que requieren coenzimas se usan muy poco porque son poco rentables

• La reutilización de estos coenzimas o su reciclaje, sería una solución que abarataría costes

• Son importantes por la importancia de las reacciones que catalizan

Problemas de la Tecnología Enzimática• La utilización de enzimas en medios acuosos no

siempre es muy efectiva• La solubilidad toma un papel importante a la

hora de producirse la reacción• La reacción en medios orgánicos, mas solubles,

puede verse adulterada o modificada en su naturaleza• Se investiga con buenos resultados, la utilización

de solventes orgánicos