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SEÑALES CELULARESSEÑALES CELULARES
20092009
hpzhpz
Un mitógeno estimula la división Un mitógeno estimula la división celularcelular
Comunicación celularComunicación celular Los organismos multicelulares necesitan mecanismos Los organismos multicelulares necesitan mecanismos
de comunicaciónde comunicación Dependen de señales extracelularesDependen de señales extracelulares Depende también de un sistema de proteínas capaz Depende también de un sistema de proteínas capaz
de responder a estas señales hacia un camino de responder a estas señales hacia un camino específicoespecífico
Estas proteínas incluyen proteínas receptoras de Estas proteínas incluyen proteínas receptoras de superficie y una variedad de proteínas señalizadoras superficie y una variedad de proteínas señalizadoras intracelulares.intracelulares.
Entre estas proteínas están kinasas, fosfatasas, Entre estas proteínas están kinasas, fosfatasas, proteínas que unen GTP y otras.proteínas que unen GTP y otras.
El final de cada señal es una proteína blanco que El final de cada señal es una proteína blanco que activa y cambia el comportamiento de la célula.activa y cambia el comportamiento de la célula.
Dependiendo del efecto de la señal estas proteínas Dependiendo del efecto de la señal estas proteínas blanco pueden ser proteínas reguladoras de genes, blanco pueden ser proteínas reguladoras de genes, canales ionicos, componentes del metabolismo, canales ionicos, componentes del metabolismo, partes del citoesqueleto, y otras.partes del citoesqueleto, y otras.
Una señal intracelular activada Una señal intracelular activada por una molécula señal por una molécula señal
extracelularextracelular La molécula señal se La molécula señal se
une a la proteína une a la proteína receptora activando las receptora activando las señales proteicas señales proteicas intracelulares.intracelulares.
La señal intracelular La señal intracelular interactúa sobre una interactúa sobre una proteína blanco proteína blanco alterándola y alterándola y produciendo un cambio produciendo un cambio en el comportamiento en el comportamiento de la célulade la célula
SEÑALES QUIMICAS ENTRE CELULASSEÑALES QUIMICAS ENTRE CELULAS
Moléculas de SeñalizaciónMoléculas de Señalización Moléculas que indican a una célula cómo Moléculas que indican a una célula cómo
proceder.proceder. Actúan como ligando para las células blanco).Actúan como ligando para las células blanco). Las células (blanco) diana poseen receptores Las células (blanco) diana poseen receptores
para captar estas moléculas e iniciar la para captar estas moléculas e iniciar la respuesta.respuesta.
Son :Son : NeurotransmisoresNeurotransmisores HormonasHormonas Mediadores químicos localesMediadores químicos locales
Las moléculas señales pueden actuar a distancias cortas Las moléculas señales pueden actuar a distancias cortas o largaso largas
A) Dependiente de A) Dependiente de contactocontacto, ,
especialmente importantes en especialmente importantes en el desarrollo y respuesta el desarrollo y respuesta inmuneinmune
B) Paracrina,B) Paracrina, señal liberada al exterior y señal liberada al exterior y
actúan sobre las células actúan sobre las células vecinas. Se destruyen vecinas. Se destruyen rápidamenterápidamente
C) Señales sinápticasC) Señales sinápticas de neuronas que transmiten de neuronas que transmiten
señales a lo largo de los señales a lo largo de los axones y liberan axones y liberan neurotransmisores en las neurotransmisores en las sinapsis situadas lejos del sinapsis situadas lejos del cuerpo de la célula.cuerpo de la célula.
D) EndocrinasD) Endocrinas Depende de células que Depende de células que
secretan hormonas a la secretan hormonas a la circulacióncirculación
La unión de la La unión de la molécula señal molécula señal
extracelular puede ser extracelular puede ser en receptores de en receptores de
superficie o receptores superficie o receptores intracelularesintracelulares
MOLECULAS DE SEÑALIZACIONMOLECULAS DE SEÑALIZACIONHidrófilicas. Receptores de SuperficieHidrófilicas. Receptores de Superficie
Dentro de este grupo están los neurotransmisores, las hormonas Dentro de este grupo están los neurotransmisores, las hormonas proteicas y glucoproteínas y los mediadores locales.proteicas y glucoproteínas y los mediadores locales.
Estas moléculas se degradan a los pocos minutos de ser liberados Estas moléculas se degradan a los pocos minutos de ser liberados y median respuestas de corta duración. y median respuestas de corta duración.
Activan proteínas receptoras de la superficie de la membrana Activan proteínas receptoras de la superficie de la membrana plasmática.plasmática.
Tras la unión al ligando, el complejo receptor-ligando queda Tras la unión al ligando, el complejo receptor-ligando queda atrapado en una vesícula de endocitosis revestida por clatrina y es atrapado en una vesícula de endocitosis revestida por clatrina y es endocitado.endocitado.
El ligando es destruido y el receptor, o bien es destruido o El ligando es destruido y el receptor, o bien es destruido o reciclado hacia la membrana plasmática.reciclado hacia la membrana plasmática.
MOLECULAS DE SEÑALIZACIÓNMOLECULAS DE SEÑALIZACIÓN
1.1. Neurotransmisores (señalización sináptica):Neurotransmisores (señalización sináptica): producidos y liberados producidos y liberados por las neuronas en la terminación sináptica y actúan sólo sobre la por las neuronas en la terminación sináptica y actúan sólo sobre la célula postsináptica. La señalización es casi instantánea.célula postsináptica. La señalización es casi instantánea.
2.2. Hormonas (secreción endocrina):Hormonas (secreción endocrina): son liberadas hacia la sangre y son liberadas hacia la sangre y transportadas por ella hasta la célula diana, que pueden estar situadas transportadas por ella hasta la célula diana, que pueden estar situadas muy lejos de las células que secretaron la hormona, por lo que ésta muy lejos de las células que secretaron la hormona, por lo que ésta puede tardar minutos e incluso horas en llegar.puede tardar minutos e incluso horas en llegar.
3.3. Mediadores químicos locales (secreción paracrina)Mediadores químicos locales (secreción paracrina) que son que son producidos por muchos tipos de celulares y, tan pronto como son producidos por muchos tipos de celulares y, tan pronto como son liberados, son rápidamente absorbidos o destruidos, de modo que sólo liberados, son rápidamente absorbidos o destruidos, de modo que sólo actúan sobre las células localizadas en su entorno inmediato actúan sobre las células localizadas en su entorno inmediato (secreción autocrina, mismo tipo de célula). (secreción autocrina, mismo tipo de célula).
Señal autocrina. Señal autocrina. Cuando la señal es recibida por un receptor Cuando la señal es recibida por un receptor
de la misma célula estas responden de la misma célula estas responden coordinadamente como un grupocoordinadamente como un grupo
Una célula animal depende de Una célula animal depende de múltiples señales extracelularesmúltiples señales extracelulares
Las diferentes células pueden Las diferentes células pueden responder diferentemente a la responder diferentemente a la
misma molécula señal misma molécula señal extracelularextracelular
MOLECULAS DE SEÑALIZACIONMOLECULAS DE SEÑALIZACIONHidrófobas. Receptores intra citoplasmáticosHidrófobas. Receptores intra citoplasmáticos
Hormonas esteroides y tiroideas, la vitamina D, los retinoles, los Hormonas esteroides y tiroideas, la vitamina D, los retinoles, los eicosanoides (prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos y eicosanoides (prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos y leucotrienos) el NO y el CO.leucotrienos) el NO y el CO.
Las hormonas hidrófobas permanecen mucho tiempo en la sangre Las hormonas hidrófobas permanecen mucho tiempo en la sangre y median respuestas de larga duración.y median respuestas de larga duración.
Al ser liposolubles pasan fácilmente a través de la membrana Al ser liposolubles pasan fácilmente a través de la membrana plasmática (difusión simple) y activan proteínas receptoras en el plasmática (difusión simple) y activan proteínas receptoras en el citoplasma.citoplasma.
El complejo receptor-hormona es introducido en el núcleo de la El complejo receptor-hormona es introducido en el núcleo de la célula donde se une a la cromatina y regula la trascripción de un célula donde se une a la cromatina y regula la trascripción de un pequeño número de genes (respuesta primaria).pequeño número de genes (respuesta primaria).
Estos genes pueden activar a otros genes y dar lugar a una Estos genes pueden activar a otros genes y dar lugar a una respuesta secundaria retardada.respuesta secundaria retardada.
MOLÉCULAS DE SEÑALIZACIÓN HIDRÓFOBAS
El gas óxido nítrico (NO) se une El gas óxido nítrico (NO) se une directamente a una enzima al directamente a una enzima al
interior de la célula blancointerior de la célula blanco
Respuesta inducida por un Respuesta inducida por un receptor nuclear de la hormonareceptor nuclear de la hormona
Tres clases de receptores de Tres clases de receptores de superficiesuperficie
Diferentes Diferentes clases de clases de señales señales
intracelulares intracelulares a lo largo de a lo largo de un camino de un camino de señales desde señales desde un receptor de un receptor de
superficie superficie hasta el hasta el núcleonúcleo
RECEPTORES LIGADOS A PROTEÍNAS GRECEPTORES LIGADOS A PROTEÍNAS G
Señales a traves de la Señales a traves de la unión de proteínas G a unión de proteínas G a
receptores de la receptores de la superficie superficie celularcelular
Los receptores ligados a proteína G Los receptores ligados a proteína G es una gran familia que se es una gran familia que se
encuentra en todos los eucariontes.encuentra en todos los eucariontes.
Receptores ligados a proteínas GReceptores ligados a proteínas G::
Activan o inactivan indirectamente una enzima ligada a la Activan o inactivan indirectamente una enzima ligada a la membrana plasmática (generalmente la adenil ciclasa), o membrana plasmática (generalmente la adenil ciclasa), o bien un canal iónico separado del receptores. bien un canal iónico separado del receptores.
La interacción receptor-enzima (o canal) está mediada por la La interacción receptor-enzima (o canal) está mediada por la proteína G, que se une al GTP.proteína G, que se une al GTP.
La unión del receptor al ligando activa una cadena de La unión del receptor al ligando activa una cadena de acontecimientos que alteran la concentración de una o más acontecimientos que alteran la concentración de una o más moléculas señal intracelulares, denominados mensajeros moléculas señal intracelulares, denominados mensajeros intracelulares, mediadores intracelulares o segundos intracelulares, mediadores intracelulares o segundos mensajeros; AMP cíclico (cAMP) y el Ca++.mensajeros; AMP cíclico (cAMP) y el Ca++.
AA su vez, estos mensajeros actúan alterando el su vez, estos mensajeros actúan alterando el comportamiento de otras proteínas diana de la célula.comportamiento de otras proteínas diana de la célula.
Una vez activada la Una vez activada la proteina G por formación proteina G por formación
de GTP se activa la de GTP se activa la formación de adenil formación de adenil ciclasa que activa la ciclasa que activa la
proteina regulatoria del proteina regulatoria del gen CREB etc.gen CREB etc.
Señales a traves de la unión de enzima a los Señales a traves de la unión de enzima a los receptores de la superficie.receptores de la superficie.
Activación de una enzima ligada a la Activación de una enzima ligada a la membrana plasmática (adenil ciclasa)membrana plasmática (adenil ciclasa)
La activación de la adenil ciclasa altera la concentración del La activación de la adenil ciclasa altera la concentración del cAMP.cAMP.
Casi siempre esta alteración es un incremento de la concentración Casi siempre esta alteración es un incremento de la concentración de cAMP, pero también puede ser que se reduzca la de cAMP, pero también puede ser que se reduzca la concentración.concentración.
El cAMP se sintetiza a partir del ATP, por la enzima adenil ciclasa.El cAMP se sintetiza a partir del ATP, por la enzima adenil ciclasa. Es rápida y continuamente degradada por la fosfodiesterasa del Es rápida y continuamente degradada por la fosfodiesterasa del
cAMP.cAMP. El aumento de los niveles de cAMP estimula una proteína quinasa El aumento de los niveles de cAMP estimula una proteína quinasa
dependiente de cAMP, que fosforila determinadas proteínas dependiente de cAMP, que fosforila determinadas proteínas dianas en residuos de serina o treonina, desencadenando una dianas en residuos de serina o treonina, desencadenando una serie de señales intracelulares.serie de señales intracelulares.
Receptores catalíticos (ligados a enzimas):Receptores catalíticos (ligados a enzimas):
Son proteínas transmembranosas con un dominio citoplasmático Son proteínas transmembranosas con un dominio citoplasmático que bien está asociado a una enzima o actúa como enzima.que bien está asociado a una enzima o actúa como enzima.
Esta enzima es generalmente del tipo proteína quinasa específica Esta enzima es generalmente del tipo proteína quinasa específica de tirosinas.de tirosinas.
La enzima puede ser también una proteína quinasa de La enzima puede ser también una proteína quinasa de serina/treonina.serina/treonina.
La fosforilación desencadena una cascada de nuevas La fosforilación desencadena una cascada de nuevas fosforilaciones proteicas que dan lugar a una serie de señales fosforilaciones proteicas que dan lugar a una serie de señales citoplasmáticas.citoplasmáticas.
Mediante unas proteínas Ras, estas señales llegan al núcleo, Mediante unas proteínas Ras, estas señales llegan al núcleo, alterando se expresión génica, de modo que se activan unos alterando se expresión génica, de modo que se activan unos genes y se reprimen otros.genes y se reprimen otros.
Regulación de la actividad Regulación de la actividad RASRAS
Señales mediadas por RASSeñales mediadas por RAS Ligando:Ligando: factor de crecimiento fibroblastos,factor de crecimiento fibroblastos, factores crecimiento epitelial, factor de factores crecimiento epitelial, factor de
crecimiento plaquetario, stem cell factorcrecimiento plaquetario, stem cell factor Receptor:Receptor: Tirosino-kinasa (RTK) Tirosino-kinasa (RTK) Dimerización y fosforilaciónDimerización y fosforilación Activación proteína intermediaria GNRPActivación proteína intermediaria GNRP Activación proteína G RAS, fosforilación Activación proteína G RAS, fosforilación Proteína GAP inactiva RASProteína GAP inactiva RAS (mutaciones RAS en gran proporción (mutaciones RAS en gran proporción de tumores)de tumores) RAS activada activa proteína kinasa RAFRAS activada activa proteína kinasa RAF RAF activa MEK por fosforilaciónRAF activa MEK por fosforilación La kinasa ERK puede entrar al núcleo y La kinasa ERK puede entrar al núcleo y
activa ciertos factores de transcripciónactiva ciertos factores de transcripción por fosforilación.por fosforilación. Modula la transcripción.Modula la transcripción.
Señales por ligandos TGF Beta y por BMP
SEÑAL QUE HEMOS SEÑAL QUE HEMOS TERMINADOTERMINADO
GRACIASGRACIAS
Regulación de la Regulación de la expresión génicaexpresión génica
HPZ 2009HPZ 2009
Regulación de la expresión Regulación de la expresión génicagénica Genes se expresan transcribiéndose en moléculas de RNA
• Todas las células tienen la misma información genética.• Variabilidad en la forma y función celular.• Multiplicación y diferenciación celular.• Ausencia o presencia de proteínas específicas.• Los genes se expresan reguladamente• La expresión de los genes puede ser permanente y en todos los tipos de células por la función desempeñada: genes housekeeping o restringido a un tejido específico.• Control de la expresión génica a través de proteínas reguladoras.• Respuesta a estímulos ambientales activando o desactivando genes específicos en forma permanente o temporal.• Además, modificaciones de la cromatina, metilación del DNA, acetilación de histonas pueden regular la expresión génica (mecanismos epigenéticos)
Control de degradación del RNA
mRNA degradado
Control transcripcional
Control post-transcripcional
Control en el transporte
Control traduccional
Control en la degradación proteica
Control pre-transcripcional
Transporte al Citoplasma
Proteína
Proteína degradada
DNA
Pre-mRNA
mRNA maduro
Niveles de Regulación GénicaNiveles de Regulación Génica
La regulación génica puede ocurrir a nivel:La regulación génica puede ocurrir a nivel:
• Pre- transcripcional
• Transcripcional
• Post-transcripcional
• Traduccional
• Post-traduccional
•Velocidad de síntesis de proteínas
•Velocidad de degradación de proteínas
•Modificaciones post-traduccionales
•Destinación diferencial
•Etc, etc….
Regulación Post-traduccionalRegulación Post-traduccional
Niveles de Regulación GénicaNiveles de Regulación Génica
• Pre- transcripcional
Estímulo externo:
inducción hormonal, factores de crecimiento, moléculas señales o intermediarios para la inducción de la transcripción.
Interacciones inductivas Interacciones inductivas durante el desarrollo del ojodurante el desarrollo del ojo
Mecanismos Mecanismos pretranscripcionalespretranscripcionales
Ligando: factor de crecimiento Ligando: factor de crecimiento fibroblastos,fibroblastos,
Factores crecimiento epitelial, factor de Factores crecimiento epitelial, factor de crecimiento plaquetario, stem cell factorcrecimiento plaquetario, stem cell factor
Receptor: Tirosino-kinasa (RTK)Receptor: Tirosino-kinasa (RTK) Dimerización y fosforilaciónDimerización y fosforilación Activación proteina intermediaria GNRPActivación proteina intermediaria GNRP Activación proteína G RAS, fosforilacion Activación proteína G RAS, fosforilacion Proteína GAP inactiva RASProteína GAP inactiva RAS (mutaciones RAS en gran proporción (mutaciones RAS en gran proporción de tumores)de tumores) RAS activada activa proteina kinasa RAFRAS activada activa proteina kinasa RAF RAF activa MEK por fosforlizaciónRAF activa MEK por fosforlización La kinasa ERK puede entrar al nucleo y La kinasa ERK puede entrar al nucleo y
activa ciertos factores de transcripciónactiva ciertos factores de transcripción por fosforilación.por fosforilación. Modula la transcripción.Modula la transcripción.
Pre-transcripcionales
Niveles de Regulación GénicaNiveles de Regulación Génica
• Transcripcional
Promotor core o básico Caja TATA (posición -30)
Elementos proximales ~ 20bp (hasta -200)
Enhancers y silenciadores ~ 100-200 bp con elementos de control de 8-20 bp (distancias variables)
Estructura básica de un promotor Estructura básica de un promotor eucarionteeucarionte..
Elementos proximales Core
Río arriba Río abajo
Caja GC Caja CAAT Caja TATA
ESPECÍFICOS
Promotor: secuencias necesarias para el inicio de transcripción
Regulación a nivel transcripcional
Regulación a nivel transcripcional.
Regulación a nivel transcripcional....
R, retinalCNS, sistema nervioso centralS: Células de Schwann G, general
Uso de promotores alternativos.La distrofina en distintos tejidos tienen promotores diferentes
L, lymphocyteC, corticalM, muscleP, Purkinje
Gen Distrofina:Xp2179 exones2,4 MB
Niveles de Regulación GénicaNiveles de Regulación Génica
• Post-transcripcional
1. Modificación del extremo 5’: Adición de CAP (7-
metilguanosina )
2. Modificación del extremo 3’: Poliadenilación y uso de secuencias de término alternativas
3. Remoción de intrones: splicing alternativo
4. Edición del RNA
Procesamiento del RNA. Regulación Procesamiento del RNA. Regulación a nivel post transcripcional. a nivel post transcripcional.
Regulación a nivel post-transcripcional...Regulación a nivel post-transcripcional...
Splicing alternativoSplicing alternativo
EJ: GEN DE LA FIBRONECTINA Múltiples exones 75 kb
El mRNA de la fibronectina del fibroblasto tiene los exones EIIIB y EIIIA. En el hepatocito carece de éstos.
-tropomyosin: Uso de promotores alternativos•Splicing alternativo y Secuencias de término alternativas
Hígado.Une receptores de LDL presentes en todas las células.Transporta lípidos y colesterol
Intestino delgado. Transporta lípidos.
En el cerebro de mamíferos, la edición del RNA produce cambios significativos en las propiedades funcionales de receptores de importantes neurotransmisores tales como glutamato y serotonina.
Cambio de C a U enla base 6666 ocasiona un codón de término en el APO del intestino.
Regulación post transcripcional...Regulación post transcripcional... Edición del RNAEdición del RNA
Modificación del DNA o del core de histonas que regulan la actividad génica, sin alterar la secuencia del DNA.
Se puede transmitir después de la división celular a las células hijas.
Mecanismos:
Metilación del DNA
Modificación de histonas.
Exclusión alélica
Imprinting
Factores epigenéticos.Factores epigenéticos.Epigenética: “Fuera de la genética convencional”
C mC
Metil transferasa
Regulación de la actividad Regulación de la actividad transcripcional.transcripcional.
Metilación del DNA Metilación del DNA
Características asociadas con cromatina transcripcionalmente activa e inactiva
Característica Cromatina transcripcionalmente activa
Cromatina transcripcionalmente inactiva
conformación de la cromatina
conformación abierta y extendida
Conformación altamente condensada, particularmente en heterocromatina (facultativa y constitutiva)
metilación del DNA Relativamente no metilada, especialmente en regiones promotoras
Metilada, incluyendo en regiones promotoras
acetilación histonas Histonas acetiladas Histonas desacetiladas
metilación de histonas Histonas metiladasHistonas no metiladas
Metilación del DNA. Islas CpG
• Islas CpG: segmentos de 200-2.000 bp con una alta concentración de dinucleótidos CpG.• 56% de los genes humanos tienen islas CpG cercanas al extremo 5’.• Housekeeping genes permanecen no metilados por lo que se expresan en todos los tejidos. • Genes tejido específicos permanecen no metilados SOLO en tejidos donde deben expresarse.
• La inactivación del cromosoma X es un proceso regulado que se produce en hembras de mamíferos durante la embriogénesis Blastocisto.
XIST codifica para un RNA de 17 kb poliadenilado que no se traduce y es inestable (200 a 1000 / célula ). También se transcribe Tsix.
XIST es un gen localizado dentro de una región denominada XIC (Xq13.2)
• Unos pocos genes del cromosoma X inactivo, 15% permanecen activos, incluyendo el gen XIST.
•La inactivación se mantiene a lo largo de la vida.
Exclusión alélica por Inactivación del cromosoma X
• Cromatina de Barr
• Síndrome de Turner (45,X) no tienen cuerpos de Barr, Síndrome de Kleinfelters (47, XXY) sí tiene
• Hipótesis Lyon – uno de los dos cromosomas X en hembras se inactiva. Si hay múltiples cromosomas X, todos excepto uno se inactivan. “compensacion de dosis”
Exclusión alélica por Inactivación del cromosoma XExclusión alélica por Inactivación del cromosoma X
XIST : Transcrito específico del Cromosoma
Centro de Inactivación del cromosoma X, XIC
Metilación en citosina en regiones CpG en promotores y alta compactación.
150Mb 1168 Genes conocidos.1.500 potenciales
Xq13
Xist
Xist
Xist
Activo
Inactivo
Factores bloquean la expresión de XIST del X activo
RNA XIST RNA interactúa con factores de estabilización
XIST se expresa en ambos cromosomas X en hembras.
El RNA Xist se distribuye y cubre el cromosoma X que lo sintetiza
Exclusión alélica por Inactivación del cromosoma X
Metilación de Xist para silenciarlo
Exclusión alélica por reordenamiento programado del DNA.
Un mamífero sintetiza 107- 1011
diferentes tipos de anticuerpos
Cada linfocito B sintetiza sólo un tipo de anticuerpo
Heavy chain IGH 14 86 30 9 11 Light k chain IGK 2 76 0 5 1 Light l chain IGL 22 52 0 7 7
Componente Locus Cromosoma Número de segmentos génicosV D J C
Generación de variabilidad en las inmunoglobulinas
Unión VJ (recombinación) en linfocitos B
Unión DJ
Unión VDJ
Exclusión alélica por reordenamiento
programado del DNA.
Generación de variabilidad en las inmunoglobulinas
PUFF en Drosophila
Sitio de eritropoiesis y tipos de Sitio de eritropoiesis y tipos de cadenas en el desarrollo cadenas en el desarrollo
humanohumano
Familia de las beta globinas en el cromosoma 11Familia de las beta globinas en el cromosoma 11
Región controladora de Región controladora de locus (LCR)locus (LCR)
Super enhancers Super enhancers (intensificadores)(intensificadores)
El LCR está ubicado entre El LCR está ubicado entre 6 a 22 Kb rio arriba del 6 a 22 Kb rio arriba del gen globina epsilongen globina epsilon
Interacción entre LCR y Interacción entre LCR y los genes globina es los genes globina es polarizado. Los genes polarizado. Los genes globina mas cercanos se globina mas cercanos se abren primero y los mas abren primero y los mas lejanos después. lejanos después.
Metilación de los genes globina en Metilación de los genes globina en células sanguíneas humanas células sanguíneas humanas
embrionariasembrionarias
GRACIASGRACIAS